ДЕРЖАВНА УСТАНОВА “ІНСТИТУТ МІКРОБІОЛОГІЇ ТА

ІМУНОЛОГІЇ ІМ. І.І. МЕЧНИКОВА АКАДЕМІЇ МЕДИЧНИХ НАУК

УКРАЇНИ”

Мозгова Юлія Анатоліївна

УДК 616.98:579.862] - 092.4/.9 - 085

Сучасні аспекти терапії

експериментальної ентерококової інфекції

03.00.07 – мікробіологія

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата медичних наук

Харків – 2008

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Харківському державному медичному університеті МОЗ України.

Науковий керівник доктор медичних наук, професор, академік УАН, АН ВШУ, заслужений працівник вищої школи України Циганенко Анатолій Якович, Харківський національний медичний університет МОЗ України, завідувач кафедри мікробіології, вірусології та імунології.

Офіційні опоненти:

доктор медичних наук, професор Філімонова Наталя Ігорівна, Національний фармацевтичний університет МОЗ України, професор кафедри мікробіології, вірусології та імунології;

доктор медичних наук, професор, заслужений працівник вищої школи та народної освіти України Кременчуцький Геннадій Миколайович, Дніпропетровська державна медична академія МОЗ України, завідувач кафедри мікробіології, вірусології та імунології.

Захист відбудеться “17” квітня 2008 р. о 10.00 годині на засіданні

спеціалізованої вченої ради Д 64.618.01 при ДУ «Інститут мікробіології та імунології ім. І.І. Мечникова АМН України» (61057, м. Харків, вул. Пушкінська, 14-16).

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці ДУ «Інститут мікробіології та імунології ім. І.І. Мечникова АМН України» (61057, м. Харків, вул. Пушкінська, 14-16).

Автореферат розісланий “ 4 ” березня 2008 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради

кандидат медичних наук Бруснік С.В.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Ентерококи входять до складу нормальної мікрофлори людини, для яких природним біотопом є кишечник, але за певних умов ентерококи, як й інші умовно-патогенні бактерії, можуть стати збудниками інфекцій сечовивідних шляхів, інтраабдомінальних інфекцій, інфекцій малого тазу, ранових інфекцій (Авдєєва Л.В., Поліщук О.І., Макушенко О.С., Каніболоцька М.Б., 2001; Edmond M.B., 1997).

В останні два десятиріччя ентерококи посідають третє місце серед найпоширеніших збудників внутрішньолікарняних інфекцій після S. аureus та коагулазонегативних стафілококів (Emori T.G., Gyanes R.P., 1993; Frieden T.R., Munsiff S.S.,1993; Муконин А.А., Гайдуль К.В., 2004). Ентерококи входять до п'ятірки основних груп збудників гнійно-септичних захворювань немовлят і дітей раннього віку (Авдєєва Л.В., Поліщук О.І., Макушенко О.С., Каніболоцька М.Б., 2001; Павел Лиссецки, Ежи Микуцки, Артур Сулик, 2003).

Ентерококи є значною постійною загрозою виникнення вогнища інфекції майже у всіх органах і системах організму; характеризуються природною резистентністю до впливу фізико-хімічних факторів й антибактеріальних хіміопрепаратів, а також здатністю до легкого набуття, накопичення й розмноження позахромосомного генетичного матеріалу, що кодує ознаки резистентності до антибіотиків. Це надає ентерококам високу здатність до виживання в стресових умовах навколишнього середовища в місцях їх локалізації та підкреслює зростаюче значення даних мікроорганізмів як етіологічних факторів інфекцій різної локалізації. Виявлення декількох генів резистентності в одного штаму викликає зростаючі систематичні труднощі в призначенні адекватного лікування й контролі за ентерококовими інфекціями (Elsher H.A., Sobottka I., Mack D. et al., 2000; Facklam R.R., Collins M.D., 1989).

Найнебезпечнішими захворюваннями в людей, які можуть бути спричинені ентерококами, є бактеріємія й ендокардит (Павел Лиссецки, Ежи Микуцки, Артур Сулик, 2003; Hricak V.Jr., Kovacik J., Marx P. et al., 1998). Ентерококи посідають третє місце після стрептококів і стафілококів серед найбільш частих збудників бактеріального ендокардиту (Бєлобородов В.Б., 2000; Буткевич О.М., Виноградова Т.Л., 1997; Сєдов В.И., 1998; Тюрін В.П., 2000).

Вибір стартової емпіричної терапії ендокардиту становить серйозну проблему, тому що особливістю ентерококів є їх чутливість до обмеженого спектра антибактеріальних препаратів, при цьому жоден з доступних у клініці антибіотиків не діє на них бактерицидно (Сідоренко С.В., Резван С.П., Грудініна С.А. та ін., 1998).

В останні роки все більше досліджень підтверджують ключову роль імунної системи в розвитку багатьох патологічних процесів, зокрема й інфекційного ґенезу. Виникає необхідність стимулювання імунної системи при розвитку вторинних дефіцитів, що викликані інфекційними патологічними процесами.

Тому важливим питанням є розробка науково обґрунтованого підходу до вибору методів комплексного лікування генералізованої ентерококової інфекції, що включають призначення антибактерыальних та імунокорегуючих препаратів.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота виконана відповідно до планової тематики науково-дослідної роботи Харківського державного медичного університету “Вивчення загальних закономірностей патологічних процесів та розроблення принципів і методів їх корекції”; темою основного плану кафедри мікробіології, вірусології та імунології: “Експериментально-клінічна розробка нових протимікробних засобів та способів селективної антибактеріальної терапії гнійно-септичних захворювань у дітей” КПКВК 2301020 (державний реєстраційний номер 0106U001860); проблемою Харківського державного медичного університету: “Антибіотики та інші активні речовини природного походження” (реєстраційний номер 0103U004547), у межах яких здобувач дослідив ефективність використання амоксиклаву, цефепіму, ципрофлоксацину, кларитроміцину окремо та у комбінаціях з поліоксидонієм або тималіном для лікування ентерококової інфекції. Тема дисертації затверджена на засіданні Вченої ради ХДМУ 17.03.2005р., протокол № 3.

Мета і завдання дослідження. Метою даного дослідження є обґрунтування комбінованого методу лікування ентерококової інфекції з використанням антибактеріальних й імунокорегуючих препаратів на основі чутливості збудника до антимікробних препаратів та вивчення порушень метаболізму, імунної системи та морфологічних змін при даній інфекції.

Для досягнення мети в дисертаційній роботі були поставлені такі завдання:

1. Вивчити етіологічну структуру гнійно-запальних захворювань і частоту зустрічності ентерококів.

2. Визначити біологічні особливості циркулюючих серед населення міста Харкова штамів бактерій роду Enterococcus.

3. Визначити чутливість до антибіотиків виділених штамів ентерококу.

4. Вивчити механізми імунітету при експериментальній ентерококовiй інфекції.

5. Вивчити морфологію та метаболізм у тканинах при даній інфекції.

6. Вивчити механізми дії антимікробних та імунокорегуючих препаратів на макроорганізм.

7. Обґрунтувати комбіновану терапію.

Об'єкт дослідження – хворі на ентерококову інфекцію, у т.ч. генералізовану; інфіковані експериментальні тварини.

Предмет дослідження – штами бактерій роду Enterococcus; антибактеріальні препарати; імунокорегуючі препарати.

Методи дослідження. Бактеріоскопічний (визначення морфологічних ознак мікроорганізмів); бактеріологічні (визначення біологічних характеристик виділених штамів бактерій, ідентифікація мікроорганізмів, визначення антибіотикочутливості ізолятів диско-дифузійним методом та методом серійних розведень у бульйоні); біологічний (моделювання ентерококової інфекції на лабораторних тваринах); імунологічні (визначення субпопуляцій Т- і В- лімфоцитів периферичної крові, рівнів цитокінів (IL-1, IL-4, TNF) й імуноглобуліну М); біохімічні (визначення в тканинах інфікованих тварин вмісту ферментів, малонового діальдегіду, дієнових кон’югатів, сульфгідрильних груп); морфологічні (за загальноприйнятими методиками); статистичні (обчислення середньої арифметичної, стандартної похибки та критерію Стьюдента).

Наукова новизна отриманих результатів. Уперше проведено вивчення біологічних властивостей та чутливості до антибактеріальних препаратів ентерококів, виділених від хворих з гнійно-запальними захворюваннями (ГЗЗ), що знаходилися на лікуванні в Харківській обласній клінічній лікарні (ХОКЛ).

На основі дослідження факторів патогенності ізолятів ентерококів показано, що штами відрізняються високою резистентністю до антибактеріальних препаратів, якi широко використовуються в лікувальній практиці.

Вивчення механізмів порушень у функціонуванні імунної системи та процесах метаболізму вперше при ентерококовiй інфекції дозволило обґрунтувати ефективність використання комбінації антибактеріальних й імунокорегуючих препаратів для лікування даної інфекції.

Практичне значення отриманих результатів. Вивчення біологічних властивостей штамів ентерококів, виділених від хворих, які знаходилися на лікуванні в різних відділеннях ХОКЛ; визначення рівня чутливості до антибактеріальних препаратів ізольованих мікроорганізмів дозволило провести оцінку дії антимікробних (амоксиклаву, цефепіму, ципрофлоксацину й кларитроміцину) й імунокорегуючих (тималіну і поліоксидонію) препаратів на функціонування імунної системі та окремі процеси метаболізму макроорганізму при експериментальній септичній ентерококовiй інфекції. На основі цього встановлено, що застосування комбінації вказаних антибактеріальних й імунокорегуючих препаратів є раціональним та ефективним у терапії генералізованої ентерококової інфекції.

Особистий внесок здобувача. Автор самостійно обрав напрямок наукової роботи, поставив мету й сформулював задачі, провів аналіз наукової літератури та патентний пошук, обрав методологічні підходи, згідно яким виконані дослідження з оцінки дії препаратів на імунітет при генералізованій ентерококовiй інфекції. Самостійно були ізольовані й охарактеризовані штами бактерій роду Enterococcus, проведені дослідження з вивчення антибіотикочутливості всіх виділених клінічних штамів бактерій диско-дифузійним методом та методом серійних розведень у бульйоні. Автор самостійно провів досліди на лабораторних тваринах з отримання доз ентерококу, що необхідні для відтворення генералізованої ентерококової інфекції, а також експерименти з вивчення дії антимікробних й імунокорегуючих препаратів як окремо, так і в комбінації при даній інфекції. Самостійно досліджена й проаналізована ефективність застосування даних препаратів. Автор узагальнив всі отримані лабораторні результати. Усі положення, висновки, статистична обробка отриманих результатів належать автору.

Апробація результатів дисертації. Матеріали дисертації оприлюднені на підсумковій науково-практичній конференції молодих вчених Харківського державного медичного університету “Медицина третього тисячоліття” (Харків, 2006р., 2007р.); на міжнародній науково-практичній конференції «Актуальні питання боротьби з інфекційними захворюваннями» (Харків, 2006р., ін-т ім. І.І. Мечнікова); на VЙ Національному з'їзді фармацевтів України «Досягнення та перспективи розвитку фармацевтичної галузі України» (Харків, 2006р.); на міжнародній науково-практичній конференції «Актуальні питання боротьби з інфекційними захворюваннями в гуманній і ветеринарній медицині» (Харків, 2005р.); на VЙЙЙ науково-практичній конференції Українського суспільства фахівців з імунології, алергології й імунореабілітації «Сучасні аспекти діагностики і лікування імуно- і алергопатології» (Київ, 2006р.); на науково-практичній конференції «Сучасні підходи до діагностики та лікування в клінічній інфектології» (Харків, 2007р.).

Публікації. За результатами дисертації опубліковано 12 наукових праць, з них 4 – у наукових журналах, рекомендованих ВАК України (1 – самостійна), 8 – у збірниках конференцій.

Структура дисертації. Дисертація викладена на 160 сторінках, ілюстрована 41 рисунком, 16 таблицями, складається із вступу, огляду літератури, розділу “Матеріали і методи дослідження”, 6 розділів власних досліджень, розділу аналізу та узагальнення результатів, висновків, списку використаних джерел, що містить 223 найменувань, з них 68 іноземних.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

У першому розділі роботи подано огляд літератури, в якому наведені стислі дані про етіологічну роль і клінічне значення ентерококів в інфекційній патології людини, чутливість до антибактеріальних препаратів та механізми формування стійкості до них в ентерококів. Звернуто увагу на мікробіологічні, патогенетичні й імунологічні аспекти інфекційного ендокардиту ентерококової етіології як варіанту генералізованої інфекції. Розглянуто біохімічні аспекти інфекційної патології. Наголошено на необхідності імунокорекції септичної інфекції ентерококової етіології.

Матеріали, методи та обсяг досліджень наведено в другому розділі. Матеріалом для дослідження слугували: сеча, відокремлюване з уретри, секрет передміхурової залози, відокремлюване піхви й цервікального каналу, відокремлюване з рани, кров хворих, що знаходилися на лікуванні в різних відділеннях ХОКЛ. Матеріал відбирали й доставляли в лабораторію відповідно до вимог забору й доставки матеріалу для мікробіологічних досліджень, запропонованих Київською медичною академією післядипломної освіти ім. П.Л. Щупика (Білько I.П., 2001). Усього проаналізовано 2205 штамів мікроорганізмів, з яких 374 штами ентерококів. Виділення й ідентифікацію чистої культури ентерококів проводили щодо загальноприйнятих для даних мікроорганізмів методів (Дехнич А.В., Козлов Р.С, Стецюк О.У., 1996; Г.П. Каліна, 1966; Наказ № 535 МОЗ СРСР, 1985; В.В. Меньшиков, 1983; Knudtson L.M., Hartman P.A., 1992; Manero A., Blanch A.R., 1999). Біологічні особливості вивчено на вибірці з 36 штамів, виділених від 125 хворих на гнійно-запальні захворювання. Відтворення генералізованої ентерококової інфекції проводили на 500 мишах лінії C57BL/J6Sto, самках вагою 18-20 г, шляхом внутрішньоочеревинного введення штамів E.faecalis NCNC 6783 і E.faecalis № 119, виділеного від хворого з ендокардитом; інфікуюча доза становила 2х109 мікробних клітин у 0,5 мл фізіологічного розчину. Для лікування експериментальної інфекції були використані наступні препарати: ципрофлоксацин [1 -циклопропіл - 6 -фторо - 1,4 -дигідро - 4 -оксо- 7-(піперазин-1-іл)-хіноліно-3 -карбоксикислота, моногідрохлорид, моногідрат], прозора жовтувата рідина без запаху, гіркувата на смак, 0,2 % розчин для інфузій, виробник - ТОВ "Юрія-Фарм", м.Київ (реєстраційне посвідчення № UA/3643/01/01 з 17.08.05); цефепім [1-[[(6R,7R)-7-[2-(2аміно-4-тіазоліл) гліоксиламідо]-2-карбокси-8-оксо-5-тіа-1-азабіцикло[4.2.0]окт-2-ен-3-іл] метил-1-метилпіролідину хлорид, 7І-(Z)-(О-метилоксим), моногідрохлоридмоногідрат], порошок від білого до світло-жовтого кольору, у флаконах по 1 г, для приготування розчину для ін’єкцій, ТОВ"Фармацевтична компанія"Здоров’я", м. Харків (реєстраційне посвідчення № UA/3715/01/01 з 27.09.05); амоксиклав [амоксициліну тригідрат з калієвою сіллю клавуланової кислоти], білий або жовтуватий порошок у флаконах, що містять 1 г амоксициліну та 200 мг клавуланової кислоти, для приготування розчину для внутрішньовенних ін’єкцій, "Sandoz GmbH" для "Lek" Pharmaceutical Company d.d., Австрія/Словенія (реєстраційне посвідчення № UA/3011/02/02 від 07.04.05); фромілід [кларитроміцин], таблетки, вкриті плівковою оболонкою, по 250 мг, "KRKA", Словенія (реєстраційне посвідчення № 3703 з 07.04.05); тималін [екстракт тимусу великої рогатої худоби], аморфний порошок білого чи білого з жовтим відтінком кольору, ліофілізований, для приготування розчину для ін’єкцій, РУП "Бєлмедпрепарати", Республіка Білорусь, (реєстраційне посвідчення № П.04.03/06488 з 08.04.03); поліоксидоній [похідне сополімер N-окису полі- 1,4-етиленпіперозину і (N-карбоксіетил)-1,4 етиленпіперозиній броміду], Порошок по 6 мг у флаконах, ліофілізований, для ін'єкцій, ТОВ "НПО "Петровакс Фарм", Росія, (реєстраційне посвідчення № UA/5334/01/01 з 12.10.06).

Робота з тваринами проводилася відповідно до Європейської конвенції по захисту хребтових тварин при їх використанні в експериментальних й інших наукових цілях (Strasbourg, 1987). Розподіл лабораторних тварин (по 20 мишей у кожній групі ) був проведений таким чином: 1 група – інтактні миші; 2 група – інфіковані; 3 група – інфіковані миші, які отримували терапію амоксиклавом (Ам); 4 група – інфіковані миші, що отримували амоксиклав і цефепім (Ам+Цф); 5 група – інфіковані миші, які отримували терапію амоксиклавом, цефепімом і поліоксидонієм (Ам+Цф+По); 6 група – інфіковані миші, що отримували амоксиклав, цефепім і тималін (Ам+Цф+Т); 7 група – інфіковані миші, які отримували терапію фромілідом (Ф); 8 група – інфіковані миші, що отримували фромілід і амоксиклав (Ф+Ам); 9 група – інфіковані миші, які отримували терапію фромілідом і цефепімом (Ф+Цф); 10 група – інфіковані миші, що отримували амоксиклав, ципрофлоксацин і поліоксидоній (Ам+Цп+По); 11 група – інфіковані миші, які отримували терапію амоксиклавом, ципрофлоксацином і тималіном (Ам+Цп+Т); 12 група – інфіковані миші, що отримували цефепім, ципрофлоксацин і поліоксидоній (Цф+Цп+По); 13 група – інфіковані миші, які отримували терапію цефепімом, ципрофлоксацином і тималіном (Цф+Цп+Т). Розрахунок доз лікарських препаратів проводили за формулою Риболовлєва (Риболовлєв Ю.Р., Риболовлєв Р.С., 1979).

Визначення субпопуляції Т- і В-лімфоцитів у крові здійснювали в реакції імунофлюоресценції з використанням моноклональних антитіл (Змушко Е.I., Бєлозєров Е.С., Мітін Ю.А., 2001; Ковальчук Л.В., Чередєєв А.Н., 1990; Лефковитс І., Пернис П., 1988; Пінегін В.Б., 1992; Філатов А.В., Багурін П.С., Маркова Н.А. и др., 1990). Рівні інтерлейкінів, фактору некрозу пухлин та імуноглобуліну М (IgM) визначали твердофазовим імуноферментним аналізом (Соколов Е.І., 1998). Морфологічне дослідження проводили загальноприйнятими методиками з гістологічної техніки та гістохімії (Лили Р., 1969). Біохімічні показники визначали за загальноприйнятими методами (Торчинський Ю.М., 1971; Уїльямс Б., Уїлсон К., 1978). Для статистичної обробки результатів використовували статистичні програми за допомогою персонального комп’ютера (Лакин Г.Ф., 1990; Лапач С.Н., Чубенко А.В., Бабич П.Н., 2000).

Результати власних досліджень наведено в 3-ому – 8-ому розділах. Аналіз структури гнійно-запальних захворювань за 2004 – 2005 рр. виявив, що серед 2205 штамів патогенних та умовно-патогенних мікроорганізмів – збудників ГЗЗ різної локалізації, ентерококи склали 16,96 % (374 штами). Бактерії роду Enterococcus були виділені від хворих при наступних захворюваннях: при рановій, хірургічній інфекції та гнійно-запальній інфекції ЛОР-органів (99 штамів); при інфекціях жіночих статевих органів, в. т.ч. при загрозі переривання вагітності (168 штамів); при інфекціях чоловічих статевих органів (84 штами); при інфекціях сечовивідної системи (13 штамів); при генералізованій інфекції (у т.ч. інфекційному ендокардиті) було виділено 10 штамів ентерококів. Видова приналежність 374 штамів ентерококів була такою: 319 штамів (85,29 %) Enterococcus faecalis, 51 штам (13,64 %) Enterococcus faecium і 4 штами (1,07 %) Enterococcus spp.

Вивчення біологічних властивостей ентерококів було проведене на 36 штамах, виділених з: піхви жінок з неспецифічними запальними захворюваннями урогенітального тракту – 11 штамів, сечі хворих з інфекціями сечовивідних шляхів – 3 штами, з відокремлюваного уретри чоловіків з неспецифічними інфекціями урогенітального тракту – 5 штамів, з вогнищ ГЗЗ м'яких тканин – 14 штамів і крові хворих з підозрою на сепсис або ендокардит – 3 штами. Ізольовані ентерококи були віднесені до наступних видів: Enterococcus faecalis – 32 штами (або 88,9 %) і E.faecium – 4 штами (або 11,1 %).

У результаті проведених досліджень виявлено, що всі штами Enterococcus faecalis лізирували еритроцити, а штами Enterococcus faecium не мали такої властивості. Визначення протеолітичної активності показало, що всі штами E. faecalis мали дану ознаку, на відміну від культур E. faecium, які не утворювали зони просвітлення навколо колоній на молочно-інгибуючому середовищі. Желатиназною активністю володів 21 штам (58,33 %) ентерококів, з яких 20 штамів (95,24 %) були віднесені до E. faecalis і 1 штам (4,76 %) – E. faecium. При вивченні ДНК-азної активності виявлено, що дана властивість була притаманна 8 штамам E. faecalis (25,0 % всіх виділених штамів даного виду), і жоден з 4 досліджених штамів E. faecium не володів цією ознакою.

Визначення чутливості 36 штамів ентерококів до антибактеріальних препаратів диско-дифузійним методом показало, що 32 штами E. faecalis були чутливі до ванкоміцину, цефепіму й кларитроміцину. Стосовно ципрофлоксацину 23 штами були чутливими та 9 – помірно чутливими до даного антибіотика. Більше половини штамів E. faecalis (а-саме: 28 та 24) були чутливими, 0 і 6 – помірно чутливими та 4 і 2 - стійкими до ампіциліну та хлорамфеніколу відповідно, до еритроміцину було виявлено 5 чутливих, 23 помірно чутливих та 4 резистентних штамів E. faecalis, і тільки виявилося 4 чутливих та 12 помірно чутливих до тетрацикліну штамів E. faecalis. Більшість штамів E. faecalis була стійкою до стрептоміцину та гентаміцину. Усі 4 штами E. faecium були чутливими тільки до тетрацикліну, 2 штами з них були чутливі до хлорамфеніколу й помірно чутливі до ципрофлоксацину, а 1 штам – помірно чутливий до гентаміцину та стрептоміцину, тобто всі ізольовані штами E. faecium виявилися поліантибіотикорезистентними (стійкими до трьох і більше антибіотиків).

Вивчення чутливості ізолятів ентерококів до антибіотиків методом серійних розведень у бульйоні виявило, що штами E. faecalis були чутливими до ципрофлоксацину (МПК 0,125-1-2 мкг/мл), 90,625 % штамів – до цефепіму (МПК 0,031-0,5-1 мкг/мл) та 87,5 % штамів – до ампіциліну (МПК 0,5 – 8 мкг/мл), хлорамфеніколу (МПК 1-8-16 мкг/мл) й еритроміцину (МПК 0,25-1-4 мкг/мл). Половина ізолятів E. faecalis виявилася чутливими до тетрацикліну (МПК 2-4-8 мкг/мл), по 37,5 % та 31,25 % штамів – до гентаміцину (МПК 32-256 мкг/мл) і стрептоміцину (МПК 1024 мкг/мл) відповідно, та 25 % штамів даного виду були помірно чутливими до кларитроміцину (МПК 0,5 мкг/мл). Усі 4 штами E. faecium виявилися чутливими тільки до тетрацикліну (МПК 1-2 мкг/мл), 2 штами з них – до хлорамфеніколу (МПК 1-8 мкг/мл) і 1 ізолят – до гентаміцину (МПК 128 мкг/мл). До решти антибіотиків усі 4 досліджених штами E. faecium були резистентні: до ампіциліну МПК складала 64-128 мкг/мл, до ципрофлоксацину – 4-16 мкг/мл, до еритроміцину – 16-64 мкг/мл, до стрептоміцину – 2048-8192 мкг/мл, до цефепіму – 4 мкг/мл та до кларитроміцину МПК складала 8-32 мкг/мл (табл. 1).

Таблиця 1

Чутливість до антибактеріальних препаратів виділених від хворих штамів бактерій роду Enterococcus (кількість штамів =36, з них 32 штами E. faecalis і 4 – E. faecium)

Анти-

біотик | S1, з них | I1, з них | R1, з них | МПК, мкг/мл

Efs2 | Efm3 | Efs2 | Efm3 | Efs2 | Efm3

Ампіцилін | 77,78 / 28 | - | 22,22 / 8 | 0,5 – 128

100,0/28 | 0 | - | - | 50,0/4 | 50,0/4

Тетра-

циклін | 33,34 / 12 | 22,22 / 8 | 44,44 / 16 | 1 – 128

66,67/8 | 33,33/4 | 100,0/8 | 0 | 100,0/16 | 0

Ципро-

флоксацин | 63,89 / 23 | 25,0 / 9 | 11,11 / 4 | 0,125 – 16

100,0/23 | 0 | 100,0/9 | 0 | 0 | 100,0/4

Хлорам-

фенікол | 72,22 / 26 | 11,11 / 4 | 16,67 / 6 | 0,5 – 128

92,31/24 | 7,69/2 | 100,0/4 | 0 | 66,67/4 | 33,33/2

Еритро-

міцин | 13,89 / 5 | 63,89 / 23 | 22,22 / 8 | 0,25 – 64

100,0/5 | 0 | 100,0/23 | 0 | 50,0/4 | 50,0/4

Гента-

міцин | 36,11 / 13 | - | 63,89 / 23 | 32 – 4096

92,31/12 | 7,69/1 | - | - | 86,96/20 | 13,04/3

Стрепто-

міцин | 27,78 / 10 | - | 72,22 / 24 | 1024 – 8192

100,0/10 | 0 | - | - | 91,67/22 | 8,33/4

Цефепім | 69,45 / 25 | 11,11 / 4 | 19,44 / 7 | 0,031 – 4

100,0/25 | 0 | 100,0/4 | 0 | 42,86/3 | 57,14/4

Кларитро-

міцин | 0 | 22,22 / 8 | 77,78 / 28 | 0,5 – 32

0 | 0 | 100,0/8 | 0 | 85,71/24 | 14,29/4

Примітка: 1 – %/кількість штамів чутливих (S), помірно чутливих (I) та стійких (R); 2 – %/кількість штамів E. faecalis; 3 – %/кількість штамів E. faecium.

Для вивчення патогенетичних механізмів перебігу генералізованої ентерококової інфекції та ефективності використаної терапії при даній інфекції було проведено відтворення генералізованої

ентерококової інфекції згідно із запропонованою Г.М. Першиним моделлю, адаптованою для ентерококу, дози мікроорганізму підбирали експериментально. Для оцінки функціонування імунної системи при ентерококовій інфекції визначали вміст у крові лабораторних мишей показників Т-ланки імунітету, стан фагоцитозу, вміст нейтрофілів, В-клітин, IgM, C3-конвертази комплементу, цитокінів. Механізми метаболізму вивчали за показниками перекисного окислення ліпідів (ПОЛ), антиоксидантної системи (АОС) та вмісту ферментів у крові та тканинах сердець, нирок, печінки експериментальних тварин. Морфологічні зміни досліджували стосовно гістологічних ознак у препаратах, що були зроблені з органів лабораторних тварин і відповідно забарвлені.

Після аналізу змін в імунному та цитокіновому статусі при експериментальній ентерококовій інфекції в інфікованих тварин у порівнянні з інтактною групою можна зробити висновок про те, що при генералізованій ентерококовій інфекції має місце недостатність Т-ланки імунітету (достовірне зниження показників CD3+, CD4+, CD8+, CD11в+ та CD18+) на фоні активації В-ланки імунної системи (гiперпродукція CD22+, посилення продукції імуноглобулінів класу М). Також має місце достовірне зниження рівня С3-компоненту комплементу в крові інфікованих мишей порівнянні з інтактними тваринами (рис. 1). Визначення показників цитокінового статусу (IL-1, IL-4, TNF) у крові мишей 1-ої та 2-ої груп виявило, що в організмі інфікованих тварин відбувається активація цитокінового каскаду (підвищується рівень IL-1 та TNF – прозапальних цитокінів), на тлі зниження протизапального цитокіну IL-4 у порівнянні з інтактними тваринами (рис.2).

Рис. 1. Стан імунної системи при генералізованій ентерококовій інфекції.

Рис. 2. Цитокіновий статус при генералізованій ентерококовій інфекції.

Результати оцінки стану ПОЛ та АОС у біологічних субстратах вважають об'єктивними показниками загального стану організму та його регуляторних систем. Як критерії, що свідчать про зміну активності процесу ПОЛ, використовували визначення вмісту в сироватці крові та органах мишей, інфікованих ентерококовою інфекцією, дієнових кон’югатів, малонового діальдегіду та гідроперекисів. Аналіз проведених досліджень показав суттєве підвищення рівня дієнових кон’югатів у сироватці крові інфікованих тварин у середньому на 165%, а також статистично достовірне підвищення в печінці – на 42 %, порівняно з інтактною групою тварин. У серці теж спостерігалося зростання продуктів ПОЛ, а саме гідроперекисів у середньому на 87 %. Значно високим показником інтенсивності ПОЛ за рівнем розходжень з контролем був вміст малонового діальдегіду. Істотне зростання цього показника спостерігали в сироватці крові експериментальних тварин порівняно з контролем, характерним воно було й для нирок – у середньому на 68 %, менш вираженим у печінці – у середньому на 45 %. Найважливішою й необхідною умовою окислювального гомеостазу організму є стабільність складу й властивостей біологічних рідин. Існують спеціалізовані АОС, що відповідають за стабільність оксидантно-антиоксидантної рівноваги рідинних середовищ організму. До їхнього числа належать сульфгідрильні групи білків. В організмі мишей з генералізованою ентерококовою інфекцією спостерігали зниження вмісту сульфгідрильних груп крові в середньому на 29 % порівняно з інтактними тваринами. Також для організму інфікованих мишей характерним було суттєве підвищення активності каталази в серці – на 163 %, тоді як у нирках цей показник підвищувався лише на 26 % порівняно з інтактними тваринами. Підвищення активності каталази в серці та нирках можна розглядати як захисно-пристосувальну реакцію у відповідь на посилення в цих органах процесів вільнорадикального перекисного окислення. Тому доцільним було визначення активності ключових ферментів різних метаболічних шляхів, за рівнем активності яких у сироватці крові можна судити й про наявність структурно-функціональних порушень у плазматичних та мітохондріальних мембранах клітин організму. Про деструктивні процеси в організмі свідчить підвищений вихід ферментів з органів та тканин у кров. У результаті проведених досліджень спостерігали в сироватці крові інфікованих тварин статистично достовірне підвищення активності загальної лактатдегідрогенази (ЛДГ), у середньому на 41 %, що спостерігається при ушкодженнях печінки різного ґенезу та при захворюваннях серця. Визначення ізоферментної серцевої форми ЛДГ показало статистично недостовірне підвищення активності цього ізоферменту в сироватці крові тварин на тлі підвищення в серці в середньому на 84 %. Крім того, у серці спостерігалося суттєве підвищення (на 198%) креатинфосфокінази порівняно з контролем. Але за результатами експериментів можна припустити, що більш суттєвий пошкоджуючий вплив ентерококова інфекція спричиняє на печінку та нирки (рис.3). Підтвердженням цього стали результати підвищення активності індикаторних ферментів печінки: аспартатамінотранферази (АсТ), аланінамінотрансферази (АлТ), лужної фосфатази (ЛФ), г-глутамілтранспептидази (г-ГТП) у сироватці крові експериментальних тварин. Спостерігалося збільшення активності ЛФ – на 225%, г-ГТП – на 73%. Відомо, що г-ГТП характеризується високою активністю не тільки в печінці, а й у нирках. Підвищення активності АсТ та АлТ у сироватці крові (відповідно на 95% і 195%) корелювало з підвищенням активності в печінці інфікованих тварин (відповідно на 61% і 94%), порівняно з контролем. Таким чином, можна зробити висновок про те, що в організмі мишей з генералізовною ентерококовою інфекцією виникає напруга функціонування оксидантно-антиоксидантної системи, яка супроводжується посиленням окислювального метаболізму, збільшенням продукції активних форм кисню, активацією процесів перекисного окислення ліпідів, здатних перебороти бар'єр антиоксидантного захисту. Підвищений вихід ферментів з органів та тканин у кров свідчить про деструктивні процеси в організмі мишей за умов ентерококової інфекції, що може бути наслідком ініціації та інтенсифікації процесів ПОЛ. І морфологічне дослідження підтверджує, що при генералізованій ентерококовій інфекції мають місце виражені дистрофічні та дегенеративні зміни строми й паренхіми внутрішніх органів, поширене інтерстиціальне запалення із залученням паренхіматозних структур (інтерстиціальний міокардит, поліпозно-виразковий ендокардит, гострий продуктивний гепатит, гострий дифузний гломерулонефрит), альтеративно-продуктивними процесами в судинах серця, печінки та нирок, вираженими дисциркуляторними змінами, а також гіперплазією та плазмобластно-макрофагальною трансформацією лімфоїдної тканини селезінки й лімфатичних вузлів.

Рис. 3. Стан ПОЛ та АОС у тканинах мишей при генералізованій ентерококовій інфекції.

Дослідження дії факторів вірулентності ентерококів на механізми функціонування імунної системи дозволили розробити модель патогенетичних механізмів при ентерококовій інфекції, основні положення якої зводяться до того, що ентерококи активують вільнорадикальні процеси ПОЛ та призводять до накопичення активних форм кисню, перекисів, гідроперекисів, вільних радикалів, які порушують структуру біологічних мембран та модулюють розвиток вільнорадикальної патології в організмі. Тривала стимуляція ПОЛ призводить до виснаження АОС, інгібірування процесів біоенергетики та біосинтезу. Ці процеси є вирішальними у формуванні патологічних механізмів супресії клітинного імунітету на етапах диференціювання та проліферації Т-клітин (рис. 4).

Оцінку ефективності використаних схем лікування генералізованої ентерококової інфекції проводили за показником летальності лабораторних тварин та за згаданими вище показниками стану імунної системи, цитокінового балансу, процесів метаболізму та морфологічних

Рис. 4. Концептуальна модель патогенетичних механізмів при ентерококовій інфекції.

характеристик в організмі інфікованих тварин, що отримували різні схеми терапії, порівняно з мишами з генералізованою ентерококовою інфекцією без лікування. У схеми терапії були включені наступні антибактеріальні препарати: амоксиклав, цефепім, ципрофлоксацин та фромілід (у різних поєднаннях), а у зв’язку з тим, що при генералізованій ентерококовій інфекції має місце вторинний імунодефіцит, декілька схем були доповнені імунокорегуючими препаратами такими, як тималін та поліоксидоній. Терапію щодо схеми кожної групи мишей починали наступного дня після зараження лабораторних тварин.

При проведенні лікування лише антимікробними препаратами летальність мишей варіює залежно від використаного антибактеріального засобу. Так, при проведенні лікування тільки амоксиклавом летальність знижується в два рази і становить 25 % у порівнянні з інфікованою групою, яка не отримувала ніякої протимікробної терапії. При використанні тільки фроміліду летальність склала 35 %. А при застосуванні поєднання амоксиклаву з цефепімом летальність залишилася 25 %, у той же час при використанні амоксиклаву разом з фромілідом або цефепіму з фромілідом летальність була 30 та 40 % відповідно, тобто вказана монотерапія лише антибіотиками не є достатньо ефективною, що також підтверджується аналізом змін в імунній системі, окислювально-відновних процесах та морфогенезі. У показниках функціонування імунної системи мали місце певні позитивні зрушення, але цього було недостатньо для нормалізації імунітету (рис. 5). Тобто виявлений при генералізованій ентерококовій інфекції імунодефіцит Т-ланки на фоні активації В-ланки зберігався, а також залишалася неспроможність системи комплементу протистояти даній бактеріальній інфекції. Вивчення показників цитокінового статусу показало, що при згаданій терапії рівні IL-1 та TNF поступово знижуються відповідно до схеми лікування, але все ж таки залишаються на високому рівні, а рівень IL-4, навпаки, залишається на низькому рівні порівняно з інтактною та інфікованою групами (рис. 6).

Рис. 5. Показники імунітету при проведенні терапії антибактеріальними препаратами.

Рис. 6. Параметри цитокінового статусу при лікуванні антибактеріальними препаратами: 1 група – інтактні миші; 2 група – інфіковані; 3 група – Ам; 4 група – Ам+Цф; 7 група – Ф; 8 група – Ф+Ам; 9 група – Ф+Цф.

При вивченні окислювально-відновних процесів у тканинах тварин при застосуванні лише антибактеріальних препаратів дані свідчать, що використання такої терапії не призводить до нормалізації показників процесів ПОЛ та активності АОС, тобто показники, хоча і мали незначну позитивну тенденцію порівняно з інфікованими тваринами, все ж таки не досягали рівня 1-ої (інтактної) групи. Патоморфологічне дослідження також свідчило про недостатність використання тільки протимікробної терапії, хоча при такій монотерапії мали місце відокремлення проміжного запалення у серці, печінці, нирках до осередкового характеру, зниження частоти ускладнення септичного процесу гострим гломерулонефритом у 2 рази порівняно з інфікованою групою, відсутність деструктивно-проліферативних процесів у судинному руслі, зменшення виразності дистрофічних та дегенеративних змін строми і паренхіми. Але у селезінці та лімфатичних вузлах залишалися морфологічні ознаки антигенної стимуляції у вигляді гіперплазії та плазмобласно-

макрофагальної трансформації лімфоїдної тканини, що свідчило про продовження запалення.

Дослідження зазначених показників при використанні комбінованого методу лікування виявило, що застосування комбінацій антибактеріальних та імунокорегуючих препаратів ліквідує прояви септичного процесу та попереджає розвиток його ускладнень. Як це видно з рис. 7, при використанні комбінованого лікування в організмі інфікованих тварин має місце наближення до показників інтактної групи рівнів CD3+, CD4+, CD8+, CD11в+, CD18+, CD22+, вмісту IgM, C3-конвертази комплементу (при лікуванні комбінаціями амоксиклав+цефепім або амоксиклав+ ципрофлоксацин з тималіном визначається приближення параметрів до показників інтактної групи, а при використанні замість тималіну у згаданих комбінаціях поліоксидонію спостерігається ідеальне відновлення функцій імунної системи); при вивченні рівнів цитокінів при даній терапії має місце нормалізація вмісту прозапальних та протизапальних цитокінів (рис. 8). Біохімічне дослідження виявило, що найбільш позитивний корегуючий вплив на функціонування оксидантно-антиоксидантної системи організму мишей мали такі комбінації препаратів, як амоксиклав+цефепім або амоксиклав+ципрофлоксацин з тималіном або поліоксидонієм, бо призводили до суттєвої корекції активності індикаторних ферментів в організмі інфікованих тварин. Морфологічна картина в паренхіматозних органах характеризувалася значним зниженням ступеня виразності запальних і відсутністю проліферативних та деструктивно-некротичних процесів у стромі, судинах і паренхіматозних структурах серця, печінки та нирок, зменшенням виразності дистрофічних і дисциркуляторних порушень при використанні згаданих комбінацій антибактеріальних та імунокорегуючих препаратів.

Враховуючи отримані дані стосовно ентерококової інфекції в цілому, слід виділити основні моменти: у клінічному матеріалі, що був отриманий від хворих на ГЗЗ різної локалізації, ентерококи зустрічалися в кожному 5-6 випадку, частіше збудником виявлявся Enterococcus faecalis, хоча й Enterococcus faecium теж зустрічався; виділені штами ентерококів характеризувалися комплексом біологічних властивостей, у т.ч. й множинною стійкістю до антибактеріальних препаратів (особливо штами Enterococcus faecium), що широко використовуються в клінічній практиці; відтворення експериментальної генералізованої ентерококової інфекції дозволило вивчити патогенетичні особливості перебігу даної інфекції, сформулювати концептуальну модель патологічних механізмів при ній та комплексно обґрунтувати необхідність використання комбінованої антибактеріальної та імунокорегуючої терапії при лікуванні генералізованої ентерококової інфекції.

У дев’ятому розділі в стислій формі проведено узагальнення та аналіз отриманих результатів, наведено підсумки проведених досліджень, результати реалізації поставленої мети та завдань дисертаційної роботи.

Рис. 7. Параметри імунітету при комбінованій терапії ентерококової інфекції.

Рис. 8. Цитокіновий статус при комбінованій терапії ентерококової інфекції: 1 група – інтактні миші; 2 група – інфіковані; 5 група – Ам+Цф+По; 6 група – Ам+Цф+Т; 10 група – Ам+Цп+По; 11 група – Ам+Цп+Т; 12 група – Цф+Цп+По; 13 група – Цф+Цп+Т.

ВИСНОВКИ

У дисертації експериментально обґрунтовано необхідність використання комбінації антибактеріальних та імунокорегуючих препаратів при лікуванні генералізованої ентерококової інфекції.

1. Із клінічного матеріалу 125 хворих виділено 36 штамів ентерококів: з піхви жінок з

неспецифічними запальними захворюваннями урогенітального тракту – 11 штамів, із сечі хворих з інфекціями сечовивідних шляхів – 3 штами, з відокремлюваного уретри чоловіків з неспецифічними інфекціями урогенітального тракту – 5 штамів, з вогнищ гнійно-запальних захворювань м'яких тканин – 14 штамів і крові хворих з підозрою на сепсис або ендокардит - 3 штами.

2. Виділені ентерококи віднесено до наступних видів: E. faecalis – 32 штами (88,9 %),

E. faecium – 4 штами (або 11,1 %). Встановлено, що всі клінічні штами E. faecalis лізирували еритроцити, на відміну від ізолятів E.faecium, у яких дана ознака була відсутня. Желатиназну активність мав 21 штам (58,33%) ентерококів, з яких 20 штамів (95,24%) було E.faecalis і 1 штам (4,76 %) – E. faecium. Виявлено, що 8 штамів E.faecalis мали ДНК-азну активність.

3. Усі штами E. faecalis виявилися чутливими до ампіциліну (МПК 0,5 – 8 мг/мл), ципрофлоксацину (0,125-1-2 мкг/мл), цефепіму (МПК 0,031-0,5-1 мкг/мл), а всі штами E. faecium – лише до тетрацикліну (МПК 1-2 мкг/мл).

4. При дослідженні стану імунної системи встановлено, що при генералізованій ентерококовій інфекції розвивається імунна відповідь, активована за гуморальною (достовірне підвищення вмісту В-клітин, IgM) та пригнічена за Т-клітинною ланками (достовірне зниження вмісту популяцій Т-лімфоцитів – CD3+, CD4+, CD8+). Також має місце пригнічення неспецифічної резистентності організмів лабораторних тварин – достовірне зниження вмісту комплементу (С3 фракції), нейтрофілів (CD18+) та фагоцитів (CD11в+).

5. При генералізованій ентерококовій інфекції у тварин чітко проявляється пригнічення метаболічних процесів за рахунок активації ПОЛ та виснаження АОС, а також виявлені при мікроскопічному дослідженні сердець, нирок, печінки, селезінки, лімфовузлів лабораторних тварин явища розладу кровообігу, дистрофічні й дегенеративні зміни строми і паренхіми, розповсюджене інтерстиціальне запалення із залученням паренхіматозних структур, альтеративно-продуктивні процеси у судинах внутрішніх органів.

6. Застосування при лікуванні мишей з генералізованою ентерококовою інфекцією комбінацій амоксиклав+цефепім+поліоксідоній й амоксиклав+цефепім+тималін нормалізувало показники імунітету, відновлювало процеси метаболізму (процеси ПОЛ та функціональний стан АОС). При цьому морфологічні зміни піддавалися зворотному розвитку (зниження ступеня виразності запалення, відсутність проліферативних і деструктивно-некротичних процесів у стромі, судинах та паренхімі внутрішніх органів).

7. Патогенетично обґрунтовано застосування комбінації антибактеріальних й імунокорегуючих препаратів (амоксиклав+цефепім+поліоксідоній й амоксиклав+цефепім+ тималін) для терапії лабораторних тварин з генералізованою ентерококовою інфекцією з метою підвищення ефективності лікування.

СПИСОК ОПУБЛІКОВАНИХ ПРАЦЬ ЗДОБУВАЧА ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Современные проблемы этиологии и антибактериальной терапии перитонита / Цыганенко А.Я., Мухаметдинова О.В., Ткаченко В.Л., Мозговая Ю.А. // Експериментальна і клінічна медицина. – 2002. - № 3. – С. 39-44. (Здобувач зібрав фактичний матеріал щодо етіологічної ролі ентерококів у розвитку генералізованих інфекцій).

2. Мозгова Ю.А. Оцінка ефективності комбінованої терапії експериментальної генералізованої ентерококової інфекції // Врачебная практика. – 2007. – № 2. – С. 42–45.

3. Концептуальна модель імунопатологічних механізмів при стрептококовій інфекції / Циганенко А.Я., Мішина М.М., Курбанов Р.А.,