АКАДЕМІЯ МЕДИЧНИХ НАУК УКРАЇНИ

ДЕРЖАВНА УСТАНОВА

«ІНСТИТУТ ФАРМАКОЛОГІЇ ТА ТОКСИКОЛОГІЇ»

ШЕРЕМЕТА Руслан Олександрович

УДК: 616.831:616-089.818-08

ЦЕРЕБРОПРОТЕКТОРНІ ВЛАСТИВОСТІ НОВИХ АМІНОКИСЛОТНИХ ПОХІДНИХ

1,4-НАФТОХІНОНУ

(експериментальне дослідження)

14.03.05 – фармакологія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата медичних наук

Київ-2008

Дисертацією є рукопис

Робота виконана у Вінницькому національному медичному університеті
ім. М.І. Пирогова МОЗ України

Науковий керівник: доктор медичних наук, професор

Степанюк Георгій Іванович, Вінницький національний медичний університет ім. М.І. Пирогова МОЗ України, завідувач кафедри фармакології.

Офіційні опоненти:

- доктор медичних наук, професор Ярош Олександр Кузьмич, Державна установа «Інститут фармакології та токсикології» АМН України, м. Київ, керівник відділу фармакокінетики;

- доктор медичних наук, професор, заслужений діяч науки і техніки України Лук’янчук Віктор Дмитрович, Луганський державний медичний університет МОЗ України, завідувач кафедри фармакології.

Захист відбудеться « 18 » червня 2008 р. о 13 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.550.01 при Державній установі «Інститут фармакології та токсикології» АМН України за адресою: 03057, м. Київ, вул. Ежена Потьє, 14.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Державної установи «Інститут фармакології та токсикології» АМН України за адресою: 03057,
м. Київ, вул. Ежена Потьє, 14.

Автореферат розісланий « 17 » травня 2008 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої

ради Д 26.550.01,

кандидат біологічних наук Данова І.В.

Актуальність теми. Гострі порушення мозкового кровотоку (ГПМК) посідають друге місце після ішемічної хвороби серця в структурі причин раптової смерті серед усіх серцево-судинних захворювань. Сьогодні ГПМК стали однією із найважливіших медико-соціальних проблем, що зумовлено високим рівнем інвалідності та летальності з тенденцією до помолодшання контингенту постраждалих (В.Р.Назаренко и др., 1994; G.I.Hen Key, C.P.Warlow, 1999; С.М.Кузнецова, 2006).

В спектрі патологічних станів, обумовлених ГПМК, домінуюча роль належить ішемічним ушкодженням клітин мозку. За даними різних авторів (R.Bonita, 1992; D.T. Wade, 1992; M.Boiten et al., 1996; Б.А.Булеца, Е.Айбен, 1998), на їх долю приходиться від 74% до 85% всіх мозкових інсультів. Суттєве переважання частоти ішемічних інсультів над геморагічними сьогодні має тенденцію до зростання (M. Brainin, 1997; D.Leys, 2001; Т.С.Мищенко, 2003).

Проблема ішемічних інсультів актуальна і в Україні, оскільки близько 175 тис. населення щороку страждає від них, а смертність при цьому у 2,5-3 рази вища, ніж у США та країнах Європи (Т.С.Міщенко та ін., 2004).

В нашій країні проживає більше 1 млн. людей, які перенесли інсульт, причому 80% із них інваліди. Результатом цього є величезні економічні втрати (В.И. Черний, Г.А. Городник, 2001).

Успішний розвиток та впровадження в практичну медицину новітніх технологій заклали основу формування принципово нових концепцій патогенезу ГПМК та, відповідно, нових підходів до їх запобігання та лікування. Визнано, що головним у терапії цереброваскулярних розладів є відновлення гемоперфузії та нейропротекція (Е.И. Гусев, В.И. Скворцова, 2001; А.В. Singhal et al., 2005; Д.В. Гуляев, 2007; З.А. Суслина, М.М. Танашян, 2007).

Враховуючи динамічний характер та потенційну зворотність церебральної ішемії, доведено, що одним із найперспективніших методів захисту головного мозку від ішемії та пов’язаної з нею гіпоксії є відновлення кровопостачання мозку за допомогою вазоактивних лікарських засобів в поєднанні з препаратами, які спроможні нормалізувати метаболічні процеси та реологічні властивості крові (Е.И. Гусев, В.И. Скворцова, 2001; З.А. Суслина, М.М. Танашян, 2007). В теперішній час для корекції порушень мозкового кровообігу існує великий арсенал лікарських засобів з церебропротекторною дією. Зокрема, це церебральні вазоактивні препарати зі спазмолітичним ефектом (серміон, еуфілін, вінпоцетин, цинаризин), фібринолітики (актилізе, стрептоліаза), антикоагулянти (гепарин, фраксипарин), дезагреганти (кислота ацетилсаліцилова, клопідогрель, тиклопидин, дипірідамол), ноотропні засоби (пірацетам, аміналон), антигіпоксанти (гліцин, карнозин, емоксипін), антагоністи Са2+ (німодіпін), препарати з антиоксидантними властивостями (вітамін Е, мексидол) (С.М. Віничук, 1999; Е.И. Гусев, В.И. Скворцова, 2001; G. Lewandovski, W. Barsan, 2001; В.А. Яворская и др., 2006). Разом з цим сучасні лікувальні засоби, які використовуються в терапії ГПМК, не завжди задовольняють вимоги клініцистів через недостатню ефективність та наявність побічних ефектів (артеріальна гіпотензія, розлади з боку ЦНС та шлунково-кишкового тракту у вазоактивних препаратів та антагоністів Са2+; геморагії у фібринолітиків, антикоагулянтів та дезагрегантів; практично всі сучасні церебропротекторні засоби викликають алергічні реакції), які обмежують їх застосування (М.М. Іщенко та ін., 1994; М.Д. Машковский, 2006; З.А. Суслина и др., 2003, 2007).

Наведені дані вказують на те, що однією з пріоритетних задач сучасної фармакології є пошук високоактивних та безпечних речовин з церебропротекторною дією, придатних для створення нових лікарських засобів (І.Ф. Беленічев та ін., 2001; Н.А. Хайлов, 2003; М.В. Оглобліна та ін., 2004; Л.М. Макарова, В. Е. Погорелий, 2004; К.О. Кравченко, 2005; И.Н. Тюренков и др., 2007).

В цьому плані заслуговують уваги амінокислотовмісні похідні 1,4-нафтохінону (1,4-НХ), яким притаманні протиішемічний, протигіпоксичний ефекти та активуючий вплив на біоенергетичні процеси в ішемізованому мозку тварин (Н.С. Диогенова, 1994; В.В. Юшкова та ін., 1998). Досі дослідження наявності у цих речовин церебропротекторної дії не проводились.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота виконана в рамках Держбюджетної НДР кафедри фармакології Вінницького національного медичного університету ім. М.І. Пирогова (ВНМУ) по темі „Експериментальне дослідження кардіо- та нейропротекторих властивостей похідних адамантану, 1,4-НХ та 5-оксибензофурану” (№ держреєстрації 0106V005611).

Мета роботи – на основі експериментальних досліджень протиішемічного та антигіпоксичного ефектів нових амінокислотовмісних похідних 1,4-нафтохінону виявити сполуку з найбільш виразними церебропротекторними властивостями та встановити механізм її дії.

Завдання дослідження:

1. Дослідити гостру токсичність похідних 1,4-НХ при одноразовому внутрішньоочеревинному введенні білим мишам.

2. Провести скрінінг протиішемічної та антигіпоксичної властивостей нових амінокислотовмісних похідних 1,4-НХ, і на підставі аналізу «структура-дія» виявити найбільш активну сполуку, придатну для поглибленого вивчення.

3. Оцінити фармакопрофілактичну ефективність найбільш активної сполуки в умовах ГПМК.

4. Охарактеризувати лікувальну дію найбільш активної сполуки в умовах хронічного експерименту на моделі однобічної оклюзії загальної сонної артерії у щурів.

5. Дослідити деякі механізми церебропротекторної дії відібраної сполуки.

Об’єкт дослідження. Патологічні процеси, що виникають на тлі гострих та хронічних порушень мозкового кровотоку в експерименті.

Предмет дослідження. Церебропротекторні властивості нових амінокислотовмісних похідних 1,4-НХ.

Методи дослідження. Фармакологічні, патофізіологічні, біохімічні, токсикологічні, морфологічні та статистичні методи дослідження.

Наукова новизна отриманих результатів. В роботі вперше теоретично обґрунтовано та експериментально доведено наявність церебропротекторної дії у нових амінокислотовмісних похідних 1,4-НХ, встановлено залежність даного ефекту від хімічної структури сполук.

Досліджувані сполуки при профілактичному введенні в організм зменшують показник летальності щурів з ГПМК та збільшують тривалість їх життя. При цьому калієва сіль 2-б-аланіно-3-хлор-1,4-нафтохінону (сполука 17) за величиною захисної дії в умовах ГПМК співставляється, або переважає вінпоцетин (кавінтон). Лікувальна дія сполуки 17 при ГПМК супроводжується нормалізуючим впливом на біоенергетичні процеси та оксидантно-антиоксидантний гомеостаз, що корелює з позитивною динамікою морфологічної картини ішемізованого мозку. Механізм церебропротекторного ефекту сполуки 17 обумовлений наявністю стимулюючої дії на мозковий кровотік, здатністю усувати енергодефіцит в ішемізованому мозку, нормалізувати прооксидантно-антиоксидантний рівновагу та покращувати реологічні властивості крові.

Практична цінність отриманих результатів. Розширено і поглиблено уявлення щодо фармакологічних властивостей амінокислотовмісних похідних 1,4-НХ та експериментально обгрунтована доцільність їх використання при ГПМК (особливо калієва сіль 2-б-аланіно-3-хлор-1,4-нафтохінону). Виявлена залежність „структура _дія” похідних 1,4-НХ дасть можливість хімікам-синтетикам вести цілеспрямований синтез нових речовин з церебропротекторним ефектом.

Результати проведеного дослідження впроваджено в педагогічний процес кафедр фармакології та патологічної фізіології Вінницького національного медичного університету ім. М.І. Пирогова, Луганського, Буковинського, Тернопільського та Івано-Франківського медичних університетів.

Особистий внесок дисертанта. Автором особисто проведено патентно-інформаційний пошук за темою роботи. Опрацьовані моделі порушень мозкового кровотоку, самостійно виконано всі експериментальні дослідження, проведена статистична обробка отриманих даних, які оформлено у вигляді таблиць, проаналізовано результати досліджень. Біохімічні дослідження ефективності калієвої солі 2-б-аланіно-3-хлор-1,4-нафтохінону в умовах хронічної ішемії мозку виконано при консультативній допомозі проф. М.Б. Луцюка (кафедра біоорганічної хімії ВНМУ); морфологічні - при консультативній допомозі зав. кафедри медичної біології проф. Р.П. Піскун, за що автор роботи щиро їм вдячний.

Апробація матеріалів дисертації. Основні положення дисертаційної роботи оприлюднені на ІV Українській науково-практичній конференції з міжнародною участю з клінічної фармакології (Вінниця, 2004), на ХІ університетській науково-практичній конференції молодих вчених та фахівців (Вінниця, 2005), на науково-практичній конференції з міжнародною участю „Морфологічний стан тканин і органів у нормі та при моделюванні патологічних процесів” (Тернопіль, 2006), на ІІІ Національному з’їзді фармакологів України (Одеса, 2006).

Публікації. По темі дисертації опубліковано 12 робіт у фахових журналах, рекомендованих ВАК України, та 4 тези. Отримано деклараційний патент України на винахід.

Об’єм та структура дисертації. Дисертація викладена на 150 сторінках машинописного тексту і складається зі вступу, огляду літератури, розділу „Матеріали та методи дослідження”, 4 розділів власних досліджень, розділу обговорення результатів проведеного дослідження, висновків та списку літературних джерел, який містить 309 посилань (231 вітчизняних та 78 зарубіжних). Робота ілюстрована 17 рисунками та 15 таблицями.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріали і методи досліджень. Експериментальні дослідження виконано на 210 нелінійних білих мишах обох статей масою 15-20 г та 731 нелінійному білому щурові обох статей масою 140-410 г, розводки віварію Інституту фармакології та токсикології АМН України. Усі тварини утримувались на стандартному водно-харчовому раціоні при вільному доступі до води та їжі. Тварини отримували стандартне харчування у вигляді збалансованого гранульованого корму за встановленими нормами.

Досліди проводились з урахуванням вимог належної лабораторної практики (GLP) згідно з Методичними рекомендаціями ДФЦ МОЗУ (О.В. Стефанов, 2001). Евтаназію тварин проводили шляхом передозування ефіру.

В роботі досліджено 11 оригінальних похідних 1,4-НХ, модифікованих включенням в структуру амінокислотного залишку: лейцину (сполука 15), аргініну (сполука 16), б-аланіну (сполука 17), в-аланіну (сполука 18), гістидину (сполука 19), гліцину (сполука 20), аспарагінової кислоти (сполука 21), глютамінової кислоти (сполука 22), метионіну (сполука 23), тирозину (сполука 24) або аргініну (сполука 25). Усі сполуки синтезовані у Національному університеті «Львівська політехніка» під керівництвом проф. В.П. Новикова і являються калієвими солями, а сполука 25 – сіль лимонної кислоти.

В якості препаратів зрівняння на різних за генезом патологічних станах слугували ампульні розчини емоксипіну 1% (Белмедпрепарат, Білорусь), пірацетаму 20% (Дарниця, Україна), вінпоцетину 0,5% (кавінтон фірми Gedeon Richter, Угорщина).

Гостру токсичність похідних 1,4-НХ вивчали про одноразовому внутрішньоочеревинному (в/о) введенні білим мишам у вигляді водних розчинів 1-5% концентрацій з дотриманням Методичних рекомендацій ДФЦ (О.В. Стефанов, 2001).

Скрінінг церебропротекторної активності проведено на моделі гострого порушення мозкового кровотоку (ГПМК) у наркотизованих (1 серія) та не наркотизованих (2 серія) щурів (двобічна перев’язка загальних сонних артерій). Досліджувані речовини вводили в/о за 45-60 хв до моделювання ГПМК в дозах, що становлять 5% (1 серія) та 1% (2 серія) від ЛД50. Нейропротекторну дію досліджуваних речовин зрівнювали з ефектом пірацетаму і оцінювали за динамікою показника летальності.

Скрінінг антигіпоксичної активності сполук проведено на моделі гострої асфіксії (повне перетискання трахеї) у наркотизованих (тіопентал, 70 мг/кг) щурів. Агтигіпоксичну дію зрівнювали з ефектом емоксипіну в дозі 10 мг/кг в/о (О.В.Дякова, 2005) і оцінювали за тривалістю біоелектричної активності серця (БЕАС) на ЕКГ. Досліджувані речовини вводили одноразово в/о за 45 хв до відтворення асфіксії.

Для оцінки вікової чутливості церебропротекторну дію найбільш ефективної сполуки 17 досліджено на не наркотизованих дорослих щурах (5-6 міс) та старих тваринах (16-18 міс). Сполуку 17 ( в дозах 0,5-2% від ЛД50) та препарат порівняння кавінтон (в терапевтично ефективних дозах, запозичених із літератури (Т.А. Скочко-Волкова, 2002; Г.І. Степанюк та ін., 2002)) вводили в/о за 60 хв до двобічної перев’язки сонних артерій.

Вплив сполуки 17 та кавінтону, взятих в оптимальних церебропротекторних дозах, на перебіг метаболічних процесів та морфологічної картини ішемізованого мозку вивчали на моделі ГПМК, викликаного однобічною перев’язкою лівої сонної артерії у щурів. Лікування проводили протягом 14 діб двічі на добу з інтервалом 5-6 год. Останнє введення було за 2-3 год до евтаназії тварин. Після декапітації тварин ішемізовану півкулю головного мозку виділяли в холодовій камері (-2оС) і заморожували в рідкому азоті. Цитозольну фракцію виділяли методом диференціального центрифугування (15000g). Екстракцію ліпідів проводили за методом Р.Кейтс (1974). Безбілковий екстракт отримували шляхом додавання точної наважки гомогенату тканини мозку до хлорної кислоти (0,6 М) з подальшою нейтралізацією 5 М К2СО3. Показники енергетичного обміну в безбілковому екстракті мозку (вміст АТФ, АДФ, АМФ, лактату, пірувату, глікогену та глюкози) визначали згідно з методами, описаними в літературі (М.И. Прохорова, 1982; В.В. Меньшиков, 1987). Енергетичний заряд розраховували за формулою (D.E. Atkinson, 1968):

Вміст креатинфосфату (КФ) визначали за методом Р. Ergliton et al. (1954).

Інтенсивність ПОЛ в ішемізованому мозку оцінювали за вмістом початкових (дієнові кон’югати, ДК) та кінцевих (ТБК-активних, малоновий діальдегід, МДА) продуктів ліпідпереокислення (Л.И. Андреева и др., 1998). Стан антиоксидантної системи захисту організму оцінювали за активністю ферментів каталази (М.А. Королюк, 1988) та СОД (В.А. Костюк и др., 1990).

Дослідження морфологічної структури ішемізованого мозку (фронтальні зрізи сенсомоторної кори) проводили за допомогою гістологічних методів з використанням світлової мікроскопії. Зрізи мозку забарвлювали гематоксиліном і еозином.

Об’ємну швидкість мозкового кровотоку (ОШМК) у загальній сонній артерії наркотизованих (тіопентал-натрій, 70 мг/кг) щурів вимірювали за допомогою флоуметра Transonic Animal Research Flowmeters Т-106 (USA). Після визначення фонового показника досліджувані речовини (сполука 17 в дозі 4 мг/кг, кавінтон – 5 мг/кг) вводили в стегнову вену.

Вплив сполуки 17 та кавінтону на реологічні властивості крові у щурів з ГПМК (перев’язування лівої сонної артерії та обмеження на 50% кровотоку у правій судині за допомогою мідного кільця) оцінювали за вмістом фібриногену в плазмі крові (В.П. Балуда и др., 1980) та активністю тромбопластину в тканині мозку (Г.Н. Липкан и др., 1990). Лікування проводили протягом 5 днів після моделювання ГПМК окремо сполукою 17 та кавінтоном.

Антиконвульсивну активність сполуки 17, кавінтону та карбамазепіну вивчали на щурах з моделями кордіамінових (300 мг/кг п/ш) та коразолових (80 мг/кг п/ш) судом (А.В. Матвийчук и др., 2004). Сполуку 17 в дозах 3,5-28,0 мг/кг та кавінтон в дозах 5,0-40,0 мг/кг вводили в/о за 30 хв, карбамазепін – 62 мг/кг в/ш (Л.О. Громов, О.О. Євтушенко, 2005). Протисудомну активність оцінювали за динамікою латентного періоду судом, їх тривалістю та за показником ЕД50 - дозою, яка викликала збільшення на 50% тривалості латентного періоду виникнення конвульсій.

Статистичну обробку цифрових даних проводили за методами варіаційної статистики (з визначенням t-крітерія Ст’юдента) та ч2 (М.Л. Беленький, 1963), а при нульовому та 100% значеннях показників - за методом Р.Б. Стрєлкова (1982).

Результати дослідження та їх обговорення

Скрінінг церебропротекторної активності серед амінокислотовмісних похідних 1,4-НХ проведено на моделі ГПМК, викликаною окремо у наркотизованих та ненаркотизованих щурів шляхом двобічної перев’язки загальних сонних артерій. Встановлено, що попереднє внутрішньоочеревинне введення наркотизованим тваринам досліджуваних 1,4-НХ в дозах 5% від їх ДЛ50 подібно до пірацетаму (100 мг/кг) супроводжується зниженням показника летальності та збільшенням тривалості життя щурів. Ліпше всього ця дія проявилась у сполук з лабораторними шифрами 17, 20, 21 та 22. Так, на 36 год спостереження, коли в контрольній групі мала місце 100% летальність, на тлі дії зазначених сполук цей показник становив відповідно 43, 50, 43 та 43%. Захисна дія пірацетаму в зазначений період експерименту була відсутня. В найбільшій мірі вона проявилась в перші 6 год ГПМК - показник летальності становив 0%, що співпадає з даними літератури (В.И. Скворцова, 2005).

Захисна дія похідних 1,4-НХ при ГПМК чітко проявлялась і у ненаркотизованих щурів. Превентивне внутрішньоочеревинне введення досліджуваних сполук (за винятком сполуки 15) в дозах, що становлять 1% від їх ЛД50, подібно до кавінтону (5 мг/кг) викликало вірогідне зниження показника летальності, що особливо було помітно в критичний період експерименту (перша година), коли в контрольній групі загинуло більше половини тварин з ГПМК. Найбільш ефективною виявилась сполука 17: під її дією, як і під впливом кавінтону, протягом 1 год після моделювання ГПМК була відсутня летальність. На 48 год експерименту на тлі сполуки 17 та референс-препарату показник летальності становив відповідно 30% та 40% проти 100% у контролі.

Оскільки однією з ключових патогенетичних ланок ішемічного ушкодження головного мозку є гіпоксія нейроцитів (Л.Д. Лукьянова, 1997), представляло інтерес охарактеризувати протигіпоксичну дію похідних 1,4-НХ. На моделі гострої асфіксії встановлено, що профілактичне внутрішньоочеревинне введення щурам сполук 16, 17, 18, 19, 22 та 25 в дозах, що дорівнюють 1% від їх ЛД50, подібно до емоксипіну (10 мг/кг в/о), супроводжується вірогідним зростанням тривалості БЕАС. При цьому найбільша ефективність відмічена під дією сполуки 17 - тривалість БЕАС зросла відносно контролю на 92,4% проти 37,3% на тлі емоксипіну. Таким чином, за результатами скрінінгового дослідження, можна зробити висновок, що амінокислотовмісні похідні 1,4-НХ є носіями церебопротекторної та протигіпоксичної активностей, яка в найбільшій мірі притаманна сполуці 17 - калієвій солі 2-б-аланіно-3-хлор-1,4-нафтохінону, яка за величиною захисної дії на наркотизованих щурів з ГПМК не поступається пірацетаму (100 мг/кг), співставляючись з кавінтоном (5 мг/кг) в дослідах на ненаркотизованих тваринах. Цінною властивістю сполуки 17 є наявність у неї достатньо виразного протигіпоксичного ефекту, за величиною якого вона у 2,5 рази переважає емоксипін (10 мг/кг).

Оцінка фармакопрофілактичної дії сполуки 17 на моделі ГПМК

Попереднє введення щурам з двобічною перев’язкою сонних артерій сполуки 17, так само як і кавінтону, справляло позитивний вплив на перебіг ГПМК у тварин різних вікових груп (табл. 1)

При цьому дія обох речовин була дозозалежною і проявлялась зниженням показника летальності в усі терміни досліду, збільшенням тривалості життя щурів та полегшенням перебігу клінічної картини ГПМК. Захисний ефект сполуки 17, на відміну від кавінтону, проявлявся практично в однаковій мірі як у дорослих, так і старих тварин. Кавінтон діяв більш ефективно у дорослих щурів з ГПМК, що співпадає з даними літератури (А.П. Соломонов и др., 1983; А.А.Скоромец, 2002) про більш високу терапевтичну дію препарату у молодих пацієнтів з ішемією головного мозку.

Найбільш виразна церебропротекторна дія сполуки 17 в обох вікових групах тварин відмічена в дозі 3,5 мг/кг (1% ЛД50), що проявилось, перш за все, повним запобіганням летальності в критичні періоди експерименту (загибель більше 50% щурів в контролі) як у дорослих (1 год), так і у старих (0,5 год), тварин з ГПМК. Аналогічна дія референс-препарату в оптимальній дозі 5 мг/кг мала місце лише в групі дорослих щурів. Водночас, в оптимальних дозах сполука 17 (3,5 мг/кг) ліпше за кавінтон (5 мг/кг) відстрочувала загибель щурів з ГПМК, що було досить помітно в групі старих тварин на 12 та 48 год експерименту (табл. 1).

Таким чином, калієва сіль 2-б-аланіну-3-хлор-1,4-нафтохінону (сполука 17) при попередньому введенні в організм ненаркотизованих щурів з ГПМК справляє виразну церебропротекторну дію як на дорослих, так і на старих тварин. Кавінтон є більш ефективним у дорослих щурів з ГПМК. Оптимальні фармакопрофілактичні дози названих речовин становлять відповідно 3,5 та 5 мг/кг.

Характеристика лікувальної дії сполуки 17 при ішемії головного мозку в хронічному експерименті

14-денна терапія щурів з ГПМК (однобічна оклюзія сонної артерії) за допомогою сполуки 17 (4 мг/кг), як і кавінтоном (5 мг/кг), супроводжувалась послабленням ознак енергодефіциту в ішемізованій півкулі головного мозку, що чітко проявилось вже на 5-й день експерименту (табл. 2).

Таблиця 1

Вплив сполуки 17 та кавінтону на летальність щурів з ГПМК

Умови досліду | Доза, мг/кг | n | Летальність (%) через:

0,5 год | 1 год | 2 год | 4 год | 8 год | 12 год | 24 год | 48 год

Дорослі тварини

ГПМК без лікування | - | 20 | 50 | 60 | 70 | 70 | 80 | 80 | 90 | 100

Сполука17 + ГПМК | 1,75 | 10 | 10 | 10 | 20 | 20 | 30 | 30 | 30 | 60

3,5 | 10 | 0 | 0 | 10 | 10 | 20 | 20 | 20 | 30

7,0 | 10 | 0 | 10 | 20 | 30 | 30 | 30 | 40 | 50

Кавінтон +ГПМК | 2,5 | 10 | 0 | 10 | 20 | 30 | 30 | 40 | 40 | 60

5,0 | 10 | 0 | 0 | 10 | 20 | 20 | 20 | 20 | 40

10,0 | 10 | 10 | 10 | 20 | 40 | 40 | 50 | 50 | 60

Старі тварини

ГПМК без лікування | - | 20 | 70 | 80 | 90 | 90 | 90 | 100 | 100 | 100

Сполука 17 + ГПМК | 1,75 | 10 | 10 | 30 | 40 | 50 | 60 | 70 | 70 | 100

3,5 | 10 | 0 | 10# | 20 | 30 | 40 | 50# | 50# | 60#

7,0 | 10 | 20 | 30 | 40 | 50 | 50 | 80 | 80 | 80

кавінтон + ГПМК | 2,5 | 10 | 20 | 40 | 50 | 50 | 50 | 80 | 100 | 100

5,0 | 10 | 20 | 40 | 40 | 40 | 50 | 80 | 90* | 100

10,0 | 10 | 30 | 50 | 60 | 60 | 80* | 100 | 100 | 100

Примітки:

1) * - р<0,05 відносно контролю;

2) # - р<0,05 відносно кавінтону.

В зазначений період досліду, який за даними літератури (І.М.Башкін, 1994; І.Ф. Беленічев та ін., 2001) є критичним при ГПМК, сполука 17 в такій же мірі, як і кавінтон, гальмувала порушення у складі аденіннуклеотидів, що супроводжувалось відновленням величини енергетичного заряду мозку. Обидві речовини сприяли вірогідному зростанню вмісту креатинфосфату та глюкози, а також зменшенню рівня лактатацидозу. На 15 добу експерименту зазначена динаміка показників енергетичного метаболізму під дією обох речовин зберігалась. Лікувальна дія сполуки 17 чітко проявилась на перебігу процесів ПОЛ (табл. 3).

Таблиця 3

Вплив сполуки 17 (4 мг/кг в/о) та кавінтону (5мг/кг в/о) на динаміку показників оксидантно-антиоксидантної рівноваги в головному мозку щурів з ГПМК (М±m, n=7)

Показники | Інтактні тварини | Ішемія без лікування (контроль) | Лікування сполукою 17 | Лікування кавінтоном

5 доба | 15 доба | 5 доба | 15 доба | 5 доба | 15 доба

ДК, мкмоль/г тканини | 1,34±

0,08 | 3,42±

0,24* | 2,33±

0,09* | 2,3±

0,12*# | 1,58±

0,06#* | 2,88±

0,18* | 1,55±

0,16#

МДА, мкмоль/г тканини | 0,57±

0,04 | 0,98±

0,06* | 0,78±

0,05* | 0,77±

0,04*# | 0,51±

0,04# | 0,82±

0,05* | 0,69±

0,04#*

СОД, у.о./(мг білка/хв) | 216,2±

19,6 | 82,3±

6,6* | 142,4±

7,1* | 138,1±

9,2*# | 198,4±

13,6# | 116,2±

10,7*# | 186,3±

14,1#

Каталаза, мкат/мг білка/хв. | 5,62±

0,44 | 2,36±

0,32* | 3,48±

0,21* | 4,27±

0,33*# | 5,76±

0,42# | 3,08±

0,32* | 5,51±

0,44#

Примітки:

1)*- р<0,05 відносно інтактних тварин;

2) # - р<0,05 відносно відповідного показника в контролі.

Курсове (14 денне) введення щурам з ГПМК сполуки 17 (4 мг/кг) так само, як і кавінтону (5 мг/кг), викликало пригнічення процесів ліпідпереокислення в ішемізованому головному мозку. Це чітко проявилось вже на 5-й день експерименту (критичний період досліду) і було більш виразним на тлі похідного 1,4-НХ: рівень діє нових кон’югат (ДК) та малонового діальдегіду (МДА) зменшився відносно нелікованих тварин відповідно на 33% та 21,4% (р<0,05) проти 15,8% та 16,3% відповідно під дією кавінтону (р>0,05).

Водночас обидві речовини в даний період експерименту сприяли відновленню зниженої активності ферментів антиоксидантного захисту. При цьому сполука 17 діяла більш ефективно, ніж референс-препарат: активність СОД і каталази зросла відносно нелікованих щурів з ГПМК відповідно на 68 та 81% (р?0,05) проти відповідно на 41,2 (р<0,05) та 30,5% (р>0,05) на тлі кавінтону. На 15 добу експерименту зазначена динаміка показників оксидантно-антиоксидантної рівноваги в ішемізованій півкулі зберігалась, однак повного відновлення (до рівня інтактних тварин) вмісту ДК під дією сполуки 17, як і в концентрації МДА під впливом кавінтону, не було відмічено. При цьому в кінці експерименту на тлі обох речовин помітно зросла (практично до рівня інтактних тварин) активність ферментів антиоксидантної системи.

Оцінюючи динаміку метаболічних процесів в хронічному експерименті, можна заключити, що спроможність сполуки 17, як і кавінтону, послаблювати ступінь енергодефіциту та лактатацидозу разом з пригніченням процесів ліпідпереоксивлення в ішемізованій півкулі головного мозку, ймовірно, посідає провідне місце в механізмі їх нейропротекторного ефекту, оскільки саме ці фактори патогенезу церебральної ішемії є найбільш визначальними як у виникненні, так і в розмірах ділянки некрозу мозку (Е.И. Гусев и др., 1999, Е.И.Гусев, В.И.Скворцова, 2001).

Наведена динаміка метаболічних процесів під дією сполуки 17 та кавінтону цілком корелювала із морфологічними змінами в корі ішемізованого головного мозку щурів. На 5 добу досліду спостерігалось поліпшення цитоархітектоніки кори головного мозку відносно нелікованих тварин, що виражалось в зменшенні явищ периваскулярного та перицелюлярного набряку, в зменшенні кількості нейроцитів з явищами дистрофії та деструкції, в зменшенні кількості капілярів із спавшимися просвітами. Також спостерігалося збільшення макрогліальних елементів (астроцитів навколо судин). При цьому клітини мікроглії скупчувались в місцях загибелі нейроцитів, утворюючи демаркаційну зону.

На 15 добу досліду в корі великих півкуль головного мозку щурів, лікованих сполукою 17 так само, як і кавінтоном, комплекс змін цитоархітектоніки мав ряд позитивних ознак, порівняно зі змінами у нелікованих. Так, в корі головного мозку тварин обох піддослідних груп в різній ступені виражена радіальна посмугованість, а також спостерігалась значна кількість капілярів з розширеним просвітом. Вогнищ загиблих нейроцитів, а відповідно і осередків макрофагальної інфільтрації, виявлялось менше, ніж в контролі. Більшість нервових клітин відносилась до нормохромного типу, мала чітко оконтуровані округлі ядра з 1-2 ядерцями.

Таким чином, курсове лікування змодельованої ішемії головного мозку за допомогою калієвої солі 2-б-аланіно-3-хлор-1,4-нафтохінону (сполуки 17) в дозі 4 мг/кг так само, як і кавінтону в дозі 5 мг/кг, викликало помітне послаблення пошкоджуючої дії ішемії на тканини головного мозку, однак не призвело до повного відновлення морфологічних показників цитоархітектоніки кори головного мозку, що корелює зі станом метаболічних процесів.

Дослідження механізмів церебропротекторної дії сполуки 17

Вплив сполуки 17 на кровопостачання головного мозку інтактних наркотизованих щурів оцінювали за динамікою показника ОШМК, яку вимірювали в загальній сонній артерії. Із даних, наведених на рис.1, видно, що внутрішньовенне введення щурам сполуки 17 (4 мг/кг) подібно до кавінтону (5 мг/кг), викликало зростання ОШМК відносно як початкового рівня, так і відносно величини кровотоку в контрольній групі тварин (введення еквівалентної кількості 0,9% розчину NaCl).

Примітка: *- р<0,05 відносно кавінтону

Рис. 1. Динаміка об`ємної швидкості мозкового кровотоку у інтактних щурів та на фоні дії сполуки 17 (4 мг/кг в/в) або кавінтону (5 мг/кг в/в)

При цьому сполука 17 переважала референс-препарат як за величиною стимулюючої дії на кровопостачання головного мозку (максимальний приріст ОШМК становив відповідно 60 та 30%), так і за тривалістю ефекту. Рівень АТ під дією сполуки 17 практично не змінювався, а на тлі кавінтону знижувався в середньому на 12%. Зазначений вплив обох речовин на величину ОШМК може бути свідченням наявності у них судинорозширюючого ефекту.

Вплив досліджуваного похідного 1,4-НХ на реологічні властивості крові при експериментальному порушенні мозкового кровотоку оцінювали за вістом фібриногену в плазмі крові та активністю тромбопластину в головному мозку. 5-денне лікування щурів з ГПМК за допомогою сполуки 17 (3,5 мг/кг в/о) так само, як і кавінтону (5 мг/кг) супроводжувалось вірогідним зменшенням вмісту фібриногену в плазмі крові відповідно на 21% та 30% всередньому відносно нелікованих тварин. Це супроводжувалось вірогідним зростанням часу зсідання субстратної плазми у всіх розведеннях тканинних екстрактів головного мозку на тлі обох речовин відносно нелікованих тварин, що вказує на блокування активності тромбопластину мозку. Наведені дані можна охарактеризувати як спроможність сполуки 17, як і кавінтону, покращувати реологічні властивості крові шляхом зменшення рівня фібриногену в плазмі крові та блокування активності тромбопластину мозку.

Оскільки при ішемічному інсульті часом спостерігаються вогнищеві та генералізовані судоми (П.В. Волошин та ін., 2005), представляло інтерес дослідити цю сторону церебропротекторної дії сполуки 17. За даними літератури (А.А. Дутов и др., 1987) кавінтону притаманний протисудомний ефект.

Нами встановлено, що запобіжне введення щурам сполуки 17, як і кавінтону, збільшує тривалість латентного періоду конвульсій та тривалість самих судом, викликаних кордіаміном (300 мг/кг п/ш) або коразолом (80 мг/кг п/ш). На моделі кордіамінових судом оптимальні захисні дози сполуки 17 та кавінтону становили відповідно 14 та 20 мг/кг, а ЕД50 за показниками тривалості латентного періоду конвульсій - відповідно 10 та 17 мг/кг. На моделі коразолових судом оптимальні антиконвульсивні дози сполуки 17 та референс-препарату становили 7 та 30 мг/кг, а ЕД50 - відповідно 3,8 та 14,6 мг/кг. За величиною протисудомного ефекту обидві речовини поступались еталонному антиконвульсанту карбамазепіну (62 мг/кг в/ш), який повністю запобігав виникненню кордіамінових та коразолових судом у більшості (5 із 7) взятих у дослід тварин. Отже, церебопротекторна дія сполуки 17, як і кавінтону, в певній мірі обумовлена наявністю протисудомного ефекту.

Захисна дія калієвої солі 2-б-аланіно-3-хлор-1,4-нафтохінону на ішемізований мозок обумовлена комплексом фармакологічних властивостей (рис. 2).

Стимуляція кровопостачання головного мозку | Усунення енергодефіциту в ішемізованому мозку | Нормалізація порушених показників ПОЛ - АОС

Калієва сіль 2-б-аланіно-3-хлор-1,4-нафтохінону

Покращення реологічних властивостей крові | Протигіпоксичний ефект | Протисудомна дія

Рис. 2. Спрямованість церебропротекторної дії калієвої солі 2-б-аланіно-3-хлор-1,4-нафтохінону (схема).

Таким чином, на підставі результатів проведеного дослідження можна зробити заключення про те, що досліджуваним амінокислотним похідним 1,4-нафтохінону притаманна виразна церебропротекторна дія. В найбільшій мірі цей ефект проявився у калієвої солі 2-б-аланіо-3-хлор-1,4-нафтохінону (сполука 17) в дозах, що становлять близько 1% від її ЛД50.

Висновки

В дисертації наведено теоретичне узагальнення і нове експериментальне вирішення наукової здачі, спрямованої на підвищення ефективності фармакотерапії порушень мозкового кровотоку шляхом застосування калієвої солі 2-б-аланіно-3-хлор-1,4-нафтохінону.

1. Серед 11 нових амінокислотовмісних похідних 1,4-нафтохінону найбільшу церебропротекторну та протигіпоксичну активності мають сполуки, які містять в структурі б-аланін (сполука 17) або гліцин (сполука 20): ці речовини при превентивному введенні в організм в дозі 1% від ЛД50, так само, як і кавінтон (5 мг/кг), запобігають летальності ненаркотизованих щурв з ГПМК в критичний період (1 год) експерименту. За величиною тривалості біоелектричної активності серця у щурів з гострою асфіксією сполука 17 (3,5 мг/кг) вірогідно переважає емоксипін (10 мг/кг) в 2,5 рази.

2. Сполука 17 (калієва сіль 2-б-аланіно-3-хлор-1,4-нафтохінону, 1,75-
7,0 мг/кг в/о) при попередньому одноразовому введенні в організм, як і кавінтон (2,5-10,0 мг/кг в/о), справляє дозозалежну захисну дію на ненаркотизованих щурів з двобічною перевязкою сонних артерій, що проявляється зменшенням летальності (на 20-70%) та збільшенням тривалості життя тварин різних вікових груп. За величиною зазначеного ефекту похідне 1,4-нафтохінону в умовно терапевтичній дозі (3,5 мг/кг) вірогідно переважає кавінтон (5 мг/кг) в дослідах на старих щурах: на 12 год експерименту показник летальності тварин становив, відповідно, 50% і 80% (в контролі 100%).

3. Курсове (14 днів) лікування щурів з ГПМК (однобічна перевязка сонної артерії) сполукою 17 (щоденно 1 раз на добу 4 мг/кг, в/о), як і кавінтону (5 мг/кг, в/о) вірогідно послаблює прояви енергодефіциту в ішемізованому мозку тварин, починаючи з 5-ої доби спостереження: вміст АТФ становив, відповідно, 1,96±0,13 та 1,88±0,13 проти 1,52±0,14 мкМ/г тканини у нелікованих тварин, а концентрація креатинфосфату – відповідно 2,01±0,14 та 2,12±0,11 проти 1,42±0,12 мкМ/г тканини в контролі. При цьому обидві речовини вірогідно знижують концентрацію молочної кислоти (на 23% та 26% відповідно) та збільшують рівень глюкози (на 55% та 22% відповідно) тканинах мозку. Зазначена динаміка зберігалась і на 15 добу експерименту.

4. Калієва сіль 2-б-аланіно-3-хлор-1,4-нафтохінону (4 мг/кг) при курсовому введенні щурам з ГПМК проявляє антиоксидантні властивості, про що свідчить зниження на 5 добу експерименту рівня ДК на 33% (р<0,05) та МДА на 21,4% (р<0,05) при одночасному підвищенні активності СОД на 67,8% та каталази на 81% (р<0,05) відносно нелікованих тварин. Зазначена динаміка зберігалась і на 15 добу експерименту.

5. Курсове (14 днів) введення щурам з ГПМК сполуки 17 (4 мг/кг) сприяє відновленню цитоархітектоніки сенсомоторної кори головного мозку, зменшенню ознак дистрофічних та деструктивних змін в ішемізованому мозку.

6. 5-денне введення сполуки 17 (3,5 мг/кг внутрішньоочеревинно) усуває ознаки гіперкоагуляції крові у щурів з гострим порушенням мозкового кровотоку: вміст фібриногену в плазмі крові в кінці лікування вірогідно зменшується на 21%. Водночас спостерігається блокування активності тканинного тромбопластину мозку на що вказує скорочення терміну зсідання субстратної плазми на 20,3-27,4% проти 46,0-55,7% в контролі (р?0,5).

7. Калієвій солі 2-б-аланіно-3-хлор-1,4-нафтохінону притаманна дозозалежна антиконвульсивна дія у білих щурів з моделлю кордіамінових і коразолових судом. При цьому за величиною показника ЕД50 (тривалість латентного періоду судом) сполука 17 переважає кавінтон, відповідно, в 1,7 та 3,8 рази, поступаючись за ефективністю карбамазепіну (62 мг/кг в/ш).

8. Лікувальний ефект калієвої солі 2-б-аланіно-3-хлор-1,4-нафтохінону при ГПМК обумовлений відновленням мозкового кровотоку, усуненням енергодефіциту та порушень оксидантно-антиоксидантного гомеостазу, покращенням реологічних властивостей крові.

Список праць, опублікованих за темою дисертації

1. Шеремета Р.О., Степанюк Г.І., Новиков В.П., Марінцова Н.Г. Порівняльний вплив калієвої солі 2-б-аланіно-3-хлор-1,4-нафтохінону та кавінтону на перебіг біоенергетичних процесів при гострій експериментальній ішемії мозку // Вестник неотложной и восстановительной медицины. - 2005. - Т.6, №1. - С. 138-141. (Дисертант особисто виконав експериментальну частину, проаналізував отримані результати, підготовив матеріали до друку).

2. Шеремета Р.О., Степанюк Г.І., Новиков В.П., Марінцова Н.Г. Порівняльний вплив калієвої солі 2-б-аланіно-3-хлор-1,4-нафтохінону та кавінтону на процеси ліпідпереокиснення в головному мозку щурів з гострим порушенням мозкового кровотоку // Одеський медичний журнал. - 2005. - №2 (88). - С. 38-40. (Здобувач особисто виконав експериментальну частину, проаналізував отримані результати, підготував матеріали до друку).

3. Степанюк Г.І., Шеремета Р.О., Новиков В.П., Марінцова Н.Г. Порівняльний оцінка захисної дії нового амінокислотного похідного 1,4-нафтохінону та кавінтону на моделі гострого порушення мозкового кровотоку у щурів різних вікових груп // Вісник Вінницького національного медичного університету. - 2005. - №9(2). - С. 43-45. (Дисертант особисто виконав експериментальну частину, проаналізував отримані результати, підготовив матеріали до друку).

4. Степанюк Г.І., Шеремета Р.О., Новиков В.П., Марінцова Н.Г., Журахівська Л.Р. Церебропротекторна дія амінокислотовмісних похідних 1,4-нафтохінону на моделі гострої ішемії головного мозку // Одеський медичний журнал. - 2005. - №3(89). - С. 43-45. (Здобувач особисто виконав експериментальну частину, проаналізував отримані результати, підготував матеріали до друку).

5. Журахівська Л.Р., Комаровська-Порхнявець О.З., Марінцова Н.Г., Новиков В.П., Губицька І.І., Степанюк Г.І., Шеремета Р.О., Тендітна О.М., Макончук Д.Ю., Лисун В.М. Синтез, гостра токсичність, потигіпоксична та протиішемічна активності нових амінокислотних похідних 1,4-нафтохінону // Фармацевтичний журнал. - 2005. - №3. - С.67-73. (Здобувачем особисто проведено дослідження гострої токсичності, протиішемічної та протигіпоксичної активності; проаналізовано отримані результати).

6. Піскун Р.П., Шеремета Р.О., Степанюк Г.І. Структурні зміни сенсомоторної кори великого мозку щурів в умовах гострого порушення мозкового кровообігу та при фармакокорекції похідним 1,4-нафтохінону // Вісник наукових досліджень. - 2006. - №3. - С. 60-62. (Здобувачем особисто виконано експериментальну частину, проаналізовано отримані результати, підготовлено матеріали до друку).

7. Степанюк Г.І., Шеремета Р.О., Пашинська О.С., Козирєв С.Н. Експериментальне дослідження антиконвульсивної активності калієвої солі 2-б-аланіно-3-хлор-1,4-нафтохінону // Вісник Вінницького медичного університету. - 2006. - №10(1). - С. 22-24. (Здобувачем особисто виконано експериментальну частину, проаналізовано отримані результати, підготовлено матеріали до друку).

8. Шеремета Р.О. Характеристика гемореологічних властивостей калієвої солі 2-б-аланіно-3-хлор-1,4-нафтохінону при експериментальній ішемії головного мозку // Biomedical and Biosocial Anthropology. - 2007 №8. - Р.15-18.

9. Шеремета Р.О., Дякова О.В., Кирничний А.І. Порівняльна оцінка церебропротекторної дії кавінтону, вінборону, пірацетаму, пентоксифіліну, емоксипіну та натрію оксибутирату на моделі гострого порушення мозкового кровотоку / «Актуальні питання фармакології»: Мат. ІV Української наук.-практ. конф. з міжнародною участю з клін. фармакології. - Вінниця, 2004. - С.166-167.

10. Шеремета Р.О. Експериментальне дослідження церебропротек-торних властивостей нових амінокислотовмісних похідних 1,4-нафтохінону / Мат. ХІ Університетської наук.-практ. конф. молодих вчених та