НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ МІКРОБІОЛОГІЇ І ВІРУСОЛОГІЇ ім. Д.К. ЗАБОЛОТНОГО

ШЕПЕЛЕВИЧ ВІКТОРІЯ ВОЛОДИМИРІВНА

УДК: 578.24: 578.85/86

ПАТОГЕНЕЗ ТА ІНДУКОВАНА СТІЙКІСТЬ У РОСЛИН РОДИНИ SOLANACEAE, УРАЖЕНИХ ВІРУСОМ БРОНЗОВОСТІ ТОМАТІВ

03.00.06 – вірусологія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Київ – 2007

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана у відділі фітопатогенних вірусів Інституту мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного Національної академії наук України

Науковий керівник: доктор біологічних наук, старший науковий співробітник

Коваленко Олексій Григорович,

Інститут мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного

НАН України, провідний науковий співробітник відділу

фітопатогенних вірусів

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, старший науковий співробітник

Товкач Федір Іванович,

Інститут мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного

НАН України, завідувач відділу молекулярної біології

вірусів

доктор біологічних наук, старший науковий співробітник Міщенко Лідія Трохимівна,

Київський Національний Університет ім. Тараса Шевченка,

провідний науковий співробітник кафедри вірусології

Провідна організація: Інститут сільськогосподарської мікробіології УААН,

м. Чернігів.

Захист відбудеться “18” квітня 2007 р. о 1000 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.233.01 при Інституті мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України за адресою: Д 03680, м. Київ, МСП, вул. Заболотного, 154

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України за адресою: м. Київ, вул. Заболотного, 154

Автореферат розісланий “16” березня 2007 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради,

кандидат біологічних наук, с.н.с. Пуріш Л.М.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Поряд з фітопатогенними бактеріями і грибами віруси спричиняють ураження рослин, що призводить до зниження їх врожайності, чи навіть загибелі. Вірус бронзовості томатів (ВБТ) поміж фітовірусів вирізняється тим, що він є одним з найменш спеціалізованих, а відтак надзвичайно широко розповсюдженим. Він уражує понад 900 видів рослин і є одним із десяти найбільш шкодочинних вірусів у світі (Peters, 1998). ВБТ уражує такі важливі сільськогосподарські та декоративні культури, як томати, картопля, салат, перець, тютюн, соняшник, арахіс, рис, петунія, хризантема та ін. (Van Regenmortel et al., 2000; Nagata et al. 2002). Підраховано, що щорічні економічні втрати у світі від нього становлять не менше 1 мільярда доларів. В Україні найбільше потерпають від ВБТ тютюн та соняшник (Коваленко и др., 1987; Князєва, Смирнова, 1998). Значне поширення вірусу вимагає адекватних засобів боротьби з ним. Найбільш безпечним і раціональним способом боротьби з фітовірусами, зокрема з вірусом бронзовості томатів, є селекція та використання вірусостійких сортів. Проте, для успішної селекції потрібні глибокі знання механізмів і факторів природної стійкості рослин.

Відомо, що в рослинах, уражених вірусною інфекцією, поряд з паталогічною дією останньої, мають місце процеси, що приводять до виникнення набутої (індукованої) стійкості рослинних тканин до повторної інфекції. Ці процеси вже досить досконально вивчені на рослинах, які реагують на інокуляцію вірусом локальною некротичною реакцією і пов’язаною з нею локальною та системною індукованою вірусостійкістю (ІВС) (Loebenstein, 1972; Sela, 1981). Стосовно системної вірусної інфекції, якою є ВБТ-інфекція на пасльонових, процеси й чинники, що лімітують реплікацію та поширення вірусу в рослинах, досліджені недостатньо. Деякий поступ у цьому напрямку означився на моделях із системною вірусною інфекцією переважно “мозаїчної” симптоматики (Nienhaus, Babovic, 1978; Gera, Loebenstein, 1988). Проте дані про патогенез у рослин, уражених ВБТ, в літературі обмежені, а про наявність індукованої стійкості та фактори, що її зумовлюють, при системній некротичній ВБТ-інфекції відсутні. Недостатньо вивченими є також біологічні властивості і штамовий склад ВБТ, поширеного в агроценозах півдня України. Між тим вплив цього збудника на рослину-хазяїна значною мірою залежить від його вірулентності, виду та сорту рослин (Коваленко А. и др., 1987).

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота виконана в рамках науково-дослідних робіт відділу фітопатогенних вірусів Інституту мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України відповідно до теми 2.28.2.7 “Дослідження ролі вірусних і клітинних компонентів у детермінації природної і індукованої вірусостійкості рослин” за 2000-2004 рр. (державний реєстраційний номер 0100U004337) та проекту “Розробка системи захисту рослин від вірусних хвороб на основі мікробних полісахаридів та антиметаболітів”, що виконувався за програмою “Новітні медико-біологічні проблеми та навколишнє середовище людини” за 2004-2006 рр. (державний реєстраційний номер 0104U007732).

Мета і задачі досліджень. Метою дисертаційної роботи є вивчення патогенезу та індукованої вірусостійкості (ІВС) у рослин за системної ВБТ-інфекції. Для досягнення зазначеної мети необхідно було вирішити такі задачі:

1. Вивчити властивості ізолятів ВБТ, що зустрічаються на тютюні в умовах передгірського і південнобережного Криму.

2. Дослідити патологічні зміни в рослинах, інфікованих ВБТ, на макро- і мікроскопічному рівнях.

3. Вивчити динаміку розвитку неспецифічної ІВС та її фактори у рослин родини Solanaceae за системної некротичної ВБТ-інфекції.

4. Дослідити кількісні та якісні зміни в білок-вуглеводному комплексі рослин тютюну, уражених ВБТ.

Об’єктами дослідження були ізоляти ВБТ та рослини родини Solanacea (Nicotiana tabacum, N. sanderae, Datura stramonium D. metel).

Предмет дослідження – фактори патогенезу та індукованої вірусостійкості за системної некротичної ВБТ- інфекції.

Методи дослідження – біологічні, вірусологічні, біохімічні, фізико-хімічні.

Наукова новизна одержаних результатів.

Автором дисертації вперше виявлено розвиток у рослинах неспецифічної локальної та системної індукованої стійкості за системної некротичної вірусної інфекції. Показано, що індукована стійкість супроводжується синтезом PR-білків, антивірусних факторів (АВФ, ІВР) та вуглеводвмісного Кон-А-специфічного біополімера. Системна ВБТ-інфекція в рослинах тютюну вперше інтерпретується як реакція повільної надчутливості, подібна до реакції, індукованої ВТМ у надчутливих рослин. Вперше встановлено, що ВБТ у тютюні спричиняє якісні і кількісні зміни в складі білків і вуглеводів апопласту на ранніх стадіях інфекції (6 доба після інокуляції).

Практична значимість роботи. Результати вивчення механізму індукованої стійкості, зокрема ролі в ньому клітинного білково-вуглеводного комплексу можуть бути використані при розробці нових підходів до створення сортів рослин, стійких до ВБТ.

Дані про антивірусні властивості полісахаридів та антивірусну активність антиметаболітів можуть бути використані при розробці біологічних способів захисту рослин від вірусних інфекцій.

Особистий внесок здобувача. Дисертаційна робота виконана автором особисто. Дослідження перебігу хвороби, викликаної у рослин різними ізолятами ВБТ, вірулентності та деяких фізичних характеристик останніх, випробування полісахаридів і антиметаболітів як можливих індукторів стійкості та інгібіторів вірусу, виконано самостійно. Зміни в білок-вуглеводному комплексі рослин проведено спільно з Т.А. Телегеєвою, яка є співавтором відповідних публікацій. Спільно з науковим керівником охарактеризовано розвиток і чинники неспецифічної стійкості, зміни в ультраструктурній організації клітин, індуковані в рослинах системною ВБТ-інфекцією. Під керівництвом д.б.н. О.Г. Коваленка планувалися основні напрямки роботи, аналізувалися результати та готувалися публікації.

Апробація результатів дисертації. Результати досліджень, які викладено в дисертаційній роботі, були представлені на наукових конференціях-конкурсах молодих вчених ІМВ НАН України (2002 р., 2003 р., 2005 р.), Всеукраїнській конференції молодих вчених “Засади сталого розвитку аграрної галузі” (Київ, жовтень 2002 р.), IV Всеукраїнській конференції студентів і аспірантів “Біологічні дослідження молодих вчених на Україні” (Київ, квітень 2004 р.), 4-й Міжнародній конференції “Біоресурси та віруси” (Київ, вересень 2004 р.), X з’їзді Товариства мікробіологів України (Одеса, вересень 2004 р.).

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 10 наукових праць, із них – 6 статей у фахових виданнях та 4 тези доповідей.

Структура та обсяг дисертації. Дисертація містить розділи: вступ, огляд літератури, експериментальна частина, що включає в себе матеріали та методи досліджень, а також результати та їх обговорення; підсумок, висновки та перелік використаних літературних джерел, який містить 295 назв (із них 236 –іншомовних). Загальний обсяг дисертації становить 147- сторінок машинопису. Рукопис ілюстрований 7 таблицями та 30 рисунками.

Огляд літератури

розділ 1. Тосповірусні інфекції рослин та біологія їх збудників

В огляді літератури представлено сучасні дані щодо поширеності та шкодочинності тосповірусів, розглянута також їх структура та механізм репродукції. Узагальнено літературні дані щодо симптоматології, циркуляції, фізико-хімічних властивостей, морфології та класифікації цього роду вірусів. Розглядаються також дані літератури стосовно патогенезу, природної та індукованої стійкості та заходів боротьби з тосповірусами.

експериментальна частина

розділ 2. матеріали та методи досліджень

Об’єкти досліджень. Об’єктом досліджень слугував вірус бронзовості томатів (ВБТ), в зарубіжній літературі відомий під назвою вірус плямистого в’янення томатів (Tomato spotted wilt virus – TSWV). Зразки уражених ВБТ рослин тютюну (Nicotiana tabacum L.) були відібрані з тютюнових плантацій відділу тютюнництва Інституту виноградарства та виноробства “Магарач” (с. Табачне, Бахчисарайського району та околиці Ялти). В цілому було відібрано 43 зразки листя. Для дослідження вірулентності та генетичної стабільності вилучених ізолятів було проведено від 8 до 12 пасажів через рослини тютюну сорту Імунний 580 та дурману (Datura stramonium L. та D. metel L.).

Як тест-вірус в дослідах по вивченню індукованої стійкості і активності хроматографічних фракцій глікобіополімерів використовували вірус тютюнової мозаїки (Tobacco mosaic virus), штам Vulgare (U1).

В роботі використовувались такі рослини-індикатори до ВБТ: тютюни (N. tabacum L.) сортів Імунний 580, надчутливий до ВТМ, його чутливий мутант та сорт Самсун; дикий вид тютюну N. sanderae Hort. та махорка (N. rustica. L.), а також два види дурману (D. stramonium L. та D. metel L.). Для визначення антивірусної активності фракцій, отриманих після афінної хроматографії, використовували рослини D. stramonium L., а також диски з листя чутливого мутанта тютюну сорту Імунний 580.

Наявність активності у антивірусного фактора (АВФ), інгібітора вірусної реплікації (ІВР) тестували в системі ВТМ – диски із листя тютюну сорту Самсун, чутливого до даного вірусу. Випробування індукторів вірусостійкості (ІВ) та інгібіторів вірусів (ВБТ та ВТМ) проводили на рослинах та ізольованих листках тютюну сорту Імунний 580 та дурману D. metel.

Одержання препаратів ВБТ. Виділення вірусного матеріалу проводили шляхом гомогенізації свіжозірваного листя з вираженими симптомами ВБТ (1:10, в/о) в 0,1 М гліцин-сульфіт-магнієвому (ГСМ) буфері, що містив 0,1 М гліцину, 0,01 М MgCl2 x 6H2O та 0,01 М Na2SO3, рН 8,0, на льоду. Інокуляцію листя здійснювали лише свіжоприготовленим вірусовмісним матеріалом.

Інокуляція рослин та ізольованих листків. Інфікування рослин здійснювали методом механічної інокуляції за допомогою скляного шпателя чи пензлика для фарбування, змочених в інокулюмі. Як абразив використовували дрібнозернистий карборунд, яким рівномірно опудрювали листя рослин.

Визначення індукованої вірусної стійкості (ІВС). Наявність перехресного захисту між мозаїчним (ВБТм) та суворим (ВБТс) ізолятами ВБТ та його ефективність визначали за часом появи на рослинах некротичних симптомів від повторної інокуляції ВБТс. Неспецифічну ІВС, індуковану ВБТс та ізолятом ВБТ-1п цього вірусу виявляли за реакцією рослин на наступну інокуляцію ВТМ. Величину місцевої та системної ІВС виражали як зниження порівняно з контролем середнього числа і розміру некрозів, індукованих ВТМ, за формулою: % захисту = (1-Д/К) х 100%, де Д – середнє значення розміру чи кількості некрозів в досліді, К – те ж саме в контролі.

Визначення дії дріжджового манану та деяких антиметаболітів на ВБТ інфекцію. Досліди проводили на цілих рослинах тютюну сорту Імунний 580 та дурману D. metel, обприскуючи листя тричі досліджуваними препаратами за 1 – 3 дні до інокуляції вірусом. Дію препаратів щодо ВБТ визначали за кількістю локальних некрозів, динамікою появи системних симптомів та відсотком уражених ВБТ рослин тютюну, що мали м’які (мозаїчні) чи суворі (некротичні) симптоми на листі. В дослідах з ВБТс використовували такі концентрації досліджуваних речовин: дріжджовий манан (ДМ) – 0,02%; ціаногуанідин (ЦГ) – 0,1%; 2,4-діоксогексагідро-1,3,5-триазин (ДГТ) або діацетил-ДГТ – 0,1%. Випробовували також комбінації речовин: ДМ, 0,01% + ЦГ, 0,05%; ДГТ, 0,05%+ ЦГ 0,05%; ДМ, 0,01% + ДГТ, 0,05%; ДМ, 0,01% + ЦГ, 0,05% + ДГТ, 0,05%.

Одержання міжклітинної рідини та клітинних екстрактів. Міжклітинну рідину (МР) і клітинні екстракти (КЕ) одержували із листя здорових і уражених ВБТ рослин тютюну гібридів [Американ 307 X Лехія] F1 і [Дюбек новий X Американ 3] F1, вирощених у польових умовах, а також з рослин тютюну сорту Імунний 580, здорових та інфікованих ВБТ, вирощених в умовах вегетаційного будиночка. КЕ з листя тютюну отримували шляхом гомогенізації здорового та ураженого листя в 0,1 М ГСМ буфері (1:5, в/о, при 0С) із наступним центрифугуванням 20 хв при 35000 g. МР отримували після інфільтрації ураженого ВБТ і здорового листя ГСМ-буфером, що містив 1 М NaCl, та наступного центрифугування його в пробірках, що мали перфороване дно (10000g, 15 хв). МР та КЕ ліофільно висушували і зберігали при +4С до використання.

Визначення вмісту білків, вуглеводів, уронових кислот та поліуронідів. Вміст білків в препаратах МР та КЕ визначали за методом Bradford (1976), вуглеводів – в реакції з 0,2 %-ним розчином антрону в концентрованій H2 SO4 (Захарова, Косенко, 1972), уронових кислот та поліуронідів – за реакцією з карбозолом (Дише, 1967). Калібрувальні криві будували відповідно за сироватковим альбуміном, глюкозою та глюкуроновою кислотою.

Екстракція та електрофорез білків. Розчинні білки екстрагували із листя здорових і уражених ВБТ рослин 0,1 М фосфатно-цитратним буфером рН 2,8, що містив 0,5 М сахарозу, 0,1 % цистеїн-HCl, 0,1 % аскорбінову кислоту і 0,3 % 2-меркаптоетанол (Gianinazzi et al., 1977). Електрофорез проводили в трубках з 7,5 % поліакріламідним гелем (ПААГ) в лужній буферній системі (Davis, 1964). Гелі фіксували в 7 % оцтовій кислоті, фарбували кумасі діамантовим синім R-250 і знебарвлювали згідно з Fairbanks et al., 1971. Положення білкових смуг на електрофореграмах реєстрували за допомогою денситометра Beckmann DU-8B і виражали в значеннях Rf відносно до бромфенолового синього чи до рослинних фенолів, Rf яких приймали за 1 (Ahl et al., 1982).

Гельфільтрація і афінна хроматографія глікобіополімерів (ГБП). Високомолекулярні фракції білків і вуглеводів з МР виділяли за допомогою гельфільтрації на колонці (1,6 х 52 см) з біогелем Р-10. Речовини з колонки елюювали 0,1 М фосфатним буфером (рН 7,4), що містив 0,15 М NaCl (ФБС).

Афінну хроматографію ГБП проводили на колонці (1 х 5 см) з конканаваліном А (Кон А), іммобілізованим на CNBr-активованій сефарозі 4В (Остерман Л., 1985). На колонку наносили фракції високомолекулярних сполук, отримані після гельфільтрації. Для кращого зв’язування ГБП з лектином адсорбцію проводили при +4C в присутності іонів Ca2+ та Mn2+. Елюентами ГБП слугував 50 мМ розчин -метил-D-манозиду в ФБС. Швидкість току рідини – 0,1-0,5 мл/хв; процес елюції ГБП реєстрували, як і у випадку гельфільтрації, за допомогою проточного спектрофотометра, сполученого з самописцем КСП-4. Фракції об’ємом 1,2 мл збирали за допомогою колектора Yargo при довжині хвилі 276 мм. Афінні носії регенерували 0,01М боратним буфером рН 8,8 та 1%-ним розчином оцтової кислоти.

Виявлення антивірусних чинників у рослинах тютюну, інфікованих ВБТ. Антивірусний фактор (АВФ) та інгібітор вірусної реплікації (ІВР) із листя уражених ВБТ рослин тютюну Імунний 580 були екстраговані за методами Sela et al. (1964) та Loebenstein, Gera (1981). Екстракти інфільтрували в диски з листя тютюну сорту Самсун через 30 хв після зараження їх ВТМ. Вміст інфекційного ВТМ в дисках визначали на дурмані.

Антивірусну активність фракцій, отриманих після афінної хроматографії, визначали за впливом фракцій на інфекційність ВТМ на листі дурману та на репродукцію цього вірусу – в дисках із листя чутливого мутанта тютюну Імунний 580.

Електронна мікроскопія. Для електронної мікроскопії використовували половинки листя тютюну, оброблені водою та інфіковані суворим (ВБТс) чи мозаїчним (ВБТм) ізолятами ВБТ. Проби паренхімної тканини (0,5 х 5 мм) фіксувалися 6% розчином глютаральдегіду в 0,1 М фосфатному буфері, рН 7,2, а потім в 1% OsO4. Зразки тканини полімеризували в смолі Epon-812, нарізали ультрамікротомом (“Reichert”), контрастували цитратом свинцю і розглядали в електронному мікроскопі JEM-7(“JEON”) при інструментальному збільшенні 8 – 28 тис. Найбільш характерні електронномікроскопічні картини експонували на фотопластинки, з яких виготовляли фотографії.

Статистична обробка експериментальних даних. Для оцінки достовірності експериментальних даних використовували параметричні критерії нормального розподілу, обчислюючи середнє арифметичне (Х сер.), середню квадратичну похибку (Sx сер.), при рівнях значимості 0,05 чи 0,01 (Урбах , 1975), визначали критерій Стьюдента t і по таблиці для малих виборок (Молостов, 1965) знаходили рівні значущості (Р) різниць або відношень середніх величин. Результати статистичної обробки подавали у вигляді довірчих інтервалів або Хсер. ± SХсер. Рівні значущості різниць (відношень) величин в таблицях позначали символами : +++ : р 0,1%; ++ : 0,1% р 1%; + : 1% р 5%; 0р > 5%.

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

Розділ 3.1. Особливості перебігу хвороби, викликаної у рослин різними ізолятами ВБТ. При обстеженні посадок тютюну на виробничих і селекційних ділянках відділу тютюнництва Інституту виноградарства та виноробства “Магарач” (с. Табачне, Бахчисарайського району та околиці Ялти) в 2002 – 2003 рр. спостерігалась значна різноманітність симптомів ураження рослин ВБТ. Розмаїття симптомів тієї чи іншої хвороби у природних умовах може залежати як від вірулентності вірусу, сприйнятливості рослин до вірусної інфекції так і фізичних факторів довкілля. Тому на першому етапі роботи нами було досліджено біологічні та фізичні властивості деяких ізолятів ВБТ. Було відібрано 43 зразки листя різних сортів і гібридів тютюну, з яких шляхом пасування на рослини тютюну та рослини-диференціатори було виділено 34 ізоляти. На тютюні розвивалися різні симптоми ураження: первинні кільцеві некрози на інокульваних листках, на відростаючих – хлороз та некротизація, сіткуватість, зморшкуватість, серповидність листкової пластинки. На дурмані, поряд з локальними некрозами, виділені ізоляти викликали посвітління жилок, серповидність, деформацію та дегенерацію листкової пластинки. За реакцією на рослинах-диференціаторах ізоляти було розподілено на три групи: 1) сильновірулентні або суворі (с); 2) середньовірулентні або помірні; 3) слабковірулентні або мозаїчні (табл.1). Для подальшої роботи було виділено та додатково очищено чотири ізоляти ВБТ: суворий (ВБТс), “мозаїчний” (ВБТм), та два помірних: ВБТ-1п, ВБТ-2п.

Позаяк ВБТ-1п та ВБТ-2п за вірулентністю між собою відрізнялися мало, являло інтерес дослідити деякі фізичні характеристики цих ізолятів, зокрема точку температурної інактивації (ТТІ), граничне розведення соку, за якого ще зберігалась інфекційність вірусу, а також тривалість збереження інфекційної активності вірусу у віджатому соці in vitro.

Виявилось, що граничне розведення, за якого сік ще залишається інфекційним, для обох ізолятів становив 1:60, обидва ізоляти проявляють інфекційність при вистоюванні в соці не більше 8 годин; ТТІ для ізоляту ВБТ-1п становить 55 C, а для ВБТ-2п – 50С.

Таблиця 1

Біологічні характеристики ізолятів ВБТ, виділених із тютюну

Група ізолятів | Кількість ізолятів, шт. | Розмір локальних некрозів на дурмані, мм |

Системні симптоми на тютюні

Сильновірулен-тні (суворі) | 11 | 3,5 – 6,0 | Некроз листя, стебел, сітчастість, деформація листкової пластинки

Середньовіру-лентні (помірні) | 7 | 2,0 – 3,5 | Сітчастість, крапчаста некротизація листка

Слабковірулент-ні (“мозаїчні”) | 8 | <2,0 | Посвітління жилок, хлороз, прижилкова мозаїка

Розділ 3.2. Неспецифічна стійкість рослин, індукована системною ВБТ інфекцією. Процеси виникнення ІВС рослинних тканин до повторної інфекції вже досить досконало вивчені на рослинах, які реагують на інокуляцію вірусом локальною некротичною реакцією і пов’язаною з нею локальною та системною індукованою вірусостійкістю, чого не можна сказати стосовно системної вірусної інфекції. У зв’язку з цим важливо було дослідити, чи індукуються у рослин, уражених ВБТ, захисні механізми типу ІВС і які чинники можуть їх зумовлювати. Досліди проводили на контрастних за вірулентністю ізолятах ВБТ, а саме: ВБТс і ВБТм. Коли рослини тютюну інокулювали ВБТм, вони ставали стійкими до наступної інокуляції ВБТс, про що свідчило зменшення кількості локальних некрозів у порівнянні з такою на листі, не ураженому мозаїчним ізолятом цього вірусу. Максимум індукованої стійкості (95%) припадав на 20-й день від первинної індукуючої інокуляції (рис. 1).

Оскільки у наших дослідах в уражених ВБТ рослин спостерігався розвиток стійкості до повторної інокуляції, цікаво було дослідити, наскільки виявлена стійкість була вірусоспецифічною. Тому у наступних дослідах половинки листя тютюну інокулювали суворим ізолятом ВБТ, здатним викликати первинні некрози (локальна ІВС), а потім через рівні проміжки часу ці та протилежні їм половинки інокулювали ВТМ (системна ІВС). |

Рис. 1. Інтерференція між слабковірулентним (ВБТм) і сильновірулентним (ВБТс) ізолятами ВБТ у рослинах тютюну сорту Імунний 580

Підрахунок кількості ВТМ-індукованих некрозів показав, що системна інфекція ВБТс здатна викликати у рослин появу локальної і системної стійкості до неспорідненого вірусу – ВТМ, тобто індукована стійкість є неспецифічною (рис. 2). |

Рис. 2. Розвиток локальної (1) і системної (2) стійкості до інокуляції ВТМ, індукованої в рослинах тютюну сорту Імунний 580 суворим (ВБТс) ізолятом ВБТ

В наступних дослідах у порівняльному аспекті ми вивчали неспецифічну локальну та системну ІВС, індуковану у рослин тютюну сорту Імунний 580 ізолятом ВБТ-1п. Виявлено, що у рослин тютюну розвивається неспецифічна локальна (75%) та системна (67%) набута стійкість з максимумом через 9 днів після інокуляції цим ізолятом ВБТ. На рослинах N. sanderae ІВС мала подібну, а на рослинах D. metel – дещо іншу динаміку. У N. rustica ІВС не розвивалась зовсім.

Отже, динаміка розвитку індукованої стійкості залежить переважно від виду рослини-хазяїна. Це може бути свідченням того, що така стійкість контролюється клітинним, а не вірусним геномом.

Ця думка підтверджується і тим, що на вірусостійкість рослин можуть впливати речовини екзогенного походження, зокрема, дріжджовий манан та алкансульфокислоти. Комбінуючи такі речовини з ефективними інгібіторами репродукції вірусів, наприклад з 2-4-діоксогексагідро-1,3,5-триазином (ДГТ), ціаногуанідином (ЦГ) в одному препараті, можна досягти високого антивірусного ефекту і на цій основі розробити ефективну систему захисту рослин від вірусних інфекцій.

Вивчення дії цих препаратів щодо локальної та системної інфекції ВБТ показало, що вони значно інгібують утворення локальних некрозів, індукованих ВБТ (рис. 3). |

Рис. 3. Дія дріжджового манану та деяких антиметаболітів на ураження рослин тютюну ВБТ:

1 – Контроль;

2 – ДМ(0,02%);

3 – ЦГ(0,1%);

4 – ДА-ДГТ(0,1%);

5 – ДМ(0,01%) + ЦГ(0,05%);

6 – ДГ(0,05%) + ЦГ(0,05%);

7 – ДМ(0,01%) + ЦГ(0,05%) + ДГТ(0,05%);

а – мозаїчні симптоми;

б – некротичні симптоми

Стійкість проявлялась не лише в зниженні кількості локальних некрозів на листі, а й у маскуванні симптомів хвороби. У оброблених рослин рідше розвивались симптоми суворої бронзовості: зазвичай спостерігалася слабка мозаїка, посвітління жилок та хлоротичність листової пластинки.

Однак, такий ефект не завжди корелював з інгібуванням утворення локальних некрозів, що може свідчити про складний, неоднозначний механізм антивірусної дії екзогенних речовин.

Розділ 3.3. Зміни в ультраструктурі клітин тютюну, ураженого ВБТ.

Виявлені зміни в стійкості рослин під дією вірусної інфекції можуть бути зумовлені, з одного боку, деструктивними паталогічними змінами в ураженій тканині, з іншого – конструктивними процесами, що ведуть до формування механізмів стійкості. Тому цікаво було дослідити ультраструктурні особливості клітин тютюну, ураженого різними за вірулентністю ізолятами ВБТ.

Було показано, що у клітинах, уражених ізолятом ВБТс, відбуваються глибокі зміни структури органел, особливо хлоропластів, зокрема мембран, що утворюють ламели і грани. Спостерігається посилена вакуолізація цитоплазми; деградація тонопласту і плазмалеми, набрякання мітохондрій. Водночас вірусні частки в уражених тканинах зустрічаються рідко, а вірусні включення не виявляються зовсім (рис. 4а).

Рис. 4. Фрагменти клітин тютюну Імунний 580, ураженого ВБТс (а) х32000 та ВБТм (б) х55000.

Клітини, інфіковані ВБТм, за ультраструктурою менш дегенеровані. Деструктивні процеси у них мало виражені, мембрани і органоїди мають нормальний вигляд, проте в цитоплазмі виявлена значна кількість вірусних часток, що обмежені цитоплазматичними мембранами (рис. 4б). В окремих клітинах виявлено вірусні включення у вигляді “лінійних” мембранних структур різної форми. Тобто, у рослинах, уражених суворим ізолятом ВБТ, мають місце деструктивні зміни, в той час як у рослин, інфікованих мозаїчним ізолятом ВБТ, – переважають вірусоспецифічні зміни.

Розділ 3.4. Зміни в білок-вуглеводному комплексі рослин, уражених ВБТ. Спочатку нами було проаналізовано зміни вмісту білків і вуглеводів в рослинах тютюну, інфікованих ВБТ у польових умовах передгірського Криму. Результати дослідів показали, що в уражених рослинах, що мали симптоми суворої бронзовості на листках, спостерігається зменшення вмісту білків, вміст вуглеводів має тенденцію до зростання в клітинному екстракті і зниження в міжклітинній рідині.

В подальшій роботі ми досліджували динаміку вмісту білків і вуглеводів в апопласті інфікованих ВБТ рослин тютюну сорту Імунний 580, вирощених в умовах вегетаційного будиночка, через 3 – 12 діб після їх інокуляції. Нами було показано підвищення вмісту білків в ВБТ-інфікованих рослинах на ранніх етапах вірусної інфекції (3 – 9-та доби) з максимумом на 6-ту добу. Динаміка вмісту вуглеводів у порівнянні з контролем в уражених рослинах має такий характер: спочатку йде зниження (3 доба), потім – підвищення (6 доба), після чого відбувається спад (9 – та доба) і нормалізація () вмісту цих речовин (рис. 5 ). |

Рис. 5. Вміст білків (а) і вуглеводів (б) в апопласті рослин тютюну Імунний 580, інфікованих вірусом бронзовості томатів

У польових і модельних дослідах на тютюні було показано, що ВБТ-інфекція суттєво не стимулювала накопичення уронових кислот і поліуронідів в міжклітинному просторі уражених листків; навпаки, спостерігається деяке зменшення вмісту цих речовин в апопласті. Очевидно, пектиновий компартмент апопласту не має відношення до механізмів стійкості, і деякий спад вмісту його складових компонентів пов’язаний з паталогічними змінами в рослинах.

Розділ 3.5. Патогенез-асоційовані антивірусні білки та вуглеводи рослин як можливі чинники ІВС. Методом електрофорезу в 7,5% ПААГ з інфікованих ВБТс рослин тютюну сорту Імунний 580 було виявлено три мажорних білкових компонента, відсутніх у контролі. Їх Rf (0,57; 0,71 і 0,89) близькі до Rf білків, індукованих в рослин тютюну ВТМ-інфекцією, і за існуючою класифікацією (Antoniw et al., 1980) відповідають PR-білкам тютюну 1-ї групи, а саме: la, lb, 1с.

Цікаво, що мозаїчний ізолят цього вірусу (ВБТм) не викликав утворення нових білкових компонентів у тютюні. Цей факт може бути аргументом на користь того, що не репродукція вірусу сама по собі, а некротична реакція рослин на ВБТс, є причиною синтезу додаткових білкових компонентів і що ці компоненти кодуються не вірусним, а клітинним геномом.

У рослинах тютюну, інфікованих ВБТс, поряд з PR-білками, нами було виявлено також два антивірусних білка типу АВФ та ІВР (Sela, 1981; Loebensten et al., 1993). Активність антивірусних чинників проявлялася як через 3 тижні, так і через 12 тижнів після інокуляції рослин, хоча на більш пізній стадії вона виявилася дещо нижчою (рис. 6). |

Рис. 6. Інгібування репродукції ВТМ антивірусними білками типу АВФ та ІВР, виділеними із листя тютюну Імунний 580, ураженого ВБТ.

Виявлення антивірусних білків може свідчити про важливу роль їх у розвитку ІВС за некротичної системної інфекції, та у самооздоровленні (“видужуванні”) рослин – феномена, характерного для ВБТ.

Відомо, що розвиток стійкості рослин до вірусів забезпечується шляхом індукування експресії певних генів за участю сигнальних молекул. Одним з механізмів передачі хімічних сигналів може бути білок-вуглеводна взаємодія (Коваленко, 1993, 1996), що вже доведено для надчутливих рослин тютюну за локальної ВТМ-інфекції (Кириченко та ін., 2005). Відтак цікаво було дослідити якісні зміни у вмісті вуглеводовмісних біополімерів, що відбуваються в рослині тютюну під впливом системної ВБТ-інфекції. Для цього з листя уражених і здорових рослин через 3, 6, 9, 12 та 20 діб після інокуляції відбирали МР, з якої методом гельфільтрації виділяли високомолекулярні фракції і піддавали афінній хроматографії на колонці з Кон-А, імобілізованим на сефарозі. Суттєві зміни в компонентному складі екстрагованих біополімерів були виявлені нами на 6-ту добу ВБТ-інфекції. Аналіз хроматограм показав, що нанесений на колонку контрольний взірець елююється трьома, а в досліді – чотирма піками. В досліді в зоні виходу Кон-А специфічних речовин реєструються два чітких компонента, один з яких відсутній в контролі (рис. 7). |

Рис. 7. Афінна хрома-тографія глікокобіополі-мерів із апопласту листя тютюну Імунний 580, ураженого ВБТ (6-та доба інфекції)

ФБС – фосфатний буфер (сольовий);

ММ – -метил-D-манозид

Перевірка вуглеводовмісних фракцій на активність щодо ВТМ показала, що вона виявляється у різні строки відбору МР як у досліді, так і контролі. Однак істотне підвищення антивірусної активності в досліді порівняно з контролем спостерігалась лише у фракціях, виділених через 6 діб після інокуляції тютюну ВБТ (табл. 2), тобто тоді, коли в апопласті з’являвся “новий” глікобіополімер. Така тенденція мала місце при випробуванні препаратів глікобіополімерів як на інфекційність ВТМ (на D. stramonium), так і на репродукцію цього вірусу в дисках із листя тютюну. Пригнічення репродукції ВТМ контрольними фракціями свідчить про те, що виявлений глікобіополімер є природним компонентом здорових рослин, а ВБТ-інфекція лише стимулює його синтез або мобілізацію у міжклітинний простір.

Таблиця 2

Вплив Кон-А-специфічних фракцій апопласту ВБТ-інфікованих рослин на репродукцію ВТМ в дисках із листя тютюну Імунний 580 (чутливий мутант)

Інку-

люм | Час відбору зразків п.і., доби | Вміст білка у фракції, мкг/мл | Кількість некрозів, шт.* | Пригнічення інфекційності вірусу, %

В досліді | В контролі

ВБТ | 6 | 90 | 0,1 | 4,6 | 98 +++

Вода | 6 | 90 | 1,8 | 6,5 | 72 ++

ВБТ | 9 | 35 | 1,6 | 5,5 | 71 ++

Вода | 9 | 35 | 0,9 | 3,3 | 73 ++

ВБТ | 20 | 35 | 0,7 | 7,3 | 91 +++

Вода | 20 | 35 | 0,3 | 9,9 | 97 +++

Примітка*: інфекційність ВТМ в екстрактах визначали на D. stramonium;

++ - 1% ? p >0,1%; +++ - p <0,1%

Виявлений природний компонент, ймовірно, виконує не лише антивірусні, але й сигнальні (регуляторні) функції. Ці функції, очевидно, є необхідною ланкою у формуванні неспецифічної індукованої вірусостійкості рослин за системної ВБТ-інфекції. Оскільки антивірусні фракції специфічно зв’язуються лектином Конканаваліном-А, можна вважати, що у складі виявленого вуглеводного компонента є маноза і /або глюкоза.

ВИСНОВКИ

На основі експерементальних даних, одержаних автором, здійснене наукове узагальнення і дана нова інтерпретація системної некротичної інфекції вірусу бронзовості томату на рослинах родини Solanaceae, зокрема на тютюні та дурмані, як повільної надчутливої реакції, яка супроводжується утворенням в ураженій рослинній тканині чинників (PR-білки, антивірусні речовини та сигнальні молекули), подібних до таких, як при локальній інфекції (ВТМ) у надчутливих рослин і висловлена думка про можливість використання цієї інфекції як модельної системи для вивчення вірус-індукованих механізмів,ефективних проти системних вірусних захворювань рослин.

1. На тютюнових плантаціях передгірського і південнобережного Криму розповсюджені різні за біологічними властивостями форми вірусу бронзовості томатів (ВБТ): сильно-, середньо- і слабковірулентні.

2. Слабковірулентні ізоляти викликають переважно мозаїчні симптоми на ураженому листі, вірусоспецифічні включення і скупчення вірусних часток в клітинах. Сильновірулентні ізоляти – значні ультраструктурні зміни клітинних органел і суворі симптоми ураження листя аж до загибелі рослин.

3. Сильно- і слабковірулентні ізоляти ВБТ інтерферують між собою. Системна інфекція ВБТ здатна викликати у рослин тютюну і дурману появу неспецифічної локальної і системної стійкості щодо неспорідненого вірусу – ВТМ.

4. Мікробні полісахариди, зокрема дріжджовий манан окремо і особливо в комбінації з такими антиметаболітами, як 2-4-діоксогексагідро-1,3,5-триазин, ціаногуанідин та алкансульфокислоти (емульгатор Е-30) проявляють захисну дію проти ВБТ-інфекції: на рослинах родини Solanaceae вони пригнічують утворення вірусіндукованих локальних некрозів і пом’якшують симптоми системної інфекції.

5. За системної некротичної інфекції ВБТ на тютюні спостерігаються значні кількісні зміни в білок-вуглеводному метаболізмі, зокрема утворення PR-білків, АВФ та ІВР факторів, а також Кон-А-специфічного глікобіополімеру, які можуть бути факторами неспецифічної індукованої стійкості рослин.

6. Некротична ВБТ-інфекція на рослинах родини Solanaceae за багатьма ознаками (мікро- і макроскопічні симптоми ураження, розвиток індукованої стійкості, зміни в білковому і вуглеводному метаболізмі, поява PR-білків, антивірусних чинників, сигнальних речовин) подібна до реакції надчутливості на ВТМ і може класифікуватися як уповільнена надчутлива реакція.

7. Реакція на ВБТ рослин родини Solanaceae є зручною модельною системою для вивчення механізмів патогенезу та індукованої стійкості при системних (некротичних) вірусних інфекціях у рослин.

СПИСОК РОБІТ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Коваленко О.Г., Шепелевич В.В. Зміни в ультраструктурі і білковому метаболізмі рослин тютюну, уражених вірусом бронзовості томата.// Цитология и генетика. – 2003. – Т.37, №3. – С. 24 – 29.

2. Коваленко О.Г., Шепелевич В.В. Патогенез та індукована вірусостійкість у рослин тютюну, уражених вірусом бронзовості томатів.// Мікробіол. журн. – 2004. – Т.66, №2. – С. 81 – 85.

3. Коваленко А.Г., Телегеева Т.А., Шепелевич В.В., Рудь Е.А., Стреляева Н.И., Гудков В.А. Изменения в белково – углеводном комплексе растений табака, пораженных бронзовостью томата и мокрым монтарем.// Доклады Российской академии сельскхозяйственных наук. – 2004. - №6. – С. 21 – 23. (Здобувачем особисто було виділено міжклітинну рідину та клітинний екстракт з інфікованих в польових умовах рослин тютюну і визначено в них вміст білків, вуглеводів, уронових кислот та поліуронідів).

4. Коваленко О.Г., Шепелевич В.В., Телегеєва Т.А. Виявлення глікокон’югатів, специфічних до конканаваліну А, в апопласті листя тютюну, здорового та ураженого вірусом бронзовості томатів.// Вісник Київського університету ім. Т. Шевченка. Біологія. – 2005. - №44. – С. 20 – 21.

5. Шепелевич В.В. Деякі біологічні характеристики ізолятів вірусу бронзовості томатів.// Мікробіол. журн. – 2005. – Т.67, №5. – С. 97 – 102.

6. Коваленко О.Г., Кириченко А.М., Шепелевич В.В., Баркалова А.О. Комбінована антифітовірусна дія дріжджового манану, деяких антиметаболітів і ксенобіотиків //Допов. НАНУ – 2006. – №3. – С. 153 – 157.

7. Коваленко О.Г., Шепелевич В.В., Баркалова А.О., Телегеєва Т.А. Зміни вмісту білків і вуглеводів в рослинах тютюну, уражених вірусом бронзовості томату.// Матеріали Всеукраїнської конференції молодих вчених “Засади сталого розвитку аграрної галузі”, 28 – 30 жовтня 2002 р., м. Київ, Україна. – С. 107 – 108.

8. Коваленко О.Г., Шепелевич В.В., Телегеєва Т.А. Виявлення глікокон’югатів, специфічних до конканаваліну А, в апопласті листя тютюну, здорового та ураженого вірусом бронзовості томатів.// Тези доповідей X з’їзду Товариства мікробіологів України 15 – 17 вересня 2004 р., Одеса. – С. 344.

9. Коваленко О.Г., Шепелевич В.В. Антифітовірусна дія дріжджового манану окремо та в комбінації з деякими антиметаболітами.// Тези доповідей X з’їзду Товариства мікробіологів України, 15 – 17 вересня 2004 р., Одеса. – С. 363.

10. Шепелевич В.В., Коваленко О.Г. Зміни вмісту розчинних білків і вуглеводів в апопласті тютюну, індуковані вірусом бронзовості томатів.// Тези доповідей IV міжнародної конференції “Біоресурси і віруси”, 27 – 30 вересня 2004 р., Київ, Україна. – С. 27.

АНОТАЦІЯ

Шепелевич В.В. Патогенез та індукована стійкість у рослин родини Solanaceae, уражених вірусом бронзовості томатів. – Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.06 – вірусологія. – Інститут мікробіології і вірусології ім. Д.К.Заболотного НАН України, Київ, 2007.

Дисертація присвячена дослідженню патогенезу та індукованої вірусостійкості за системної ВБТ-інфекції.

Вивчено біологічні та фізичні властивості деяких ізолятів ВБТ, що зустрічаються на тютюнових плантаціях передгірського та південнобережного Криму; макро- та мікроскопічні симптоми, індуковані цим вірусом у рослинах тютюну та дурману. Встановлено, що слабковірулентний ізолят ВБТ викликає переважно мозаїчні симптоми на ураженому листі і вірусоспецифічні зміни в клітинах, в той час як сильновірулентний ізолят ВБТс – суворі симптоми ураження тканини, вірусоспецифічні та значні патологічні зміни в структурі цитоплазми і клітинних органел.

Автором вперше показано, що системна інфекція ВБТ здатна викликати у рослин тютюну та дурману появу неспецифічної локальної і системної стійкості щодо неспорідненого вірусу тютюнової мозаїки (ВТМ), а сильно- і слабковірулентні ізоляти ВБТ в рослині інтерферують.

Виявлено захисну дію дріжджового манану окремо і в комбінації з деякими антиметаболітами щодо ВБТ-інфекції.

Встановлено, що за системної некротичної інфекції ВБТ на тютюні спостерігаються значні кількісні зміни в білок-вуглеводному метаболізмі і утворення PR-білків, антивірусних білків та Кон-А-специфічного глікобіополімеру, які можуть бути факторами неспецифічної та індукованої стійкості рослин.

ВБТ-інфекція в рослинах тютюну інтерпретується автором подібною до реакції, індукованої ВТМ у надчутливих рослин.

Ключові слова: тосповіруси, вірус бронзовості томатів, tomato spotted wilt virus, патогенез, індукована стійкість, ультраструктура, симптоматика, антивірусна активність, білки, вуглеводи.

АННОТАЦИЯ

Шепелевич В.В. Патогенез и индуцированная устойчивость у растений семейства Solanaceae, инфицированных вирусом бронзовости томата. – Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.06 – вирусология. – Институт микробиологии и вирусологии