Національний аграрний університет

Бугай Андрій Олександрович

УДК 619:636.22/28.015.32

Ліпідний склад плазмолеми абсорбційних ентероцитів порожньої кишки плодів великої рогатої худоби

03.00.04 – біохімія

а в т о р е ф е р а т

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата ветеринарних наук

Київ – 2008

Дисертацією є рукопис

Робота виконана в Національному аграрному університеті

Кабінету Міністрів України

Науковий керівник – доктор біологічних наук, професор, академік УААН

Цвіліховський Микола Іванович,

Національний аграрний університет,

директор Навчально-наукового інституту ветеринарної медицини та якості і безпеки продукції тваринництва

Офіційні опоненти : доктор ветеринарних наук, професор

Любецький Віталій Йосипович,

Національний аграрний університет,

завідувач кафедри акушерства, гінекології та біотехнології відтворення тварин

доктор біологічних наук, професор

Войціцький Володимир Михайлович,

Київський національний університет

імені Тараса Шевченка,

професор кафедри біохімії

Захист відбудеться 15 травня 2008 р. о 12 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.004.08 у Національному аграрному університеті за адресою: 03041, м. Київ - 41, вул. Героїв Оборони, 15, навчальний корпус № 3, ауд. 65

З дисертацією можна ознайомитися у бібліотеці Національного аграрного університету за адресою: 03041, м. Київ - 41, вул. Героїв Оборони, 13, навчальний корпус 4, кімн. 28

Автореферат розісланий 14.04.2008 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради Є.А. Деркач

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. В останній час велика увага в галузі фундаментальних і прикладних наук приділяється дослідженням структури та функцій плазматичних мембран ентероцитів (Мельничук Д.О., 1992; Цвіліховский М.І., 1988 1998; Simons K., 2000; Pike L., 2003). Це зумовлено центральним положенням плазмолеми цих клітин кишечника в транспортних і регуляторних процесах та в реалізації генетичних програм, що має важливе значення у вивченні молекулярних закономірностей життєвих функцій та розвитку багатьох патологічних процесів в організмі тварин і людини. (Foltzer-Jourdainne C., 1989; De Vries K., 1995; Hoekstra D., 2004; Haegebarth A., 2006).

Функції всмоктування та переносу поживних речовин з кишечника до кровоносного русла обумовлені, насамперед, поляризованістю ентероцитів з утворенням макродоменів плазматичної мембрани - апікальної та базолатеральної мембран (Кушак Р.І., 1983; Мельничук Д.О., 1992; Цвіліховский М.І., 1988 - 1998).

Відомо, що апікальна мембрана виконує функції гідролізу та транспорту поживних речовин до ентероциту (Уголев А.М., 1970 1990), а також володіє рецепторними властивостями, що є первинною ланкою трансцитозу імуноглобулінів молозива й зумовлює формування колострального імунітету в організмі новонароджених тварин (Мельничук Д.О., 1992; Карпуть І.М., 1993; Цвіліховський М.І., 1998). Базолатеральна мембрана виконує функції транспорту поживних речовин у кровоносне русло, контакту ентероцитів з екстрацелюлярним матриксом, а також здійснює регуляцію процесів росту та розвитку клітин слизової оболонки кишечника (Fujita M., 1981).

Головним структурним елементом плазмолеми ентероцитів є ліпіди. Утворюваний ними бішар необхідний не тільки для компартмелізації та чіткої регуляції фізіолого-біохімічних процесів, які відбуваються в клітині, а й для підтримки оптимальних умов функціонування мембранних ферментів, білків-транспортерів, рецепторів тощо (Марри Р., 1991).

Дослідження, які були проведені на кафедрі біохімії та біотехнології Національного аграрного університету (Цвіліховський М.І., 1988 1998; Мельничук Д.О., 1992), показали значні відмінності ліпідного складу та функціональних властивостей фракцій плазматичної мембрани ентероцитів здорових і хворих на гострі розлади травлення новонароджених телят. В той же час, дані щодо ліпідного складу апікальної та базолатеральної мембран абсорбційних ентероцитів плодів великої рогатої худоби відсутні. Це вказує на необхідність досліджень мембраногенезу ентероцитів порожньої кишки в пренатальний період онтогенезу великої рогатої худоби. Результати досліджень дозволять більш глибоко вивчити етіопатогенез гострих розладів травлення у новонароджених телят та розробити комплекс заходів щодо їх профілактики та лікування, вивчити причини різної конверсії кормів і формування рівня продуктивності тварин (Щербаков Г.Г., 1984; Левченко В.І., 1995; Грищенко В.А., 2006).

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота є розділом комплексної наукової теми “Визначення молекулярних механізмів становлення мембранного травлення у сільськогосподарських тварин та розробка методів оптимізації мембранного травлення” (номер державної реєстрації 0106U010063) (2005 2008 рр).

Мета і завдання дослідження. Метою дисертаційної роботи було дослідити ліпідний склад плазматичної мембрани абсорбційних ентероцитів порожньої кишки плодів великої рогатої худоби в різні періоди пренатального розвитку.

Для досягнення мети були поставлені такі завдання:

- розробити метод виділення абсорбційних ентероцитів та отримати їх високоочищену фракцію з порожньої кишки плодів великої рогатої худоби;

- дослідити кількісний та якісний склад ліпідної компоненти плазмолеми абсорбційних ентероцитів порожньої кишки великої рогатої худоби у пренатальному періоді онтогенезу;

- визначити особливості ліпідного складу апікальної та базолатеральної мембран абсорбційних ентероцитів порожньої кишки 3-х, 5-ти та 7-ми місячних плодів великої рогатої худоби;

- визначити показники ліпідного складу плазмолеми абсорбційних ентероцитів порожньої кишки, які можуть бути маркерними щодо ступеню розвитку цих клітин.

Об’єкт дослідження – ліпідний склад плазмолеми абсорбційних клітин порожньої кишки 3-х, 5-ти та 7-ми місячних плодів великої рогатої худоби.

Предмет дослідження – порожня кишка, ізольовані абсорбційні ентероцити, ліпідні фракції плазматичної мембрани, апікальна та базолатеральна мембрани.

Методи дослідження клінічні, морфометричні, цитологічні (ізольовані ентероцити порожньої кишки), препаративні (ультрацентрифугування), біохімічні (активність лужної фосфатази, лактатдегідрогенази, Na+, K+-ATPази, вміст загального білка, загальних ліпідів, загальних фосфоліпідів та їх фракцій, жирних кислот), статистичні.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше розроблено метод виділення абсорбційних ентероцитів з порожньої кишки плодів великої рогатої худоби з низьким ступенем їх руйнації та забрудненості іншими клітинами. У мембранному бішарі абсорбційних ентероцитів порожньої кишки плодів великої рогатої худоби встановлено наявність капронової та елаїдинової кислот, які не властиві для плазмолеми цих клітин великої рогатої худоби в постнатальному періоді онтогенезу. В плазмолемі абсорбційних ентероцитів плодів великої рогатої худоби встановлено підвищення вмісту гептадеценової, гептадеканової, лауринової та міристинової кислот, рівень яких значно перевищує такий у новонароджених телят та дорослих тварин. Виявлено високу в’язкість апікальної та базолатеральної мембран абсорбційних ентероцитів плодів великої рогатої худоби, яка з віком значно зменшується. Встановлено маркери ліпідної структури, які вказують на розвиток абсорбційних ентероцитів (динаміка вмісту амінофосфоліпідів, дієнових жирних кислот, кислих фосфоліпідів тощо).

Практичне значення одержаних результатів. Розроблений метод виділення високоочищеної фракції абсорбційних ентероцитів з порожньої кишки плодів великої рогатої худоби з низьким ступенем руйнації дозволяє використовувати ці клітини в різних напрямах досліджень (біохімічні, фізіологічні, цитологічні, моделювання тощо). Отримані дані щодо динаміки змін ліпідного складу плазмолеми абсорбційних ентероцитів плодів великої рогатої худоби вказують на необхідність чіткого балансування ліпідної компоненти раціону тільних корів, особливо з 5-го по 7-й місяці тільності, з метою профілактики порушень органогенезу травного каналу плодів та дозволяють вивчати формування і розвиток травної функції у жуйних тварин у пренатальному періоді онтогенезу.

Результати досліджень впроваджені в навчальний процес і використовуються при викладанні дисциплін “Біохімія тварин”, ”Фізіологія тварин”, ”Цитологія, гістологія та ембріологія” на факультетах ветеринарної медицини Білоцерківського національного аграрного університету, Дніпропетровського державного аграрного університету, Луганського національного аграрного університету, Сумського національного аграрного університету, Львівської національної академії ветеринарної медицини (нині Львівський національний університет ветеринарної медицини та біотехнологій) ім. С.З. Гжицького.

Особистий внесок здобувача. Автор самостійно опрацював літературні першоджерела, освоїв методики досліджень, провів експериментальні дослідження та статистичну обробку одержаних результатів. Ним здійснено інтерпретацію результатів за методичної та консультативної допомоги наукового керівника.

Апробація результатів дисертації. Результати досліджень доповідались на науково-практичних конференціях професорсько-викладацького складу і аспірантів Національного аграрного університету (2005 - 2007 рр.); Дніпропетровського державного аграрного університету (2005 р.); VIII Міжнародній науково-практичній конференції “Наука і освіта 2005” (м. Дніпропетровськ, 2005); Міжнародній науковій конференції “Ветеринарні препарати: розробка, контроль якості та застосування” (ДНДКІ ветпрепаратів та кормових добавок, м. Львів, 2005 р.); Міжнародній науково-практичній конференції “Сучасні проблеми біохімії, фізіології та функціональної морфології продуктивних тварин” (м. Дніпропетровськ, 2005 р.); Міжнародній науково-практичній конференції молодих вчених “Теоретичні і практичні досягнення молодих вчених-аграріїв” (м. Дніпропетровськ, 2006 р.); IX з’їзді Українського біохімічного товариства (м. Харків, 2006 р.); ІІІ Міжнародній науково-практичній конференції студентів і аспірантів “Молодь та поступ біології” (м. Львів, 2007 р.).

Публікації. За темою дисертаційної роботи опубліковано 10 наукових праць, з яких 3 статті у фахових виданнях, що входять до переліку ВАК України (з них 2 одноосібні), 6 тез - у матеріалах конференції і з’їзду.

Структура та обсяг дисертації. Дисертаційна робота складається зі вступу, огляду наукової літератури, матеріалів і методів досліджень, результатів експериментальних досліджень, аналізу та узагальнення результатів досліджень, висновків і пропозицій виробництву, списку використаних джерел, що включає 226 найменувань, з яких 180 латиницею. Робота викладена на 155 сторінках машинописного тексту, ілюстрована 7 таблицями і 21 рисунком.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріали і методи досліджень. Експериментальна частина роботи виконана в 2005 - 2007 рр. на базі проблемної наукової лабораторії внутрішніх незаразних хвороб тварин кафедри терапії і клінічної діагностики Національного аграрного університету.

Для досліджень відбирали матеріал від 27 (3-х, 5-ти та 7-ми місячних) плодів великої рогатої худоби, період розвитку яких визначали морфометрично (Студенцов А.П., 2000). Плоди отримували від клінічно здорових корів голштинської породи під час вимушеного забою на м’ясокомбінаті “Ювілейний” (м. Дніпропетровськ), з дотриманням положення ветеринарного законодавства “Про попередження наслідків стихійного лиха” (посуха).

Після евтаназіі плодів розтинали черевну порожнину, видаляли порожню кишку, промивали її фізіологічним розчином (NaCl-HEPES, рН 7,4) для видалення вмісту. Для виділення ентероцитів порожню кишку відділяли від брижі, визначали її загальну довжину, знаходили середину, від якої відміряли рівновіддалені точки у краніальному та каудальному напрямах та відрізали ділянку кишки. При цьому довжина кишки складала третину від загальної (у ранній плідний період середня довжина цієї ділянки складала 0,8 м; у пізній плідний період - 1,7 м).

Базовою методикою виділення клітин був хімічний (цитрат/ЕДТО) метод (Цвіліховський М.І., 1998), на основі якого розроблявся метод отримання очищеної фракції абсорбційних ентероцитів із порожньої кишки плодів великої рогатої худоби.

Вихід ентероцитів визначали шляхом вимірювання концентрації білка в інкубаційному середовищі (Lowry O., 1951). Визначали активність лужної фосфатази (ЛФ, КФ 3.1.3.1), як маркера зрілих стовпчастих ентероцитів та активність лактатдегідрогенази (ЛДГ, КФ 1.1.1.27), як маркера деструкції клітин, питому активність яких наводили у двох варіантах – інтервальна активність (детекція виключно за певний часовий відрізок, не враховуючи показники попереднього) та кумулятивна активність (детекція наприкінці часового відрізку, враховуючи показники попереднього) (Cartwright I., 1999). Отримані клітини розфасовували в поліпропіленові флакони, позначали і зберігали в рідкому азоті впродовж 2 - 6 місяців для подальшого використання.

Отримання апікальної (АМ) і базолатеральної (БМ) мембран ентероцитів виконували за схемою (Масюк Д.М., 2004), яка включала в себе такі етапи:

1. Гомогенізація суспензії клітин у ножовому гомогенізаторі MPW-302 (Польща) при швидкості обертання ножа 9,5 тис. об/хв упродовж 90 с у середовищі складом (мМ): 250 сахарози, 5 ЕДТО, 5 тріс-НСl буфер при 4 6°С, рН 7,4 (Цвіліховський М.І., 1998). Концентрація білка ентероцитів у середовищі гомогенізації складала 1,65 мг/мл. Ступінь гомогенізації контролювали за допомогою мікроскопа Olimpus СH-20 (Японія) у мазках забарвлених за Романовським-Гімза, при збільшенні у 1000 разів. Критерієм якості гомогенізації були: наявність незруйнованих клітин (недостатня гомогенізація) чи відсутність вираженого осаду при центрифугуванні (10 тис.g) гомогенату (надмірна гомогенізація).

2. Диференційне центрифугування за допомогою рефрижераторної ультрацентрифуги MSE High Speed 25 (Великобританія). З метою очищення гомогенату від супутніх частин клітини та її органел (ядер, мітохондрій) і грубих мембранних фракцій його центрифугували при 10 тис.g упродовж 15 хв. Далі проводили центрифугування супернатанту при 15 тис.g - для виділення АМ, і при 70 тис.g - для виділення БМ, упродовж 60 хв, кожну. Осади очищених фракцій АМ і БМ ресуспендували у фізіологічному розчині (t 4 - 6°С, рН 7,4), які одразу використовували для дослідження ліпідного складу або поміщали в поліпропіленові флакони й зберігали в рідкому азоті.

Ефективність отримання фракцій плазмолеми здійснювали за вмістом білка в мембранному матеріалі. Оцінку ступеня очистки та забруднення мембранних препаратів здійснювали за активністю їх маркерних ферментів: АМ - лужної фосфатази (Cartwright I., 1999) і БМ – Na+, K+-АТРази (КФ 3.6.3.9) (Хижняк С.В., 1997).

Вміст загальних ліпідів (ЗЛП) у мембранних препаратах визначали фосфорнованіліновим методом (Knight J., 1972). Екстракцію ліпідів АМ та БМ проводили за методом (Blight E., Dyer W., 1959). Вміст загального холестеролу (ХС) в аліквоті екстракту визначали за методом (Courchaine A., 1959), а вміст загальних фосфоліпідів (ФЛ), після попередньої мінералізації, - за мікрометодом (Bartlett G., 1959).

Розділення фосфоліпідів (ФЛ) на класи проводили методом тонкошарової хроматографії на силікагелі (пластини ПТСХ-АФ-В 10Ч15, товщина шару сорбенту - 9 мкм, зв’язуюча ланка - силіказоль). В якості рухомих систем використовували суміш хлороформ-метанол-вода в об’ємному співвідношенні 65:25:4. Детекцію проводили шляхом обприскування пластин 5 % спиртовим розчином фосфорномолібденової кислоти із наступним прогріванням при 1200 С. Ідентифікацію їх класів проводили шляхом порівняння отриманої Rf з літературними даними, а також за допомогою кольорових реакцій (Кейтс M., 1975). Кількісне визначення окремих фосфоліпідів проводили шляхом вирахування площі та інтенсивності кольору плям за допомогою оптичної програми “Densitometr”.

З метою отримання метилових ефірів жирних кислот (ЖК), ліпідний екстракт мембранних фракцій обробляли метилатом натрію та 3 М розчином хлороводню в метанолі (Цвіліховский М.І., 1989), які очищували на пластинках ПТСХ-АФ-В у бензолі. Розділення метилових ефірів ЖК здійснювали на газовому хроматографі “Shimadzu” (Японія) (програмне забезпечення “Мультихром”, Росія), з використанням кварцової капілярної колонки HP-PONA (J&W, США) та полум’яно-іонізаційного детектора. Ідентифікацію піків проводили за показниками відносного часу утримування компонентів (функція програмного забезпечення). Кількісний розрахунок проводився в відсотках від загального вмісту метилових ефірів ЖК (функція програмного забезпечення).

Статистичну обробку результатів проводили з використанням програми Statistica-6.

Результати досліджень та їх обговорення

Виділення абсорбційних ентероцитів із порожньої кишки плодів великої рогатої худоби. Отримання абсорбційних ентероцитів з порожньої кишки плодів великої рогатої худоби здійснювали шляхом інкубації відрізків порожньої кишки в розчині, який містив в якості хелатуючого агента ЕДТО.

При отриманні ізольованих ентероцитів з порожньої кишки 3-х місячних плодів встановлено, що основна кількість цих клітин (86 %) виділяється в середовище впродовж перших 5 хв інкубації. Через 10 та 15 хв інкубації порожньої кишки виділилось 12 % та 2 % клітин відповідно. Слід зазначити, що відмінності між трьома клітинними фракціями стосовно активності ЛФ, як маркерного фермента ентероцитів, не було виявлено (табл. 1). Однак було встановлено, що із збільшення часу інкубації порожньої кишки 3-х місячних плодів великої рогатої худоби відбувається посилення цитолізу ентероцитів, оскільки зростає інтервальна активність ЛДГ в 1,3 та в 7,8 раза, на 10-й і 15-й хв інкубації, відповідно.

Таблиця 1

Кумулятивна та інтервальна активність лужної фосфатази в середовищі виділення ентероцитів порожньої кишки плодів великої рогатої худоби в залежності від часу інкубації, мкмоль/мгЧгод (М ± m, n = 6)

Вік плодів, місяці | Час інкубації порожньої кишки в середовищі виділення ентероцитів, хв

5 | 10 | 15

кумулятив-на активність | інтерваль-на активність | кумулятив-на

активність | інтерваль-на активність, | кумулятив-на

активність | інтерваль-на

активність

3 | 120,4 ±

3,9 | 120,4 ±

3,9 | 118,8 ±

2,5 | 116,3 ±

4,0 | 115,3 ±

3,3 | 109,3 ±

5,6

5 | 165,1 ±

4,4 | 165,1 ±

4,4 | 152,4 ±

2,5* | 32,3 ±

1,6* | 148,2 ±

3,8 | 111,1 ±

4,6*

7 | 1620,7 ± 32,0 | 1620,7 ± 2,0 | 1381,5 ± 30,9* | 328,3 ± 12,3* | 1122,1 ± 49,7* | 95,7 ±

4,8*

Примітка. * - Р < 0,05 - дані вірогідні у порівнянні з попереднім часовим відрізком для плодів одного віку.

При отриманні ізольованих ентероцитів з порожньої кишки 5-ти місячних плодів, за перші 5 хв в середовище інкубації виділилося 82 % клітин. За наступні два п’ятихвилинних інтервали часу виділилось 10 % та 8 % клітин відповідно (рис. 1).

При цьому фракція клітин, яка виділилась через 10 хв інкубації порожньої кишки 5-ти місячних плодів, є менш диференційованою і, ймовірно, не виконує в повній мірі абсорбтивної функції, оскільки інтервальна активність ЛФ (маркерного ферменту зрілих ентероцитів), зменшилась, у порівнянні з першим відрізком часу, в 5 разів (табл. 1). Через 15 хв інкубації порожньої кишки, інтервальна активність ЛФ зросла ще в 4 рази. Це свідчить про ймовірність лізису клітин та збільшення активності ЛФ за рахунок певних її лізоформ, які можуть міститись в клітинних органелах.

Рис. 1. Вихід ентероцитів порожньої кишки плодів великої рогатої худоби в залежності від часу інкубації в середовищі виділення.

Примітка. * - Р < 0,05 - дані вірогідні у порівнянні з попереднім часовим відрізком для плодів одного віку.

Підтвердженням цьому є й значне підвищення інтервальної активності ЛДГ в середовищі виділення клітин через 10 хв (на 30 %) та через 15 хв (у 7,8 раза) (табл. 2).

Аналогічна тенденція встановлена при отриманні абсорбційних ентероцитів з порожньої кишки 7-ми місячних плодів. Так, за перші 5 хв інкубації порожньої кишки виділилось 66 % ентероцитів. Через 10 та 15 хв інкубації порожньої кишки 7-ми місячних плодів виділилось 14 % і 20 % клітин, відповідно. Це в 1,3 та у 2 рази більше, ніж за цей час було отримано ентероцитів з порожньої кишки 5-ти місячних плодів. Тобто, процес відшарування ентероцитів із слизової оболонки у 7-ми місячних плодів є більш повільним, що можна пояснити вищими адгезивними властивостями БМ ентероцитів у цих плодів.

Одержані дані свідчать, що абсорбтивна функція ентероцитів порожньої кишки у 7-ми місячних плодів великої рогатої худоби більш розвинута, ніж у 5-ти місячних. Так, активність ЛФ ентероцитів 7-ми місячних плодів, яка була отримана за перші 5 хв виділення в порівнянні з цим показником 5-ти місячних плодів. Після 10-ї хв виділення клітин отримували тільки недиференційовані епітеліальні клітини.

Таблиця 2

Кумулятивна та інтервальна активність лактатдегідрогенази у середовищі виділення ентероцитів порожньої кишки плодів великої рогатої худоби в залежності від часу інкубації, мкмоль/мгЧгод (М ± m, n = 6)

Вік плодів, місяці | Час інкубації порожньої кишки в середовищі виділення ентероцитів , хвилин

5 | 10 | 15

кумулятив-на

активність | інтерваль-на

активність | кумулятив-на

активність | інтерваль-на

активність | кумулятив-на

активність | інтерваль-на

активність

3 | 0,16 ±

0,01 | 0,16 ±

0,01 | 0,20 ±

0,01 | 0,21 ±

0,04 | 0,30 ±

0,02 | 1,64 ±

0,03

5 | 0,16 ±

0,01 | 0,16 ±

0,01 | 0,19 ±

0,01 | 0,21 ± 0,01* | 0,29 ± 0,01* | 1,60 ± 0,05*

7 | 0,040 ± 0,001 | 0,040 ± 0,001 | 0,08 ±

0,01* | 0,29 ± 0,01* | 0,14 ± 0,01* | 0,38 ± 0,01*

Примітка. * - Р < 0,05 - дані вірогідні у порівнянні з попереднім часовим відрізком для плодів одного віку.

Значна відмінність між 5-ти та 7-ми місячними плодами великої рогатої худоби встановлена й щодо стійкості ентероцитів у процесі їх виділення. Так, активність ЛДГ у середовищі з ентероцитами 7-місячних плодів була нижчою впродовж усього часу їх виділення: за перші 5 хв виділення вона була нижчою у 7-ми місячних плодів, у порівнянні з 5-ти місячними плодами, у 4,4 раза. Це свідчить про значно вищі механічні властивості плазмолеми ентероцитів порожньої кишки у 7-ми місячних плодів.

Таким чином, скорочення часу інкубації порожньої кишки плодів великої рогатої худоби в середовищі виділення з 15 до 5 хв дозволяє суттєво знизити ступінь забруднення абсорбційних ентероцитів іншими клітинами та зменшити їх деструкцію.

Ліпідний склад плазмолеми абсорбційних ентероцитів порожньої кишки плодів великої рогатої худоби. Проведені нами дослідження свідчать, що вже на 3-му місяці пренатального періоду розвитку ентероцити порожньої кишки плодів великої рогатої худоби є досить поляризованими клітинами. Співвідношення між ліпідами та білками в АМ ентероцитів цих плодів є меншим у 4,3 раза у порівнянні з БМ. Основним ліпідом АМ і БМ ентероцитів 3-х місячних плодів є ХС. Вміст ХС в АМ (858,60 ± 8,95 нмоль/мг білка) вищий за його вміст у БМ на 39 %, що вказує на формування холестерол-збагачених мікродоменів (“рафтів”). Вміст загальних ФЛ в АМ ентероцитів порожньої кишки 3-х місячних плодів складає 640,00 ± 10,21 нмоль/мг білка, що вище за цей показник у БМ у 2,5 раза. Коефіцієнт співвідношення ХС/ФЛ (1,34 в АМ та 2,43 в БМ) є вищим в 2,0 і 3,4 рази за цей показник у новонароджених телят та дорослої великої рогатої худоби. Це свідчить про значу в’язкість, а отже, і низьку функціональну активність АМ та БМ абсорбційних ентероцитів порожньої кишки 3-х місячних плодів (рис. 2).

Одержані дані свідчать, що зміни ліпідного складу плазмолеми абсорбційних клітин на 5-му місяці розвитку плодів полягають в зменшенні в’язкості мембранного бішару. Даний факт ми пов’язуємо з початком амніотрофного живлення плоду, яке розпочинається з другої половини внутрішньоутробного розвитку. Про зростання функціональної активності плазмолеми ентероцитів 5-ти місячних плодів може свідчити зниження величини ліпід/білкового коефіцієнта в АМ на 15 %, а в БМ – у 2,3 раза. Вміст ХС в обох фракціях плазмолеми ентероцитів порожньої кишки 5-ти місячних плодів знижується в АМ на 24 %, а в БМ – на 32 %, у порівнянні з цим показником у 3-х місячних плодів.

Рис. 2. Коефіцієнт ХС/ФЛ в плазмолемі абсорбційних ентероцитів порожньої кишки плодів великої рогатої худоби.

Примітки: * - Р < 0,05 - дані вірогідні між показниками 5-ти та 3-х місячних плодів;

** - Р < 0,05 - дані вірогідні між показниками 7-ми та 5-ти місячних плодів.

Це сприяє зниженню в’язкості мембранного бішару, а отже, активізації транспортних процесів у кишечнику. На нашу думку, зниження в’язкості плазмолеми абсорбційних ентероцитів призводить до зростання кількості флуктуацій її бішару та посилення інтенсивності парацелюлярного шляху транспорту речовин з порожнини кишки. Поряд із зниженням вмісту ХС в плазмолемі абсорбційних ентероцитів 5-ти місячних плодів, встановлено значне підвищення вмісту ФЛ, що може вважатися одним із адаптивних механізмів у процесах онтогенезу епітелію порожньої кишки. Більш вираженою є динаміка цього показника в БМ, де він вищий у 3,9 раза у 5-ти місячних плодів у порівнянні з 3-х місячними плодами. Значне зниження в’язкості плазмолеми ентероцитів порожньої кишки 5-ти місячних плодів великої рогатої худоби підтверджується зміною коефіцієнту ХС/ФЛ, який в АМ ентероцитів знижується на 32 %, а в БМ – у 5,6 раза.

Ліпід/білковий коефіцієнт АМ ентероцитів порожньої кишки 7-ми місячних плодів майже не змінюється у порівнянні з цим показником в АМ ентероцитів 5-ти місячних плодів. Проте, в БМ ентероцитів 7-ми місячних плодів встановлено зменшення величини цього показника. Отже, результати досліджень ентероцитів плодів великої рогатої худоби свідчать про поступове зниження співвідношення між ліпідами та білками в АМ та БМ у період пренатального онтогенезу. Вказана тенденція більш характерна для онтогенезу моногастричних тварин (Pang К., 1983), але не відмічена для жуйних тварин в постнатальний період онтогенезу (Цвіліховський М.І., 1989).

Вміст загальних ФЛ у плазмолемі абсорбційних ентероцитів плодів великої рогатої худоби з 5-го по 7-й місяці розвитку підвищувався в АМ на 38 %, а в БМ - на 90 %. В той же час, вміст ХС в цей же період зменшився в АМ у 2,2 раза, в БМ - у 2,0 раза. При цьому, коефіцієнт ХС/ФЛ знизився в АМ у 3,0 рази, а в БМ - у 3,8 раза, і досяг досить низьких значень (0,29 - в АМ та 0,13 - в БМ), які не описані в літературі для жодного виду тварин.

Одержані дані свідчать, що в процесі пренатального онтогенезу великої рогатої худоби зменшується в’язкість плазмолеми абсорбційних ентероцитів, що є передумовою розвитку їх функціональної активності.

Фосфоліпідний склад плазмолеми абсорбційних ентероцитів порожньої кишки плодів великої рогатої худоби. В АМ та БМ абсорбційних ентероцитів порожньої кишки 3-х місячних плодів великої рогатої худоби виявлено по 6 ФЛ, з домінуванням в їх структурі ФХ та ФЕ. Спектр ФЛ представлений фосфатидилхоліном (ФХ, 52,50 ± 2,67 %), фосфатидилетаноламіном (ФЕ, 23,03 ± 1,82 %), фосфатидилсерином (ФС, 11,36 ± 0,53 %), сфінгомієліном (СМ, 9,43 ± 0,43 %), лізофосфоліпідами (ЛФЛ, 2,30 ± 0,18 %) та фосфатидилінозитолом (ФІ, 1,23 ± 0,09 %) (рис. 3).

Рис. 3. Фосфоліпідний склад плазмолеми абсорбційних ентероцитів порожньої кишки 3-х місячних плодів великої рогатої худоби.

В БМ, у порівнянні з АМ, встановлено вірогідно вищий вміст ФС та ФІ (на 16 % та 56 %, відповідно). Значні відмінності між плодами 3-х місячного віку та великою рогатою худобою в постнатальний період онтогенезу виявлені щодо вмісту в плазмолемі ентероцитів ФІ, похідні якого виконують роль вторинних месенджерів у передачі сигналу через клітинну мембрану (Цвіліховський М.І., 1989). Так, вміст ФІ в АМ ентероцитів 3-х місячних плодів у 6,4 раза і в 2,2 раза нижчий за цей показник у новонароджених телят і дорослої великої рогатої худоби. В БМ ентероцитів 3-х місячних плодів вміст ФІ у 2,5 раза нижчий, ніж в БМ ентероцитів новонароджених телят, і в 1,8 раза, ніж дорослої великої рогатої худоби.

Незначна різниця щодо вмісту СМ між АМ та БМ абсорбційних ентероцитів порожньої кишки 3-х місячних плодів може свідчити про незавершеність формування полярності плазмолеми цих клітин на даному етапі онтогенезу. Одержані дані свідчать про те, що у 3-х місячних плодів коефіцієнт співвідношення кислі/основні ФЛ є вищим в БМ, у порівнянні з АМ ентероцитів.

Кількісні зміни у вмісті ФЛ плазмолеми абсорбційних ентероцитів порожньої кишки 5-ти місячних плодів великої рогатої худоби свідчать про подальший розвиток абсорбтивної та транспортної функцій цих клітин.

Основними ФЛ АМ ентероцитів порожньої кишки 5-ти місячних плодів великої рогатої худоби також є ФЕ та ФХ. Проте, вміст ФЕ в АМ ентероцитів цих плодів має тенденцію до підвищення у порівнянні з 3-х місячними плодами, що може бути пов’язано зі зростанням інтенсивності синтезу амінофосфоліпідів. Вміст СМ в АМ ентероцитів 5-ти місячних плодів нижчий у порівнянні з 3-х місячними плодами в 2,7 раза. Це можна пояснити інтенсивним амніотрофним живленням 5-ти місячних плодів і наростанням необхідності передачі сигналу до клітини. В той же час, вміст ФІ в АМ ентероцитів 5-ти місячних плодів у 3,3 раза вищий, у порівнянні з цим показником у 3-х місячних плодів. Внаслідок змін щодо вмісту ФЛ в плазмолемі ентероцитів 5-ти місячних плодів зменшується співвідношення між кислими та основними ФЛ (рис. 4). Цей показник характеризує зменшення заряду на поверхні мембрани та зниження її адсорбційних властивостей з розвитком ентероцитів порожньої кишки (Stern M., 1984; Paulsson M., 1992; Repa J., 2002).

Зміни вмісту ФЛ БМ абсорбційних ентероцитів порожньої кишки 5-ти місячних плодів є більш вираженими в порівнянні з АМ. Так, в БМ встановлено зменшення вмісту ФХ та підвищення вмісту ФЕ. Внаслідок цього змінюється асиметричність розподілу головних структурних ФЛ між АМ та БМ, з переважанням вмісту ФЕ в БМ, а ФХ в АМ. На користь нашого припущення щодо механізмів, які покращують парацелюлярну проникність, вказує підвищення вмісту ЛФЛ в БМ ентероцитів 5-ти місячних плодів майже на 50 % у порівнянні з цим показником в БМ ентероцитів 3-х місячних плодів.

Вміст СМ у плазмолемі ентероцитів 5-ти місячних плодів менший, у порівнянні з 3-х місячними плодами. В той же час, вміст СМ в БМ ентероцитів цих плодів вищий, у порівнянні з АМ, що не характерно для великої рогатої худоби у постнатальному періоді онтогенезу (Цвіліховський М.І., 1989).

Рис. 4. Співвідношення між кислими та основними ФЛ у плазмолемі абсорбційних ентероцитів порожньої кишки плодів великої рогатої худоби.

Примітка. * - Р < 0,05 - дані вірогідні між БМ та АМ ентероцитів плодів одного віку.

Значну інтенсивність впливу певних сигнальних речовин (пептиди, тощо) на плазмолему ентероцитів порожньої кишки 5-ти місячних плодів можна передбачити за зростанням вмісту ФІ в БМ, який у 3,3 раза вищий у порівнянні з цим показником в БМ 3-х місячних плодів (табл. 3). Розподіл ФІ між АМ та БМ майже не змінюється в період з 3-го по 5-й місяці внутрішньоутробного розвитку великої рогатої худоби. Не виключається ймовірність інтенсивного транспорту речовин у напрямі міжклітинний матрикс – БМ - цитоплазма ентероциту, що може бути основним джерелом надходження поживних речовин до швидкоростучих клітин (Chen M., 2001; Thomas C., 2006).

Також встановлено зміни вмісту ФЛ у плазмолемі абсорбційних ентероцитів від 5-го до 7-го місяців розвитку плодів великої рогатої худоби. Так, вміст ФС в АМ та БМ ентероцитів 7-ми місячних плодів зменшився в 2,2 і в 2,3 раза, відповідно, що встановлено і для дорослої великої рогатої худоби (Цвіліховський М.І.,1989), а вміст ЛФЛ у БМ зменшився на 38 %. Зменшення вмісту ФС в АМ та БМ абсорбційних ентероцитів плодів великої рогатої худоби в період з 3-го по 7-й місяці розвитку, можна вважати маркерним показником для розвитку цього типу клітин.

В БМ і АМ ентероцитів 7-ми місячних плодів встановлено зменшення в 2,0 рази співвідношення між кислими та основними ФЛ, що свідчить про зниження поверхневого заряду мембранного бішару. При цьому індекс кислі/основні ФЛ був вищим у БМ, у порівнянні з АМ, упродовж всього досліджуваного періоду пренатального розвитку великої рогатої худоби.

Одержані дані свідчать, що на 7-му місяці розвитку плодів великої рогатої худоби абсорбційні ентероцити є більш полярними клітинами, ніж на 3-му та 5-му місяцях, оскільки саме в цей період встановлена найбільша різниця у ФЛ складі АМ та БМ. Так, якщо у 3-х місячних плодів є вірогідна різниця між АМ та БМ тільки за двома фракціями ФЛ (ФС та ФІ), то у 5-ти місячних плодів їх вже три (СМ, ФІ та ФХ), а у 7-ми місячних плодів – п’ять (ЛФЛ, СМ, ФС, ФІ та ФХ).

Таблиця 3

Фосфоліпідний склад плазмолеми абсорбційних ентероцитів порожньої кишки 3-х, 5-ти та 7-ми місячних плодів великої рогатої худоби, %, (М ± m, n = 6)

Фосфоліпіди | Вік плодів, міс.

3 | 5 | 7

АМ | БМ | АМ | БМ | АМ | БМ

ФХ | 52,53 ±

2,67 | 48,85 ±

1,90 | 50,13 ±

2,11 | 39,30 ± 2,37* | 51,01 ±

1,95 | 44,57 ±

2,14

ФЕ | 23,03 ±

1,82 | 24,40 ±

1,68 | 29,76 ±

2,92 | 34,25 ± 2,71* | 34,77 ±

2,34 | 37,60 ±

2,08

ФС | 11,36 ±

0,53 | 13,22 ±

0,44 | 9,94 ±

0,61 | 12,10 ±

1,04 | 4,61 ±

0,17** | 5,26 ±

0,04**

СМ | 9,43 ±

0,44 | 9,77 ±

0,90 | 3,45 ±

0,10* | 5,67 ±

0,34* | 3,86 ±

0,20 | 5,15 ±

0,11**

ФІ | 1,23 ±

0,09 | 1,92 ±

0,12 | 4,11 ±

0,22* | 6,26 ±

0,31* | 3,44 ±

0,20 | 5,52 ±

0,24**

ЛФЛ | 2,30 ±

0,18 | 1,97 ±

0,12 | 2,51 ±

0,22 | 2,93 ±

0,22* | 2,33 ±

0,07 | 1,81 ±

0,07**

Примітки: * - Р < 0,05 - дані вірогідні між показниками 5-ти та 3-х місячних плодів;

** - Р < 0,05 - дані вірогідні між показниками 7-ми та 5-ти місячних плодів.

Жирнокислотний склад плазмолеми абсорбційних ентероцитів порожньої кишки плодів великої рогатої худоби. В АМ та БМ абсорбційних ентероцитів порожньої кишки 3-х місячних плодів виявлено по 10 ЖК (табл. 4).

Основними ЖК АМ є лінолева (С18:2), гептадеценова (С17:1), стеаринова (С18:0) та пальмітинова (С16:0). Також виявлені середньоланцюгові ЖК – лауринова (С12:0) та міристинова (С14:0), які не властиві для плазмолеми ентероцитів порожньої кишки дорослої великої рогатої худоби (Цвіліховський М.І., 1989).

Загальна сума насичених ЖК складає 25,70 ± 0,19 %, ненасичених - 74,30 ± 0,34 %, а співвідношення між ними становить 0,350 ± 0,004. Переважання ненасичених ЖК може бути компенсаторним механізмом щодо зменшення в’язкості ліпідного бішару АМ внаслідок високого вмісту в ньому ХС. Сума моноєнових ЖК складає 41,92 ± 2,12 %, дієнових – 31,78 ± 2,25 %, а співвідношення між ними становить 1,34 ± 0,16.

Слід зазначити, що в постнатальному періоді онтогенезу в плазмолемі ентероцитів порожньої кишки великої рогатої худоби не встановлено високого вмісту гептадеканової (С17:0) та гептадеценової (С17:1) кислот (Цвіліховський М.І., 1989). Тому, виявлена нами у плідному періоді розвитку великої рогатої худоби особливість щодо значного вмісту цих кислот у плазмолемі ентероцитів можна пояснити значною активністю елонгазо-десатуразної системи в тканинах плода та використанням в якості субстратів для синтезу вищих ЖК пропіонату, який може надходити з материнського організму.

Таблиця 4

Жирнокислотний склад плазматичної мембрани абсорбційних ентероцитів порожньої кишки плодів великої рогатої худоби, % (М ± m, n = 6)

Жирна кислота | Вік плодів, міс.

3 | 5 | 7

АМ | БМ | АМ | БМ | АМ | БМ

С10:0 | - | - | 0,56 ±

0,04 | 1,21 ±

0,02 | 0,56 ±

0,02 | 0,15 ±

0,02

С12:0 | 2,76 ±

0,03 | 3,31 ±

0,03 | 2,07 ±

0,07 | 4,41 ±

0,14 | 1,98 ±

0,09 | 1,31 ±

0,06

С14:0 | 2,45 ±

0,04 | 3,98 ±

0,06 | 3,59 ±

0,07 | 5,11 ±

0,14 | 2,58 ±

0,09 | 3,60 ±

0,17

С14:1 | - | - | - | 2,03 ±

0,11 | 1,08 ±

0,07 | 0,39 ±

0,06

С15:0 | - | 4,21 ±

0,10 | 1,23 ±

0,08* | 2,22 ±

0,06* | 1,11 ±

0,13 | 1,87 ±

0,08

С16:0 | 6,55 ±

0,09 | 7,30 ±

0,08 | 28,80 ± 2,71* | 23,50 ± 0,20* | 16,90 ± 0,25** | 18,02 ± 0,46**

С16:1 | 2,82 ±

0,04 | 3,47 ±

0,08 | 8,42 ±

0,19* | 10,63 ± 0,47* | 5,28 ± 0,06** | 4,16 ± 0,26**

С17:0 | 2,03 ±

0,04 | - | 4,96 ±

0,15* | 9,10 ±

0,04* | 12,86 ± 0,30** | 4,11 ±

0,22

С17:1 | 30,00 ± 1,98 | 17,00 ± 0,99 | 6,96 ±

0,38* | 5,62 ±

0,53* | 21,70 ± 1,13** | 46,90 ± 2,75**

С18:0 | 11,90 ± 0,15 | 27,40 ± 2,60 | 13,98 ± 0,14* | 11,30 ± 0,26* | 11,60 ± 0,23** | 7,74 ± 0,06**

С18:1 | 5,84 ±

0,03 | 8,36 ±

0,14 | 21,30 ±

1,9* | 18,00 ± 0,17* | 15,70 ± 0,32** | 9,60 ± 1,42**

С18:2 | 31,78 ± 2,30 | 23,97 ± 1,50 | 4,04 ±

0,08* | 3,52 ±

0,10* | 2,47 ± 0,04** | 1,31 ± 0,07**

С18:3 | - | 0,72 ±

0,02 | - | - | 2,85 ± 0,19** | -

С20:1 | 3,22 ±

0,19 | - | - | - | - | -

С20:4 | - | - | - | - | 2,67 ± 0,04** | -

Примітки: * - Р < 0,05 - дані вірогідні між показниками 5-ти та 3-х місячних плодів;

** - Р < 0,05 - дані вірогідні між показниками 7-ми та 5-ти місячних плодів.

Основною ЖК БМ абсорбційних ентероцитів порожньої кишки 3-х місячних плодів є стеаринова (С18:0) кислота, вміст якої в 2,2 рази вище, ніж в АМ. В БМ, у порівнянні з АМ, встановлено нижчий вміст ненасичених ЖК - лінолевої (на 36,6 %) та гептадеценової (в 1,8 раза), проте частка олеїнової кислоти є вищою на 43 %. Загальний вміст насичених ЖК в БМ вищий, ніж в АМ в 1,8 раза, а ненасичених – нижчий на 27 %. Співвідношення насичені/ненасичені ЖК в БМ склало 0,87 ± 0,09, що нижче за цей показник в АМ у 2,5 раза.

Зміни ЖК складу плазмолеми абсорбційних клітин 5-ти місячних плодів можна роглядати як компенсаторний механізм по відношенню до змін динаміки вмісту ХС, що є необхідним для підтримання оптимальної в’язкості внутрішньої частини мембранного бішару (Dias V., 1995; Hansen G., 2005). Так, при зниженні вмісту ХС в плазмолемі, в ній встановлено підвищення вмісту насичених ЖК, що не властиво для великої рогатої худоби у постнатальному періоді онтогенезу (Цвіліховський М.І., 1989). При цьому співвідношення між насиченими та ненасиченими ЖК зростає: в АМ у 3,5 раза, а в БМ у