НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ
ІНСТИТУТ ФІЗІОЛОГІЇ ІМ. О. О. БОГОМОЛЬЦЯ

_____________________________________________________________

Пінченко Володимир Олегович

УДК 612.822:612.811.3

Вплив експериментально-індукованого діабету і змін позаклітинного РІВНЯ рН НА НИЗЬКОПОРОГОВІ ПОТЕНЦІАЛКЕРОВАНІ КАЛЬЦІЄВІ КАНАЛИ В ПЕРВИННИХ СЕНСОРНИХ НЕЙРОНАХ ЩУРІВ

03.00.02 – біофізика

Автореферат
дисертації на здобуття наукового ступеня
кандидата біологічних наук

Київ – 2007

Дисертацією є рукопис

Роботу виконано у відділі загальної фізіології нервової системи Інституту Фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України

Науковий керівник: | Доктор медичних наук, провідний науковий співробітник Інституту Фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України, Костюк Олена Платонівна

Офіційні опоненти: | Завідуюча лабораторії біофізики синаптичної передачі Інституту фізіології ім. О.О.Богомольця, доктор біологічних наук, професор Федулова Світлана Анатоліївна.

Науковий співробітник Міжнародного центру молекулярної фізіології, кандидат біологічних наук Іванова Світлана Юріївна.

Провідна установа: | Кафедра біофізики біологічного факультету Національного університету імені Тараса Шевченка

Захист відбудеться " 15 " травня 2007 р. о " 14 " годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д-26.198.01 при Інституті фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України за адресою: вул. Богомольця, 4, Київ 01024

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту фізіології ім. О. О. Богомольця НАН України.

Автореферат розісланий " " квітня 2007 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради

доктор біологічних наук Сорокіна-Маріна З. О.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність проблеми. В наш час достатньо відома величезна роль іонів кальцію (Са2+ ) в функціонуванні різноманітних живих істот. Механізмом, що включає дію багатьох процесів в організмі, включно з народженням клітини, її життєдіяльністю, патологічними змінами і смертю, є збільшення внутрішньоклітинної концентрації іонів кальцію. Транспорт Са2+ з позаклітинного середовища до клітини здійснюється за допомогою спеціальних каналів, що пронизують двошарову ліпідну мембрану, що надійно відокремлює клітину від позаклітинного середовища. Ці канали, що складаються переважно з білку, є селективними потенціалкерованими кальцієвими каналами, здатними відкриватись при зміні мембранного потенціалу. Видатні вітчизняні вчені з Інституту фізіології ім. О.О.Богомольця академіки НАН України Костюк П.Г., Кришталь О.О. внесли суттєвий вклад у вивчення біологічних, фізіологічних процесів, пов’язаних з роллю Са2+ в різноманітних процесах, що відбуваються в організмі. Сучасними дослідженнями розкрито складний комплекс молекулярних механізмів, які формують кальцієві сигнали, зумовлюють формування нейронних систем і всі форми їх діяльності. Ці механізми порушуються при патологічних змінах в організмі. Детальне вивчення природи таких змін має фундаментальне наукове і практичне значення.

Кальцієвий струм деполярізує плазматичну мембрану, внаслідок чого активізуються інші потенціалозалежні канали. Особлива роль належить низькопороговим потенціалкерованим кальцієвим каналам Т-типу. Вони приймають участь в генерації пейсмекерної активності, процесах клітинної диференціації, є гетерогенними і поділяються на групи за кінетичними характеристиками – зі швидкою чи повільною активацією та інактивацією (Tarasenko et al., 1997). Детальне структурне дослідження молекулярних субодиниць цих каналів дало змогу поділити їх на три підгрупи: б1G, б1H, б1I. Перші дві належать до каналів зі швидкою кінетикою інактивації, а третя - з повільною, вони відрізняються і фармакологічною чутливістю та експресією в різних збудливих структурах (Perez-Reyes, 2003).

Кислотно-лужна рівновага внутрішнього середовища організму підтримується за рахунок певного співвідношення кислотних і лужних сполук, у разі порушення балансу яких (вихід рН за межі 6,5-8,0) організм гине. Зміщення рН у зазначених межах (у формі ацидозу чи алкалозу) призводить до істотних змін у перебігу основних фізіологічних процесів. Тому вивчення впливу змін рівня рН на потенціалкеровані кальцієві канали має фундаментальне і практичне значення.

Кальцій відіграє особливу роль у виникненні та розвитку ендокринних патологій, що пов’язані з цукровим діабетом. Процес вироблення підшлунковою залозою інсуліну залежить від обміну кальцію, порушення надходження якого до секреторної клітини може призвести до порушення секреції інсуліну. Водночас прямі дослідження можливих змін іонного гомеостазу, особливо кальцієвого, за діабетичної нейропатії розпочались нещодавно, на початку 1990-х років.

Досліджувані в даній роботі нейрони спінальних гангліїв малого та середнього діаметрів беруть участь у передачі больової інформації від відповідних рецепторів, і саме зміни кальцієвого гомеостазу в цих клітинах вважаються першопричиною виникнення ноцицептивних синдромів при діабетичних нейропатіях. Тому проведені дослідження впливу експериментально викликаного діабету на потенціалкеровані кальцієві канали первинних сенсорних нейронів, які напевно залучені у ноцицепцію щурів, є дуже важливими і викликають безсумнівний науковий інтерес і мають велике практичне значення.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота виконувалась в рамках наукової програми відділу загальної фізіології нервової системи Інституту фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України: „Молекулярні механізми, відповідальні за специфіку функцій різних мозкових структур”.

Мета і завдання дослідження. Мета роботи полягала у пошуку відповіді на питання, як впливає експериментально викликаний діабет і зміни зовнішньоклітинного рівня рН на низькопорогові потенціалкеровані кальцієві канали в первинних сенсорних нейронах щурів. Для її здійснення були поставлені наступні задачі:*

на основі аналізу вольт-амперних характеристик загального кальцієвого струму виконати математичне розділення його компонентів;*

порівняти НПКК у первинних сенсорних нейронах різного діаметра і встановити кореляцію між розмірами клітин і співвідношенням густини низько- та високопорогових кальцієвих струмів в них, а також кінетичними характеристиками НПКК;*

з допомогою метода фіксації потенціалу в конфігурації “ціла клітина” дослідити електрофізіологічні характеристики низькопорогових потенціал-керованих кальцієвих каналів в первинних сенсорних нейронах щурів в нормі та при СТЗ-викликаному діабеті;*

дослідити вплив змін позаклітинного рівня рН на амплітуду та кінетику НПКК та порівняти ці зміни в нейронах малого та середнього діаметра;*

на основі отриманих даних та даних з літератури співставити рН чутливість НПКК нейронів різного діаметру та можливий субодиничний склад цих каналів;*

встановити можливу роль НПКК з різною рН чутливістю в нейропатіях, зокрема діабетичних.

Наукова новизна одержаних результатів. Всі експериментальні дані, представлені в роботі, одержані вперше. У даній роботі вперше був детально вивчений вплив змін позаклітинної концентрації протонів і СТЗ-індукованого діабету на біофізичні характеристики низькопорогових кальцієвих каналів.

З використанням методики „петч-клемп" в конфігурації „ціла клітина" вперше було досліджено дозозалежність і біофізичні характеристики (потенціалозалежність, вплив на кінетику, активацію та інактивацію) дії позаклітинної рН і діабету на НПКК в первинних сенсорних нейронах щурів малого і середнього діаметру соми, відповідних волокнам С- і Ад-типу, які передають переважно ноцицептивну інформацію.

Вперше в сенсорних нейронах щурів малого і середнього діаметру соми показано наявність двох типів НПКК з різними кінетичними властивостями і рН-чутливістю і зроблено припущення, частково підтверджене експериментальними дослідженнями, про субодиничний склад цих каналів. Також вперше експериментально показано переважну експресію НПКК з низькою рН-чутливістю в сомі нейронів малого розміру і експресію каналів з високою рН-чутливістю в сомі нейронів середнього розміру. Зроблено припущення про можливий внесок змін цих двох типів НПКК у розвиток діабетичних нейропатій.

Теоретичне і практичне значення одержаних результатів. Результати, одержані в роботі, мають як фундаментальне, так і практичне значення. Порівняння функціонування кальцієвих каналів при ацидозі і в умовах діабету може допомогти в розумінні механізмів виникнення діабетичних нейропатій.

Практичне значення одержаних результатів полягає у тому, що вони відкривають ще один аспект в розуміння причин, що лежать в основі виникнення і розвитку різних больових патологій.

Одержані в роботі дані можуть стати основою для розробки високоселективних фармакологічних підходів до лікування досліджуваних патологій. Таким чином речовини, що впливають на роботу кальцієвих каналів плазматичної мембрани первинних сенсорних нейронів, можуть бути використані при лікуванні нейропатій у хворих на діабет, а також для полегшення больових синдромів, викликаних хворобами, що супроводжуються ацидозом.

Особистий внесок здобувача. Підбір, огляд та аналіз літературних даних, виконання всього обсягу експериментальних досліджень, поданих у дисертаційній роботі, статистичне опрацювання результатів проведено особисто дисертантом. Також, за участю наукових керівників, проведено планування напрямків досліджень.

Апробація результатів дисертації. Основні положення роботи доповідалися на 13 конференції студентів Європи – для обдарованих вчених в галузі біомедицини та майбутніх лікарів, Берлін, Німеччина, 2002; на конференції молодих учених Інституту фізіології “Перспективні напрямки досліджень сучасної фізіології”, Київ, 2003; на Установчому з’їзді Українського товариства клітинної біології, Львів, 2004; IV Національному конгресі патофізіологів України, Чернівці, 2004; літній школі IBRO “Рецептори. Канали. Посередники”, Ялта, Україна, 2004; на III конференції Українського товариства нейронаук з міжнародною участю, Донецьк, 2005; на об'єднаному з'їзді німецького фізіологічного товариства та Федерації Європейських фізіологічних співтовариств, Університет Людвіга-Максиміліана, Мюнхен, Німеччина, 2006; на Міжнародній школі-семінарі фізіологічного товариства Великобританії “Вивчення ноцицепції від периферії до стовбура мозку”, Київ, 2006; а також на семінарах сектора молекулярної фізіології інституту фізіології ім. О.О. Богомольця.

Публікації. За результатами роботи опубліковано три статті у наукових журналах та тези шести доповідей на конференціях.

Структура та обсяг дисертації. Дисертація складається зі вступу, огляду літератури, опису методів та результатів досліджень, обговорення результатів, висновків та списку використаних джерел із 247 найменувань. Робота виконана на 142 сторінках та ілюстрована 37 рисунками та двома таблицями.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

У вступі обґрунтовано актуальність дослідження впливу експериментально-індукованого діабету та змін позаклітинного рівня рН на низькопорогові потенціалкеровані кальцієві канали у первинних сенсорних нейронах щурів, сформульовані мета і завдання дослідження, наведено відомості про наукову новизну практичну цінність та апробацію отриманих результатів, публікацію матеріалів дисертації.

Розділ 1. “Огляд літературних даних” присвячений висвітленню відомих аспектів фізіології та патології іонних каналів. Особливу увагу присвячено низькопороговим кальцієвим каналам: історії їх відкриття, загальним характеристикам цих каналів, фармакологічному розподілу на підтипи, іонній селективності, локалізації їх в організмі, розглянуті аспекти модуляції НПКК. Надано основні характеристики нейронів спінальних гангліїв щурів, наведено класифікацію фізіологічних та патологічних станів, що виникають внаслідок змін рН зовнішньоклітинного середовища та відомості про вплив рН на потенціалкеровані кальцієві канали.

Для досягнення поставленої мети у розділі 2 „Матеріали та методи дослідження“ описано використання наступних методичних підходів:

- ферментативне виділення ізольованих сенсорних нейронів спінальних гангліїв щурів;

- метод експериментального моделювання діабету (стрептозотоциніндукований діабет);

- метод фіксації потенціалу в конфігурації “ціла клітина”;

- обробка отриманих результатів досліджень, апроксимація даних.

Ферментативне виділення ізольованих сенсорних нейронів щурів. В експериментах використовували щурів лінії Вістар віком 8-10 тижнів в дослідах по вивченню впливу СТЗ-індукованого діабету на потенціалкеровані кальцієві токи та щурів в віці 3-4 тижні при дослідженні впливу ацидозу на такі токи. Процедура декапітації тварин проводилась у відповідності з вимогами НАН України по використанню експериментальних тварин. Виділялись грудні і поперекові спинномізкові ганглії (СГ). Нейрони СГ ізолювали шляхом піпетування гангліїв після їх ферментативної обробки у базовому зовнішньоклітинному розчині Tyrode (склад розчинів наведений нижче) з додаванням 1мг/мл протеїнази (тип ХХІІІ, Sigma, CША ) і 0,5 мг/мл колагенази (тип IA, Sigma, США) протягом 37 хвилин при температурі 36 оС. Клітини використовували в експерименті протягом 6-8 годин після їх виділення. Контрольні експерименти показали, що ізольовані таким чином нейрони зберігають свої основні характеристики протягом 12 годин. Відбір нейронів для експериментів проводився за такими параметрами: діаметр соми, наявність кальцієвих струмів у відповідь на деполяризацію, а також відсутність великих струмів втрат.

Модель стрептозотоциніндукованого діабету. В наших дослідах стан діабету викликався внутрішньобрюшинною ін’єкцією стрептозотоцину, розчиненого у фізіологічному розчині (ізотонічний розчин 0,9% NaCl для ін’єкцій, Галичфарм, Львів, Україна) в кількості із розрахунку 80 мг на 1 кг тварини. За добу піддослідним щурам проводили ще одну ін’єкцію СТЗ. Щури з СТЗ-індукованим діабетом та контрольні тварини того самого віку утримувались в однакових умовах з однаковим раціоном протягом усього періоду розвитку захворювання. Експерименти проводилися на тваринах через 5-8 тижнів після ін’єкції СТЗ. Концентрацію глюкози в плазмі крові, взятої із хвостової вени, виміряли за допомогою оптичного сенсора глюкози Глюкотрен (Roche Diagnostics Gmb., Mannheim, Німеччина). Із групи щурів з СТЗ-індукованим діабетом бралися тварини з рівнем глюкози в плазмі крові більшим ніж 16 мМ.

Метод фіксації потенціалу в конфігурації “ціла клітина”. Макроскопічні мембранні іонні токи в нейронах спінальних гангліїв реєстрували за допомогою методики “петч-клемп” в конфігурації “ціла клітина”. Експериментальну камеру з клітинами встановлювали на столику інвертованого мікроскопа з оптикою (Zeizz, Німеччина). Скляні мікропіпетки витягувалися на електронній мікрокузні Sutter (США) з капілярів з боросилікатного скла фірми WPI (США). Піпетки мали діаметр кінчика 12 мкм і опір 23 М при заповненні стандартним "внутрішньоклітинним" розчином. Піпетку закріплювали в утримувачі, прикріпленому до передпідсилювача Dagan 3900А, (Dagan Corporation., США). Передпідсилювач розташовувався на мікроманіпуляторі. Заповнену розчином піпетку опускали в позаклітинний розчин і компенсували потенціал на межі розділу фаз розчинів, який в середньому складав 45 мВ. Утворення гігаомного контакту контролювали в режимі фіксації потенціалу, подаючи на мембрану прямокутні гіперполяризуючі імпульси амплітудою -10 мВ. Після утворення щільного контакту піпетки з поверхнею мембрани компенсувалась ємність піпетки щодо зовнішнього розчину. Конфігурацію "ціла клітина" одержували при прориві мембрани під піпеткою, прикладаючи негативний тиск, після чого записували струм ємності у відповідь на гіперполяризуючий імпульс амплітудою 10 мВ. Сигнал на виході підсилювача фільтрували при частоті зрізу 5-10 кГц за допомогою чотирьохполюсного фільтру Бесселя. Комп'ютерна система забезпечувала реєстрацію даних і генерацію командних імпульсів.

Склад розчинів. Базовим позаклітинним розчином, використовуваним для ізолювання нервових клітин був модифікований розчин Тіроде наступного складу (у мМ/л): NaCl – 140, KCl – 2, MgCl2 – 2, CaCl2 – 2, HEPES – 10, глюкоза – 10. Щоб виключити натрієву і калієву провідності, кальцієві струми вимірювалися в позаклітинному розчині такого складу (ммоль/л): хлорид тетраетіламмонія – 100, холин-хлорид – 67, MgCl2 –3.8, СаCl2 – 2, HEPES – 10, KCl – 5.3 глюкоза – 5.6 (рН доводили до необхідних значень розчинами KOH або HCl). Реєструючу піпетку заповнювали внутрішньоклітинним розчином такого складу (ммоль/л): CsCl – 140, HEPES – 10, EGTA – 10, MgATP – 4 (рН доводили розчином CsOH до 7,3).

Обробка отриманих результатів досліджень та апроксимація даних. У всіх експериментах підтримуваний потенціал Vhold дорівнював –80 мВ. Для одержання вольт-амперної характеристики кальцієвих струмів ми використовували наступний протокол: від підтримуваного потенціалу подавалися тестуючи прямокутні імпульси потенціалу Vtest від –60 до 0 мВ з кроком 5 мВ і далі до +50 мВ з кроком 10 мВ. Пікове значення кальцієвого струму будували як функцію від Vtest. Одержану вольт-амперну характеристику (ВАХ) ми апроксимували за допомогою рівняння Больцмана, що описує активацію кальцієвих каналів, в припущенні наявності двох компонентів кальцієвого струму. Рушійна сила описувалася рівнянням постійного поля Гольдмана-Ходжкина-Катца. Також був врахований струм втрат одновалентних катіонів. Нижче приведена загальна формула для апроксимації ВАХ кальцієвих струмів:

де G1,G2 і G3 – максимальні провідності для НПКС, ВПКС і струму втрат відповідно, V1, V2, k1, k2 – потенціали половинної активації і параметри нахилу для НПКС і ВПКС, VCa і VL – потенціали реверсії для іонів Ca2+ і втрат (Cs+), T – абсолютна температура, R – універсальна газова константа, F – постійна Фарадея і z – валентність проникаючих іонів (дорівнює 2 для іонів Ca2+ і 1 для Cs+). Для вимірювання характеристик стаціонарної інактивації кальцієвого струму ми подавали сходинки кондиціонуючих преімпульсів Vcond тривалістю 2,5 сек. значеннями від –120 до –40 мВ з кроком 10 мВ, потім потенціал повертався на 2,5 мсек. до значення –80 мВ і відразу подавався тестуючий потенціал –30 мВ. Пікове значення зміряного при Vtest кальцієвого струму будували як функцію від Vcond. Одержані дані апроксимували рівнянням Больцмана:

, [2]

де I/Imax – відносний струм, Vcond - кондиціонуючий преімпульс, V1/2 – потенціал половинної інактивації, k– параметр нахилу, С – константа.

Постійні часу активації (m) і інактивації (h) для кальцієвих струмів визначали за допомогою апроксимації кривих струмів наступною формулою:

, [3]

де Io – нормалізуючий множник, а Ic – постійна складова струму.

Константа швидкості струму деактивації (d) визначалася з моно- або біекспоненціальної апроксимації деактиваційного струму.

I = Io +I1 exp()+I2 exp(), [4]

де t1, t2 – постійні часу спаду, I1, I2 – амплітудні коефіцієнти.

Криві доза-ефект для рН-залежності НПКТ будували користуючись наступною формулою:

, [5]

де Imax – максимальне асимптотичне значення Т-струму, pKa – значення pH при половинній амплітуді струму і h – коефіцієнт Хілла.

Дані представлені у вигляді середнє ± стандартна помилка. Для оцінки достовірності відмінностей використовувалась величина р, розрахована з використанням t-тесту Стьюдента для незалежних груп спостережень. Критерієм достовірності відмінностей було вибране значення P<0,05.

У третьому розділі “Результати досліджень” експериментально визначені характеристики низькопорогових кальцієвих струмів у нейронах спінальних гангліїв малого та середнього діаметру соми та зміни цих струмів за умов різного рівню зонішньоклітинного рН та експериментально викликаного діабету.

Нейрони СГ малого і середнього розміру соми експресують низькопорогові і високопорогові кальцієві канали, причому НПКК переважають в нейронах середнього розміру. На рис.1 представлений приклад Т-струму в нейроні середнього розміру соми (d=30 мкм; С=49 пФ). Показані перші вісім записів струмів, тому що вони містять тільки низькопорогову компоненту.

На рис. 2 показано вольт-амперну характеристику для нейрона середнього розміру.

Нижче на рис. 3 приведені перші вісім записів, відповідні оригінальним Т-струмам в нейроні малого розміру соми (d=18 мкм; С=15 пФ). Рис. 4 ілюструє відповідну вольт-амперну характеристику інтегрального кальцієвого струму в нейроні малого розміру. При порівняльному аналізі вольт-амперних характеристик кальцієвих струмів в нейронах середнього (рис. 1, 2) і малого розмірів (рис. 3, 4) помітна явна відмінність як в кінетичних властивостях самих кривих запису струму, так і в співвідношенні амплітуд низькопорогових і високопорогових компонент кальцієвих струмів.

У нашій роботі ми не користувалися фармакологічними методами для розділення

кальцієвих струмів через можливий вплив рН на блокатори кальцієвих струмів і ускладнення загальної картини. Тому ми використовували математичний метод розділення НПКС і ВПКС, використовуючи формулу [1] (див. розділ “Методи”). Приклад подібного математичного підходу приведений на рис.5, на якому представлено вольт-амперну характеристику сумарного кальцієвого струму в типовій клітині середнього діаметру і математично одержані компоненти: НПКС – тонка лінія, ВПКС – пунктирна лінія і струм втрат – штрих-пунктирна лінія, що переноситься ймовірно моновалентними катіонами. Сума цих трьох струмів – товста лінія дає якнайкраще наближення до експериментальних даних.

Наступні малюнки рис. 6 та 7 демонструють вплив закислення позаклітинного середовища на вольт-амперні характеристики кальцієвих струмів.

Рис.6 Усереднені вольт-амперні криві щільності кальцієвих струмів в клітинах малого діаметру в розчинах з нормальним рН 7,35 (чорні квадратики) і кислим рН 6,0 (білі кола). |

Рис.7 Усереднені вольт-амперні криві щільності кальцієвих струмів в клітинах середнього діаметру в розчинах з нормальним рН 7,35 (чорні квадратики) і кислим рН 6,0 (білі кола).

На малюнках помітна чітка відмінність в рН-залежності низькопорогових кальцієвих струмів в цих двох підгрупах нейронів. Так, при ацидифікації позаклітинного розчину максимум низькопорогового струму в клітинах середнього діаметру змістився приблизно на 20 мВ у бік позитивного потенціалу і при цьому амплітуда струму зменшилася в 5 разів, в той же час в малих клітинах ацидоз викликав зменшення максимальної амплітуди НПКС всього в 2 рази і зсув максимуму приблизно на 5 мВ у бік позитивного потенціалу.

Після математичного розділення (формула 1) сумарного кальцієвого струму на низькопороговий і високопороговий, ми згрупували клітини по ступеню дії ацидифікації на низькопорогову компоненту. Виявилося, що клітини з сильною рН-залежністю НПКС мають більший розмір соми (середній діаметр D = 33 ± 1 мкм і ємність мембрани С = 60 ± 4.8 пФ (пікофарад) (n=8)) в порівнянні з клітинами із слабкою рН-залежністю НПКС (середній діаметр D = 28 ± 2 мкм і ємність мембрани С = 26 ± 3.6 пФ (n=5)). Вплив ацидозу на параметри активації НПКС в цих двох групах клітин і результати статистичної обробки представлені на рис.8 і 9.

Рис.8 Вплив ацидифікації позаклітинного середовища на потенціал половинної активації низькопорогових кальцієвих каналів з сильною і слабкою чутливістю до позаклітинного рН. |

Рис.9 Вплив ацидифікації позаклітинного середовища на коефіцієнт крутизни нахилу кривої активації низькопорогових кальцієвих каналів з сильною і слабкою чутливістю до позаклітинного рН.

Як видно на рис.8, потенціал половинної активації НПКС зсунувся під впливом ацидозу приблизно на 20 мВ у бік деполяризації для середніх клітин і лише на 5 мВ для малих. Параметр крутизни кривої активації рис.9, також сильніше змінився в середніх клітинах.

Найбільша різниця у дії позаклітинного рН на два типи низькопорогових струмів відображена на Рис.10, на якому показані криві доза-ефект. Щоб оцінити рН-залежність Т-струмів в клітинах малого і середнього діаметру, ми будували вольт-амперні криві кальцієвих струмів в розчинах з позаклітинним рН рівним 6.0, 6.5, 7.35, 8.0 і 8.5. Максимум Т-струму при даному значенні рН нормалізували до значення максимуму при рН 7.35. Криві Хілла будувалися через середні значення, одержані для декількох клітин, згрупованих за розмірами (ємністю мембрани). Значення рКа і коефіцієнти Хілла h, одержані при апроксимації експериментальних даних дорівнювали 6.6 ± 0.02 і 0.94 ± 0.04 (n=5) для клітин середнього розміру і 7.9 ± 0.04 і 0.25 ± 0.1 (n=4) для клітин малого розміру відповідно.

Рис.10 Криві залежностей доза-ефект для середніх клітин (білі кола) і для малих клітин (чорні квадратики). Значення коефіцієнтів Хілла h і рКа, одержані при апроксимації експериментальних даних за формулою [5].

Таким чином, зміна позаклітинного рН сильніше впливає на Т-канали в клітинах середнього діаметру поблизу нейтрального значення рН 7.35. Оскільки коефіцієнт Хілла близький до одиниці і значення рКа зсунуте у бік кислих значень рН відбувається сильне блокування Т-струмів при ацидозі. У протилежність цьому, Т-канали в маленьких клітинах мають мале значення коефіцієнта Хілла і значення рКа зсунуто у бік лужних значень рН, що приводить до відносно слабкого пригнічення струмів через ці канали при ацидифікації.

Рис.11 Вплив позаклітинної ацидифікації на стаціонарну інактивацію НПКС в клітинах середнього розміру. |

Рис.12 Вплив позаклітинної ацидифікації на стаціонарну інактивацію НПКС в клітинах малого розміру.

Зовнішньоклітинна ацидифікація також по різному впливає на стаціонарну інактивацію НПКС. На рис.11 і 12 представлено вплив позаклітинної ацидифікації на криві стаціонарної інактивації низькопорогових струмів, зареєстрованих в клітинах з сильною та слабкою рН чутливістю Т-струмів відповідно. Позаклітинна ацидифікація до значення рН 6.0 зменшувала амплітуду Т-струму, призводила до зміщення кривої стаціонарної інактивації праворуч і зменшувала її крутизну. На рис.11 А і Б показано сімейство кривих Т-струму, знятих в типовій клітині середнього розміру при рН 7.35 і 6.0, згідно протоколу, що наведений у Методах. На рис.11В Т-струми від 8 нейронів середнього розміру нормалізовані до максимального значення для кожного з нейронів, усереднені і відносне середнє значення побудоване як функція потенціалу преімпульсу і потім апроксимоване функцією розподілу Больцмана (суцільні лінії). Потенціал половинної інактивації V1/2 inact зсунувся з -69 мВ при рН 7.35 до -57 мВ при рН 6.0 із значною зміною параметра крутизни (5.4 мВ при рН 7.35 і 7.6 мВ при рН 6.0, n=8, P<0.01). В нейроні малого розміру V1/2 inact зсунувся з -80.5 мВ при рН 7.35 до -70.5 мВ при рН 6.0, також ацидоз привів до зміни параметра крутизни, але у меншій мірі, ніж для нейронів середнього діаметру (4.6 мВ при рН 7.35 і 5.0 мВ при рН 6.0, n=4, P<0.05). Крім відмінностей в параметрах стаціонарної інактивації, Т-струми в середніх та малих клітинах також відрізняються кінетичними властивостями.

Рис.13 Кінетичні властивості двох типових Т-струмів, знятих в клітинах з сильною (суцільна лінія) і слабкою (пунктирна лінія) рН-чутливістю.

Кінетичні властивості двох типових Т-струмів, знятих в клітинах з сильною і слабкою рН-чутливістю, показані на рис.13. Підтримуваний і тестуючий потенціали були відповідно -80 мВ і -30 мВ. Легко помітити, що Т-струми, зареєстровані в клітинах з сильною рН чутливістю, набагато скоріше інактивуються і деактивуються, ніж в клітинах зі слабкою рН-чутливістю.

Залежність кінетичних пара-метрів активації і інактивації Т-струмів від тестуючих потенціалів (Vtest) в нормі і при ацидозі для нейронів малого і середнього діаметру показано на рис.14 і 15.

Рис.14 Характеристичний час активації низькопорогових струмів в нейронах середнього (А) і малого (Б) розмірів.

Рис.15 Характеристичний час інактивації низькопорогових струмів в нейронах середнього (А) і малого (Б) розмірів.

Крива залежності константи часу активації m від тестуючого потенціалу в клітинах середнього розміру (рис.14А) зсунулася при ацидозі приблизно на 20 мВ у бік деполяризації і стала менш потенціалозалежна. Крім того, в області максимуму вольт-амперної характеристики для Т-струму, при –30 мВ, m зросла приблизно в три рази. На рис. 14Б представлена аналогічна залежність константи часу активації для малих клітин. Як видно з цього малюнка, при ацидозі відбувається зсув залежності у бік деполяризації приблизно на 7 мВ, що узгоджується з гіпотезою екранування поверхневих зарядів протонами водню. При аналізі залежностей константи часу інактивації h від тестуючого потенціалу і позаклітинного значення рН для середніх і малих клітин (рис.15А і Б), можна дійти аналогічних висновків. При ретельному аналізі вольт-амперних кривих ми знайшли “ефект гістерезису”, при якому після повернення клітини в розчин з початковим значенням рН (відмивання) спостерігалося значення амплітуди струму більше, ніж в контролі, у разі переходу із стану алкалозу і відповідно менше, ніж в контролі, при переході із стану ацидозу.

Рис.16 Вольт-амперні криві кальцієвих струмів, зареєстровані в клітині малого розміру при різних значеннях позаклітинного рН..

Приклад “ефекту гістерезису” представлений на рис. 16 і 17. Даний ефект, мабуть, не можна пояснити одним лише екрануванням поверхневого заряду, і він, можливо, пов'язаний з конкурентною взаємодією протонів з іонами кальцію в селективному фільтрі кальцієвого каналу.

Приклад полегшення блоку-вання кальцієвого каналу протонами при переході з розчину з нормальним рН в лужній і подальшому поверненні в контрольний розчин приведений на рис.16 Послідовність дослідів, що проводяться, вказано на легенді в правому верхньому кутку малюнка. Після зняття вольт-амперної характеристики НПКС в контрольному розчині з рН = 7.35 проводилася повна зміна розчину на лужній з рН = 8.0 при цьому відбулося збільшення амплітуди і зсув ВАХ ліворуч. Подальший зсув до рН = 8.5 ще сильніше збільшив амплітуду струму і зсунув ВАХ ще більш ліворуч. Після подальшого відмивання в контрольному розчині з рН = 7.35 амплітуда струму виявилася дещо більшою, ніж в першому контролі і дещо зсунута вліво. При подальшому закислені розчину до рН = 6.5 і 6.0 спостерігалося зменшення низькопорогового струму з незначним зсувом ВАХ праворуч.

Рис.17 Вольт-амперні криві кальцієвих струмів, зареєстровані в клітині малого розміру при ацидозі і нормальному значенні позаклітинного рН

Приклад залишкового блокування кальцієвого каналу протонами при переході з розчину з нормальним рН в кислий розчин, і подальшому поверненні в контрольний розчин приведений на рис17. Звертає на себе увагу той факт, що високопорогова компонента практично не схильна до “ефекту гістерезису”.

При накладанні кривих стаціонарної активації і інактивації одержують зону їх перетину, в якій струм ще не повністю інактивований, але вже може бути частково активований. У цій зоні потенціалів може існувати стаціонарний струм – так званий “window-струм”. На приведених нижче малюнках 18 і 19 показані збільшені ділянки перетину кривих стаціонарної активації і інактивації для нейронів середнього і малого розміру соми відповідно. Показана область, в якій можливе виникнення “Window-струму”. Суцільними лініями позначені криві при контрольних значеннях позаклітинного рН 7.35, а пунктирними лініями – при ацидозі рН 6.0.

Рис.18 Збільшений фрагмент ділянки можливого виникнення “Window-струму” в нейронах середнього розміру. | Рис.19 Збільшений фрагмент ділянки можливого виникнення “Window-струму” в нейронах малого розміру

У роботі Warre та ін. автори досліджували рекомбінантні низькопорогові канали, що складаються з 1I субодиниць, експресованих в клітини НЕК293. Було встановлено, що швидкість деактивації при –80 мВ явно залежить від ступеня передуючої їй інактивації, досягнутої безпосередньо перед реполяризацією (поверненням потенціалу до –80 мВ), причому, чим більше відбувається інактивація, тим повільніше подальша деактивація. У нашій роботі ми використовували протокол дослідів, аналогічний застосованому у вищезгаданій роботі, для того, щоб досліджувати можливий вплив ступеня інактивації на швидкість деактивації Т-струмів в малих нейронах гангліїв задніх корінців. На верхній частині рис.20 представлений цей протокол експерименту, а на нижній частині - викликані ним Т-струми. Тестові потенціали до – 45 мВ і тривалістю 18, 36, 70, 140, 280 мс прикладалися від підтримуваного потенціалу – 80 мВ. Тривалість реполяризації складала 20 мс після кожного тестового імпульсу. Ми знайшли, що струми деактивації в малих нейронах не можуть бути апроксимованими за допомогою однієї експоненти, і тому ми використовували для цього дві експоненти. На рис.21 представлено взаємовідношення усередненої константи часу спаду і тривалості тестового імпульсу.

Рис.20 Накладені записи низькопорогового кальцієвого струму, викликані деполяризуючим тестуючим потенціалом різної тривалості. |

Рис.21 Залежність усередненої константи часу деактивації від ступеня інактивації, викликаного деполяризуючими імпульсами різної тривалості.

Аналізуючи залежність константи часу деактивації від ступеня інактивації, викликаного деполяризуючими імпульсами різної тривалості і порівнюючи її з даними, одержаними Warre та ін. а також ґрунтуючись на тому, що кінетика деактивації не апроксимувалася за допомогою однієї експоненти, ми зробили висновок, що клітини малого розміру експресують канали Т-типу з кінетичними властивостями, схожими на властивості вищезгаданих клонованих каналів, що складаються з 1I субодиниць.

Вплив СТЗ-діабету на характеристики кальцієвих струмів в первинних сенсорних нейронах. Для виявлення впливу СТЗ-діабету на низькопорогові кальцієві струми в нейронах різного розміру нами було проведено серію експериментів, в яких було отримано наступні дані, приведені на рис.22,

Рис.22 Порівняння щільності низькопорогових кальцієвих струмів в нейронах малого та середнього розміру в контрольній групі тварин і в групі із СТЗ-викликаним діабетом.

де порівнюються густина НПКК в нейронах малого розміру (d=28-30 мкм, C=22-26 пФ) та середнього розміру (d=33-35 мкм, C=44-52 пФ). Як видно з рисунка, СТЗ-діабет суттєво впливає на НПКС в сенсорних нейронах середнього розміру соми і майже не змінює струми в маленьких нейронах. Це добре узгоджується зі змінами при ацидозі і, мабуть, може призводити до поглиблення ефекту при одночасній наявності обох патологічних станів.

Обговорення. Відкриття молекулярної основи каналів Т-типу дозволило досліджувати їх експресію гістологічними методами і розділити на три основні підгрупи CaV3.1, CaV3.2 и CaV3.3. (Talley et al. 1999) спостерігали високий рівень мРНК CaV3.2 і середню кількість CaV3.3 в нейронах середнього розміру соми. У дослідженнях (Shin et al., 2003) було зроблено висновок, що малі клітини, як правило, є ноцицепторами, середні клітини можуть бути як ноцицепторами, так і низькопороговими механорецепторами, а великі клітини в основному є механорецепторами.

Більшість дослідників віддає перевагу ідеї про залучення каналів Т-типу до больової чутливості в периферичній нервовій системі. Ця ідея ґрунтується на припущенні, що нейрони, що експресують значний Т-струм, є ноцицепторами і модулюють ноцицептивну передачу в спинний мозок. На підтримку цієї гіпотези багато фармакологічних досліджень показали, що високі дози блокатора каналів Т-типу мібефраділа реверсують поведінкові реакції у відповідь на сильні механічні і термічні дії у тварин з експериментальною моделлю гіпералгезії. Також при блокуванні експресії каналів субодиниці CaV3.2 зменшувалася амплітуда НПКС, що приводило до антиноцицептивного і антигіпералгезічного ефектів.

У даній роботі ми показали, що первинні сенсорні нейрони мають як мінімум два типи низькопорогових Са2+ каналів. Ці канали відрізняються між собою рН чутливістю і кінетичними характеристиками. Ми виявили, що нейрони гангліїв задніх корінців малого діаметру переважно мають НПКК із слабкою рН чутливістю, в той час як нейрони середнього діаметру - з сильною. Також ми виявили, що канали із слабкою рН чутливістю мають повільнішу кінетику інактивації і деактивації, чим канали з сильною рН чутливістю.

Як відомо з літературних джерел, в нейронах ЗКГ експресуються чимало кальцієвих каналів, як низькопорогових, так і високопорогових. Нам вдалося математично розділити інтегральний кальцієвий струм на одну низькопорогову і одну високопорогову компоненти без використання специфічних блокаторов кальцієвих струмів. Адекватність такого підходу можна аргументувати достатньою апроксимацією отриманих нами даних і аналогічним підходом до моделювання інтегрального високопорогового струму в неокортикальних нейронах щурів в роботі (Brown et al. 1993) зроблено висновок, що високопороговий струм можна моделювати однією компонентою, незважаючи на наявність декількох фармакологічно різних компонент.

З метою прояснення можливого субодиничного складу НПКК ми порівняли наші дані з даними інших авторів (Delisle 2000, Talavera et al 2003). Було знайдено, що нативні Т-канали з високою рН чутливістю схожі з рекомбінантними каналами CaV3.2 типу по кінетичним характеристикам і впливу позаклітинної ацидифікації на потенціал половинної активації, але, у разі нативних каналів, ми спостерігали сильніший вплив ацидозу на останній параметр.

Наскільки нам відомо, ще немає публікацій, що стосуються впливу позаклітинного рН на CaV3.3 субодиницю НПКК. Кінетика інактівациі нативних каналів Т-типу із слабкою рН чутливістю близька кінетиці інактівації рекомбінантних каналів CaV3.2, але у разі нативних каналів кінетика деактивації виявилась набагато повільнішою.

Можливе фізіологічне значення результатів наших досліджень можна розглядати з погляду ноцицепції. Як відомо, первинні сенсорні нейрони різних розмірів відповідальні за генерування і проведення сигналів різної модальності. Малі нейрони отримують і передають переважно ноцицептивні сигнали, а нейрони середнього і великого розміру обробляють і передають пропріоцептивні сигнали. При різних патологічних станах, що приводять до стану ацидозу, різна рН чутливість низькопорогових каналів, експресованих в цих нейронах, може приводити до зрушення загальної модальності сигналу у бік ноцицептивних змін, що, у свою чергу, веде до розвитку нейропатій.

Зміни у фізіологічному діапазоні рН можуть бути сигналом для передачі інформації в інші структури, проте в умовах патологій значна зміна рН може істотно впливати на подальшу долю клітини. Незначний ацидоз надає гальмуючий ефект на струми через НМДА, АМПА і потенціалкеровані Са2+ канали. Цей ефект діє як нейропротектор внаслідок зменшення входу кальцію в клітину, що може її пошкодити при гіпоксії або ішемії. Проте, існує багато публікацій, що суперечать цьому твердженню, і постулюють, що сильний або навіть слабкий ацидоз є нейротоксичним по суті.

Дослідження in vivo демонструють, що гіперкапнія або гіперглікемія підсилюють нейротоксичне пошкодження. Для пояснення підсилюючої дії ацидозу на пошкодження мозку, було запропоновано декілька механізмів. Такі як: а) ацидоз сприяє утворенню вільних радикалів; б) ацидоз пригнічує гліколіз і тим самим прискорює виснаження запасів АТФ; в) ацидоз пригноблює метаболізм мітохондрій; г) ацидоз збільшує нейротоксичність, опосередковану АМПА рецепторами.

У роботі (McCallum et al, 2003) вивчався вплив нейропатичних пошкоджень на НПКК в нейронах спінальних гангліїв щурів. Було показано, що НПКС істотно зменшувалися при нейропатіях, викликаних хронічним пошкодженням периферичного нерва. Причиною цього, мабуть, були зменшення щільності струму, деполяризаційний зсув потенціалозалежності активації струмів, збільшення швидкості деактивації, а також швидша і повніша інактивація.

Зсув активації при нейропатії призводить до зменшення "window"-струму, що спостерігався при накладенні інактиваційних і активаційних кривих контрольних клітин. Оскільки активність низькопорогових струмів не може бути ізольована в режимі фіксації струму, то внесок низькопорогових кальцієвих струмів в збудливість нейрона досліджувався за допомогою додавання малих доз нікелю або мібефраділа в позаклітинне середовище. Обидва ці блокатори збільшували частоту імпульсації у відповідь на двухсотмілісекундний імпульс струму.

Низькопорогові кальцієві струми вважаються ініціаторами пачкової активності в таламічних релейних нейронах і в клітинах Пуркіньє в мозочку, а також в пейсмекерній активності в передсерді. Проте роль низькопорогових кальцієвих струмів в аферентних нейронах до кінця не з'ясована. Ймовірно, що роль Т-струмів в первинних аферентних нейронах як постачальника внутрішньоклітинного кальцію полягає в уповільненні деактивації в кінці потенціалу дії. Відсутність цього продовженого входу кальцію в пошкоджених нейронах може приводити до підвищеної збудливості.

У статті (Andre et al. 2003) було виявлено, що після аксотомії нервів сенсорних нейронів відбувалося істотне зменшення низькопорогових струмів в нейронах середнього розміру. Це в деякій мірі відповідає зменшенню низькопорогових струмів в наших дослідах, в нейронах середнього розміру у щурів із СТЗ-діабетом.

Аналізуючи наслідки змін активності низькопорогових кальцієвих струмів при діабетичній нейропатії і їх можливої участі в передачі больового сигналу, можна припустити, що: при нейропатіях зміни спостерігаються лише з боку Т-струмів, які швидко інактивуються, тоді