ЛЬВІВСЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ
ІМЕНІ ІВАНА ФРАНКА
БАБИЧ НАТАЛІЯ ОЛЕГІВНА
УДК 591.133.2:612.119:612.017.1:591.147.1
Регуляція тироксином мієлопоезу та лімфопоезу
У ранньому постнатальному періоді
03.00.13 – фізіологія людини і тварин
АВТОРЕФЕРАТ
дисертації на здобуття наукового ступеня
кандидата біологічних наук
Львів – 2001
Дисертацією є рукопис
Робота виконана на кафедрі біохімії Львівського державного медичного університету імені Данила Галицького
Наукові керівники: доктор біологічних наук, професор
Тимочко Михайло Федорович ,
Львівський державний медичний університет
імені Данила Галицького
доктор медичних наук, професор
Скляров Олександр Якович,
Львівський дер-жавний медичний університет імені Данила Галицького завідувач кафедри біологічної хімії
Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор
Великий Микола Миколайович,
Національний медичний університет ім. О.О. Богомольця (м. Київ), кафедра біоорганічної, біологічної та фармацевтичної хімії
доктор біологічних наук, професор
Смолянінов Борис Вікторович,
Одеський державний аграрний університет, завідувач кафедри фізіології та біохімії сільськогосподарських тварин
Провідна установа: Київський національний університет імені Тараса Шевченка, м. Київ
Захист відбудеться “ 21 ” грудня 2001р. о 14.00 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради К 35.051.14 у Львівському національному університеті імені Івана Франка за адресою: 79005, м. Львів, вул. Грушевського, 4, біологічний факультет Львівського національного університету імені Івана Франка, ауд. 333 .
З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Львівського національного університету імені Івана Франка за адресою: 79005, м. Львів, вул. Драгоманова, 17.
Автореферат розісланий “ 20 ” листопада 2001 року.
Вчений секретар спеціалізованої
вченої ради, кандидат біологічних наук Д.І.Санагурський
ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ
Актуальність теми. З'ясування механізмів регуля-ції тироксином про-цесів мієлопоезу та лімфопоезу є однією з важливих проблем су-часної біології і медицини. Актуальність досліджень у цьому напрямі зумовлена зростанням в Україні час-тоти захворювань, пов’язаних з розладами діяльності щитоподіб-ної залози [Касаткина и др. 1997; Пантелеев и др. 1997; Klugbauer et al. 1998; Thomas et al. 1999; Santoro et al. 2000]. В основі цих захворювань лежать фун-кціональні порушення у багатьох ланках обміну речовин, що зумовлені впливом тиреоїдних гормонів на метаболізм клітин, в тому числі, імуно-компетент-них [Павловський та співавт. 1986; Калиман 1992; Marsh, Erf 1996; Ром-Богуславская и др. 1997; Hulbert 2000]. Важливе значення мають дослі-дження дії тирок-сину на процеси лейкоцитопоезу у неонатальному періоді в зв'язку з висо-кими концентраціями тиреоїдних гормонів у крові ссавців у ранньому постнатальному пе-ріоді [Girard, Ferre 1982; Slebodzinski 1988; Polk 1995].
Дані щодо регуляторної ролі тиреоїдних гормонів у процесах мієлопоезу і лімфопоезу, а також внутрішньоклітинних механі-змів впливу тироксину на фун-кці-онування кровотворних клітин і лейкоцитів є суперечливими [Paavonen 1982; Gupta et al. 1983; Bachman, Mashaly 1987; Monte-cino-Rodri-guez et al. 1996; 1997]. Оскільки в реалізації функціональної активності імунокомпетентних клітин важлива роль належить як синтетичним, так і енергетичним процесам в кро-вотворних клітинах і лейкоцитах, важливими є дослідження вмісту тиреоїдних гормонів в організмі у взаємозв'я-зку з об-мінними, зокрема з окисно-відновними процесами в даних популяціях клі-тин. Відомо, що чутливість клітин до дії тироксину в значній мірі зумовлена наявністю ферменту, який ката-лізує перетво-рення молекул гормону до більш активної форми - трийодтироніну [Kohrle 1994, 2000; Braverman 1994; Larsen 1997; St.Germain 1999; Sabatino et al. 2000], однак функціональні характеристики процесу дейодування тироксину в мієлоїдних клітинах і лейкоцитах тварин на даний час не з'ясовані. Тому актуальними є дослідження активно-сті і властивостей йодотиронін-5’-дейодинази в мієлоїдних клі-тинах кістко-вого мозку і лейкоцитах крові, що дасть можливість з'ясувати роль ти-рок-сину у фо-рмуванні імунної реактивності організму. Дослідження такого плану є особливо актуальними для виявлення впливу тироксину в ранньому постнатальному періоді як людей, так і тварин, коли часто виникають захворювання кровотворної та імунної систем [Снітинський та співавт. 1994].
Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисер-таційна робота є частиною науково-дослідної роботи Львівського державного медичного університету ім. Данила Галицького (бюджетна тема “Сучасні підходи до хіміотерапії раку з врахуванням системного впливу пухлини і токсичної дії цитостатиків”, ІН.18.00.001.97 № держреєстрації 0198V000870).
Мета та завдання дослідження. Вивчити регуляторний вплив тирок-сину на інтенсивність лейкоцитопоезу та процеси, що забезпечують функціо-нальну активність лейкоцитів крові поросят у ранньому постнатальному періоді та з'ясувати особливості характеру дії гормону.
Для досягнення поставленої мети були сформульовані такі завдання:
1. Вивчити регуляторний вплив тироксину на популяційний склад мієлоїд-них клітин кіст-кового мозку і лейкоцитів крові по-росят раннього віку.
2. Дослідити вплив тироксину на інтенсивність включення позначених ра-діоак-тивними мітками попередників у молекули ДНК і білків у мієлоїдних клі-ти-нах кісткового мозку, клітинах тимусу та лейкоцитах крові.
3. З'ясувати вплив тироксину на інтенсивність енергетичних процесів, процесів перекисного окис-лення ліпідів (ПОЛ) і функціональну активність антиоксидантної системи в міє-локаріоцитах кісткового мозку, клітинах тимусу і лейкоцитах крові.
4. Вивчити функціональні характеристики процесу дейодування тирок-сину та властивості йодотиронін-5'-дейодинази в мієлоїдних клітинах кісткового мозку і лейкоцитах.
Об’єкт дослідження: метаболічний і функціональний стан гемопоети-чної тканини кісткового мозку та клітин крові і тимусу в організмі поросят у ранньому постнатальному періоді.
Предмет дослідження: механізми регуляції тироксином мієлопоезу, лімфопоезу та функціональної активності лейкоцитів крові в організмі поросят.
Методи дослідження: експериментальні фізіологічні, морфологічні, спектрофотометричні, радіологічні, статистичні.
Наукова новизна одержаних результатів. Уперше проведено дослі-дження впливу тироксину на інтенсивність процесів мієлопоезу та лімфопоезу в організмі поросят у ранньому періоді після народження. Встановлено інгібуючу дію гормону на проліферативну активність мієлоїдних попередників із стимуляцією дозрівання клітин до функціонально зрілих лейкоцитів крові та стимулюючий вплив тироксину на процес лімфопоезу. Виявлено значну чутливість ферментних систем окремих метаболі-чних шляхів клітин мієлоїдного ряду до впливу тироксину і меншу - в клі-тинах системи лімфопоезу. Показано інтенсифікацію процесів ПОЛ у процесі розвитку гіпертиреоїдного стану та ак-тивацію ферментів антиокси-дантного захисту в досліджуваних клітинах на окремих етапах експерименту, що свідчить про наявність внутрішньоклітинних компенсаторних механізмів детоксикації кисне-вих радикалів та продуктів неповного окислення ліпідів. Вперше встановлено функціонування системи перетворення тироксину до більш акти-вного 3,3’,5-трийодтироніну в мієлоїдних клітинах кісткового мо-зку та вивчено кінетичні характеристики йодотиронін-5’-дейодинази в мієлої-дних клітинах і лейкоцитах поросят.
Практичне значення одержаних результатів. Отримані результати мають фундаментальне зна-чення для поглиблення сучасних положень стосовно ролі тиреоїдних гормонів у меха-нізмах регуляції процесів мієлопоезу і лімфопоезу та функціональ-ної ак-тивності лейкоцитів, функціонування системи дейодування тироксину як однієї з ланок у механізмах активації гормону для реалізації його регуля-торного ефекту в клітинах кровотворної системи.
Результати досліджень впроваджені у навчальний процес кафедри біохімії Львівського державного медичного університету імені Данила Галицького при вивченні механізмів дії тиреоїдних гормонів. Отримані резуль-тати можуть бути застосовані в клінічній практиці для прогнозування можливих наслідків пору-шень функціональної активності щитоподібної залози та для розробки ефек-тивних засобів з метою їх корекції; для розробки імуно- і гемомодуляторів.
Особистий внесок дисертанта. Відповідно до поставленої мети і за-вдань автором особисто виконано всі експериментальні дослідження, прове-дено статистичну обробку одержаних результатів, їх аналіз, сформульовано основні висновки роботи та разом із співавторами (Тимочком М.Ф., Скляро-вим О.Я., Антоняк Г.Л., Сологубом Л.І. та ін.) підготовано до друку пу-блі-кації за матеріалами дисертації.
Апробація результатів дисертації. Матеріали дисертаційної роботи представлені на 2-ій та 3-ій міжнародних конференціях ім. Я. Парнаса (Гданськ, 1998; Львів, 2000), на 4-му міжнародному конгресі студентів-медиків (Катовіце, 1998), на 3-ій міжнародній конференції з ендокринології тварин (Брюссель, 1998), на Міжнародному з’їзді з експериментальної біології (Вашінгтон, 1999), на міжнародному симпозіумі “Біологічні механізми старіння” (Харків, 2000) та на засіданнях кафедри біохімії Львівського державного медичного університету імені Данила Галицького (1998-2001).
Публікації. Основні результати дисертаційної роботи висвітлені у 17 публікаціях, серед них 9 статей у наукових фахових виданнях та тези доповідей на наукових конференціях.
Структура і об’єм роботи. Дисертація складається із вступу, огляду літератури, описання ме-тодів досліджень, результатів досліджень, обговорення, висновків, практичних рекомендацій і спи-ску літературних джерел із 400 найменувань. Робота викладена на 134 сторінках, ілюстрована 10 рисунками і 12 таблицями.
ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ
МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ
В експериментах використано 40 поросят віком від народження до 10-ти днів з живою масою 1-3 кілограми, отриманих від свиноматок великої білої породи. Модель гіпертиреоїдного стану створювали шляхом введення твари-нам внутрішньоочеревинно тироксину (“Reanal”) в дозі 4,0 мг/кг маси через кожні 12 год починаючи з 2-ї доби після народження. Ефекти гормону вивчали при різній тривалості його дії [Кеворков, Бахметьев 1984; Сухомлинов и др. 1986; Кали-ман 1992]. З гемопоетичних органів та периферійної крові тварин виділяли популяції мієлоїдних клітин та лейкоци-тів шляхом диференціального центрифугування клітинних суспензій [Boyum 1968; Ling, Kay 1975; Mishell, Shiigi 1980; Freshney 1987]. Для розділення клі-тин застосовували градієнти густини фіколу і верографіну [Harrison et al.1981; Сибирная и др. 1991]. У виділених клітинах вивчали процеси синтезу ДНК і білків за інтенсивністю інкорпорації в молекули вказаних біополімерів позна-чених радіоактивними позначками тимідину та суміші амінокислот [Mishell, Shiigi 1980; Вовк, Янович 1988; Karsten et al. 1994]. В лізатах досліджуваних клітин вивчали активність фе-рментів енергетичного обміну (гексокінази, 6-фосфофруктокінази, піруваткінази, лактатдегідрогенази, глюкозо-6-фосфатдегідрогенази, ізоцитратдегідрогенази, цитохром с-оксидази) [Wharton, Tzagoloff 1967; Bergmeyer 1983] та антиоксидантної системи (cупероксиддисмутази, глутатіонпероксидази, глутатіонредуктази) [Pinto, Bartley 1969; Дубинина та співавт. 1983; Моин 1986], а також вміст продуктів перекисного окислення ліпідів (ПОЛ) малонового діальдегіду і гідроперекисів ліпідів [Мирончик 1984; Коробейников 1989]. Для з’ясування інтенсивності процесу внутрішньоклі-тинного перетворення тироксину до 3,3’,5-трийодтироніну в гомогенатах клітин визначали активність та деякі кінетичні характеристики йодотиронін-5’-дейодиназ І та ІІ типів радіологічним методом з використанням позначе-ного радіоактивною міткою реверсійного 125І-трийодтироніну (рТ3) [Leonard, Rosenberg 1980; Jack et al. 1994].
РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ
Вплив тироксину на вміст клітинних популяцій у кістковому мо-зку і крові поросят раннього віку. В процесі досліджень встановлено, що під впливом тироксину в гемопоетичній тканині кісткового мозку поросят 3-10-денного віку змінюються співвідношення між вмістом клітин окремих популяцій мієлоїдних клітин. Так, після ін’єкцій гормону в гемопое-тичній тканині 5- і 10-денних поросят вірогідно зменшується відносний вміст популяцій проліферуючих клітин: мієлобластів (на 28-33%), промієлоцитів (на 38%) і мієло-цитів (31-35%), (р<0,05-0,01). Водночас у кістковому мозку поросят дослідних груп на окремих стадіях експерименту спостерігається зменшення вмісту дозріваючих і зрілих клітин гранулоцитарного ряду: паличкоядерних нейтрофільних гранулоцитів (на 26%, p<0,05) і сегментоядерних нейтрофільних гранулоцитів (на 33%, p<0,01). Цей ефект супроводжу-ється інтенсифікацією вивільнення зрілих гранулоцитів у кров, що зумовлює кіль-кісне збільшення популяції сегментоядерних клітин та загального вмісту лей-коцитів у крові 3-денних тварин (р<0,05). Водночас після введення гор-мону в крові поросят 3-5-добового віку вірогідно зменшу-ється вміст метамієлоцитів (р<0,01), в зв’язку з чим показник співвідно-шення між вмі-стом популяцій молодих і зрілих форм гранулоци-топоезу в крові тварин зни-жується. Такий ефект свідчить про вплив тироксину на процес остато-чного дозрівання мієлоїдних клітин.
Поряд із зменшенням вмісту клітинних популяцій мієлопоезу в кістко-вому мозку 10-денних поросят спостерігається збільшення частки лімфоїдних клітин (р<0,05), не зважаючи на те, що відносний вміст лімфоцитів у периферійній крові тварин вірогідно не змінюється. Це свідчить про стимулюючий вплив тироксину на процес лімфопоезу в кістковому мозку та підтверджує дані літератури про роль тиреоїдних гормонів у регуляції імунної функції тварин [Dardenne et al 1988; Erf 1993; Marsh, Erf 1996].
Вплив тироксину на синтез ДНК і білків у мієлоїдних клітинах, клітинах тимусу і лі-мфоцитах поросят у ранньому постнатальному періоді. При дослідженні впливу тироксину на синтез ДНК і білків встановлено, що дія гормону щодо інтенсивності цих процесів у клітинах систем мієлопоезу і лімфопоезу є неоднозначною. Так, у мієлоїдних клітинах кісткового мозку 10-денних поросят, яким вводили тироксин, спостерігається пригнічення синтезу ДНК при відносно стабільній інтенсивності синтезу білків (табл.1).
Таблиця 1.
Інтенсивність включення мічених попередників у молекули ДНК і білків
у клітинах поросят 3- і 10-денного віку (Mm, n=5)
Умови досліджень
Клітини | 3-денні тварини | 10-денні тварини
Контроль | Після введення Т4 | Контроль | Після введення Т4
Включення 3Н-тимідину (кількість розпадів за хвилину на 108 клітин)
Мієлоїдні клітини | 35948 | 31738 | 47154 | 32027*
Клітини тимусу | 36727 | 31653 | 46050 | 22718*
Лімфоцити крові | 24522 | 26031 | 23220 | 18417
Включення 14С-амінокислот (кількість розпадів за хвилину на 108 клітин)
Мієлоїдні клітини | 3860340 | 3925603 | 6531518 | 4556453
Клітини тимусу | 4280250 | 5497404* | 4161421 | 4042300
Лімфоцити крові | 1338109 | 140080 | 1450160 | 1607205
Примітка:* - вірогідність відмінностей у значеннях показників між контрольною і дослідною групами тварин (р<0,05).
Подібний ефект виявлено за присут-ності тироксину в середовищі інкубації мієлоїдних клітин (1х10-8 М) (табл.2).
Таблиця 2.
Вплив тироксину на інтенсивність включення мічених попередників у молекули білків і ДНК у клітинах поросят 10-добового віку (кількість розпадів за хвилину на 108клітин , Mm, n=5)
Умови досліджень,
показник
Клітини | Включення 14С-амінокислот | Включення 3Н-тимідину
Контроль | Тироксин | Котроль | Тироксин
Мієлоїдні клітини кісткового мозку | 6531518 | 6430400 | 47154 | 28437*
Клітини
ти-мусу | 5161340 | 6553415* | 46050 | 49520
Лімфоцити
крові | 1450160 | 1448205 | 23220 | 21728
Активовані лімфо-цити (ФГА, 5 мкг/мл) | 5890601 | 9200974* | 722100 | 1040145
Примітка: * - вірогідність відмінностей у значеннях показників між контрольною і дослідною групами тварин ( р<0,05)
Водно-час, у клітинах тимусу тварин, яким вводили тироксин до 10-денного віку, ін-тенсивність включення 3Н-тимідину в молекули ДНК зменшується (р<0,05), а після інкубації клітин за присутності гормону – вірогідно не змінюється. Рівень використання позначених радіоактивною міткою амінокислот при синтезі білків тимоцитів вірогідно збільшується як у клітинах, отриманих від 3-денних тварин, яким вводили тироксин, так і за присутності тироксину в середовищі інкубації клітин 10-денних поросят (р<0,05) (табл.2,3). На відміну від клітин лімфоїдного органу, інтенсивність інкорпорації мі-чених попередників у молекули білків і ДНК лімфоцитів крові під впливом тироксину вірогідно не змінюється, що свідчить про їх низьку чутливість до дії гормону. Однак інтенсивність інкорпорації радіоактивних попередників у молекули білків збільшується у клітинах, активованих під впливом фітогемаглютиніну (5 мкг/мл) (р<0,05) (табл.2,3).
Аналізуючи отримані результати, необхідно відмітити, що напрямок змін інтенсивності біосинтетичних процесів у досліджуваних клітинах поро-сят після ін’єкцій тироксину в певній мірі залежить від дози введеного гор-мону. Адже відомо, що тиреоїдні гормони можуть зумовлювати як катаболі-чні, так і анаболічні ефекти [Greer 1990; Utiger 1995]. Крім того, певну роль в метаболічних ефектах тироксину можуть відігравати зміни у гормональному статусі тварин, зокрема, підвищення в їх крові концентра-цій глюкокортикоїдів та інсуліну – регуляторів процесів синтезу білків і нук-леїнових кислот [Girard, Ferre 1982].
Вплив тироксину на окремі ланки енергетичного метаболізму в мієлоїдних клітинах кісткового мозку, клітинах тимусу і лейкоцитах поросят. Результати досліджень каталітичної активності регуля-торних ферментів гліколізу, клітинних де-гідрогеназ і цитохром с-оксидази в мієлоїдних клітинах кісткового мозку, клітинах тимусу і лейкоцитах поросят 3-10-денного віку свідчать про те, що під впли-вом тиро-ксину відбуваються зміни у співвідношеннях між інтенсивністю протікання окремих стадій енергетичного метаболізму (табл.3).
Таблиця 3.
Вплив тироксину на активність ферментів у мієлоїдних клітинах кісткового мозку і нейтрофільних гранулоцитах поросят 3-10-денного віку (M m, n=5)
Ферменти | 3 дні | 10 днів
Контроль | Введення
ти-роксину | Контроль | Введення
ти-роксину
Мієлоїдні клітини кісткового мозку
Гексокіназа | 20,50 1,16 | 23,44 1,48 | 16,50 1,20 | 11,39 0,42
6-Фосфофрукто-кі-наза | 93,2 12,3 | 376,2 22,3*** | 154,4 21,7 | 180,8 14,7
Лактатдегідро-ге-наза | 157,0 8,0 | 195,7 8,3* | 78,5 6,8 | 76,3 7,1
Цитохром с-ок-сидаза | 2,94 0,15 | 12,56 0,75*** | 3,58 0,32 | 8,03 0,79***
Нейтрофільні гранулоцити
Гексокіназа | 3,53 0,41 | 7,15 0,59** | 7,74 0,41 | 7,98 0,53
6-Фосфофрукто-кі-наза | 89,9 4,5 | 117,4 7,9* | 133,2 5,2 | 154,0 12,8
Лактатдегідро-ге-наза | 37,6 2,1 | 75,3 7,9** | 166,5 9,9 | 135,2 9,2
Цитохром с-ок-сидаза | 3,28 0,14 | 3,76 0,40 | 4,35 0,51 | 5,83 0,27*
Примітки: 1) активність гексокінази ви-ражали в нмоль NADP/хв на 1 мг бі-лка; 6-фосфофруктокінази, лактатдегідроге-нази - в нмоль NADH/хв на 1 мг бі-лка; цитохром с-оксидази – в умовних оди-ницях на 1 мг білка; 2) у цій і наступній таблицях *,**,*** - вірогідність відмінностей у значеннях показників між контрольною і дослідною групами тварин: * - р<0,05; ** - р<0,01; *** - р<0,001.
Так, на початкових стадіях досліджень спостерігається підвищення ак-тивності гліколітичних ферментів: 6-фосфофруктокінази і лактатдегідрогенази у мієлоїдних клітинах, а в нейтрофільних гранулоцитах – гексокінази, 6-фос-фофруктокінази і лактатдегідрогенази (р<0,05-0,001).
На кінцевій стадії експерименту – в клітинах 10-денних тварин функці-ональна активність ферментів гліколізу знижується до контрольних значень, що, очевидно, зумовлюється більш виразною активацією процесів окислюва-льного катаболізму субстратів. На збільшення активності окисних процесів вказують дані щодо активації цитохром с-оксидази в мієлоїдних клітинах по-росят протягом всього періоду досліджень, а в нейтрофільних гранулоцитах – у 5- і 10-денних тварин. Такий ефект, очевидно, свідчить про стимулюючий вплив тироксину на синтез молекул цитохром с-оксидази в мієлокаріоцитах, подібно до інших клітин організму, в яких гормон є позитивним регулятором експресії гена ферменту [Wiesner et al. 1992].
Встановлено, що тироксин впливає на активність енер-гетичних процесів і в лімфоїдних клітинах, на що вказує вірогідне підвищення активності піру-ваткінази та ізоцитратдегідрогенази в тимоцитах 10-денних поросят, яким вводили гормон (р<0,05).
Відомо, що інтенсифікація під впливом тироксину окисних процесів веде до підвищення кон-цен-трацій реакційноз-датних продуктів неповного від-новлення кисневих мо-лекул у клітинах [Storz et al. 1990; Зенков, Меньщикова, 1993; Rosen et al. 1995; Тимочко та ін. 1998]. В зв’язку з цим важлива роль у захисті від окислення білкових компонентів внутрішньоклітинних плазма-тичних мембран та інших клітинних структур на-лежить системі антиокси-дантного захисту клітин. Згідно до результатів дослі-джень, після ін’єкцій ти-роксину активність одного з основних фер-ментів-анти-оксидантів - суперок-сиддисмутази - на окремих стадіях експерименту збільшується в мієлоїдних клітинах кісткового мозку, клітинах тимусу і в нейтрофільних гранулоцитах тварин дослідних груп (табл.2). Активація цього фер-менту уз-годжується з даними інших дослідників, згі-дно з якими підвищення вмісту активних форм кисню в клітині супроводжу-ється адаптаційним синте-зом ферментів-антиоксидантів [Storz et al. 1990; Pahl, Baeuerie 1994; Sen, Packer 1996]. Водночас, в активності ферментів глутатіонової системи клітин тварин, яким вводили тироксин, спостерігаються протилежні зміни. Так, активність глутатіонпероксидази знижується в мієлокаріоцитах кісткового мозку, тимоцитах і нейтрофілах крові 10-денних поросят дослідної групи (р<0,05), глутатіонредуктази – в мієлоїдних клітинах кісткового мозку і нейтрофілах тварин (р<0,05).
Що стосується процесів ПОЛ, то на початкових стадіях вміст малонового діальдегіду і гідроперекисів ліпідів зменшується в мієлоїдних клітинах і нейтрофільних грануло-цитах 3-денних поросят (р<0,05-0,01). При розвитку гіпертиреоїдного стану (у 10-денних тварин) активність ПОЛ є стабільною в усіх досліджу-ваних клітинах, за винятком нейтрофілів, де кон-центрації малонового діальдегіду і гідроперекисів ліпідів збільшуються під впливом гормону (р<0,05-0,01) (табл.4).
Таблиця 4.
Вплив тироксину на активність антиоксидантних ферментів і вміст продуктів ПОЛ в клітинах систем мієлопоезу і лімфопоезу
10-денних тварин (M±m; n=5)
Умови до-сліджень | Супероксид-дисму-таза | Глутатіон-пероксидаза | Глутатіон-редуктаза | Малоновий діальдегід | Гідропере-киси ліпідів
Мієлоїдні клітини кісткового мозку
Контроль | 18,25±1,38 | 40,34±1,76 | 32,70±1,56 | 12,28±0,67 | 0,105±0,01
Тироксин | 26,27±2,10* | 32,2±1,5* | 22,5±1,5* | 15,93±1,85 | 0,126±0,01
Нейтрофільні гранулоцити
Контроль | 20,68 1,50 | 21,4 1,1 | 29,2 1,8 | 11,37±0,75 | 0,112±0,01
Тироксин | 28,5 1,7* | 16,7 1,0* | 20,5 1,0* | 17,1±0,7** | 0,17±0,02*
Клітини тимусу
Контроль | 7,70 0,40 | 44,803,15 | 18,55 1,30 | 7,54 0,48 | 0,1800,01
Тироксин | 20,3 2,7* | 27,6 2,9* | 24,9 3,5* | 12,652,61 | 0,1750,02
Лімфоцити
Контроль | 16,28 0,93 | 24,021,67 | 25,700,85 | 7,40 0,55 | 0,1040,01
Тироксин | 15,30 1,62 | 25,31 2,45 | 20,441,64 | 10,581,38 | 0,0830,01
Примітка: активність супероксиддисмутази виражали в умовних оди-ницях в перерахунку на 1 мг білкa; глутатіонпероксидази - в нмоль глутатіону / хв на 1мг білка; глутатіонредуктази - в нмоль NАDН / хв на 1 мг білка, вміст малоно-вого діальдегіду виражали в нмоль/108 клітин, вміст гідроперекисів ліпідів - в од.Е480/5.108 клітин.
Очевидно, в умовах зниження актив-ності глутатіонзалежних ферментів активація супе-роксиддисмутази в кліти-нах відіграє компенсаторну роль у деток-сикації кисневих радикалів, які є іні-ціаторами процесів перокси-дації ліпідних молекул. Це сприяє підтриманню інтенсивності ПОЛ на стабіль-ному рівні. Разом з тим, у нейтрофільних гранулоцитах низька активність глутатіонпероксидази на тлі активації окисних процесів може зумовлювати виникнення дисбалансу між рівнем утворення кисневих ради-калів і активністю захисних механізмів, що веде до нагромадження в цих клітинах продуктів пе-рокси-дації ліпідних сполук.
Характеристика процесу дейодування йодотиронінів у мієлоїдних клітинах і лейкоцитах поросят. При дослідженні процесу 5’-дейодування йодотиронінів у мієлокаріоцитах кісткового мозку і лейкоцитах поросят 10-денного віку встановлено домінування у вка-заних клітинах йодотиронін-5'-дейодинази ІІ типу (Д2). Встановлено, що інтенсивність дейодування йодоти-ронінів у клітинних гомоге-натах є залежною від часу ін-кубації зразків, кон-центрацій білка в гомогенаті, субстрату реакції 125І-рТ3 та донаторів сульф-гідрильних груп.
При концентраціях білка 5-20 мкг/мл залежність є лінійною і виража-ється формулами y=0,042x та y=0,036x для мієлоїдних клі-тин і нейтрофільних гранулоцитів,відповідно(рис.1).
Рис.1. Залежність інтенсивності процесу йодотиронін-5’-дейодування від концентрації білка в пробах мієлоїдних клітин кісткового мозку і нейтрофіль-них гранулоцитів поросят.
Залежність інтенсивності йодотиронін-5’-дейоду-вання від часу інкубації є лінійною в досліджуваних клітинах в ін-тервалі 0-60 хви-лин і виражається формулами y=1,7x (для мієлоїдних клітин) (рис.2а) та y=1,53x (для нейт-рофільних гранулоцитів) (рис.2б).
Рис. 2. Залежність процесу 5'-дейодування 125І-субстрату від часу ін-кубації:
А- в клітинах кісткового мозку поросят; Б- в лейкоцитах крові.
Залежність активності йодотиронін-5’-дейодинази мієлоїдних клітин і нейт-рофільних гранулоцитів від концентрації рТ3 характеризу-ється гіпербо-лічною кривою (рис.3).
Рис.3. Інтенсивність йодотиронін- 5'-дейодування рТ3 в клітинах поро-сят в залежності від концентрації субстрату.
Водночас активність ферменту залежить від концен-трації донатора сульфгідрильних груп - дитіотреітолу або глутатіону (табл.5).
Таблиця 5.
Активність процесу йодотиронін-5’-дейодування в мієлоїдних клітинах
кіст-кового мозку і нейтрофільних гранулоцитах поросят
при застосуванні сульф-гідрильних реагентів (n=5)
Застосована сполука | Концентра-ція | Активність йодотиронін-5’-дейодинази (%)
Мієлоїдні клітини | Нейтрофільні грану-лоцити
Дитіотреітол | 10 мМ | 100 | 100
1 мМ | 58 | 57
0,1 мМ | 44 | 41
Відновлений глутатіон | 10 мМ | 42 | 20
5 мМ | 40 | 18
1 мМ | 35 | 10
Встановлено, що кінетичні характеристики йодо-ти-ронін-5’-дейодиназ у клітинах мієлоїдного ряду є близькими до таких, що виявлені у клітинах деяких тканин іншими авторами [Leonard 1990; Kцhrle 1994]. При цьому Vmax і Km становлять, відповідно, 6,71±0,50 пмоль рТ3/хв на 1 мг білка і 0,94±0,08 мкМ в мієлоїдних клі-тинах та 5,00±0,42 пмоль рТ3/хв на 1 мг білка і 0,78±0,12 мкМ в нейтрофільних гра-нулоцитах.
ОБГОВОРЕННЯ РЕЗУЛЬТАТІВ
Таким чином, результати досліджень вказують на те, що тироксин, який виявляє регуляторний вплив на багатьох рівнях метаболізму в організмі тварин і людини, відіграє важливу роль у регуляції обмінних процесів у клітинах систем мієлопоезу та лімфопоезу. В клітинах мієлоїдного ряду цей гормон активує процеси енергетичного метаболізму, проте знижує функціональну активність глутатіон-залежних ферментів-антиоксидантів. Така метаболічна ситуація в клітинах може виявлятися в дисбалансі між рівнем утворення кисневих радикалів та активністю захисних механізмів, зумовлюючи розвиток оксидаційного стресу [Кения и др.1993; Dice 1993; Тимочко та співавт. 1998; Sies 1997]. Так, тривале введення тироксину веде до нагромадження проміжних і кінцевих продуктів перекисного окислення ліпідів у ней-трофільних гранулоцитах, що, очевидно, знижує функціональну активність клітин.
Разом з тим, розвиток гіпертиреоїдного стану в організмі тварин раннього віку супроводжується зниженням проліферативної активності мієлоїдних клітин та підвищенням інтенсивності їх дозрівання до функціонально активних клітин крові. Такий ефект, очевидно, в значній мірі зумовлюється інгібуючим впливом тироксину на процес синтезу молекул ДНК в мієлокаріоцитах. Проте, при аналізі молекулярних механізмів впливу тироксину на мієлопоез необхідно приймати до уваги низку ефектів, які мають місце при навантаженні організму тварин раннього віку екзогенним гормоном, зокрема: зміни в гормональному статусі тварин, динаміку рецепції мієлоїдними клітинами інших регуляторів і, відповідно – перебудову численних ланок у механізмах регуляції метаболічних процесів в мієлокаріоцитах [Goetzl, Sreedharan 1992; Акмаев 1997; Mandrup-Poulsen et al 1997]. Разом з тим, безпосередні і опосередковані ефекти тироксину в клітинах мієлоїдного ряду дають підставу стверджувати про участь тиреоїдних гормонів у регуляції процесів кровотворення у тварин в ранньому постнатальному періоді онтогенезу. Важливу роль у механізмах регуляторного впливу тироксину на метаболізм мієлоїдних клітин відіграє система конверсії гормону до трийодтироніну, основним компонентом якої є фермент йодотиронін-5’-дейодиназа [Babych et al 1999].
Що стосується системи лімфопоезу, то функціональна активність лімфоїдних клітин залежить від поєднаного впливу багатьох чинників, що зумовлюється наявністю в них широкого спектру рецепторів гормонів, нейромедіаторів і цитокінів [Coffey, Hadden 1985; Корнева, Шхинек 1988; Духанин 1990]. Згідно до даних літератури, гормони щитоподібної залози належать до регуляторів метаболізму в імуноцитах, проте результати окремих експериментальних робіт є суперечливими. Так, в ряді досліджень встановлено, що видалення щитоподібної залози веде до лімфопенії та зниження активності гуморальних імунних реакцій [Fabris 1973; Hsu et al 1976; Erf 1993], а самі тиреоїдні гормони виявляють стимулюючий вплив на процеси В-лімфопоезу [Balazs et al 1980, Keast et al 1980, Montecino-Rodriguez et al 1996]. В інших роботах показано, що введення тваринам тироксину зумовлює зниження інтенсивності синтезу антитіл та пригнічення проліферативної відповіді лімфоїдних клітин на дію мітогенів [Wall et al 1981; Gupta et al 1983; Ong et al 1986]. Таким чином, на даний час нема одностайної думки відносно впливу гормонів щитоподібної залози на імунну систему.
В наших дослідженнях встановлено, що під час неонатального періоду розвитку тироксин стимулює процеси енергетичного обміну як у клітинах тимусу, так і в мієлоїдних клітинах поросят. Однак, в зв'язку з активуючим впливом тироксину на активність антиоксидантних ферментів супероксиддисмутази і глутатіонредуктази, антиоксидантний статус клітин лімфоїдного органу тварин, яким вводили гормон, є вищим, ніж у мієлокаріоцитах і нейтрофільних гранулоцитах. Очевидно, при високих концентраціях тиреоїдних гормонів у крові тварин під час неонатального періоду цей ефект сприяє підтриманню функціональної активності клітин імунної системи на відповідному рівні. Водночас регуляторні ефекти тироксину щодо енергетичного обміну та антиоксидантної системи разом зі стимулюючим впливом на синтез білків в імуноцитах можуть частково пояснювати роль стимулюючого впливу тиреоїдних гормонів на процеси лімфопоезу [Balazs et al 1980; Paavonen 1982; Gupta et al 1983; Bachman and Mashaly 1987; Montecino-Rodriguez 1997].
ВИСНОВКИ
Згідно з поставленими завданнями проведено дослідження впливу тирок-сину на процеси мієлопоезу та лімфопоезу в організмі поросят у ранньому постнатальному періоді. Встановлено, що тироксин бере участь у ре-гуляції про-цесів лейкоцитопоезу та метаболізму в клітинах системи гемолімфо-поезу.
1. Під впливом тироксину в кістковому мозку 5- і 10-денних поросят змен-шу-ється відносний вміст проліферуючих клітин (мієлобластів, промієлоцитів, мієлоцитів), паличкоядерних і сегменто-ядерних нейт-рофілів. Водночас вміст лімфоцитів в кістковому мозку 10-денних по-росят збільшується, порі-вняно з таким у тварин контрольної групи.
2. Під впливом тироксину збільшується інтенсивність синтезу білків у тимо-ци-тах і пригнічується інтенсивність вклю-чення 3Н-ти-мідину в молекули ДНК мієлоїдних клітин кістко-вого мо-зку поросят.
3. У мієлоїдних клітинах кісткового мозку, тимоцитах і нейтрофільних гранулоцитах тварин раннього віку тироксин стимулює процеси енергетичного обміну, зумовлюючи в мієлоїдних клітинах активацію 6-фосфофрукто-кінази і лактатдегідрогенази у 3- і 5-денних поросят, цитохром с-оксидази у 3-, 5-, 10-денних тварин; в нейтрофільних грану-лоцитах - актива-цію гексо-кінази, 6-фосфофруктокінази і лактатдегідроге-нази у 3- і 5-ден-них, а цитохром с-оксидази - у 5- і 10-денних тварин; в тимоцитах - активацію піруваткі-нази та ізоцитратдегідрогенази у 10-денних тварин.
4. Тироксин зменшує активність ПОЛ в мієлоїдних клітинах кісткового мозку і крові тварин 3-денного віку, збільшує інтенсивність цього процесу у нейтрофільних гра-нулоцитах 10-денних тварин і не впливає на інтенсивність ПОЛ в тимоцитах поросят раннього віку.
5. Тироксин зумовлює активацію супероксиддисмутази в мієлоїдних клітинах кісткового мозку і нейтрофільних гра-нулоцитах 5- і 10-денних поро-сят, в тимоцитах 10-денних тварин, проте пригнічує активність глутатіонзалежних ферментів у мієлоїдних клітинах і нейтрофільних гранулоцитах 5- і 10-денних поро-сят, глутатіонпероксидази - в тимоцитах 10-денних тварин.
6. Дія тироксину на функціональну активність лейкоцитів і кровотворних клі-тин опосередковується функціонуванням системи конверсії тирок-син трийодтиронін та активністю йодотиронін-5'-дейодинази. В міє-лоїд-них клітинах кісткового мозку і лейкоцитах крові активність йодо-тиронін-5’-дейодинази представлена го-ловним чином фермен-том ІІ типу. Актив-ність йодотиронін-5’-дейодиназної реакції в клі-тинах знач-ною мірою зале-жить від концентрації субстрату і дона-торів сульфгід-рильних груп – ди-тіо-треітолу або відновленого глутатіону.
7. Кінетичні характеристики (Vmax і Km) йодотиронін-5’-дейодинази в клітинах мієлоїдного ряду поросят становлять, відповідно, 6,71±0,50 пмоль рТ3/хв на 1мг білка і 0,94±0,08 мкМ в мієлоїдних клі-тинах кісткового мозку та 5,00±0,42 пмоль рТ3/хв на 1 мг білка і 0,78±0,12 мкМ в нейтрофільних гра-нулоцитах.
ПРАКТИЧНІ РЕКОМЕНДАЦІЇ
1.Результати досліджень можуть бути використані при розробці тиреотропних препаратів, адаптогенів, гемо- та імуномодуляторів, можуть бути застосовані в клінічній практиці для прогнозування можливих наслідків порушень функціональної активності щитоподібної залози.
2. Отримані результати можуть бути використані у вищих навчальних закладах в курсах лекцій з ци-тології, гематології, молекулярної біології, біохімії гормонів.
Список опублікованих праць за темою дисертації
1. Бабич Н.О., Антоняк Г.Л., Тимочко М.Ф., Снітинський В.В. Вплив тироксину на енергетичний метаболізм в мієлоїдних клітинах кісткового мозку та лейкоцитах крові поросят //Вісник проблем біології і медицини. – 1998. – 22. – С.33-37.
2. Антоняк Г.Л. Снітинський В.В., Бабич Н.О. та ін. Характеристика окремих ланок енергетичного метаболізму та антиоксидантної системи в мієлоїдних клітинах кісткового мозку і лейкоцитах поросят //Укр. біохім. журн. – 1999. – 71, №3. – С.44-50.
3. Бабич Н.О., Антоняк Г.Л., Тимочко М.Ф., Снітинський В.В. Вплив тирок-сину на активність ферментів енергетичного обміну та антиоксидантної си-стеми в нейтрофільних гранулоцитах поросят //Фізіол. журн. – 2000. – 46, № 3. – С.84-91.
4. Бабич Н.О., Антоняк Г.Л., Тымочко М.Ф. Влияние тироксина на актив-ность некоторых ферментов энергетического обмена в миелоидных клетках костного мозга и нейтрофилах крови поросят // Вопросы медицинской хи-мии. – 2000. – 46, Вып.2. – С.162-168.
5. Babych N., Antonyak Y., Sklyarov A.Ya. The influence of thyroxine on inten-sity of energy metabolism in bone marrow myeloid cells and neutrophilic polymorphonuclear leukocytes of neonatal pig //Endocrine regulations. – 2000. – 34. – P.73-81.
6. Бабич Н.О., Скляров О.Я., Антоняк Г.Л. Вплив тироксину на вміст клітин-них популяцій у кістковому мозку і крові поросят у неонатальному віці // Експериментальна та клінічна фізіологія і біохімія. – 2000. – 2, №10. – С.28-32.
7. Антоняк Г.Л., Игнатенко Ю.В., Бабич Н.О., Снитинский В.В. Структура и функции рецепторов тиреоидных гормонов //Цитология и генетика. – 2000. – 34, №5. – С.68-80.
8. Антоняк Г.Л., Бабич Н.О., Сологуб Л.І., Снітинський В.В. Утворення активних форм кисню та система антиоксидантного захисту в організмі тварин //Біологія тварин. – 2000. – 2, № 2. – С.34-43.
9. Антоняк Г.Л., Бабич Н.О., Сологуб Л.І., Снітинський В.В. Структура і функ-ції високомолекулярних протеїназ в клітинах тварин і людини //Укр. біохім. журн. – 2001. – 73, № 1. – С.5-16.
10. Babych N., Antonyak H., Tymochko M., Slebodzinski A.B. The developmental changes in thyroxine deiodinating system in animal myeloid cells and leuko-cytes /Abstrасt. The 2nd Parnas Conference. Gdansk, Poland. Sept.11-13, 1998.– P. 33.
11. Babych N. The participation of thyroxine 5’-deiodinating system in the regulatory mechanisms of haemopoiesis /Congress book of 4th International Medical Students Congress (Nov. 5-8, 1998. Katowice, Poland).
12. Babych N., Antonyak H., Snitynsky V., Tymochko M., Solohub L., SlebodzinA.B. The participation of iodothyronine-5'-deiodinase in the regulatory mechanisms of myelopoiesis and immunogenesis / Abstracts of the 3rd Interna-tional Conference on Farm Animal Endocrinology (Dec. 7-10, 1998. Brussels, Belgium).
13. Babych N., Antonyak H, Tymochko M., Snitynski V. The participation of thyhormone in regulation of myeloid and lymphoid cell metabolism / Abof the 3rd International Conference on Farm Animal Endocrinology (Dec. 7-10, 1998. Brussels, Belgium).
14. Babych N., Antonyak H., Sklyarov A. Ya. Developmental switches in the functioning of iodothyronine-5’-deiodinase in haemopoietic tissue /Abstracts of Experimental Biology Meeting ’99. (April 17-21, 1999. Washington, USA). //FASEB J. – 1999. – 13, N 5. – A1039.
15. Babych N., Antonyak H., Lacka K., Sklyarov A. Ya., Trzeciak W.H. Type 2 iodeiodinase mRNA levels in human peripheral blood lymphocytes of hypo- and hyperthyroid patients /Abstract. The 3rd Parnas Conference "Mechanisms of Cellular Signal Transduction and Communication". – Lviv, Ukraine. Oct. 14-18, 2000. – P.64.
16. Babych N., Antonyak H., Lecybyl R., Lacka K, Sklyarov A. Ya., Trzeciak W.H. Thyroid hormone regulates type 2 iodothyronine deiodinase mRNA levin cultured human peripheral blood lymphocytes /Abstract. The 3rd Parnas Conference "Mechanisms of Cellular Signal Transduction and Communication". – Lviv, Ukraine. Oct.14-18, 2000. – P.65.
17. Антоняк Г.Л., Бабич Н.О., Сологуб Л.І., Снітинський В.В. Роль гормонів і цитокінів в адаптаційних змінах метаболізму в клітинах системи гемопо-езу у тварин в неонатальному періоді розвитку /Тези доповіді. Міжнарод-ний симпозіум “Біологічні механізми старіння”. Харків, 2000. – С.102.
АНОТАЦІЇ
БАБИЧ Н.О. Регуляція тироксином мієлопоезу та лімфопоезу у ранньому постнатальному періоді. - Рукопис.
Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.13. - фізіологія людини і тварин. - Львівський націона-льний університет імені Івана Франка, Львів, 2001.
Проводились дослідження механізмів участі тироксину в регуляції проце-сів мієлопоезу і лімфопоезу в організмі поросят протягом 10-ден-ного періоду після народження. Встановлено, що при розвитку гіперти-реоїдного стану в кістковому мозку тварин змен-шується відносний вміст проліферуючих і дозріваючих клітин мієлоїдного ряду водночас з пригнічен-ням інтенсивності інкорпорації 3Н-тимідину в молекули ДНК мієлоїдних клі-тин. Під впливом гормону в мієлоїдних клітинах кісткового мозку, клітинах тимусу і нейтрофільних гранулоцитах активуються енерге-тичні процеси, відбуваються зміни в інтенсивності ПОЛ та у функціональ-ному стані системи антиоксидантного захисту. Дія тирок-сину на функціональну активність лейкоцитів і кровотворних клітин опосере-дковується функціонуванням системи конверсії тирок-син трийодтиронін та активністю йодотиронін-5'-дейодинази, яка в міє-лоїдних клітинах і лейкоци-тах представлена, го-ловним чином, фермен-том ІІ типу. Встановлено кіне-тичні характеристики йодотиронін-5’-дейодиназної реакції в клі-тинах мієлої-дного ряду кісткового мозку і крові, залежність активності ферменту від дона-торів сульфгід-рильних груп – ди-тіотреітолу або відновленого глутатіону.
Ключові слова: лейкоцитопоез, мієлопоез, лімфопоез, імунна система, тироксин, тиреоїдні гормони, йодотиронін-5'-дейодиназа.
БАБИЧ Н.О. Регуляция тироксином миелопоэза и лимфопоэза в раннем постнатальном периоде. - Рукопись.
Диссертация на соискание научной степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.13. - физиология человека и животных. - Львовский национа-льный университет имени Ивана Франко, Львов, 2001.
Проводились исследования механизмов участия тироксина в регуляции процессов миелопоэза и лимфопоэза в организме поросят на протяжении 10-дневного периода после рождения. Показано, что при развитии гипертиреоидного состояния в костном мозгу животных уменьшается относительное содержание пролиферирующих и созревающих клеток миелоидного ряда одновременно со снижением интенсивности включения 3Н-тимидина в молекулы ДНК миелоидных клеток. Под влиянием гормона в миелоидных клетках костного мозга, клетках тимуса и нейтрофильных гранулоцитах активируются энергетические процессы, происходят изменения в интенсивности ПОЛ и в функциональном состоянии системы антиоксидантной защиты. Влияние тироксина на функциональную активность лейкоцитов и кроветворных клеток опосредствуется функционированием системы конверсии тирок-син трийодтиронин и активностью йодотиронин-5'-дейодиназы, которая в миелоидных клетках и лейкоцитах представлена, главным образом, ферментом ІІ типа. Установлены кинетические характеристики йодотиронин-5’-дейодиназной реакции в кле-тках миелои-дного ряда костного мозга и крови, зависимость активности фермента от дона-торов сульфгид-рильных групп – ди-тиотреитола или восстановленного глутатиона.
Ключевые слова: лейкоцитопоэз, миелопоэз, лимфопоэз, иммунная система, тироксин, тиреоидные гормоны, йодотиронин-5'-дейодиназа.
BABYCH N.O. Regulation of myelopoiesis and lymphopoiesis in the early postnatal period by thyroxine. - Manuscript.
The thesis is subjected for the granting of a degree for a candidate оf biological sciences with speciality 03.00.13 - human and animal physiology. - The Lviv National University, Lviv 2001.
The mechanisms of thyroxine participation in regulation of myelopoiesis and lympohopoiesis in the pig during 10-day period after birth were investigated. It was established, that during development of hyperthyreoid state the percentages of
