ХАРКІВСЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ імені В.Н.  КАРАЗІНА

Баєва Олена Юріївна

УДК: 575.222.7:575.16:633.16

ІНДУКЦІЯ І ПРОЯВ РАДІОАДАПТИВНОЇ ВІДПОВІДІ КЛІТИН ІНБРЕДНИХ ТА ГЕТЕРОЗИСНИХ РОСЛИН Helianthus annuus L.

03.00.15 - генетика  

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Харків – 2008

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Харківському національному університеті ім. В.Н. Каразіна

Міністерства освіти і науки України

Науковий керівник: | доктор біологічних наук, професор

Шестопалова Надія Григорівна

Харківський національний університет ім. В.Н. Каразіна Міністерства освіти і науки України,

професор кафедри генетики і цитології

Офіційні опоненти: |

доктор біологічних наук, професор

Чекалін Микола Михайлович

Полтавська державна аграрна академія Міністерства аграрної політики України, м. Полтава професор кафедри екології і ботаніки

кандидат біологічних наук, старший науковий співробітник

Попов Віталій Миколайович

Харківський національний аграрний університет

ім. В.В. Докучаєва

Міністерства аграрної політики України, м. Харків

доцент кафедри генетики, селекції і насінництва

Захист відбудеться “20” лютого 2008 р. о 1515 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради К 64.051.21 Харківського національного університету ім. В.Н. Каразіна Міністерства освіти і науки України за адресою:

61077, м. Харків, пл. Свободи, 4, біологічний факультет, ауд. III-15.

З дисертацією можна ознайомитись у Центральній науковій бібліотеці Харківського національного університету ім. В.Н. Каразіна Міністерства освіти і науки України за адресою: 61077, м. Харків, пл. Свободи, 4.

Автореферат розісланий “18” січня 2008 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради К 64.051.21. О.М. Федота

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Для теперішнього часу характерні зміни умов навколишнього середовища, пов'язані зі збільшенням техногенного стресорного навантаження на біологічні об'єкти. Радіаційний фактор за інтенсивністю впливу на організми є одним з найбільш значимих. У зв'язку з цим набувають актуальності дослідження, спрямовані на захист клітин і організмів, підвищення їх радіорезистентності до високих доз радіації.

Одним з механізмів захисту клітин від пошкоджуючого впливу радіації є індукована радіоадаптивна відповідь (РАВ), що проявляється в зменшенні наслідків впливу високих, ударних, доз радіації після попереднього опромінення малими, адаптувальними, дозами.

Індукція РАВ виявлена в експериментах з біологічними організмами різного рівня організації - від бактерій до тварин (Ikushima T., 1987; Wolff S., 1988; Bosi A., Olivieri G., 1989; Gadhia P.K., 1998; Wang B. et al, 1999; Цховребова Л.В., Македонов Г.П., 2004; Засухина Г.Д., 2005).

Розвиток адаптивної відповіді спостерігали при дії агентів різної природи (Котеров А.Н., Никольский А.В., 1999; Савина Н.В. и др., 2003), що особливо важливо у зв'язку з комплексним впливом генотоксичних агентів на організми в природному середовищі.

Індукцію феномена радіаційно-індукованої адаптивної відповіді пов'язують із підвищенням активності репарації ДНК (Газиев А.И., Безлепкин В.Г., 1989; Сынзыныс Б.Н. и др., 1990), зміною експресії генів, синтезом ферментів репарації ДНК додатково до конститутивних ферментів (Samson L., Cairns J.A., 1977; Филиппович И.В., 1991; Ikushima T., 1996; Гродзинський Д.М., 2000), а також зі стимуляцією проліферативних процесів, що забезпечують репопуляційне відновлення утворювальних тканин (Серебряный А.М, Зоз Н.Н., 2002; Долгова Т.А., Шестопалова Н.Г., 2000).

Дослідженню РАВ рослин приділялось недостатньо уваги. В той же час вони являють собою зручну модель для вивчення механізмів розвитку захисного ефекту при мутагенній дії іонізуючого випромінювання і самі потребують захисту. Підвищення радіостійкості рослин після опромінення насіння малими дозами радіації було описано в 1971р. (Куликов Н.В. и др., 1971) і виявлено в ряді досліджень, виконаних останнім часом (Kuglik P., 1992; Данильченко О.О., Гродзинський Д.М., 2004; Долгова Т.А., 2004; Серебряный А. М. и др., 2007). Вивчення ефекту РАВ на рівні меристемних тканин рослин має важливе значення у зв'язку з тим, що в основі процесів росту рослини, реалізації його генетичної програми розвитку, а отже, і формуванні врожайних якостей, лежить структурно-функціональна цілісність клітин меристеми і активність їх поновлення від пошкоджень (Гродзинский Д.М., Гудков И.Н., 1982).

Досить повно вивчена реакція інбредних і гібридних рослин на дію широкого діапазону доз іонізуючої радіації (Турбин Н.В. и др., 1977), проте здатність до індукованої адаптації у зв'язку з явищами інбредної депресії і гетерозису дотепер не досліджували. Не проводилась оцінка можливості тривалого збереження індукованого на стадії насіння РАВ в онтогенезі рослин з різним генотипом. Немає даних і про прояв захисної радіобіологічної реакції клітин у зв'язку із тривалим зберіганням опроміненого насіння, хоча досліджені механізми й зв'язок процесів природного й прискореного старіння (Гродзинский Д.М. и др., 1987; Соколов Н.В., Сорочинский Б.В., 2001).

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота виконана на кафедрі генетики і цитології Харківського національного університета ім. В.Н. Каразіна Міністерства освіти і науки України і є складовою частиною наукових досліджень за темами «Дослідження дії іонізуючого і неіонізуючого випромінювання на геном і механізмів стресового та антистресового впливу» за номером держреєстрації 0103U004274 і «Вивчити клітинні, генетичні механізми вікових змін і адаптивності» за номером держреєстрації 0106U001579.

Мета дослідження – з'ясування можливості індукції, показників прояву, ступеню вираженості і тривалості збереження індукованої РАВ у інбредних і гібридних рослин на клітинному рівні в результаті попереднього опромінення насіння в стадії спокою адаптувальними режимами гамма-радіації і радіохвиль міліметрового діапазону.

Виходячи з мети дослідження передбачалось вирішити наступні завдання:

1. Дослідити цитологічний прояв інбредної депресії і гетерозису у досліджуваних батьківських ліній і гібрида в нормі.

2. Вивчити можливість індукції РАВ під дією обраних адаптувальних і пошкоджуючого режимів опромінення на проростках насіння інбредних ліній Helianthus annuus L. і гетерозисного гібрида, отриманого від їхнього схрещування.

3. Оцінити розбіжності в ступені прояву радіаційнно-індукованої адаптивної відповіді залежно від генотипу рослини в ранній пострадіаційний період.

4. Дослідити можливість збереження РАВ в онтогенезі на рівні клітин листової меристеми вегетуючих рослин ліній і гібрида соняшника, що виросли з опроміненого насіння.

5. З'ясувати можливість тривалого збереження індукованої радіаційної адаптації при зберіганні і відбуванні при цьому прискореному старінні інбредного і гібридного насіння.

Об'єкт дослідження – індукована радіоадаптивна відповідь рослин.

Предмет дослідження – прояв радіоадаптивної відповіді на рівні клітин кореневої меристеми проростків насіння і листової меристеми вегетуючих рослин.

Методи дослідження: для вивчення цитофізіологічних і цитогенетичних характеристик меристеми проростків опроміненого насіння визначали показники рівнів та динаміки мітотичної активності протягом перших мітотичних циклів, синхронність вступу клітин в перший мітоз, відсоток проростків без мітозів, використовуючи світловой мікроскоп. Частоту й спектр структурних ушкоджень хромосом оцінювали за допомогою ана-телофазного методу обліку хромосомних мутацій. Проводили статистичний аналіз отриманих даних.

Наукова новизна отриманих результатів. У роботі вперше отримані експериментальні дані про можливість формування індукованої фізичними факторами (гамма-радіацією і радіохвилями міліметрового діапазону) РАВ клітин інбредних і гетерозисних рослин Helianthus annuus L. в ранній післярадіаційний період. Вперше досліджені показники прояву РАВ клітин листової меристеми в онтогенезі інбредних і гетерозисних вегетуючих рослин і встановлено збереження індукованої на ранніх стадіях розвитку РАВ протягом онтогенезу. Вперше досліджена можливість збереження індукованої радіоадаптації при тривалому зберіганні опроміненого насіння з різним генотипом і показані зміни показників РАВ клітин в умовах прискореного радіаційного старіння. Підтверджено ключову роль підвищеної інтенсивності проліферативних процесів у формуванні РАВ. Вперше проведене дослідження залежності ступеня прояву РАВ від генотипу рослини і виявлені відмінності в механізмах підвищення проліферативної активності клітин інбредних ліній і гетерозисного гібрида.

Практичне значення отриманих результатів. Виявлену здатність клітин меристеми інбредних ліній до активації проліферативних процесів в умовах дії попереднього опромінення можна використовувати як можливий шлях подолання негативних наслідків інбредної депресії. Отримані дані про підвищення стійкості рослин до дії високих доз іонізуючої радіації можуть бути основою для розробки методів захисту рослин при сільськогосподарському використанні радіаційно забруднених територій.

Результати дослідження можуть бути використані в навчальному процесі при викладанні спецкурсу «Радіаційна генетика».

Особистий внесок здобувача. Автором самостійно проведені добір, аналіз і узагальнення літературних джерел за темою дисертаційної роботи; проведені експериментальні дослідження і статистичний аналіз даних. Цитогенетичний аналіз кореневої меристеми Allium fistulosum L. виконаний спільно зі ст.н.с. НДІ біології ХНУ ім. В.Н.Каразіна Л.В.Винокуровой. Вибір напрямків дослідження, обговорення результатів і формулювання основних висновків проводились разом із науковим керівником.

Апробація результатів дисертації. Результати досліджень, викладені в дисертації, були представлені і обговорені на 6й Пущінській школі-конференції молодих вчених (Пущіно, 2002), III з’їзді українського біофізичного товариства (Львів, 2002), V і VII Міжнародних симпозіумах «Биологические механизмы старения» (Харків, 2002; 2006), 2й конференції Міжнародного товариства генетиків і селекціонерів ім М.І.Вавілова «Актуальные проблемы генетики», присвяченій 115-річчю зі дня народження акад. М.І.Вавілова (Москва, 2003), 2й міжнародній конференції молодих вчених «Современные проблемы генетики, биотехнологии и селекции растений» (Харків, 2003), 5й Міжнародній міждисциплінарній науково-практичній конференції «Сучасні проблеми науки та освіти» (Алушта, 2004), VII Міжнародній науковій екологічній конференції «Актуальные проблемы сохранения устойчивости живых систем» (Бєлгород, 2004), конференції «Медико-биологические проблемы противолучевой и противохимической защиты» (Санкт-Петербург, 2004), I Міжнародній науковій конференції студентів і аспірантів «Молодь і поступ біології» (Львів, 2005), Міжнародній конференції «Генетика в России и мире», присвяченої 40-річчю Інституту загальної генетики ім. М.І.Вавілова РАН (Москва, 2006), VI Всеукраїнській науковій конференції студентів і аспірантів (Київ, 2006), VIII з’їзді Українського товариства генетиків і селекціонерів ім. М.І.Вавілова (Алушта, 2007).

Публікації. За матеріалами дисертаційної роботи опубліковано 17 наукових праць, у тому числі 5 статей (з них 4 – у фахових виданнях України), 12 – в матеріалах наукових конференцій.

Структура і об'єм дисертації. Дисертація викладена на 146 сторінках тексту, складається зі вступу, огляду літератури, розділу «Матеріали і методи дослідження», 3 розділів власних досліджень, заключення, висновків, списку використаної літератури (201 джерело, з них 157 – кирилицею, 44 - латиницею). Дисертація містить 16 таблиць, 33 рисунки, 6 мікрофотографій аберацій в клітинах кореневої меристеми.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ

Матеріалом для дослідження було насіння соняшника Helianthus annuus L.: батьківських ліній Сх503А і Х711В, і гібрида Харківський 58, отриманого шляхом їх схрещування в Інституті рослинництва ім. В. Я. Юр'єва УААН, а також насіння цибулі Allium fistulosum L. (сорт П’єро) селекції Інституту овочівництва і баштанництва УААН. Насіння одного року врожаю опромінювали гамма-радіацією 60Со (потужність опромінення – 3,21 Гр/хв) у адаптувальній дозі 50 Гр (соняшник), 40 Гр (цибуля), ударній дозі 200 Гр, і для індукції РАВ послідовно за схемами 50 (40) Гр - 200 Гр і ммХ - 50 Гр - 200 Гр. Час між адаптувальним і ушкоджуючим впливами у варіантах із попереднім опроміненням становив 3-4 години. Радіохвилі мм-діапазону (ммХ), (ЩПЕ – 100 мкВт/см2, f – 61,5 ГГц, час впливу – 20 хв) застосували як відомий радіопротекторний і стимулюючий фактор. В якості контрольних використовували неопромінені насіння.

Партії насіння розділили на дві частини для вивчення в ранній пострадіаційний період (свіжеопромінене насіння, СВ) і після трирічного зберігання (насіння, що зберігали, ЗБ). Частину свіжеопроміненого насіння висаджували на експериментальній ділянці біостанції ХНУ ім. В.Н. Каразіна (с. Гайдари) для цитологічного аналізу листової меристеми в ранній (4-5 лист) і пізній (16-17 лист) періоди вегетації. Інші пророщували в рулонах фільтрувального паперу при температурі 22-230С для цитологічного аналізу кореневої меристеми проростків.

Відбирали насіння з однаковою швидкістю проростання й фіксували в оцтовому алкоголі (96% етиловий спирт і крижана оцтова кислота в співвідношенні 3:1) протягом перших мітотичних циклів через кожні 2 години, відбираючи для кожного варіанта по 5-8 корінців на одну точку фіксації. Фіксацію проводили протягом 30 хв., після чого матеріал промивали двічі в 96% етиловому спирті і зберігали в 70% його розчині. Було проведено по 10 фіксацій кожного варіанта опромінення, кожної досліджуваної форми. Фіксування листової меристеми в кожен досліджуваний період проводили однократно, відбираючи для кожного варіанта по 4-6 листових пластинок.

Аналіз мітотичної активності кореневої меристеми проводили на постійних давлених препаратах, забарвлених реактивом Шиффа (фуксинсерніста кислота) по реакції Фьольгена (Паушева З.П., 1980), що є специфічною на ДНК, при гарячому гідролізі. Листову меристему досліджували на тимчасових давлених препаратах, забарвлених ацетолакмоїдом. На препаратах визначали мітотичний індекс (МІ, відношення кількості клітин, що діляться, до загальної кількості проаналізованих (1000), виражене у відсотках), синхронність вступу клітин до першого мітозу (за максимальними значеннями МІ першої хвилі мітозів). Для визначення рівня хромосомного мутагенезу використовували ана-телофазний метод. Загалом було проаналізовано 1  клітин кореневої і 110 клітин листової меристеми.

Статистичний аналіз даних проведено з використанням критерія Фішера (Лакин Г.Ф., 1990). Для перевірки нормальності розподілу використовували тест Шапіро-Уїлка для вибірок менше 30 дат (Атраментова Л.О., Утевська О.М., 2007); нормальність розподілу дозволила для аналізу впливу генотипу та дози опромінення використовувати двохфакторний дисперсійний аналіз (Лакин Г.Ф., 1990).

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕННЯ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

Індукція і прояв РАВ клітин кореневої меристеми проростків ліній і гібрида H. annuus L. в ранній післярадіаційний період. Результати дослідження рівнів і динаміки мітотичної активності кореневої меристеми проростків гібрида і його батьківських ліній в ранні строки проростання насіння в нормі (рис. 1) показали перевагу гібрида над батьківськими лініями, що проявлялась в більш раннім формуванні першої хвилі мітозів (на 35 годині в порівнянні з лініями - на 41 у батьківської і 45 у материнської) і різкому збільшенні числа клітин, що діляться, в 1,5 рази (з 3,0±0,5% до 8,3±0,8%, р<0,001), що відбиває більш високий ступінь синхронізації мітозів в меристемі гібрида.

Для оцінки реакції організму на послідовну дію генотоксичних агентів у малій і великій дозі, тобто дослідження ефекту адаптивної відповіді, необхідно попереднє вивчення закономірностей впливу кожного режиму окремо. Стимулюючу і пошкоджуючу дію доз 50 і 200 Гр визначали при порівнянні з неопроміненим контролем.

Рис. 1. Рівні та динаміка мітотичної активності кореневої меристеми проростків насіння ліній і гибрида H. annuus L. в контролі.

Примітка: тут і далі Р1 – материнська лінія; Р2 – батьківська лінія; F1 - гібрид.

Незначна стимуляція мітотичної активності клітин під впливом дози 50 Гр була відзначена у материнської форми (збільшення середньої кількості мітозів з 5,2±0,7 в контролі до 6,4±0,8% у варіанті 50 Гр), і гібрида (з 7,5±0,8 до 8,3±0,9%). Для гібрида, на відміну від материнської лінії, характерний не стимульований, а високий природний рівень мітотичної активності (рис. 2): максимальні значення

Рис. 2. Вплив адаптувальної (50 Гр) і пошкоджуючої (200 Гр) доз гамма-радіації на мітотичну активність ліній і гібриду H. annuus L. в ранній післярадіаційний період.

Примітка: 1 - контроль; 2 – 50Гр; 3 – 200Гр.

мітотичних індексів, МІ, що відповідають пікам мітотичної хвилі у варіанті 50 Гр вірогідно не відрізнялись від контролю, у материнської лінії відбулось їх збільшення на 2,5% (р<0,05). У батьківської лінії стимуляція виражена незначно – перевищення над контролем відзначали тільки в окремих фіксаціях (37-39 й 49-51 години). Під впливом ударної дози у всіх досліджуваних форм відбувалось зменшення проліферативної активності у порівнянні з неопроміненим контролем, але в різному ступені. Вірогідне зниження середніх значень МІ відбулось в меристемі батьківської лінії (з 5,6±0,7 до 3,7±0,5%; р<0,05) і гібрида (з 7,5±0,8 до 3,6±0,5%; р<0,01). В перші години спостереження (33-35 г.) інтенсивність розмноження клітин істотно знижувалась; у батьківської форми відзначали затримку мітозів на 2 години (рис. 2).

Максимальне пригнічення розмноження клітин спостерігали у гібрида, особливо на 33-37 годинах, коли мітотичний індекс знижувався в 8 разів у порівнянні з контролем (р<0,01). Можливо, таке значне пригнічення у гібрида пов'язане з меншою тривалістю мітотичного циклу (Шестопалова Н.Г., 1981) і меншою гетерогенністю популяції меристем у насіння гібридних рослин (Гродзинський Д.М., 2000). Крім того, протягом першого мітотичного циклу у гетерозисних гібридів відновлюється в два рази більше клітин, ніж у батьківських форм, і зниження мітотичної активності могло бути пов'язане з протіканням процесів репарації. Дані аналізу кількості клітин з абераціями хромосом (табл. 1) показують, що у гібрида в варіанті 200Гр частота клітин з абераціями хромосом вірогідно (р<0,01) нижча, ніж у материнської лінії.

Таблиця 1

Форма | 200Гр | 50-200 | ммХ-50-200

Кіль-кість ана-телофаз | З них з абераціями хромосом | Кіль-кість ана-телофаз | З них з

абераціями хромосом | Кіль-кість ана-телофаз | З них з абераціями хромосом

шт. | % | шт. | % | шт. | %

Р1 | 636 | 115 | 18,0 ± 1,6 | 270 | 32 | 11,8***±1,9 | 859 | 149 | 17,3 ±1,3

Р2 | 770 | 103 | 13,4 ± 1,5 | 407 | 35 | 8,6***±1,3 | 593 | 43 | 7,2***±1,0

F1 | 710 | 82 | 11,5 ± 2,2 | 776 | 86 | 11,1 ±1,0 | 793 | 82 | 10,3 ±0,9

Частота ана- і телофаз з абераціями хромосом в кореневій меристемі ліній і гібрида H.annuus L. після опромінення насіння гама-радіацією та радіохвилями мм-діапазону

Примітка: вірогідність різниці між варіантом 200Гр і варіантами 50-200, ммХ-50-200 при

* - р<0,05, *** - р<0,001

Прояв РАВ оцінювали, порівнюючи показники варіанта 200Гр і показники варіантів з попереднім впливом адаптувальних режимів. В ранні години росту проростків (33-41) (рис. 3А) для материнської форми відзначали лише слабку тенденцію до формування РАВ після сумісного впливу двох адаптувальних режимів (варіант ммХ-50-200). За попередньої дії гама-радіації (варіант 50-200) не тільки не індукувалась РАВ, але й відбувалося зниження мітотичної активності в 3 рази в порівнянні з варіантом 200Гр (р<0,001). Відомо, що в клітинах інбредних ліній багато генів знаходиться в репресованому стані (Wang Zh. et al., 2006), а формування РАВ може бути пов’язано з їх активацією. Певно, на даному етапі росту попередній вплив двох, а тим більше одного адаптувального фактора, не призвів до необхідного ступеню дерепресії генома.

У батьківської лінії в ранні строки після опромінення РАВ не індукувалась в жодному з варіантів. Можна зробити висновок про зв'язок стимулюючого впливу адаптувальної дози (у батьківської лінії його відзначено не було) і формуванням адаптивної відповіді. Протягом росту проростків (рис. 3Б) спостерігали тенденцію до підвищення ступеня виразності індукованої попереднім впливом адаптувальних режимів РАВ у ліній.

Рис. 3. Індукція радіоадаптивної відповіді (РАВ) за критерієм мітотичної активності кореневої меристеми проростків свіжеопроміненого насіння ліній і гібрида H.annuus L. (А – 33-41 години початкового росту проростків; Б – 43-51 години).

Примітка: вірогідність різниці між варіантом 200Гр і варіантами 50-200, ммХ-50-200 при

** - р<0,01, *** - р<0,001

У гібрида РАВ чітко проявлялась в обох варіантах протягом усього періоду спостереження. Попередній адаптувальний вплив одного фактора (50-200) обумовив збільшення мітотичної активності в 2 рази (р<0,001), а двох факторів (ммХ-50-200) – в 3 рази (р<0,001) у порівнянні з варіантом 200 Гр, тобто захисна реакція в більшій мірі проявляється при дії двох адаптувальних режимів. Максимальна виразність РАВ за показником мітотичної активності у гібрида обумовлена, очевидно, його гетерозисним станом, що забезпечує більш активне протікання процесів репопуляції.

За рівнем хромосомного мутагенезу (табл. 1) РАВ спостерігали у ліній: частота клітин з хромосомними абераціями у варіантах з попереднім впливом була нижча, ніж при дії тільки ударної дози. У гібрида РАВ виявлялась як зниження максимальних значень частоти аберантних клітин з 28,6% у варіанті 200 Гр, до 24,7% у варіанті 50-200 і до 19,2% (р<0,001) при спільній дії двох адаптувальних режимів.

Індукція і прояв РАВ в онтогенезі інбредних ліній і гетерозисного гібрида H.annuus L. Цитологічні дослідження проводили на клітинах листової меристеми вегетуючих рослин у ранній (4-5 лист) і пізній (16-17) періоди вегетації. Порівняння проліферативної активності кореневої і листової меристем показало (рис. 4), що мітотична активність знижується з віком: у листах рослин МІ в 1,5 рази нижче, ніж у коріннях проростків (р<0,01). Меристема гетерозисних рослин залишається більш активно проліферуючою, ніж меристема батьківських ліній, не тільки в період проростання насіння, але й протягом усього періоду онтогенезу: середні значення МІ листової меристеми гетерозисних рослин перевищують МІ ліній в 2 і 1,5 рази (р<0,01-0,001), що підтверджує отримані раніше дані (Баєва Т.І., 1996).

Рис. 4. Зміна рівня проліферативної активності меристем з віком рослин H.annuus L.

Примітка: розходження між лініями і гібридом вірогідні при **- р<0,01; ***- р<0,001

Вплив адаптувального режиму опромінення насіння на мітотичну активність клітин листової меристеми батьківських форм і гібрида в ранній період вегетації (рис. 5А) показав, що стимуляція мітотичної активності під впливом дози 50Гр більше виражена у материнської лінії, для якої характерний найнижчий її показник у нормі (в контролі МІ=3,8±0,3%, у варіанті 50Гр - 6,1±0,5%, р<0,001). Подібні результати отримані й для рослин батьківської лінії (р<0,01). Стимуляційний ефект адаптувального режиму найменшою мірою був виражений у гібрида й проявлявся як тенденція (в контролі МІ=7,1±0,3%, у варіанті 50Гр - 7,8±0,2%).

В меристемі гібрида в більшій мірі, ніж у батьківських ліній, відбувалось зниження здатності клітин до проліферації під впливом дози 200Гр (р<0,05). МІ знижувався з 7,1±0,3% до 5,5±0,3%. В меристемі батьківських ліній рівень мітотичної активності вірогідно не відрізнявся від контролю.

Перевищення показників мітотичної активності клітин меристеми листів після попереднього опромінення насіння ліній і гібрида одним і двома фізичними факторами свідчить про формування РАВ, але ступінь виразності феномена різний. Максимальний прояв РАВ в ранній період вегетації спостерігали у материнської лінії у варіанті ммХ-50-200 (р<0,01), що стало наслідком значної стимуляції мітотичної активності під впливом дози 50 Гр. РАВ клітин батьківської лінії й гібрида формувався під впливом обох адаптувальних режимів, але, на відміну від лінії, у гібрида феномен виявлявся лише як тенденція.

Рис. 5. Мітотична активність клітин листової меристеми вегетуючих рослин ліній і гібриду H. annuus L., що виросли з опроміненого насіння: А – ранній період вегетації, 4-5 лист; Б – пізній період вегетації 16-17 лист.

Примітка: 1 – контроль, 2 – 50Гр, 3 – 200Гр, 4 – 50-200, 5 – ммХ-50-200;

відмінність від контролю і 200 Гр при * - р<0,05; ** - р<0,01; *** - р<0,001

Зміна рівня мітотичної активності листової меристеми в онтогенезі рослин (рис. 4 и 5Б) складалась в зниженні проліферативної здатності клітин листів в пізній період вегетації в порівнянні з його раннім етапом в 2 рази (р<0,001), що узгоджується з положеннями адаптаційно-регуляторної теорії старіння (Фролькіс В.В., 1999)

В пізній період вегетації стимуляційний ефект дози 50Гр зберігався. В цей період онтогенезу ефект стимуляції мітотичної активності в більшій мірі, ніж у ранній період вегетації, був виражений у гібрида (МІ=3,0±0,5% у контролі й 5,2±0,7% у варіанті 50Гр, р<0,01).

Прояв індукованої адаптивної відповіді до радіації інбредних рослин у пізній період вегетації зберігався. В клітинах меристеми гібрида спостерігали достовірний (р<0,01) прояв РАВ: перевищення значення дози 200Гр в 1,5 (50-200) і 2 (ммХ-50-200) рази. Захисний ефект комбінованого адаптувального попереднього опромінення у гібрида відзначали і за збільшеними на 40 й 70% діаметрам кошиків. Очевидно, мм-хвилі, як радіопротектор (Галат В.В и др., 1999), посилювали позитивний ефект дози 50Гр у гібрида більшою мірою, ніж у батьківських форм.

Аналіз частоти клітин з абераціями хромосом не виявив аберантних ана-телофаз у листовій меристемі рослин, що виросли з опроміненого насіння.

Результати вегетаційного експерименту дозволяють заключити, що обов'язковою умовою формування адаптивної відповіді як інбредних ліній, так і гетерозисного гібриду, є підвищена інтенсивність розмноження клітин.

Індукція і прояв РАВ в процесі природного і прискореного радіаційного старіння насіння. Насіння рослин є зручною моделлю для вивчення можливості тривалого збереження індукованої адаптації. Отримані дані на проростках інбредного і гетерозисного насіння H. annuus L., а також насіння модельного об'єкта цибулі A. fistulosum L., що зберігали протягом 3 років після опромінення, порівнювали з показниками свіжеопроміненого насіння. При зберіганні насіння соняшника спостерігали природне зниження проліферативної активності клітин кореневої меристеми проростків, яке у гібрида відбувалось в меншому ступені (рис. 6). Також з'являлись проростки, в меристемі яких були відсутні клітини, що діляться, або зустрічалися поодинокі мітози (рис. 7). Стимулююча дія адаптувальної дози складалась в зниженні частки проростків без мітозів у ліній. У гібрида стимулюючий ефект за цим критерієм не виявлений (рис. 7).

Рис. 6. Зниження мітотичної активності клітин кореневої меристеми ліній і гібриду H.annuus L. при зберіганні насіння. ** - р<0,01; *** - р<0,001

Рис. 7. Зростання частки проростків без мітозів в партіях насіння ліній і гібрида H. annuus L. після дії опромінення і при зберіганні насіння.

Під впливом дози 50Гр максимальні значення мітотичних індексів, що відображають синхронізацію перших мітозів, вірогідно не відрізнялись від контролю у гібрида і підвищувались у ліній (Р1: 1,6±0,4 в контролі, 8,3±0,8 – 50Гр, р<0,001; і Р2: 4,4±0,5 в контролі, 6,1±0,6 – 50Гр, р<0,05), тобто стимуляцію мітотичної активності спостерігали у ліній, для яких в контролі вона була в кілька разів нижча в порівнянні з гібридом (р<0,01). Відсутність чітко вираженої стимуляції клітинної проліферації в меристемі гібрида пов'язано, можливо, з її високим природним рівнем.

У зв’язку із пізньою появою мітозів в меристемі проростків насіння, опроміненого 200Гр, про формування РАВ судили виходячи з даних, отриманих на 43-47 годинах росту проростків, коли відбулась стабілізація рівня мітотичної активності (рис. 8).

Рис. 8. Прояв РАВ за критерієм мітотичної активності клітин кореневої меристеми проростків насіння H.annuus L. після зберігання, в період 43-47ї годин росту.

Примітка: ** - р<0,01; *** - р<0,001

РАВ як збільшення проліферативної активності у варіантах із попереднім впливом адаптувальних режимів спостерігали у ліній. У зв'язку з відсутністю стимулюючого ефекту дози 50 Гр у гібрида, можна було очікувати й відсутність здатності клітин до індукції адаптивної відповіді, тому що одним з умов його розвитку є стимуляція проліферації адаптувальною дозою, що підтверджують дані обліку мітотичної активності проростків старого насіння цибулі (табл. 2): стимулюючий ефект адаптувальної дози 40Гр був відсутній і індукції достовірної РАВ не відбувалось. Проте, РАВ у гібрида соняшника була чітко виражена (рис. 8), показники мітотичної активності у варіантах 50-200 і ммХ-50-200 вірогідно перевищували аналогічні показники варіанта 200Гр (р<0,001).

Таблиця 2

Рівень мітотичної активності, частота і спектр мутацій хромосом в меристемі проростків A. fistulosum L. після трирічного зберігання

опроміненого насіння

Варіант експерименту | Мітотичні індекси

(МІ, %) | Ана-телофази з абераціями хромосом

Частота, % від загальної кількості ана-телофаз | Частка клітин з мостами | Частка клітин з фрагментами | Частка клітин з множинними пошкодженнями

Контроль | 3,4±0,5 | 8,9 | 33,3 | 58,4 | 8,3

40 Гр | 2,2±0,4 | 11,6 | 16,1 | 36,7 | 48,2

200 Гр | 0,7±0,1*** | 44,5*** | 38,2 | 8,5 | 56,3

40-200 | 0,9±0,2 | 50,0 | 40,0 | 12,2 | 48,4

В меристемі проростків свіжеопроміненого насіння вплив радіохвиль як додаткового адаптувального фактора в більшій мірі, ніж опромінення тільки гамма-радіацією, індукувало підвищення мітотичної активності клітин. При зберіганні насіння спостерігали зворотний ефект, виразність РАВ у варіанті ммХ-50-200 була вища, ніж в 50-200 тільки у батьківської форми (р<0,05). Стимулюючий вплив радіохвиль проявився в збільшенні частки проростків з мітозами (рис. 7).

Вплив зберігання опроміненого насіння на частоту і спектр аберацій хромосом (табл. 3). З віком насіння і збільшенням дози опромінення частота аберацій істотно зростала в меристемі інбредних ліній: до 37,7±2,6% у материнської і 54,5±2,9% у батьківської (р<0,001). У гібрида при опроміненні як адаптувальною, так і ударною дозами рівень аберантних клітин був нижче, ніж у ліній (р<0,01-0,001), а при зберіганні частота аберацій зросла тільки до 31,0±2,3% (р<0,01).

Індукція РАВ, тобто зменшення кількості клітин з ушкодженнями в умовах попереднього впливу адаптувальних режимів відбулась в клітинах меристеми свіжеопроміненого насіння і після його трирічного зберігання у батьківської лінії (р<0,01) (табл. 3), що, очевидно, пов'язане із затримкою розподілів (на 6 годин) і можливою репарацією ушкоджень в цей час. У материнської лінії і гібрида спостерігали слабко виражену тенденцію: у лінії - у меристемі свіжеопроміненого насіння, а у гібрида - в меристемі і свіжеопроміненого насіння і після його зберігання. Вплив радіохвиль як додаткового адаптувального фактора, знижувало рівень аберацій хромосом в більшій мірі, ніж попереднє опромінення однією гамма-радіацією.

Таблиця 3

Частота аберантних ана-телофаз у кореневій меристемі проростків свіжеопроміненого насіння (СВ) і насіння, що зберігали після опромінення (ЗБ), ліній і гібрида H. annuus L., в % від загальної кількості ана-телофаз

Варіант експерименту | Частота аберацій в меристемі проростків СВ | Відмінність від контролю і 200Гр | Частота аберацій в меристемі проростків ЗБ | Відмінність від контролю і 200Гр | Вірогідність СВ-ЗБ

Материнська лінія

Контроль | 0,60,1 | 9,10,2

50 Гр | 5,10,9 | <0,001 | 17,51,5 | <0,001 | <0,01

200 Гр | 18,71,2 | <0,001 | 37,72,6 | <0,001 | <0,001

50-200 | 11,81,9 | <0,01 | 46,32,8 | <0,05 | <0,001

ммХ-50-200 | 17,3 1,3 | 36,02,2 | <0,01

Батьківська лінія

Контроль | 0,30,1 | 6,60,9 | <0,01

50 Гр | 3,40,8 | <0,01 | 18,91,7 | <0,001 | <0,01

200 Гр | 14,21,3 | <0,001 | 54,52,9 | <0,001 | <0,001

50-200 | 8,01,4 | 50,63,0 | <0,001

ммХ-50-200 | 6,71,1 | <0,05 | 35,22,3 | <0,01 | <0,001

Гібрид

Контроль | 0,90,2 | 3,30,8* | <0,05

50 Гр | 4,51,1 | <0,01 | 11,81,5** | <0,01 | <0,05

200 Гр | 11,71,2**1 | <0,001 | 31,02,3 | <0,001 | <0,01

50-200 | 11,12,4 | 31,32,4*** | <0,01

ммХ-50-200 | 10,31,2 | 29,21,9* | <0,01

1 – вірогідність різниці між лініями і гібридом *-при р<0,05; **-при р<0,01; ***-при р<0,001

Відомо, що в ході природного старіння насіння спостерігається зміна типів аберацій хромосом (Орлова Н.Н., 1972). Основними типами ушкоджень, що були зареєстровані в меристемі проростків соняшника, були мости і множинні аберації хромосом (рис. 9). В меристемі свіжеопроміненого насіння доля клітин з мостами після впливу дози 50Гр досягала 60-65% у ліній і менше (р<0,01), 50%, у гібрида. В меристемі проростків насіння після зберігання кількість клітин з мостами знижувалась до 40-55%, але зростала частота анафаз з множинними абераціями.

Так, у варіанті 50 Гр їх частка в загальному числі клітин з абераціями підвищувалася в 3-5 разів у порівнянні зі свіжеопроміненими (р<0,001), а при збільшенні дози до 200 Гр множинні ушкодження становили 30-37% у ліній і в 1,5-2 рази менше - 20% - у гібрида (р<0,001). Збільшення частки множинних аберацій хромосом при зберіганні опроміненого насіння інтенсивніше відбувалось в клітинах ліній порівняно з гібридом.

Рис. 9. Множинні структурні мутації хромосом в клітинах кореневої меристеми проростків опроміненого насіння H.annuus L. (А) і A.fistulosum L. (Б).

За частотою клітин із множинними абераціями РАВ проявлялась в меристемі проростків свіжеопроміненого насіння у всіх досліджуваних форм, про що свідчить зниження показника в порівнянні з варіантом 200 Гр (р<0,05-0,001). В меристемі проростків насіння після зберігання РАВ за цим показником або не проявлялась, або була слабко виражена. Відсутність РАВ, очевидно, пов'язана із частковою загибеллю й елімінацією ушкоджених клітин із популяції під впливом дози 200Гр і тривалого зберігання насіння. Аналогічну тенденцію до зниження кількості множинних ушкоджень хромосом після попереднього впливу адаптувального режиму виявлено в клітинах A.fistulosum L. (табл. 2).

ВИСНОВКИ

В дисертаційній роботі представлено теоретичне узагальнення і нове експериментальне вирішення наукової задачі, яка полягає у вивченні можливості індукції, показників прояву, ступеню вираженості і тривалості збереження індукованої радіоадаптивної відповіді клітин у інбредних і гетерозисних рослин в результаті попереднього опромінення насіння адаптувальними режимами гамма-радіації і радіохвиль міліметрового діапазону. В результаті дослідження можливо зробити наступні основні висновки.

1. Інбредна депресія у батьківських ліній і гетерозис у гібрида чітко виявляється в нормі за показниками рівня і динаміки мітотичної активності клітин кореневої меристеми проростків і листової меристеми вегетуючих рослин. Природна проліферативна активність меристеми гібрида в 1,5-2 рази вище, ніж у ліній (р<0,01-0,001) на протязі всього періоду онтогенезу.

2. Стимуляція мітотичної активності клітин під впливом дози 50Гр відбувається у материнської лінії, для якої характерний низький рівень мітозів в нормі. Під впливом ударної дози у всіх досліджуваних форм інтенсивність розмноження клітин істотно зменшується, максимальне зниження проліферативної активності спостерігали у гібрида.

3. Вплив на насіння інбредних ліній і гетерозисного гібрида соняшника адаптувальних режимів індукує радіоадаптивну відповідь, яка проявляється на клітинному рівні в ранній післярадіаційний період, в онтогенезі рослин, і після трирічного зберігання опроміненого насіння.

4. На ранніх етапах проростання насіння в ранній післярадіаційний період феномен радіоадаптивної відповіді виявляється в клітинах ліній і гібрида, але ступінь його виразності різний. Максимально індукована дією радіації адаптивна відповідь виражена в меристемі гібрида. Захисна реакція (РАВ) в більшій мірі активується при дії двох адаптувальних режимів (варіант ммХ-50-200), і проявляється в стимуляції мітотичної активності клітин, зниженні рівня хромосомного мутагенезу, зниженні частоти клітин із множинними абераціями хромосом.

5. Індукована на ранніх етапах росту рослин за показниками рівня мітотичної активності РАВ зберігається в онтогенезі протягом усього періоду вегетації. В ранній період вегетації (4-5 лист) максимальний стимуляційний ефект мітотичної активності і прояв РАВ виявляється у материнської лінії. В пізній період вегетації (16-17 лист), коли починають формуватися генеративні органи і компоненти врожаю, максимальний рівень мітотичної активності і РАВ спостерігали у гетерозисних рослин.

6. При зберіганні опроміненого насіння природне зниження проліферативної активності, а також нагромадження аберацій хромосом меншою мірою відбувається в меристемі гібрида в порівнянні з лініями, що відбиває більшу стабільність його генома. Після трирічного зберігання опроміненого насіння стимулюючий ефект адаптувальної дози, необхідний для індукції РАВ, зберігається у ліній, і проявляється за критерієм мітотичної активності клітин меристеми і не виявлений у гібрида.

7. Ступінь прояву РАВ за критерієм мітотичної активності в меристемі проростків інбредних ліній в перші години проростання насіння після зберігання був нижчий, ніж у свіжеопроміненого насіння і гібрида. В пізні строки росту проростків РАВ індукувався в меристемі всіх форм.

8. Вихід хромосомних аберацій має дозовий характер, збільшується при старіння насіння. За рівнем радіаційно-індукованого мутагенезу інбредні лінії перевищують гібрид. При зберіганні опроміненого насіння збільшення частки клітин з множинними абераціями хромосом відбувається в більшій мірі в меристемі ліній. Адаптувальне опромінення насіння призводить до зниження частки клітин з множинними абераціями хромосом в меристемі проростків свіжеопроміненого насіння і після його зберігання, що, можливо, пов’язано із загибеллю і елімінацією із популяції ушкоджених клітин.

9. Обов'язковою умовою формування РАВ є стимуляція поділу клітин для репопуляційного відновлення рослин. Механізми підвищення мітотичної активності ліній і гібридів різні - у ліній стимуляція проліферації викликається впливом на насіння адаптувальних режимів. Підвищений рівень мітотичної активності клітин меристеми гібридів є в певній мірі наслідком гібридизації, розвитку гетерозиготи й проявом гетерозису.

СПИСОК ПУБЛІКАЦІЙ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Шестопалова Н.Г., Баева Е.Ю. Митотический потенциал корневой и листовой меристемы гетерозисных растений в период раннего и позднего онтогенеза // Вісник Харківського національного аграрного университету. Сер. Біологія. – 2004. – Вип. 1 (4). – С. 64-69.

2. Баева Е.Ю. Индукция и проявление радиоадаптивного ответа клеток корневой меристемы линий и гибрида подсолнечника // Вісник Харківського національного університету. Серія: Біологія. – 2006. – Вип. 3 (№ 729). – С. 47-52.

3. Баева Е.Ю. Влияние хранения облученных семян на проявление радиоадаптивного ответа клеток корневой меристемы проростков Helianthus annuus L. с разным генотипом // Вісник Харківського національного аграрного университету. Сер. Біологія. – 2007. – Вип. 2 (11). – С. 93-99.

4. Шестопалова Н.Г., Баева Е.Ю. Радиоадаптивный ответ клеток листовой меристемы инбредных линий и гетерозисных растений Helianthus annuus L. В период раннего и позднего онтогенеза // Цитология и генетика. – 2007. – Т. 41, № 6. – С. 44-49.

5. Баева Е.Ю. Изменение цитогенетических показателей радиоадаптивного ответа при хранении семян Helianthus annuus L. с разным генотипом // Досягення і проблеми генетики, селекції та біотехнології: Зб. наук.