НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ
ІНСТИТУТ МОЛЕКУЛЯРНОЇ БІОЛОГІЇ ТА ГЕНЕТИКИ

_________________________________________________________

МІРОШНИЧЕНКО ДАР’Я ОЛЕКСАНДРІВНА

УДК 616–006:577.2.575

СТРУКТУРА І ФУНКЦІЇ ГТФаз- МОДУЛЮЮЧИХ ДІЛЯНОК БІЛКА BCR ПРИ Ph’- ПОЗИТИВНИХ ЛЕЙКЕМІЯХ

03.00.03 –молекулярна біологія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня
кандидата біологічних наук

КИЇВ -2008

Дисертацією є рукопис.

Роботу виконано у відділі молекулярної генетики Інституту молекулярної біології та генетики НАН України.

Науковий керівник: кандидат біологічних наук, старший науковий співробітник

Телегеєв Геннадій Дмитрович,

Інститут молекулярної біології та генетики НАН України,

старший науковий співробітник відділу молекулярної генетики.

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор

Дробот Людмила Борисівна,

Інститут біохімії імені О.В.Палладіна НАН України,

завідувач лабораторії сигнальних механізмів клітини;

доктор біологічних наук, професор

Негруцький Борис Сергійович,

Інститут молекулярної біології та генетики НАН України,

завідувач лабораторії біосинтезу білка

відділу механізмів трансляції генетичної інформації.

Захист відбудеться “22” квітня 2008 року о 10 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.237.01 Інституту молекулярної біології та генетики НАН України за адресою: 03680, м.Київ, вул. Заболотного, 150.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту молекулярної біології та генетики НАН України.

Автореферат розіслано 22 березня 2008 року.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради,

кандидат біологічних наук О.В. Підпала

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Лейкемії –група захворювань, які характеризується безконтрольною проліферацією кровотворних клітин і порушенням їхнього диференціювання. Вважають, що всі лейкемічні клітини є потомками однієї плюрипотентної стовбурової клітини, яка була злоякісно трансформована і передала ці властивості далі, після чого популяція клітин із порушеннями диференціювання прогресує і поступово замінює нормальні гемопоетичні клітини . Причиною таких змін прийнято вважати хромосомні аберації –транслокації, інверсії, делеції тощо. Філадельфійська (Ph’) хромосома –перший описаний цитогенетичний маркер хронічної мієлоїдної лейкемії (ХМЛ), що є результатом реципрокної транслокації між 22 і 9 хромосомами і по суті є укороченою 22 хромосомою. Внаслідок цього утворюється гібридний ген bcr-abl, продукт якого, як вважають, спричиняє розвиток хвороби. Наявність Ph’- хромосоми детектують в 95 % випадків захворювання на ХМЛ та 30 % випадків гострого лімфобластного лейкозу (ГЛЛ) у дорослих і 2-10 % ГЛЛ у дітей .

Розриви в гені abl відбуваються таким чином, що вони не змінюють структурну частину гібридного білка, що належить Abl. На відміну від цього, ген bcr має три ділянки, в яких розриви відбуваються найчастіше і залежно від точки розриву bcr, утворюються три різні за довжиною форми білка Bcr-Abl. Показано, що три види білка Bcr-Abl відповідають різним формам захворювання. Так, білок р210 Bcr-Abl виявляють при ХМЛ, р190 Bcr-Abl –при ГЛЛ, а найдовшу форму р230 Bcr-Abl –при відносно доброякісній нейтрофільній формі мієлоїдної лейкемії .

Мультидоменний білок Bcr має у своєму складі DH (Dbl-гомологічний) і РН (pleckstrin- гомологічний) домени, що знаходяться в ділянці, яка відрізняє між собою форми р190 і р210 Bcr-Abl. Відомі експериментальні дані недостатньо описують функціональну активність цих доменів як у складі Bcr, так і в р210 Bcr-Abl. Встановлено, що злоякісна трансформація клітин, які експресують гібридний білок Bcr-Abl, пов‘язана з порушеннями регуляції тирозинової кінази Abl, але фактори, які призводять до загострення хронічної форми хвороби і переходу її спочатку до стадії акселерації, а потім до бластної кризи, залишаються не з‘ясованими повністю. Основна частина досліджень у цій галузі спрямована на вивчення кіназної активності Bcr-Abl. Це дало змогу розробити і впровадити в клінічну практику перший специфічний інгібітор тирозинової кінази, однак з‘являється все більше даних про виникнення мутацій, що перешкоджають дії цього лікарського засобу . Таким чином, виникає проблема розробки нових специфічних агентів, як і нових підходів до блокування сигнальних шляхів, у яких бере участь гібридний білок Bcr-Abl.

З цієї точки зору надзвичайно важливим є з‘ясування різниці між функціональними властивостями різних за довжиною форм білка Bcr-Abl, та встановлення сигнальних механізмів, що задіяні при злоякісній трансформації та визначенні шляху диференціювання гемопоетичної клітини-попередника, яка набуває зазначену хромосомну перебудову. Беручи до уваги вище зазначене, актуальним є визначення функціональної активності DH і РН доменів білка Bcr, що відрізняють між собою білки р190 і р210 Bcr-Abl.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Роботу виконано в рамках наукових проектів відділу молекулярної генетики Інституту молекулярної біології та генетики НАН України “Структура і функція ГТФ-аз модулюючих доменів Bcr та їх роль в перебігу Ph’-позитивних лейкемій” (державний реєстраційний номер №0107U008546, 2007 р.) , наукова програма НАН України “Вивчення ендогенних чинників пухлинної прогресії при злоякісних лімфомах і мієлопроліферативних захворюваннях людини” (держ. реєстр. № 0104U000163, 2004-2008 рр.); роботу підтримано грантами Президії НАН України для молодих вчених “Роль доменів bcr при Ph’- позитивних лейкеміях” (2003-2004 рр.), “Роль PH доменів при Ph' позитивних лейкеміях” (2005-2006 рр.), дослідницьким грантом Федерації Європейських біохімічних товариств FEBS “Investigation of bcr gene GTPase-modulating regions in Philadelphia-positive leukemias” (2005 р.).

Мета та завдання дослідження. Метою даної роботи була функціональна характеристика DH і РН доменів білка Bcr та аналіз їхньої участі в сигнальних мережах при Ph’-позитивних лейкеміях. Для досягнення цієї мети необхідно було вирішити такі завдання:

1. Клонувати DH і РН ділянки гена bcr у вектори для експресії в бактеріальній системі та в клітинах евкаріотів. Експресувати та афінно очистити рекомбінантні білки, що відповідають DH і РН доменам білка Bcr.

2. Встановити вміст основних типів вторинної структури рекомбінантного білка, що відповідає РН домену Bcr, та провести порівняльний аналіз з даними для РН доменів із визначеною структурою.

3. Охарактеризувати специфічність та афінність зв‘язування РН домену Bcr з ліпідами клітини.

4. Здійснити протеомний аналіз зв‘язувальних партнерів РН домену білка Bcr в Ph’-позитивних клітинах К562.

5. Дослідити клітинну локалізацію GFP-кон‘югованих DH, PH і DHPH доменів, екзогенних білків p210 і p190 Bcr-Abl флуоресцентною мікроскопією.

6. Дослідити наявність GEF- активності DH домену Bcr in vitro та in vivo.

Об‘єкт дослідження – біологічна роль DH і РН доменів у складі білків Bcr і Bcr-Abl в нормальній та злоякісній клітині.

Предмет дослідження –білки Bcr, p190 Bcr-Abl і p210 Bcr-Abl.

Методи дослідження –стандартні молекулярно-біологічні методи, що включали ПЛР, афінну хроматографію, трансформацію клітин евкаріотів, Вестерн-блот аналіз, флуоресцентну мікроскопію та ін. Визначення білків-партнерів РН домену Bcr було проведено методами MALDI TOF мас-спектрометрії.

Наукова новизна одержаних результатів. –

Отримані рекомбінантні білки, що відповідають DH і РН доменам білка Bcr.–

Вперше було проведено дослідження GEF- активності окремого DH домену Bcr методом “pull-down” аналізу. Показано відсутність його GEF- активності щодо Rho-ГТФаз підкласів RhoA, Cdc42 і Rac1 in vitro та in vivo.–

Вперше ідентифіковані ліпіди, що зв‘язуються з РН доменом Bcr з високою афінністю.–

Методами мас-спектрометрії вперше ідентифіковані 23 білки, що взаємодіють з РН доменом Bcr, іншими методами підтверджено зв‘язування з білками SMC1, в-тубуліном, зизиміном-1, PLCе.–

Показано вплив РН домену на субклітинну локалізацію білка Bcr-Abl.

Практичне значення одержаних результатів. Результати проведених досліджень ролі DH і РН доменів у складі білків Bcr та р210 Bcr-Abl дозволяють поглибити знання про участь цих білків у сигнальних мережах клітини. Це дає можливість пояснити вплив різних форм гібридного білка Bcr-Abl на диференціювання гемопоетичних клітин-попередників та перебіг Ph’- позитивних лейкемій. Форма р210 білка Bcr-Abl завдяки наявності двох додаткових доменів Bcr частини може зв‘язувати ключові білки, які беруть участь у передачі сигналу в клітині, що потенційно може бути використано для розробки нових цільових лікарських агентів. Встановлення ліпідної специфічності взаємодії РН домену дозволяє використовувати його для детекції ліпідів та їхньої локалізації в клітині. Результати дисертаційної роботи можуть бути використані в загальному курсі “Молекулярна біологія” для студентів університету спеціальності “молекулярна біологія”.

Особистий внесок здобувача. Клонування DH, РН і DHPH ділянок bcr, отримання відповідних рекомбінантних білків, аналіз первинної структури доменів, дослідження GEF- активносіті DH домену in vitro та in vivo, аналіз ліпідної специфічності РН домену були виконані автором особисто. Досліди із отримання спектрів кругового дихроїзму були виконані спільно із аспірантом відділу білкової інженерії і біоінформатики Інституту молекулярної біології та генетики НАН України Ложко Д.Б. Досліди із застосуванням методів двомірного електрофорезу і MALDI TOF мас-спектрометрії були виконані разом із співробітником відділу молекулярної генетики Інституту молекулярної біології та генетики НАН України Дубровською А.М. на базі Людвіговського інституту досліджень раку, м.Упсала, Швеція. Константи асоціації РН домену з фосфатидилінозитолами були обчислені спільно з к.б.н. відділу білкової інженерії і біоінформатики Інституту молекулярної біології та генетики НАН України Кордиш М.О.

DH і PH ділянки гена bcr були клоновані спільно із к.б.н. відділу молекулярної генетики Інституту молекулярної біології та генетики НАН України Дибковим М.В. та студенткою Київського національного університету імені Т.Шевченка Малютою О.В. Обробку та аналіз отриманих результатів виконано під керівництвом к.б.н., с.н.с. відділу молекулярної генетики Інституту молекулярної біології та генетики НАН України Телегеєва Г.Д. Одержані результати обговорено та опубліковано в спільних публікаціях.

Автор щиро вдячна д.б.н., професорові, член-кор. НАН України Малюті С.С. за всіляке сприяння проведенню досліджень та обговоренні результатів даної роботи.

Апробація результатів дисертації. Загальні положення роботи доповідались на поточних наукових семінарах Інституту молекулярної біології та генетики НАН України та наукових конференціях: Конференція молодих науковців, аспірантів та студентів з молекулярної біології і генетики (25-27 вересня 2003 р., Київ, Україна); Установчий з‘їзд українського товариства клітинної біології (25-28 квітня 2004 р., Львів, Україна); ІХ З‘їзд українського біохімічного товариства (24-27 жовтня 2006 р., Харків, Україна); Конференція молодих вчених Інституту молекулярної біології та генетики НАН України (17-18 травня 2007 р., Київ, Україна); 6 Парнасівська конференція (30 травня- 2 червня 2007 р., Краків, Польща); Конференція молодих вчених “Актуальні проблеми біохімії та біотехнології – 2007” (7-8 червня 2007 р., Київ, Україна); VIII З‘їзд українського товариства генетиків і селекціонерів імені М.І.Вавилова (24-28 вересня 2007 р., Алушта, Україна); ECCO14 European Cancer Conference (23-27 вересня 2007 р., Барселона, Іспанія).

Публікації. За темою дисертації опубліковано 3 статті у наукових фахових журналах, 1 деклараційний патент, та тези 8 доповідей у збірниках матеріалів з‘їздів та конференцій.

Структура та обсяг роботи. Дисертація складається із вступу, огляду літератури, матеріалів і методів дослідження, результатів екпериментальних досліджень, аналізу та узагальнення результатів досліджень, висновків та списку використаних джерел. Дисертацію викладено на 129 сторінках стандартного машинопису. Вона містить 35 рисунків, 2 таблиці. Список використаної літератури охоплює 169 найменувань.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ

Матеріали та методи досліджень. У роботі було використано антитіла: моноклональні мишачі анти-6xhis (Clontech, США), анти-myc, анти-HA, анти-Flag, анти-тубулін, анти-SMC1, анти-Cdc42, анти-RhoA (Santa Cruz Biotechnology, США); поліклональні кролячі анти-GFP (MolecularProbes, США), анти-Rac1, анти-Abl (Santa Cruz Biotechnology, США); вторинні моноклональні анти-мишачі, анти-кролячі антитіла, кон‘юговані з пероксидазою хрону (Amersham Bioscienses, США). Для флуоресцентної мікроскопії: анти-мишачі TRITC-кон‘юговані (SouthernBiotech, Швеція), анти-кролячі Cy2™-кон‘юговані антитіла (Jackson ImmunoResearch, США), моноклональні мишачі анти-GM130 (Santa Cruz Bitechnology, США); фалоїдин TRITC -кон‘югований, DAPI (Sigma, США). Лінії клітин E.coli: XL1-Blue, DH5б, BL21(DE3). Плазмідні вектори: pET32a (Novagen, UAS), pUC19 (NEB, Велика Британія), pEGFP-C1 (Clontech, США), pRK5-myc зроблений на основі вектора pRK5 (Farmingen, Швеція) отримано від др. P.Aspenstrom (ЛІДР, Швеція). Вектор pCMV, що експресує PLCе з flag послідовністю, було отримано від др. M. Josephs (Лондон, Велика Британія) . Конструкцію, на основі вектора pEF4, що експресує зизимін-1 з епітопом НА, було отримано від др. N. Meller (Університет Вірджинії, США) . Конструкції з p190 Bcr-Abl на основі вектора pSG5 і з р210 Bcr-Abl на основі вектора pCDE було отримано від др. N. Heisterkamp (Дитячий госпиталь Лос-Анжелесу, США) . Культури клітин ссавців: HEK 293Т, Cos-1, NIH 3T3, К562. Праймери: РН домен - РH intf 5’-tcctccatgacttgctgaag-3’, PH intr 5’-acacacgagttggtcagcat-3’, DH -Ext dbl 5’-aagcttgccctggagtccactaaag- 3’, Ext rev dbl 5’-gaattctgcctccagttcatccac-3’, DHPH - DHPHf-5’-cccctgatcagccctggagtcc-3’, DHPHr-5’-ccccaagcttcaaaaacacttcttctgc-3’.

ДНК-фрагменти РН та DH доменів гена bcr були синтезовані за допомогою двораундової ПЛР із використанням специфічних олігонуклеотидів. кДНК хворого, який проходив діагностику у відділі молекулярної генетики Інституту молекулярной біологій та генетики НАН України за направленням медичної установи, було використано як матрицю для ПЛР. Для бактеріальної експресії РН ділянку було клоновано у вектор pET32a. Для експресії в клітинах ссавців DH і DHPH ПЛР фрагменти було клоновано у вектор pRK5-myc.

Для визначення вмісту основних типів вторинної структури рекомбінантного РН білка було використано аналіз спектрів кругового дихроїзму. Спектри кругового дихроїзму рекомбінантного білка PH вимірювали на спектрометрі Aviv Circular Dichroism Spectrometer, Model 202 (Aviv, LakeWood N.J., США) при температурі 24?С в УФ-діапазоні від 200 до 240 нм.

Для аналізу ліпідів, з якими зв‘язується РН домен Bcr, мембрану PIP Strip із нанесеними 15 ліпідами (Echelon, USA) інкубували з 0,5 мкг/мл рекомбінантного білка РН, який візуалізовали за допомогою Вестерн-блот аналізу з використанням відповідних антитіл. Для визначення афінності зв‘язування РН домену з ліпідами було використано мембрану PIP Array (Echelon, USA) з нанесеними ліпідами різної концентрації.

Для аналізу білків, з якими взаємодіє РН домен Bcr, рекомбінантний білок РН, кон‘югований з Ni-NTA агарозою інкубували з лізатом клітин К562, розділяли зразки двовимірним електрофорезом і аналізували з використанням метода MALDI TOF мас-спектрометрії згідно .

Для підтвердження зв‘язування з ідентифікованими за результатами мас-спектрометрії білками було проведено in vitro та in vivo аналіз. Для in vitro аналізу лізат клітин К562 інкубували з рекомбінантним білком РН, ендогенні білки в-тубулін і SMC1 ідентифікували Вестерн-блот аналізом з використанням специфічних антитіл. Для in vivo аналізу проводили трансфекцію клітин 293Т конструкціями pRK5-myc-DHPH, pRK5-myc-DH і pCMV-PLCе-flag або pEF4-зизимін1-НА. Імунопреципітацію комплексів білків DHPH-myc або DH-myc і білків PLCе-flag або зизимін1-HA здійснювали, інкубуючи лізат клітин 293Т з моноклональними анти-myc антитілами і сефарозою Immunosorb A (EC Diagnostics AB, Швеція). Аналіз імунопреципітатів проводили методом Вестерн-блот аналізу.

Для аналізу GEF-активності DH домену Bcr in vitro були використані рекомбінантні білки DH і DHPH. Очищені рекомбінантні ГТФази Rac1, Cdc42 і RhoA були люб‘язно надані др. P.Aspenstrom (ЛІДР, Швеція). Вивільнення радіоактивно міченого [3H]-GDP із комплексу з ГТФазою за присутності білків DH або DHPH проводили за .

Для аналізу GEF-активності DH домену Bcr in vivo було використано “pull down” аналіз з GST-кон‘югованими ГТФазо-зв’язувальними доменами білків PAK1 і Rhotekin . Як позитивний контроль було використано DHPH ділянку білка Dbl, негативний контроль –вектор pRK5-myc.

Аналіз локалізації білків р190 і p210 Bcr-Abl було проведено методом імунофлуоресцентної мікроскопії. Фотографії було зроблено за допомогою цифрової камери Hamamatsu ORCA CCD, флуоресцентного мікроскопу Zeiss Axioplan2 і програмного забезпечення QED Imaging System.

Результати досліджень та їх обговорення.

Експресія білка РН і оцінка вмісту типів вторинної структури. Білок РН (674-869а.к.), що мав на N-кінці полігістидиновий фрагмент, було експресовано в клітинах E.coli лінії BL21 DE3. Для аналізу вторинної структури РН домену Bcr було використано рекомбінантний білок РН концентрацією 0,5 мг/мл, експресований у клітинах BL21 DE3.

Для експериментального визначення вмісту основних типів вторинної структури нами було проаналізовано КД спектри досліджуваного білка в діапазоні 200-240 нм при температурі 24?С. Отриманий спектр характеризується чітким мінімумом в ділянці 209 нм (рис. 1). Теоретично така форма спектра характеризує білки класу в, які переважно представлені в-тяжами. Розрахований за даними програми K2d вміст -тяжів у структурі рекомбінантного PH-домену становить 47,0 %, вміст -спіралей –5,0 %, а вміст нерегулярних конформацій – 48,0 %.

Рис.1. Спектр кругового дихроїзму білка РН:

1 –спектр буфера;

2 –спектр білка РН;

вісь абсцис –довжина хвилі (нм), вісь ординат –еліптичність

Для аналізу отриманих результатів ми порівнювали вміст -спіралей і -тяжів у гомологічних білків із визначеною структурою. За допомогою баз даних UniProt та PDB були відібрані білки, що містять РН домени, для яких було встановлено просторову структуру . Дані про їхню вторинну структуру аналізували усереднювали вміст б-спіралей і в-тяжів, що становило -спіралей –10 %, а -тяжів –37 %. Просторова структура РН домену є консервативною, тому члени цієї родини доменів мають постійний вміст всіх типів вторинної структури. Таким чином, для рекомбінантного РН домену Bcr вміст типів вторинної структури, визначений за даними КД, корелює з літературними даними для нативних РН доменів, структуру яких було встановлено методами рентгеноструктурного аналізу та ЯМР. Це свідчить на користь того, що отриманий нами білок має конформацію, близьку до нативної, що дозволяє використовувати його для подальших експериментів із аналізу функціональної активності.

Для використання в експериментах із визначення специфічності зв‘язування з ліпідами білок РН було експресовано в клітинах BL21 DE3 у середовищі LB з 100 мг/л ампіциліну і очищено в нативних умовах. Концентрація білка становила 0,12 мг/мл.

Визначення ліпідів, що зв‘язуються із РН доменом Bcr. Для визначення ліпідів, що зв‘язуються із РН доменом Bcr, було використано мембрану з нанесеними 15 ліпідами. Щоб виключити зв‘язування білка послідовностями, що належать вектору (наприклад, полярними полігістидиновими послідовностями) як контроль було використано білок, експресований із вектора pET32a без клонованого продукту (“порожнього” вектора). Встановлено, що РН домен Bcr зв‘язується з фосфатидилінозитол-монофосфатами, а саме РІ(3)Р, РІ(4)Р і РІ(5)Р (рис. 2а). Після якісного визначення ліпідів, що зв‘язують РН домен, досліджували афінність цих взаємодій. Для визначення специфічності зв‘язування було використано мембрану з нанесеними ліпідами різної концентрації (рис. 2б).

Рис. 2. Аналіз ліпідів, що зв‘язуються з РН доменом Bcr і афінність їхнього зв‘язування.

а: 1 –лізофосфатидна кислота (LPA); 2 –лізофосфохолін (LPC); 3 –РІ; 4 –РІ(3)Р; 5 –РІ(4)Р; 6 –РІ(5)Р; 7 –фосфатидилетаноламін (PE); 8 –фосфатидилхолін (РС); 9 –сфінгозин-1-фосфат (S1P); 10 –РІ(3,4)Р2; 11 –РІ(3,5)Р2; 12 –РІ(4,5)Р2; 13 –РІ(3,4,5)Р3; 14 –фосфатидна кислота (РА); 15 –фосфатидилсерин (PS); 16 –порожня лунка.

б: 1 –РІ; 2 –РІ(3)Р; 3 –РІ(4)Р; 4 –РІ(5)Р; 5 –РІ(3,4)Р2; 6 –РІ(3,5)Р2; 7 –РІ(4,5)Р2; 8 –РІ(3,4,5)Р3

Для оцінки константи дисоціації комплексу ліпід-білок була визначена інтенсивність сигналу кожного зразка щодо концентрації нанесеного на мембрану ліпіда згідно . Таким чином, були визначені фосфатидилінозитоли, з якими зв‘язується РН домен білка Bcr. Ця взаємодія є високоафінною, константи дисоціації становили: КД РІ(3)Р =0,6 нМ, КД РІ(4)Р =1,7 нМ, КД РІ(5)Р =3 нМ. Слід зазначити, що обчислення констант дисоціації за результатами дот-блот гібридизації не є точним, але в даному випадку було важливим встановити порядок величин констант для того, щоб порівняти силу взаємодії РН домену з різними ліпідами. Специфічність зв‘язування тільки фосфатидилінозитол- монофосфатів є досить нетиповою для РН родини. Зазвичай, РН домени з високою афінністю зв‘язують фосфатидилінозитол- три- і біфосфати, що є продуктами діяльності РІ3-кінази. Фосфатидилінозитоли розташовані нерівномірно в клітині й тим самим забезпечують розподіл сигнальних молекул і організацію компартмент-специфічних сигнальних комплексів . Таким чином, завдяки зв‘язуванню з РІ(3)Р і РІ(4)Р білки Bcr або р210 Bcr-Abl можуть бути асоційовані відповідно з мембранами ранніх ендосом і комплексу Гольджі.

Аналіз білків, що зв‘язуються із РН доменом Bcr. Попередні дані свідчать про те, що РН домени деяких білків крім зв‘язування з ліпідами можуть також брати участь у білково-білкових взаємодіях. Наприклад, РН домен PLCв2 зв‘язується з Rac і таким чином, забеспечує локалізацію білка на мембрані і його активацію . Для перевірки можливості РН домену Bcr брати участь у білково-білкових взаємодіях були використані методи “pull-down” преципітації білків лізату клітин К562 і подальший їхній аналіз методами протеоміки. Клітини К562 вирощували у середовищі з [35S]-метіоніном, таким чином, всі білки К562 мали радіоактивний сигнал, що давало змогу відрізняти їх від бактеріальних. Білки було преципітовано рекомбінантним білком, що відповідає РН домену Bcr, на колонці Ni-NTA, після чого білки, що зв‘язувались із РН доменом, аналізували двовимірним електрофорезом (рис.3).

Рис.3. Електрофореграма білків, що були преципітовані: а- контроль (білки, преципітовані на колонці з білком, експресованим з «порожнього» вектору);б- білки, що взаємодіяли з РН доменом Bcr

Зображення порівнювали між собою і вирізали ті ділянки гелю, що відповідали білкам, зв‘язаним із РН доменом, і аналізували їх. В результаті були ідентифіковані 23 білки (табл. 1). Для подальшого вивчення були відібрані білки SMC1 (structure maintenance of chromosomes), в-тубулін, зизимін1 і PLCе.

Для підтвердження зв‘язування з в-тубуліном і SMC1 застосовували колонки з рекомбінантним білком, що відповідав РН домену Bcr. Лізат клітин К562 наносили на колонку, контролем був білок, експресований з “порожнього” вектора. Ендогенні в-тубулін і SMC1 детектували специфічними антитілами. В обох випадках було підтверджено зв‘язування РН домену з в-тубуліном і SMC1 (рис. 4).

Рис. 4. Зв‘язування РН домену Bcr із білком SMC1 і в-тубуліном in vitro.

а: 1 –маркер молекулярної маси; 2 –лізат клітин К562; 3 –білки, що взаємодіяли із РН доменом; 4 –контроль. Вестерн-блот аналіз: анти-SMC1 1:150; анти-his 1:3000.

б: 1 –маркер молекулярної маси; 2 –контроль; 3 –білки, що були преципітовані РН доменом.

Вестерн-блот аналіз: анти-в- тубулін 1:200; анти-his 1:3000

Для in vivo аналізу зв‘язування РН домену із зизиміном-1 і PLCе було використано конструкцію DHPH, що містить обидва домени РН і DH, і як контроль –конструкцію DH, що не має РН домену. Через 36 годин після трансфекції лізат клітин використовували для аналізу методом імунопреципітації. Було підтверджено зв‘язування РН домену Bcr з обома білками (рис. 5). Важливим є факт підтвердження зв‘язування РН домену з білком зизимін-1, який є членом родини DOCK180, яку було охарактеризовано в 2002 році . Зизимін-1 містить також РН домен. Відомо, що в деяких білках РН домени здатні олігомеризуватись, отже, взаємодія зизиміну-1 з РН доменом Bcr потенційно може бути обумовлена зв‘язуванням двох РН доменів цих білків. Було показано, що члени родини DOCK180 виявляють GEF-активність щодо ГТФаз родини Rho. Так, зизимін1 має GEF- активність щодо Cdc42 . Інший визначений нами білок, що зв‘язує РН – PLCе –також містить РН домен, який є потенційним партнером по зв‘язуванню. PLCе каталізує розщеплення фосфатидилінозитол-4,5-біфосфату на діацилгліцерол та інозитол-1,4,5-трифосфат (Ins(1,4,5)P3), який є вторинним месенжером у клітині . Серед визначених білків, що зв‘язуються із РН доменом Bcr, саме білок PLCе є найцікавишим з нашої точки зору, тому що він має біфункціональну роль: приймає участь у метаболізмі ліпідів і також є GEF-фактором для ГТФаз Ras. Отже, PLCе може як регулювати Ras (через її GEF-домен), так і зв‘язувати Ras-GTP, що потенційно формує складний механізм зворотнього зв‘язку з багатокомпонентною системою регуляції.

Рис. 5. РН домен Bcr зв‘язує білки зизимін1 і PLCе in vivo.

а: 1 –лізат клітин 293Т (контроль); 2 –DH-myc; 3 –DHPH-myc; 4 –зизимін1-HA; 5 –DH-myc + зизимін1-HA; 6 –DHPH-myc+ зизимін1-HA.

б: 1 –клітинний лізат 293Т (контроль); 2 – PLCе-flag; 3 –DH-myc; 4 –DHPH-myc; 5 –DH-myc + PLCе-flag; 6 –DHPH-myc + PLCе-flag. Вестерн-блот аналіз: анти-myc; анти-НА; анти-flag -1:1000.

IP –імунопреципітація; WB –Вестерн-блот

Аналіз GEF-активності DH домену Bcr in vitro. Для тестування GEF-активності було використано рекомбінантні білки DH і DHРН, а також рекомбінантні ГТФази. Вивчали три основні ГТФази, що входять до Rho-родини: Cdc42, RhoA і Rac1 (рис.6).

Рис. 6. Дослідження вивільнення GDP різними ГТФазами у присутності білків DH або DHPH. Вісь абсцис –час проведення експерименту; вісь ординат –частка ГТФази, зв‘язаної з [3H]-GDP. –контроль (реакція обміну нуклеотиду без участі білків DH або DHPH); –реакція обміну нуклеотиду з додаванням 0,5 мкг відповідного білка (DH або DHPH); –реакція з додаванням 1 мкг білка

Вважають, що DH домен Bcr діє як GEF-фактор для ГТФаз родини Rho . Однак, всі попередні експерименти, що були описані в літературі, були проведені з неповним DH доменом, отже, говорити про його функції як GEF-фактора можна тільки після вивчення функцій домену з повною амінокислотною послідовністю.

Використання двох конструкції DH і DHРН пов‘язано з тим, що в деяких білках РН домен може модулювати активність DH домену. Для перевірки GEF-активності застосовували вимірювання вивільнення радіоактивно-міченого GDP, при цьому не спостерігали GEF-активності домену DH. Крім того, було виявлено, що наявність РН домену не впливає на функціональну активність домену DH в реакції обміну нуклеотидів на ГТФазах RhoA, Rac1 і Cdc42 (рис. 6). Цей результат вирішили перевірити in vivo методом детекції ГТФази в активному, GTP-зв‘язаному стані, у присутності DH домену Bcr.

Аналіз GEF-активності DH домену Bcr in vivo. Для перевірки GEF-активності in vivo було використано клітини 293Т, що були трансформовані конструкціями, які мали DH або DHPH домени Bcr, а також різні ГТФази. В цьому випадку досліджували декілька представників родини Rho (яка містить 22 ГТФази): Rac-підгрупа: Rac1, Rac3; Cdc42-підгрупа: Cdc42, Wrch2; RhoA-підгрупа: RhoA, RhoB. Як позитивний контроль було використано DHPH-фрагмент білка Dbl, що має визначену GEF-активність . Всі конструкції було створено на основі вектора pRK5-myc, відповідні білки мали myc-епітоп на N-кінці. Для детекції всіх білків використовували моноклональні антитіла анти-myc.

В GTP-зв‘язаному стані ГТФаза здатна зв‘язуватись з її ефекторами: WASP (Wiskott-Aldrich syndrome protein), PAK (p21-activated kinase), Rhotekin, PI3K та ін. Таким чином, якщо використовувати іммобілізований ефектор, можна виділити активну форму ГТФази із лізату клітин. Для цього були використані GST-зв‘язані домени білків: Rhotekin –для RhoA-підгрупи ГТФаз, Pak1 –для Cdc42 і Rac1 (рис. 7).

Рис. 7. DH і DHPH білки не виявляють GEF-активності проти ГТФаз Rac1, Cdc42 і RhoA в експериментах in vivo:

1 –позитивний контроль (DHPH ділянка білка Dbl); 2 –негативний контроль (pRK5-myc); 3 –DHPH; 4 –DH; Вестерн-блот: анти-myc –1:1000; вторинні анти-мишачі антитіла –1:10000

Спочатку перевірели три ГТФази, з якими попередньо проводили експерименти in vitro і з якими, як вважали, взаємодіє DH домен Bcr: Rac1, RhoA і Cdc42. В даному випадку не було виявлено GEF-активності. Цей результат підтверджував дані, попередньо отримані in vitro.

Для того, щоб перевірити, чи має DH домен GEF-активність щодо інших ГТФаз родини Rho, було проведено аналогічні експерименти з різними ГТФазами підкласів RhoA, Cdc42 i Rac1 (рис. 8).

Рис. 8. DH і DHPH білки не виявляють GEF-активності проти ГТФаз Rac3, Wrch1 і RhoB в експериментах in vivo:

1 –позитивний контроль (DHPH ділянка білка Dbl);

2 –негативний контроль (pRK5-myc);

3 –DHPH; 4 –DH; Вестерн-блот: анти-myc –1:1000; вторинні анти-мишачі антитіла –1:10000

У жодному випадку не було виявлено GEF- активності DH домену Bcr in vivo. Відсутність GEF-активності DH домену Bcr до ГТФаз підкласів RhoA, Rac1 і Cdc42 поставила низку нових запитань щодо функцій DH домену. Множинне вирівнювання з амінокислотними послідовностями членів DH родини показало, що в DH домені Bcr присутні консервативні амінокислоти, які відповідають за формування третинної структури, наявні три консервативні ділянки CR1, CR2 і CR3, що можуть брати участь у формуванні зв‘язків із ГТФазою. Таким чином, аналіз первинної послідовності дозволяє зробити висновок, що DH домен Bcr має всі необхідні структурні елементи, що присутні в цей родині доменів, і тому потенційно може функціонувати як GEF-фактор; можливо, він має специфічність щодо інших членів Rho-родини ГТФаз або Ras-надродини. Таким потенційним партнером може бути, зокрема, ГТФаза Rap1.

Дослідження локалізації білків р190 і р210 Bcr-Abl. Як було зазначено, білки р190 і р210 відрізняються тим, що до складу останнього входять домени DH і РН, яких немає в р190. Було встановлено, що РН домен зв‘язує фосфатидилінозитол-монофосфати. Відомо, що в клітині існує розподіл ліпідів за компартментами, тому наявність у складі білка РН домену може впливати на його локалізацію.

Клітини Cos-1 було трансфіковано конструкціями, які експресували р190 або р210 Bcr-Abl. Через 36 годин після трансфекції клітини фіксували і забарвлювали (рис. 10). Було показано, що білки р190 і р210 Bcr-Abl мають відмінності в локалізації. Обидва білки знаходяться в цитоплазмі, але р190 Bcr-Abl має більш рівномірний розподіл по цитоплазмі клітини. Білок р210, навпаки є більш концентрованим навколо ядра.

Рис.10. Імунофлуоресцентний аналіз розподілу білків р210 і р190 Bcr-Abl в клітинах Cos-1.

Візуалізація Bcr-Abl: анти-Abl антитіла 1:100; вторинні Cy2-мічені антитіла 1:500; актин: фалоїдин 1:200; ядро: DAPI 1:1000

Отже, можна зробити висновок, що ділянка Bcr, яка входить до складу р210 і не входить до р190 Bcr-Abl, має певний вплив на розподіл зазначених білків. Найбільш вірогідною є участь РН домену в локалізації білка Bcr-Abl.

Пояснити різницю регуляції сигнальних шляхів, у яких беруть участь дві форми білка Bcr-Abl, можна спираючись на роль Bcr в ендосомальному сортингу. Було встановлено, що Bcr взаємодіє з компонентами комплексу ендосомального сортингу ESCRT і таким чином, існує вірогідність порушень ендосомального транспорту завдяки появі мутантної форми Bcr при розвитку ХМЛ або ГЛЛ. Інгібування експресії Bcr або TSG101 в клітинах HeLa було достатньо для розвитку порушень деградації рецепторів клітинного росту. Було встановлено, що ділянка, яка відповідає за зв‘язування Bcr з білком TSG101 знаходиться приблизно у ділянці С2 домену Bcr, але, незважаючи на втрату цієї ділянки в гібридному білку, взаємодію Bcr-TSG101 все одно спостерігали в клітинах К562, що експресують р210 Bcr-Abl . Ми вважаємо, що цей факт можна пояснити саме завдяки встановленому в нашій роботі зв‘язуванню РН домену з РІ(3)Р, який є компонентом ранніх ендосом. Таким чином, незважаючи на відсутність у гібридному білку ділянки зв‘язування з компонентами ендосомального сортингу, р210 Bcr-Abl може зв‘язуватись завдяки РН домену з мембранами ендосом і частково виконувати функції нормального Bcr в ендосомальному транспорті (рис. 11б). Така можливість відсутня в білка р190 (рис.11в) Bcr-Abl, тому експресія його в клітинах може призводити до значніших порушень ендосомального сортингу і деградації рецепторів факторів росту. Диференціювання гемопоетичної клітини залежить не тільки від експресії рецепторів факторів диференціювання й клітинного росту, але й від вчасної їхньої інтерналізації та деградації.

Рис. 11. Схема можливого впливу різних форм білка Bcr-Abl на диференціювання гемопоетичної клітини: ФД –фактор диференціювання; РФД –рецептор фактора диференціювання; РЕ –рання ендосома, МВЕ –мультивезикулярна ендосома.

а –нормальна клітина; б –клітина при ХМЛ; в –клітина при ГЛЛ

Таким чином, порушення ендосомального транспорту і накопичення на поверхні клітини факторів диференціювання, які не можуть бути деградовані, можуть впливати на диференціювання гемопоетичної клітини. Відомо, що три різні форми білка Bcr-Abl по-різному впливають на розвиток, гостроту і тип захворювання, і саме DHPH ділянка частини Bcr може обумовлювати цю різницю. Нашу модель впливу різних форм білка Bcr-Abl на диференціювання представлено на рис.11.

ВИСНОВКИ

Вивчено структурно-функціональну роль DH і РН доменів у складі білків Bcr та р210 Bcr-Abl. Результати проведених досліджень розширюють уявлення про сигнальні шляхи білків р210 і р230 Bcr-Abl, до складу яких вони входять, дають можливість пояснити вплив різних форм гібридного білка Bcr-Abl на диференціювання гемопоетичних стовбурових клітин та перебіг Ph’- позитивних лейкемій.

1. Клоновано DH, РН і DHPH ділянки гена bcr у вектори для бактеріальної експресії та експресії у клітинах евкаріотів, отримано відповідні рекомбінантні білки. Дані кругового дихроїзму свідчать на користь близької до нативної структури рекомбінантного РН домену Bcr.

2. Визначено специфічність зв‘язування РН домену Bcr із ліпідами методом ліпід-білкової гібридизації. Показано, що РН домен Bcr зв‘язує фосфатидилінозитоли РІ(3)Р, РІ(4)Р і РІ(5)Р із високою афінністю.

3. Із використанням методів двовимірного електрофорезу і MALDI TOF мас-спектрометрії ідентифіковано 23 білки, що зв‘язують РН домен. Підтверджено взаємодію PH домену Bcr із білками SMC1, в-тубулін, зизимін1, PLCе in vitro та in vivo.

4. Показано відсутність GEF-активності ізольованого DH домену Bcr щодо Rho-ГТФаз підкласів RhoA, Cdc42 і Rac1 in vitro та in vivo. Встановлено, що наявність РН домену не впливає на функціональну активність домену DH.

5. Показано вплив РН домену на характер субклітинної локалізації різних форм білка Bcr-Abl.

ПЕРЕЛІК НАУКОВИХ ПРАЦЬ,

ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Мірошниченко Д., Малюта О., Ложко Д., Телегеєв Г., Малюта С. Аналіз первинної і вторинної структури РН домену білка Bcr // Доповіді Національної Академії Наук України. -2007. –№7. –С.176-180. Дисертантом клоновано фрагмент кДНК, що відповідає РН домену білка Bcr. В мінімальному середовищі експресовано та очищено рекомбінантний білок РН. Проаналізовано КД спектри рекомбінантного білка та вторинну структуру РН домену Bcr.

2. Мірошниченко Д.О., Дубровська А.М., Телегеєв Г.Д., Малюта С.С. Визначення специфічності білок-ліпідних і білок-білкових взаємодій РН домену білка Bcr, пов‘язаного з хронічною мієлоїдною лейкемією // Біополімери і клітина. –2007. –Т.23, №5. –С.405-409. Дисертантом експресовано і очищено рекомбінантний білок, що містить РН домен Bcr. Досліджено специфічність зв‘язування РН домену з ліпідами і білками, проаналізовано вплив РН домену на локалізацію білка, до складу якого він входить.

3. Мірошниченко Д.О., Телегеєв Г.Д., Малюта С.С. Аналіз GEF- активності DH домену білка Bcr // Український біохімічний журнал. –2007. –Т.79, №5. –С.55-60. Дисертантом отримано конструкції, що експресують DH і DHPH домени Bcr, перевірено GEF-активність DH домену в експериментах in vivo.

4. Малюта С.С., Дибков М.В., Телегеєв Г.Д., Мірошниченко Д.О. Спосіб діагностики Ph’лейкемій за допомогою специфічних праймерів /Деклараційний патент на корисну модель UA № 10385./ 15.11.2005 бюл. №11. Дисертантом проведено ЗТ-ПЛР із набором специфічних праймерів для модифікованої тест-системи, для діагностики Ph’-хромосоми і виявлення змін в bcr-ділянці химерного гена.

5. Мирошниченко Д.А., Телегеев Г.Д.,Корнелюк А.И. Моделирование пространственной структуры Dbl и РН доменов белка Bcr-Abl // Тезисы 7й Пущинской школы-конференции молодых учених. –Пущино (Россия) -2003 г. -С.354. Дисертантом проаналізовано первинну структуру DH і РН доменів, модульовано просторову структуру DHPH фрагмента білка Bcr.

6. Miroshnychenko D.A., Telegeev G.D., Maliuta S.S. GEF activity analysis of bcr Dbl-homology domain / Abstr. Conference of Young Scientists dedicated to the 185th anniversary of Gregor Mendel // Біополімери і клітина. –2007. –Т.23, №4. –С.293. Дисертантом проаналізовано GEF-активність DH домену Bcr in vitro та in vivo. Проведено експресію і очищення рекомбінантних білків, проведено трансфекцію клітин евкаріотів, виконано “pull down” аналіз.

7. Телегеєв Г.Д., Дибков М.В., Дубровська А.М., Мірошниченко Д.О., Малюта С.С. Отримання поліклональних антитіл до різних ділянок гібридних білків при Ph-лейкеміях і їх використання для діагностики і вивчення патогенезу хвороби // Тези Установчого з‘їзду Українського товариства клітинної біології. –Львів (Україна). -2004. -С.123. Дисертантом виконано клонування DH і DHPH доменів білка Bcr.

8. Miroshnychenko D., Dybkov M.,Telegeev G., Maliuta S. Lipid binding specificity of Bcr PH domain // Матеріали IX Українського біохімічного з‘їзду. –Харків (Україна). -2006 р. -С.14. Дисертантом клоновано РН фрагмент білка Bcr, проведено аналіз специфічності зв‘язування ліпідів і вплив РН домену на локалізацію білка Bcr-Abl.

9. Miroshnychenko D., Telegeev G., Maliuta S.. Structural and functional peculiarities of Bcr PH domain / Abstr. 6th Parnas Conference Molecular Mechanisms of Cellular Signalling (30 May- 2 June, 2007, Krakow, Poland) // Acta Biochimica Polonica. –2007. –Vol.54/Sup2. –P.23. Дисертантом проведено аналіз первинної і вторинної структури РН домену Bcr, виявлено мотив, що відповідає за зв‘язування РН доменів з продуктами РІ3- кінази.

10. Мірошниченко Д.О. Аналіз взаємодії РН домену Bcr з білками методами мас-спектрометрії / Конференція молодих учених “Актуальні проблеми біохімії та біотехнології -2007” (червень, 2007р., Київ) // Український біохімічний журнал. –2007. –Т.79, №.4. –С.128. Дисертантом проаналізований спектр білків, які зв‘язуються з РН доменом Bcr.

11. Malyuta O., Miroshnychenko D., Telegeev G. Structure of Bcr PH domain // Conference for young scientists, PhD students and students on molecular biology and genetics. Abstract book. –Kyiv (Ukraine). -2007. –P.76. Дисертантом отримано конструкції для експресії полігістидин-зв‘язаного рекомбінантного білка, що містить РН домен Bcr, проаналізовано вміст основних типів вторинної структури.

12. Miroshnychenko D., Dubrovska A., Maliuta S., Telegeev G. Novel view on Bcr PH domain as a protein binding partner / Abstr. ECCO14 the European Cancer Conference // EJC. –2007. –Vol.5, №.4. –P.85. Дисертантом продемонстровано ефективність застосування методів протеоміки для виявлення білків, що зв‘язуються з РН доменом Bcr.

АНОТАЦІЯ

Мірошниченко Д.О. Структура і функції ГТФаз- модулюючих ділянок білка Bcr при Ph’-позитивних лейкеміях. – Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.03 –молекулярна біологія. – Інститут молекулярної біології та генетики НАН України, Київ, 2008.

Метою даної роботи було дослідження