ХАРКІВСЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ

імені В. Н. КАРАЗІНА

ШАХОВА ОЛЕНА ГРИГОРІВНА

УДК 612.66: 615.322: [577.125+612.357]

ВІКОВІ ОСОБЛИВОСТІ МОДУЛЯЦІЇ ОБМІНУ ЛІПІДІВ ТА ЗОВНІШНЬОСЕКРЕТОРНОЇ ФУНКЦІЇ ПЕЧІНКИ ЩУРІВ ФЛАВОНОЇДАМИ

03.00.13 - фізіологія людини і тварин

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Харків - 2007

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Харківському національному університеті імені В. Н. Каразіна Міністерства освіти і науки України (м. Харків).

Науковий керівник -

Офіційні опоненти:

Провідна установа - | доктор біологічних наук, старший науковий співробітник

Бабенко Наталія Олексіївна,

Харківський національний університет

імені В. Н. Каразіна МОН України, завідувач відділу фізіології онтогенезу Науково-дослідного інституту біології

доктор біологічних наук, професор

Бондаренко Тетяна Петрівна,

Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України, завідувач відділу кріобіохімії і фармакології нейрогуморальних систем

доктор медичних наук, професор

Давидов Вадим В’ячеславович,

Інститут охорони здоров’я дітей та підлітків АМН України, завідувач лабораторії вікової ендокринології та обміну речовин

Інститут геронтології АМН України (лабораторія регуляції метаболізму), м. Київ

Захист відбудеться “6” березня 2007 р. о 14 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д .051.17 Харківського національного університету імені В. Н. Каразіна (61077, м. Харків, пл. Свободи, 4, ауд. III-15).

З дисертацією можна ознайомитись у Центральній науковій бібліотеці Харківського національного університету імені В. Н. Каразіна за адресою: 61077, м. Харків, пл. Свободи, 4.

Автореферат розісланий “29” січня 2007 р.

Учений секретар

спеціалізованої вченої ради В. І. Падалко

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Останніми десятиріччями інтенсивно розвивається уявлення про те, що ліпіди є не тільки структурними компонентами клітинних мембран і ліпідних рафтів, але й залучені до регуляції таких важливих фізіологічних функцій клітин, як секреція, эндоцитоз, мембранний транспорт та ін. [Abdel-Latif, 1986; Kogteva, 1998; van Blitterswik і співавт., 2003].

Відомо, що на пізніх етапах онтогенезу в метаболізмі ліпідів відбуваються істотні зміни. Відзначають модифікації жирнокислотного складу ліпідів різних субклітинних фракцій [Alvares і співавт., 1993; Кульчицкий і співавт, 2001, 2004], падіння швидкості ацильного обміну [Бабенко, 1991; Никитин і співавт., 1992], порушення метаболізму гліцероліпідів (фосфатидилхоліну (ФХ), триацилгліцеринів (ТГ) та ін.), холестеролу (ХС) і жовчних кислот (ЖОК) [Bose і співавт, 2005; Mulas і співавт, 2005; Pessayre, ]. Відомо, що ХС є попередником ЖОК – фізіологічних регуляторів зовнішньосекреторної функції печінки [Синельник і співавт., 2003]. Порушення обміну ХС і утворення ЖОК у старості, поряд із зниженням транспортної здатності каналікулярних мембран гепатоцитів, вважають важливими причинами порушення процесів жовчоутворення і жовчовиділення [Uchida і співавт., 1990; Hashimoto і співавт., 2001].

Результати досліджень останніх років свідчать про більш активний обмін сфінголіпідів (СФЛ) у старих щурів у порівнянні з молодими [Lightle і співавт., 2000] і акумуляцію церамідів та сфінгозину в деяких тканинах і клітинах при старінні [Giusto і співавт., 1992; Lightle і співавт., 2000]. Вважають, що цераміди відіграють важливу роль в індукції процесів, характерних для старіння клітин: додавання цих ліпідів до культури тканини викликає експресію в-галактозидази, дефосфорилювання продукту гена ретинобластоми, інгібування теломерази, синтезу ДНК і мітогенезу [Venable і співавт., 1999; Cutler і співавт., 2001; Hannun і співавт., 2002].

Вважають, що зміна метаболізму ліпідів в організмі людини і експериментальних тварин у процесі старіння може лежати в основі розвитку жовчнокам’яної хвороби, цукрового діабету, кардіоваскулярних і нейродегенеративних захворювань [Lightle і співавт., 2000; Unger, 2002; Кульчицкий і співавт., 2004; Cutler і співавт., 2004; Statford і співавт., 2004]. Означене вище, а також зниження при старінні детоксикаційної функції печінки і підвищення частоти розвитку побічних реакцій при використанні хіміотерапевтичних засобів [McLean і співавт., 2004] визначають актуальність пошуку фізіологічних шляхів корекції вікових порушень обміну ліпідів і зовнішньосекреторної функції печінки. Особливу увагу дослідників привертають флавоноїди — природні фенольні сполуки, широко розповсюджені в рослинному світі [Middleton і співавт., 2000]. Постійне надходження флавоноїдів до організму людини і тварин у складі рослинної їжі в процесі еволюції зумовило широкий спектр біологічної активності цих сполук. Встановлено, що флавоноїди здатні модулювати фізіологічні функції клітин (секрецію, міжклітинні взаємодії, мітогенез та ін.) шляхом регулювання активності ферментів, які залучені до реалізації цих процесів [Барабой, 1976; Middleton і співавт., 2000; Nijveldt і співавт., 2001]. Результати ряду досліджень свідчать про те, що флавоноїди нормалізують обмін нейтральних ліпідів у організмі людини і тварин при його порушенні у процесі старіння [Nijveldt і співавт., 2001; Bastianetto і співавт., 2002] і при експериментальній патології [Zern і співавт., 2003; Martins і співавт., 2005]. Флавоноїди знижують синтез ліпідів, їх циркуляцію, реабсорбцію у кишечнику, а також посилюють катаболізм нейтральних ліпідів [Crocenzi і співавт., 2000; Wood, 2004; Huang і співавт., 2005]. Відомо також, що флавоноїди є інгібіторами продукції цитокінів (IL-в, TNF-б), регуляторами редокс-статусу клітини і рівня глутатіону - факторів, які модулюють активність сфінгомієліназ (СМАЗ) [Hougee і співавт., 2005; Singab і співавт., 2005]. Ці дані дають підставу припустити участь флавоноїдів у регуляції сфінгомієлінового циклу. Проте механізми реалізації біологічних ефектів флавоноїдів багато в чому невідомі, даних про вікові аспекти впливу флавоноїдів на обмін ліпідів і функціональний стан печінки в літературі недостатньо, а вплив флавоноїдів на обмін сфінголіпідів практично не вивчався.

З огляду на важливу роль порушення метаболізму ліпідів у зниженні функціональної активності печінки при старінні і зважаючи на здатність флавоноїдів регулювати обмін ліпідів, видається актуальним вивчення вікових аспектів модуляції вмісту й обміну ФХ, ХС, СФЛ і нейтральних ліпідів, а також зовнішньосекреторної функції печінки щурів флавоноїдами.

У роботі використовували флавоноїди Chamomilla recutita: камілофлан, який являє собою комплекс найбільш розповсюджених флавоноїдів (апігенін, апігенін-7-глюкозид (АП-7-ГЛ), лютеолін, лютеолін-7-глюкозид, ізорамнетин, кверцетин, герніарин та ін.), а також основний компонент камілофлану - АП-7-ГЛ.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота виконана у відділі фізіології онтогенезу НДІ біології Харківського національного університету імені В.Н. Каразіна в рамках науково-дослідної роботи “Дослідження механізму розвитку резистентності клітин до дії регуляторних сигналів при старінні” (№ держреєстрації: 0103U004275).

Мета і завдання дослідження. Метою дослідження було встановлення вікових особливостей вмісту і обміну гліцероліпідів, сфінголіпідів, холестеролу, жовчних кислот та зовнішньосекреторної функції печінки щурів лінії Вістар, а також корекція експериментальних порушень і вікових змін функціонального стану печінки за допомогою флавоноїдів. Відповідно до мети було поставлено такі завдання:— 

провести дослідження вікових особливостей вмісту і обміну гліцеро-, сфінголіпідів і холестеролу в печінці та ізольованих гепатоцитах щурів;— 

з’ясувати вплив флавоноїдів Chamomilla recutita на вміст і обмін ліпідів у печінці шурів 3-, 24 і 27-28-місячного віку;— 

установити роль флавоноїдів Chamomilla recutita в елімінації ХС із організму через гепатобіліарний тракт і з’ясувати вплив цих сполук на зовнішньосекреторну функцію печінки щурів 3- і 24-місячного віку;— 

вивчити вміст ліпідів і функціональний стан печінки щурів 3- і 24-місячного віку в умовах експериментального стеатозу, індукованого чотирихлористим вуглецем (CCl4), і при його корекції флавоноїдами Chamomilla recutita;— 

вивчити вміст і обмін сфінголіпідів у печінці щурів 3-місячного віку в умовах експериментального стеатозу і при його корекції флавоноїдами Chamomilla recutita.

Об'єкт дослідження. Модуляція вікових змін і експериментальних порушень обміну ліпідів та функціонального стану печінки щурів флавоноїдами.

Предмет дослідження. Вміст і обмін ліпідів у печінці та ізольованих гепатоцитах, секреція жовчі, вміст ХС і ЖОК у жовчі щурів різного віку.

Методи дослідження: фізіологічні (дослідження зовнішньосекреторної функції печінки), хроматографічні (розподіл ліпідів на класи), спектрофотометричні (визначення вмісту ліпідів, ферментів, білірубіну, жовчних кислот і білка), радіоізотопні (включення 14С-мічених попередників до складу ендогенних ліпідів), гістологічні (вивчення гістоструктури тканини печінки), статистичні (критерій Вілкоксона-Манна-Уїтні й t-критерій Стьюдента – при порівнянні двох груп, критерій Крускала-Уоліса і дисперсійний аналіз - при множинних порівняннях).

Наукова новизна отриманих результатів. Установлено вікові особливості вмісту і обміну гліцеро-, сфінголіпідів, холестеролу, жовчних кислот та зовнішньосекреторної функції печінки самців щурів лінії Вістар, а також модулюючу дію флавоноїдів Chamomilla recutita на функціональний стан печінки, змінений з віком і експериментально. Встановлено, що з віком у печінці щурів відбувається змінення обміну СФЛ, що виявляється в прогресуючому підвищенні вмісту церамідів і зниженні вмісту СФМ за рахунок активації СМАЗ. З’ясовано, що флавоноїди Chamomilla recutita знижують вміст церамідів у печінці старих щурів до рівня молодих тварин шляхом інгібування сфінгомієліназної активності.

Доведено, що, не впливаючи на вміст досліджуваних ліпідів у печінці 3-місячних щурів, камілофлан знижує підвищений з віком вміст ХС і вільних жирних кислот (ВЖК) і підвищує вміст ФХ у печінці 24-місячних тварин. Ефект флавоноїдів на вміст ФХ і ВЖК відбувається за рахунок стимуляції в печінці старих тварин синтезу ФХ de novo, активації процесів ацилювання і синтезу загальних фосфоліпідів (ФЛ), а також попередників ФЛ — діацилгліцеринів (ДАГ). Зниження вмісту ХС у печінці старих щурів під дією камілофлану відбувається шляхом інгібування біосинтезу цього ліпіду, посилення його перетворення в жовчні кислоти і виведення з жовчю.

Встановлено зниження з віком зовнішньосекреторної функції печінки самців щурів лінії Вістар, що виявляється в зменшенні біліарної екскреції жовчних кислот і холестеролу. Камілофлан чинить стимулюючий вплив на холерез як у молодих, так і у старих щурів, підсилюючи біліарну екскрецію жовчних кислот. Разом з тим камілофлан стимулює виведення з жовчю холестеролу в старих тварин, не впливаючи на його біліарну екскрецію в молодих щурів.

Доведено, що експериментальний стеатоз, індукований CCl4, супроводжується накопиченням церамідів у печінці 3-місячних щурів, яке відбувається за рахунок підвищення сфінгомієліназної та інгібування церамідазної активності печінки. Флавоноїди Chamomilla recutita нормалізують обмін СФЛ і перешкоджають надлишковій продукції й накопиченню церамідів у печінці молодих щурів в умовах стеатозу шляхом зниження сфінгомієліназної і підвищення церамідазної активності печінки.

Теоретичне i практичне значення отриманих результатів. Отримані в роботі дані про зміни обміну СФЛ у печінці щурів при старінні та за умов моделювання експериментального стеатозу, індукованого CCl4, сприятимуть розвитку сучасних уявлень про роль СФЛ у процесах старіння та у реалізації токсичності CCl4.

Дані про зниження флавоноїдами Chamomilla recutita утворення церамідів і про їх стимулюючий вплив на синтез ФЛ, катаболізм ХС і екскрецію ЖОК сприятимуть розумінню шляхів дії флавоноїдів на обмін ліпідів і зовнішньосекреторну функцію печінки.

Установлене в роботі зменшення секреції ЖОК і ХС із жовчю старих щурів, у порівнянні з молодими тваринами, свідчить на користь уявлень про зниження екскреторної функції печінки цих тварин з віком.

Виявлені в дослідженнях вікові особливості модуляції метаболізму ліпідів і зовнішньосекреторної функції печінки щурів флавоноїдами можуть бути основою для подальшого вивчення впливу флавоноїдів на фізіологічні функції тварин різного віку.

Використання даних про корекцію обміну ліпідів і зовнішньосекреторної функції печінки флавоноїдами Chamomilla recutita у клініці і дієтології сприятиме підвищенню ефективності комплексної терапії токсичних уражень печінки і захворювань, пов‘язаних із порушеннями обміну ліпідів.

Особистий внесок здобувача. Разом з науковим керівником обрано об'єкт і предмет дослідження, визначено мету, завдання і тему дисертаційної роботи, інтерпретовано отримані результати. Автор самостійно здійснив аналіз наукової літератури, виконав експериментальні дослідження, оформив та підготував матеріали до публікації.

Апробація результатів. Основні положення дисертаційної роботи були представлені на І Національному з’їзді фармакологів України “Сучасні проблеми фармакології” (Полтава, 1995 р.); V Національному з’їзді фармацевтів України “Досягнення сучасної фармації та перспективи її розвитку у новому тисячолітті” (Харків, 1999 р.); IV, VI і VII Міжнародних симпозіумах “Биологические механизмы старения” (Харків, , 2004, 2006 р.); ІІ Міжнародній науково-практичній конференції “Динаміка наукових досліджень 2003” (Дніпропетровськ, 2003 р.); Установчому з’їзді Українського товариства клітинної біології (Львів, 2004 р.); ІІІ Львівсько-Люблінській конференції з експериментальної та клінічної біохімії (Львів, 2004 р.); 5th Parnas Conference “Molecular mechanisms of cellular signaling”, April 26-29 (Kyiv, 2005 р.); конференції “Сучасні проблеми медичної та клінічної біохімії” (Чернівці, 2005 р.); IV Національному конгресі геронтологів та геріатрів України (Київ, 2005 р.).

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 15 наукових робіт, з яких 7 - статті (3 - у фахових наукових журналах) і 8 - тези доповідей у збірниках матеріалів конференцій. Публікації повністю відображують основний зміст дисертаційної роботи.

Структура та обсяг дисертації. Дисертація викладена на 158 сторінках друкованого тексту і містить вступ, огляд літератури, опис матеріалів і методів дослідження, три розділи власних досліджень, заключну частину, висновки і список наукових джерел. Роботу ілюстровано 15 таблицями і 23 рисунками. Список літератури складається з 297 найменувань та займає 30 сторінок.

ОБ'ЄКТ, МАТЕРІАЛИ та МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ

В експериментах використовували самців щурів лінії Вістар 3-, 24- і 27-28- місячного віку масою 180-250 і 350-450 г. Дослідження проводили відповідно до вимог “Європейської конвенції про захист хребетних тварин, що використовуються в експериментальних та інших наукових цілях” (Страсбург, 1985). Знеживленя тварин здійснювали під ефірним наркозом. Печінку тварин перфузували 0,9розчином NaCl, гомогенат тканини отримували шляхом продавлення печінки через перфоровану платівку з діаметром отворів 0,3 мм. Нативність ізольованих гепатоцитів, які було виділено за методом Канаевой і співавт. (1975) у модифікації Петренка і співавт. (1991), оцінювали загальновживаним методом за допомогою трипанового синього. Життєздатні клітини становили 85-95від їх загальної кількості. Гепатоцити ресуспендували (до концентрації 6·106 клітин в  мл) у середовищі Ігла (рН ,4), що містило 25 мМЕРЕS, пеніцилін (61 мг/л) і стрептоміцин (100 мг/л), та інкубували при 37оС із флавоноїдами (камілофлан 500 мкг/мл, АП-7-ГЛ  мкM/л) протягом 4 або 24-х годин. В окремих випадках до гепатоцитів, передінкубованих протягом 2-х годин з флавоноїдами або без них, додавали CСl4 (40 мM/л), після чого клітини інкубували ще 2 години.

При вивченні синтезу ФЛ і ХС у печінці щурів використовували [14С]Н3COONa (5,18 МБк/мл) і флавоноїди у концентраціях, які були вказані вище. При визначенні сфінгомієліназної активності печінки інкубаційна суміш містила 50 мМ ацетатний буфер (рН ,0) або 50 мМ трис-HCl-буфер (рН ,35), у які додавали 1 мМ ЕДТА, 10 мМ2, 2 мМN-метил-14С]СФМ (2,15 ГБк/мМ) або попередньо мічений [14С]пальмітиновою кислотою (370 КБк/мл) СФМ [Petkova, 1986]. Гомогенат інкубували протягом 1 год у присутності флавоноїдів (камілофлан - 500 мкг/мл, АП-7-ГЛ - 30 мкМ/л) або без них. Сфінгомієліназну активність печінки оцінювали за переходом мітки у вигляді [N-метил-14С]фосфорилхоліну у водно-метанольну фазу після екстракції ліпідів (при використанні [N-метил-14С]СФМ) і за зменшенням [14С]СФМ та зростанням [14С]церамідів (при використанні [14С]СФМ). При вивченні обміну СФЛ гомогенат печінки інкубували в присутності флавоноїдів у 50 мМ трис-HCl-буфері (рН 7,4), який містив 0,25 М сахарозу, 0,15 мМ КCl і [14С]церамід. Церамідазну активність оцінювали за утворенням [14С]сфінгозину, СФМ-синтазну активність — за перетворенням [14С]цераміду в [14С]СФМ. Крім того, вплив флавоноїдів на обмін СФЛ вивчали на ізольованих гепатоцитах, при цьому інкубаційна суміш містила [14С]серин (370 КБк/мл) [Messmer, 1989]. Радіоактивність зразків визначали за допомогою лічильника радіоактивності БЕТА-1 (“Медприбор”, Київ).

Вивчення вмісту гліцеро- і сфінголіпідів та їх обміну в печінці тварин в умовах експериментального стеатозу і при його корекції флавоноїдами проводили, використовуючи модель гострого та хронічного токсичного ураження CСl4 [Скакун, 1998]. Ліпіди екстрагували за методом Bligh i Dyer (1959). Розподіл ліпідів на фракції проводили методом тонкошарової хроматографії в силікагелі Wоеlm, використовуючи системи розчинників: для ДАГ, ХС, ВЖК, ТГ і загальних ФЛ - гексан: діетиловий ефір: оцтова кислота (73:25:2, за об’ємом), для СФЛ – 1) діетиловий ефір, 2) хлороформ: метанол: вода (40:10:1, за об’ємом) [Кейтс, 1975]. Плями ДАГ, ХС, ВЖК, ТГ і ФЛ проявляли в парах йоду, сфінгозину — в 3розчину нінгідрину в бутанолі, після чого ідентифікували порівнянням зі стандартами. Вміст ліпідів у пробах визначали за методом March i Weinstein (1966), вміст білка - за методом Lowry і співавт. (1951).

Дослідження зовнішньосекреторної функції печінки щурів проводили за методом Дроговоз і співавт. (1994). Холеретичний ефект флавоноїдів оцінювали за швидкістю секреції жовчі за кожну годину спостереження (мл/год) і за загальною кількістю жовчі за увесь час досліду (мл/4 год). У жовчі визначали концентрацію холестерину й загальний вміст жовчних кислот за методом Громашевської і співавт. (1998). Світлооптичне дослідження гістоструктури тканини печінки проводили за методами Меркулова (1969). Морфологічні ознаки патологічного процесу в печінці (стеатоз, некроз, регенерація) оцінювали, використовуючи чотирибальну систему: 0 балів – відсутність ознаки, 1 бал – слабо виражена ознака, 2 бали - помірно виражена ознака, 3 бали – виражена ознака, 4 бали – різко виражена ознака [Автандилов і співав., 1981].

При аналізі отриманих даних використовували критерії Вілкоксона-Манна-Уїтні, Крускала-Уоліса, t-критерій Стьюдента i дисперсійний аналіз (ANOVA, критерій Turkey й Fisher LSD –

У роботі було використано: [N-метил-14С]СФМ (2,15 ГБк/мМ, “Amersham”, Англія), [14C]пальмітинову кислоту (2,22 ГБк/мМ, “Amersham”, Англія), [14С]серин (860 ГБк/М, Росія), [14С]H3COONa (1,7ТБк/М, Росія), Тритон Х-100, HEPES, трипановий синій (“Serva”, Німеччина), дитіотрейтол, силікагель (“Woelm”, Німеччина), стандартні набори реактивів фірми “LACHEMA” (Чехія). Також застосовували сахарозу, ЕДТА й інші реактиви вітчизняного виробництва кваліфікації х.ч. Флавоноїди, виділені з Chamomilla recutita (камілофлан, АП-7-ГЛ, ЛЮ-7-ГЛ), були надані ДП “Державний науковий центр лікарських засобів” м. Харкова.

ОСНОВНІ РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

Вікові особливості модуляції вмісту і обміну гліцероліпідів та холестеролу в печінці щурів флавоноїдами Chamomilla recutita. У поданій роботі встановлено підвищення вмісту ВЖК і ХС, а також зниження вмісту ФХ в печінці 24-місячних тварин у порівнянні з 3-місячними (табл. ).

Таблиця 

Вікові особливості впливу камілофлану на вміст ВЖК, ФХ і ХС у печінці щурів, нмоль/мг білка (Мm, n = 6)

Вік тварин, міс. | Ліпіди | Умови експерименту | Контроль | Камілофлан | 3 | ВЖК | 24,622,23 | 23,331,11 | ФХ | 92,778,83 | 87,884,91 | ХС | 12,161,57 | 15,831,27 | 24 | ВЖК | 35,332,04** | 23,771,12* | ФХ | 59,665,32** | 97,263,04* | ХС | 34,284,59** | 14,921,47* | Примітка. * - вірогідно щодо контролю, р<0,01; ** - вірогідно стосовно тварин 24-місячного віку, р<0,02.

Виявлено, що флавоноїди камілофлану при багаторазовому внутрішньошлунковому введенні не впливають на вміст досліджуваних ліпідів у печінці 3-місячних щурів і модулюють змінений з віком рівень ХС, ВЖК і ФХ у печінці 24-місячних тварин (табл. ). Важливими причинами підвищення вмісту ФХ і зниження рівня ВЖК під впливом флавоноїдів є активація в печінці старих тварин процесів ацилювання й синтезу загальних ФЛ і попередників ФЛ – ДАГ (рис. 1 А), а також стимуляція синтезу ФХ de novo (рис. 1 Б). Водночас у зменшення під дією камілофлану вмісту ХС у печінці старих щурів залучене зниження біосинтезу цього ліпіду (рис. 1 Б). Той факт, що синтез холестеролу знижується і під впливом камілофлану, і за умов дії його головного компонента – АП-7-ГЛ дозволяє припустити, що у даному випадку ефект камілофлану опосередкований впливом АП-7-ГЛ.

Рис. 1. Вплив флавоноїдів на утворення [14С]ліпідів: А – у ізольованих гепатоцитах (попередник - олеїнова кислота), Б - у печінці (попередник - СH3COONa) 24-місячних щурів.

Примітка. * - вірогідно щодо контролю, р<0,05.

Відомо, що деякі флавоноїди (кверцетин, мірицетин, кемпферол та ін.) чинять істотний регулюючий вплив на ключові ферменти обміну стеролів в організмі людини й тварин [Zern і співавт., 2003]. Для дослідження можливого стимулюючого впливу камілофлану на обмін ХС, його перетворення в ЖОК і виведення з організму тварин у складі жовчі вивчали інтенсивність жовчовиділення, вміст ХС і ЖОК у жовчі щурів 3- і 24-місячного віку на тлі введення камілофлану.

Вікові особливості модуляції зовнішньосекреторної функції печінки щурів флавоноїдами Chamomilla recutita. Встановлено, що у 24-місячних тварин, у порівнянні з 3-місячними, відбувається зниження зовнішньосекреторної функції печінки, яке проявляється у зменшенні біліарної екскреції ЖОК і ХС. Так, концентрація ЖОК у жовчі молодих щурів складала 1159,3  56,18 мг%, тоді як у старих — 791,9  46,42 мг% (Р < 0,001, n=8), а вміст ХС у жовчі — 36,0  2,78 мг% і 18,1  1,3 мг% (Р < 0,001, n=8), відповідно. Камілофлан при одноразовому інтрадуоденальному введеннi чинить дозозалежний стимулюючий вплив на зовнішньосекреторну функцію печінки щурів обох досліджуваних вікових груп (рис. А), приводячи до збільшення об’єму жовчі та посилення біліарної екскреції жовчних кислот. Камілофлан стимулює виведення ХС із жовчю у старих щурів шляхом підсилення секреції жовчі і збільшення в ній концентрації ХС (рис. 2 Б). Поряд із цим, підвищення об’єму жовчі в молодих щурів під впливом камілофлану супроводжується зниженням у ній концентрації ХС (рис.  Б), що, в остаточному підсумку, не змінює біліарної екскреції ХС у цих тварин.

Рис. 2. Вплив камілофлану на секрецію жовчі (А) і концентрацію ХС у жовчі (Б) щурів різного віку. Примітки: 1. За 100в А прийнято загальну кількість жовчі контрольних тварин кожної вікової групи за 4 години експерименту. 2. * - вірогідно щодо контролю, р<0,05.

Збільшення під впливом камілофлану біліарної екскреції ЖОК може бути пов'язано зі стимуляцією їх утворення із ХС у результаті посилення обміну цього ліпіду. З огляду на той факт, що ЖОК є фізіологічними регуляторами зовнішньосекреторної функції печінки й модулюють транспортні процеси в гепатоцитах, можна припустити, що камілофлан посилює холерез шляхом стимулювання обміну ХС в організмі, підсилення його перетворення в ЖОК і виведення останніх із жовчю.

Вплив флавоноїдів на вміст ліпідів і функціональний стан печінки щурів різного віку в умовах експериментального стеатозу. Відомо, що зниження функціональної активності печінки та порушення обміну нейтральних ліпідів у літньому й старечому віці може супроводжуватися жировою дистрофією печінки Pessayre, ; Unger, , розвитком запалення і формуванням фіброзу Videla, 2004; Unger, 2002. Дані літератури вказують на властивість флавоноїдів модулювати обмін нейтральних ліпідів [Kurowska і співавт., 2004], однак вікові аспекти цього питання вивчені недостатньо.

У ході проведених досліджень встановлено, що введення камілофлану на тлі моделювання експериментального стеатозу сприяє зниженню вмісту ТГ в печінці і 3- і 24-місячних тварин, а також зменшує жирову дистрофію печінки (рис. ). Так, по даним оцінки морфологічних ознак патологічного процесу, стеатоз у печінці тварин, яки отримували CCl4, сягав 3,63 і 4,05 балів, а при введенні CCl4 разом із камілофланом — ,7 і 2,4 бали (Р = ,012) у молодих і старих щурів, відповідно. Як свідчать дані біохімічного дослідження сироватки крові і гістологічного дослідження паренхіми печінки, використання камілофлану на тлі гепатотоксичної дії CCl4 спричиняє більш виражене поліпшення функціонального стану печінки експериментальних тварин, ніж застосування фламіну та сілібору (відомих рослинних флавоноїдних препаратів із гепатозахистною дією), і стимулювання репаративної регенерації ушкодженої паренхіми печінки.

Рис. . Мікрофотографії ділянок печінки щурів 3-місячного віку, які одержували: А - ССL4 (порушення балочного рисунку, велико- і дрібнокраплинний стеатоз, мікрокисти, каріорексис, анізонуклеоз і некроз), Б - ССL4 разом із камілофланом (дрібнокраплинний стеатоз, балочний рисунок відносно збережений, мітози). Гематоксилін і еозин. х .

Це має свій прояв у звуженні осередків ураження, збільшенні чисельності ядер із підвищеною кількістю ядерець і збільшенні кількості фігур мітозу (рис. ). Введення камілофлану на тлі інтоксикації CCl4 виявилося менш ефективним у старих тварин у порівнянні з молодими, що, ймовірно, пов'язане з більш суттєвим ураженням печінки та зниженням активності регенераційних процесів у старих щурів.

Обмін сфінголіпідів у печінці щурів в умовах стеатозу, індукованого CCl4, і його регуляція флавоноїдами. Відомо, що важливою патогенетичною причиною ураження печінки при дії гепатотоксинів є продукція прозапальних цитокінів (TNF-б, IL-в й ін.), які призводять до некрозу і/або апоптозу клітин [Weber і співавт., 2003]. Встановлено також, що цитокіни модулюють активність СМАЗ і викликають утворення індукторів апоптозу - церамідів [Memon і співавт., 1999, Karakashian і співавт., 2004]. Ці дані вказують на важливу роль церамідів у розвитку ураження печінки, однак вплив CCl4 на рівень і метаболізм церамідів у печінці не вивчено.

Нами виявлено, що CCl4 і при чотириразовому підшкірному введенні 3-місячним щурам, і при внесенні в середовище інкубації ізольованих гепатоцитів викликає підвищення вмісту церамідів і збільшення співвідношення цераміди/СФМ у печінці (рис. ). Разом з тим введення флавоноїдів на тлі дії CCl4 запобігає цим змінам і приводить до збільшення вмісту СФМ у гепатоцитах щурів (рис. ).

Рис. . Вплив CCl4 і флавоноїдів на вміст церамідів і сфінгомієліну в ізольованих гепатоцитах 3-місячних щурів. Примітка. * - вірогідно щодо контролю; ** - вірогідно щодо CCl4, р<0,05.

Відомо, що накопичення церамідів у клітинах може бути наслідком їх підвищеного утворення зі СФМ у результаті активації СМАЗ або відбуватися за рахунок інгібування активності ензимів метаболізму церамідів: церамідази, яка гідролізує цераміди до сфінгозину, і СФМ синтази, яка каталізує перетворення церамідів у СФМ [Hannun, 2002]. З метою дослідження можливої ролі СМАЗ в утворенні церамідів в умовах токсичного ураження печінки CCl4 вивчали вплив флавоноїдів на сфінгомієліназну активність гомогенату печінки щурів. Як субстрат в даному випадку використовували [N-метил-14С]СФМ. Установлено, що в процесі інкубації гомогенату печінки щурів, яким вводили CCl4, з [N-метил-14С]СФМ відбувається зниження вмісту цього ліпіду в середовищі інкубації. Цей процес супроводжується підвищенням маси церамідів, у порівнянні з контролем (табл. ), і збільшенням на 28,7(Р ,05) вивільнення [N-метил-14С]фосфорилхоліну. Виявлені зміни вмісту даних ліпідів указують на активацію нейтральних СМАЗ у печінці тварин під впливом CCl4.

Для вивчення можливого внеску церамідази й СФМ синтази в індуковане CCl4 накопичення церамідів, гомогенат печінки щурів, підданих дії CCl4, інкубували в присутності ендогенних церамідів, які мічені [14C]пальмітиновою кислотою. Установлено, що CCl4 сповільнює деградацію [14C]церамідів і утворення [14C]сфінгозину (табл. ). Поряд із цим під дією CCl4 не спостерігалося вірогідної зміни рівня наново синтезованого [14C]СФМ. Таким чином, у даних експериментальних умовах під дією CCl4 виявлено інгібування церамідазної активності й відсутність ефекту CCl4 на процеси синтезу СФМ. У той же час флавоноїди камілофлану нормалізують порушений під дією CCl4 обмін СФЛ у печінці тварин як в умовах in vivo, так і - in vitro.

Таблиця 

Вплив CCl4 і камілофлану на вміст [14C]сфінголіпідів у печінці 3-місячних щурів, % від контролю (М±m, n=6)

14C-субстрати | Ліпіди | Умови експерименту

CCl4 | CCl4Камілофлан

[N-метил-14С]СФМ | Цераміди а | 134,5±8,6* | 95,0±8,9**

[N-метил-14С]СФМ а | 66,2±7,1* | 82,2±11,2

[N-метил-14С]фосфорилхолін б | 128,7±4,3 | 97,5±3,0**

[14C]Цераміди | [14C]Цераміди а | 135,7±10,7* | 68,7±7,9**

[14C]сфінгозин а | 75,96,8* | 88,78,7

Примітки: 1. Введення камілофлану:а  in vivo, б  in vitro. 2. * - вірогідно щодо контролю, р<0,05; ** - вірогідно щодо CCl4, р<0,05. 3.Н 7,35.

Установлено, що камілофлан при введенні тваринам (in vivo) уповільнює деградацію [N-метил-14С]СФМ і знижує масу церамідів (табл. ), а при внесенні в середовище інкубації (in vitro) — зменшує вивільнення [N-метил-14С]фосфорилхоліну із [N-метил-14С]СФМ в гомогенаті печінці щурів, яким вводили CCl4 (табл. ). Ці дані вказують на інгібування камілофланом активованої CCl4 нейтральної СМАЗи. Поряд із цим підвищення під впливом камілофлану деградації [14C]церамідів і посилення утворення [14C]сфінгозину свідчать про нормалізацію флавоноїдами зниженої під впливом CCl4 церамідазної активності печінки (табл. ).

Таким чином установлено, що CCl4 викликає підвищення сфінгомієліназної і зниження церамідазної активності печінки тварин, що призводить до накопичення церамідів. Уведення в організм або середовище інкубації тканини печінки флавоноїдів Chamomilla recutita нормалізує обмін СФЛ і перешкоджає надлишковій продукції й накопиченню церамідів у печінці в умовах експериментального стеатозу шляхом зниження сфінгомієліназної і підвищення церамідазної активності печінки тварин. Результати нашої роботи дозволяють припустити, що запобігання накопиченню індукторів апоптозу - церамідів флавоноїдами лежить в основі захисної дії цих сполук на печінку в умовах стеатозу, індукованого CCl4.

Вміст і обмін сфінголіпідів у печінці щурів різного віку. Модуляція вікових змін обміну сфінголіпідів флавоноїдами. Оскільки відомо, що в старості активується обмін СФЛ, а флавоноїди, як було встановлено в нашій роботі, є модуляторами вмісту СФЛ в умовах експериментального порушення їхнього обміну, в роботі вивчали вікові особливості вмісту і обміну СФЛ у печінці самців щурів, а також вплив флавоноїдів Chamomilla recutita на метаболізм СФЛ у печінці щурів різного віку.

Установлено, що в процесі старіння відбувається прогресуюче підвищення вмісту церамідів і зниження рівня СФМ у печінці щурів лінії Вістар (рис. ).

Рис. 5. Вплив камілофлану на вміст СФМ і церамідів у печінці щурів різного віку.

Примітка. * - вірогідно щодо тварин 3-місячного віку, р<0,05; ** - вірогідно щодо контролю, р<0,05.

Флавоноїди камілофлану не впливають на вміст церамідів і СФМ у печінці молодих щурів ні при внутрішньошлунковому введенні тваринам (рис. ), ні при додаванні в середовище інкубації ізольованих гепатоцитів (вміст церамідів: контроль  ,39±0,30, камілофлан  ,55±0,24; вміст СФМ: контроль  ,33±1,22, камілофлан  ,76±0,24 нмоль на ·106 клітин.). Поряд із цим, введення камілофлану в організм старих (24 міс) і дуже старих (27-28 міс) тварин викликає зниження вмісту церамідів і підвищення рівня СФМ у печінці, модулюючи, таким чином, вікові зміни вмісту ліпідів (рис. ). У той же час інкубація ізольованих клітин печінки старих тварин у присутності флавоноїдів протягом 4 і 24 годин практично не впливає на рівень церамідів. Так, вміст церамідів при інкубації клітин протягом 4 годин у контролі сягав ,1±1,25, при додаванні камілофлану — ,8±0,43, при інкубації протягом 24 годин: контроль — ,9±0,75, камілофлан — ,4±1,06 нмоль на 6·106 клітин.

Для з'ясування потенційного механізму модулюючої дії флавоноїдів на вміст СФЛ у печінці старих щурів вивчали метаболізм СФМ і церамідів у печінці 24-місячних тварин на тлі введення камілофлану. Досліди проводили також на ізольованих гепатоцитах старих щурів при їх інкубації в присутності флавоноїдів.

В експериментах з використанням як субстрату СМАЗ попередньо міченого [14С]пальмітиновою кислотою ендогенного СФМ установлено, що в умовах кислого і нейтрального рН продукція [14С]церамідів знижується в гомогенаті печінки 24-місячних щурів, яким попередньо вводили камілофлан, у порівнянні з контрольними тваринами того ж віку (табл. ). Ці результати вказують на інгібування флавоноїдами сфінгомієліназної активності печінки. Такий висновок було підтверджено в наступних експериментах, де як субстрат СМАЗ використовували [N-метил-14С]СФМ.

Таблиця 

Вплив камілофлану (in vivo) на метаболізм СФМ і церамідів у печінці 24-місячних щурів, імп/хв на 1 мг білка (М±m, n=6)

Внесення

14C-ліпідів у середовище інкубації клітин | pН | Утворення 14C-ліпідів у печінці щурів | Умови експерименту

Контроль | Камілофлан

СФМ | 4,45 | Цераміди | 171085,7 | 1352103*

7,40 | Цераміди | 109892,0 | 79587,0*

Цераміди | 7,40 | Цераміди | 173080,4 | 1722140,9

СФМ | 47439,9 | 46051,4

Примітка. * - вірогідно щодо контролю, р<0,05.

Як при введенні тваринам протягом 6 днів (in vivo), так і при додаванні до середовища інкубації (іn vitro), камілофлан знижував вивільнення [N-метил-14С]фосфорилхоліну із [N-метил-14С]СФМ при інкубуванні з гомогенатом печінки, що свідчить про інгібування камілофланом сфінгомієліназної активності печінки (табл. 4).

Таблиця 4

Вплив камілофлану на утворення [N-метил-14C]фосфорилхоліну і [14С]сфінгозину в печінці 24-місячних щурів (М±m, n=6)

Умови експерименту | [N-метил-14С]фосфорилхолін | [14С]сфінгозин

In vivo | Контроль | 252668,1 а | 478,016,2 а

Камілофлан | 188932,6 а * | 497,024,8 а

In vitro | Контроль | 162968,7 а | 2720,062,8 б

Камілофлан | 142836,4 а * | 1996,5414,0 б

Примітки: 1. а – імп/хв на 1 мг білка;  б – імп/хв на ,5·107 клітин. 2.- вірогідно щодо контролю, р<0,05.

Для з'ясування можливого впливу флавоноїдів на церамідазну і СФМ-синтазну активність печінки гомогенат печінки старих контрольних щурів і тварин, яким протягом 6 днів уводили камілофлан, інкубували в присутності ендогенних церамідів, які попередньо мітили [14C]пальмітиновою кислотою.

Установлено, що камілофлан ні при введенні тваринам (in vivo), ні при додаванні до середовища інкубації ізольованих гепатоцитів (іn vitro) не впливає на деградацію [14С]цераміду до [14С]сфінгозину (табл. ), а також — на конверсію [14С]цераміду в [14С]СФМ (табл. ). Ці результати дозволяють стверджувати, що флавоноїди в даних експериментальних умовах не впливають на церамідазну і СФМ-синтазну активність печінки старих щурів.

Той факт, що флавоноїди знижують сфінгомієліназну активність печінки старих щурів і не змінюють значно метаболізм СФМ і церамідів в ізольованих гепатоцитах цих тварин дозволяє вважати, що ефект флавоноїдів на обмін СФЛ пов'язаний не з їхньою прямою дією на гепатоцити, а опосередкований іншими клітинами печінки. Відомо, що в процесі старіння спостерігається надлишкова секреція прозапальних цитокінів (TNF-б, IL-1в та ін.) активованими Купферовськими клітинами печінки. Це супроводжується індукцією експресії білків гострої фази, яка характерна для хронічного запального стану [Lozanski і співавт., 1997; Lightle і співавт., 2000]. Установлено, що реалізація запальної реакції, яку викликають цитокіни, здійснюється за допомогою сфінгомієлінової сигнальної системи. Показано, що IL-1в супресує CYP2С11 у гепатоцитах щурів, що призводить до швидкого обміну СФМ і накопичення церамідів у клітинах [Chen, 1995].

Відомо, що флавоноїди (апігенін і лютеолін) здатні інгібувати продукцію цитокінів (IL-1в і ФНО-б) шляхом блокування експресії їх генів [Kowalski і співавт., 2005]. Оскільки цитокіни є активаторами СМАЗ, можна припустити, що інгібування флавоноїдами камілофлану сфінгомієліназної активності печінки старих щурів, яке було виявлене в нашій роботі, може відбуватися за рахунок блокування флавоноїдами продукції цитокінів. Для підтвердження цього висновку потрібні подальші дослідження.

Таким чином, у ході проведених досліджень було встановлено, що флавоноїди Chamomilla recutita є модуляторами вмісту і обміну гліцеро-, сфінголіпідів і холестеролу у печінці самців щурів за умов експериментального порушення і вікових змін їх метаболізму. Наші результати, а також дані інших авторів про антиоксидантні і протизапальні властивості флавоноїдів [Middleton і співавт., 2000; Nijveldt і співавт., 2001], указують на їхню потенційно важливу роль у зниженні ризику виникнення і розвитку захворювань, пов‘язаних із порушеннями обміну ліпідів.

ВИСНОВКИ

1. Установлено вікові особливості вмісту і обміну гліцеро-, сфінголіпідів, холестеролу, жовчних кислот та стану зовнішньосекреторної функції печінки щурів лінії Вістар, а також модулюючий вплив флавоноїдів Chamomilla recutita на змінену з віком та порушену при моделюванні стеатозу функціональну активність печінки.

2. У печінці 24-місячних щурів лінії Вістар, у порівнянні з 3-місячними, спостерігається підвищення вмісту вільних жирних кислот, холестеролу і церамідів, а також зниження вмісту фосфатідилхоліну і сфінгомієліну.

3. Флавоноїди, не впливаючи на вміст ліпідів у печінці здорових 3-місячних щурів, модулюють змінений з віком рівень сфінголіпідів, холестеролу і фосфатидилхоліну у печінці 24-місячних тварин. Підвищення під впливом флавоноїдів вмісту фосфатидилхоліну є наслідком стимуляції синтезу цього ліпіду de novo, процесів ацилювання фосфоліпідів і утворення попередників фосфоліпідів - діацилгліцеринів. Зниження вмісту холестеролу відбувається за рахунок інгібування біосинтезу цього ліпіду, посилення його перетворення в жовчні кислоти і виведення з жовчю. Зменшенню вмісту церамідів сприяє зниження флавоноїдами підвищеної у старості сфінгомієліназної активності печінки.

4. З віком відбувається зниження зовнішньосекреторної функції печінки самців щурів лінії Вістар, яке проявляється у зменшенні біліарної екскреції жовчних кислот і холестеролу. Камілофлан стимулює холерез як у молодих, так і у старих щурів, підсилюючи біліарну екскрецію жовчних кислот. Разом з тим камілофлан стимулює виведення з жовчю холестеролу в старих тварин, не впливаючи на його біліарну екскрецію в молодих щурів. Камілофлан можна вважати істинним холеретиком, який стимулює виділення холатів і збільшує секрецію жовчі.

5. В умовах експериментального стеатозу введення флавоноїдів Chamomilla recutita спричиняє істотне зниження жирової дистрофії печінки як молодих, так і старих тварин, стимулює репарацію ушкодженої паренхіми та поліпшує функціональний стан печінки.

6. На тлі моделювання стеатозу, індукованого чотирихлористим вуглецем, у печінці 3-місячних щурів спостерігається накопичення церамідів, яке відбувається за рахунок підвищення сфінгомієліназної та інгібування церамідазної активності печінки. Флавоноїди нормалізують обмін сфінголіпідів і перешкоджають надлишковій продукції й накопиченню церамідів у печінці в умовах експериментального стеатозу шляхом зниження сфінгомієліназної і підвищення церамідазної активності печінки тварин.

СПИСОК ОПУБЛІКОВАНИХ РОБІТ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Вередіна (Шахова) О.Г., Нікітіна Н.С., Бабенко Н.О. Вплив камілофлану на функціональний стан печінки // Експериментальна та клінічна фізіологія і біохімія. – 1999. - № 4. – С. 16-22.

Особистий внесок дисертанта полягає у дослідженні впливу флавоноїдів Chamomilla recutita на функціональний стан печінки щурів в умовах гострого експериментального ураження CCl4, аналізі наукової літератури, статистичній обробці даних та оформленні й підготовці матеріалів до публікації.

2. Вередина (Шахова) Е.Г. Эффективность суммы флавоноидов ромашки аптечной в условиях хронического токсического поражения печени четыреххлористым углеродом // Экспериментальная и клиническая медицина. - 2001. - № 3. - С. 28-32.

3. Babenko N., Shachova E. Effects of flavonoids on carbon tetrachloride induced accumulation of lipids in the liver // Annales Universitatis Mariae Curie – Sklodowska, Lublin-Polonia. – 2004. - Vol. XVII, №2, sectio DDD. - Р. 177-179.

У цій роботі особисто здобувачем виконано експериментальні дослідження, проведено аналіз наукової літератури, статистичну обробку результатів та оформлення й підготовку матеріалів до публікації.

4. Бабенко Н.О., Шахова О.Г. Вікові особливості впливу флавоноїдів на зовнішньосекреторну функцію печінки щурів // Фізіологічний журнал. – 2005. – Том 51, № 4. - С. 65-69.

У цій роботі Шаховою О.Г. особисто виконано експериментальні дослідження, проведено аналіз наукової літератури, статистичну обробку результатів та оформлення й підготовку матеріалів до публікації.

5. Шахова Е.Г., Бабенко Н.А. Влияние флавоноидов на содержание липидов в изолированных гепатоцитах крыс разного возраста // Буковинський медичний вісник. – 2005. – Том 9, № . - С. 259-261.

Особисто здобувачем було виконано експериментальні дослідження, проведено аналіз