НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ ФІЗІОЛОГІЇ РОСЛИН І ГЕНЕТИКИ

Дзюба Оксана Іванівна

УДК 581.524.1

ФІЗІОЛОГІЧНІ ТА БІОХІМІЧНІ ОСОБЛИВОСТІ РОДОДЕНДРОНА ЖОВТОГО

( Rhododendron luteum Sweet ) : АЛЕЛОПАТИЧНИЙ АНАЛІЗ

03.00.12.-фізіологія рослин

А В Т О Р Е Ф Е Р А Т

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Київ – 2001

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана у відділі алелопатії Національного ботанічного саду ім. М. М. Гришка НАН України

Науковий керівник доктор біологічних наук, професор

Головко Ераст Анатолійович

Національний ботанічний сад

ім. М. М. Гришка НАН України

завідувач відділу

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, старший науковий

співробітник

Косаківська Ірина Василівна

Інститут ботаніки ім. М.Г. Холодного НАН України

старший науковий співробітник

кандидат біологічних наук, професор

Брайон Олександр Володимирович

Київський національний університет ім. Тараса Шевченка

професор

Провідна установа: Львівський національний університет

ім. Івана Франка

Захист відбудеться 19.04.2001 р. о 10.00 годині на засіданні спеціалізованої ради Д. 26.212.01. при Інституті фізіології рослин і генетики НАН України за адресою: 03022, Київ, вул. Васильківська, 31/17, тел. 263-51-50.

З дисертацією можна ознайомитись в бібліотеці Інституту фізіології рослин і генетики НАН України за адресою: 03022, Київ, вул. Васильківська, 31/17.

Автореферат розісланий 16.03. 2001 р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради

кандидат біологічних наук  Мордерер Є. Ю.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Збагачення асортименту декоративних рослин новими стійкими видами і формами є необхідною умовою створення культурних фітоценозів. Значне погіршення екологічного стану внаслідок техногенного забруднення середовища зумовлюють пошук та мобілізацію рослин з підвищеною стійкістю та життєздатністю. Отже, першочергова увага приділяється рідкісним та малопоширеним видам рослин, що мають високий біологічний потенціал. Серед декоративних деревних рослин особливо цінними є представники роду Rhododendron L., що включає більш ніж 1200 видів і близько 10000 сортів і використовуються в основному як декоративні рослини відкритого і закритого грунту (Кондратович, 1981; Александрова, 1989).

Рододендрон жовтий (Rhododendron luteum Sweet (рід Rhododendron L., родина Ericaceae))- третинний релікт флори України, вже давно привертає увагу вчених. З часу його першої знахiдки Мiклером в 1795 р. в Українi висувались рiзнi гiпотези щодо походження R. luteum Sweet на Полiссi (Барбарич, 1962), уточнювався його ареал (Полянська, 1929, Кондратюк, 1950, Смик, 1973), а також виявлялись можливостi практичного використання цiєї рослини (Российский, 1954; Овчинников, Знаменская, 1961). Паралельно велись дослiдження по вивченню фармакологiчної цiнностi R. luteum Sweet. Було встановлено, що вiн багатий на флавоноїди, ефiрнi масла, дубильнi речовини, вiтамiн С (Белова, 1968, Бандюкова, Оганесян, 1973, Кереселидзе, 1976, Алания, 1979; Коммисаренко, 1980). Вище зазначений хiмiчний склад дає теоретичну основу про наявнiсть у R. luteum Sweet високої алелопатичної активностi, яка зовсiм не вивчалась. Беручи до уваги той факт, що в світі активно ведеться пошук фіторегуляторів природного походження, вивчення фізіолого - біохімічних властивостей рододендрона жовтого та встановлення хімічної природи алелопатично активних сполук цієї рослини є актуальним завданням, вирішення якого на сучасному етапі може дати цінну інформацію щодо ролі вторинних метаболітів R. luteum Sweet в процесах регуляції росту і розвитку рослин та більш повно розкрити біохімічний потенціал даного виду.

Зв'язок роботи з науковими програмами. Робота виконувалась у відповідності до плану науково-дослідних робіт відділу алелопатії Національного ботанічного саду ім. М.М.Гришка НАН України за темою “ Алелопатично активні сполуки вищих рослин та мікроорганізмів: скринінг, ідентифікація та створення на їх основі природних фіторегуляторів”, номер державної реєстрації 0198U000781.

Мета та завдання досліджень. Основна мета роботи – дослідити фізіолого-біохімічні особливості рододендрона жовтого, дати його алелопатичну характеристику при інтродукції.

Для досягнення поставленої мети необхідно було вирішити такі завдання:

-визначити алелопатичну активність прижиттєвих виділень різних органів, опаду та ризосферного грунту рододендрона жовтого в динаміці;

-вивчити алелопатичні особливості насіння різних видів роду Rhododendron L.

-дати характеристику хімічної природи алелопатично активних речовин рододендрона жовтого;

-вивчити механізм адаптації рододендрона жовтого при дії стресових факторів;

-змоделювати процеси комбінованої дії фізіологічно активних речовин;

-дослідити біологічну активність виділених речовин;

-визначити перспективи використання біологічно активних речовин рододендрона жовтого.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше дана алелопатична характеристика рододендрона жовтого (R.luteum Sweet ), вивчені його фізіолого-біохімічні особливості та адаптаційні процеси при інтродукції. Встановлено, що алелопатична активність рододендрона жовтого обумовлена наявністю сполук фенольної природи, амінокислот, лектинів і сапонінів. Вивчена сезонна динаміка накопичення алелопатично активних сполук в рослині та ризосферному грунті.

Вперше виділена сума сапонінів рододендрона жовтого і досліджена їх біологічна активність та показано, що рододендрон жовтий є лектиномісткою рослиною. Досліджена динаміка активності лектинів з різних органів рослини.

Практичне значення одержаних результатів. Отримані результати розширюють існуючі погляди відносно збереження R.luteum Sweet в природних фітоценозах, як реліктового виду флори України, а також дозволяють рекомендувати рододендрон жовтий для інтродукції в ботанічні сади, дендропарки та використання в ландшафтній архітектурі. Враховуючи накопичення в надземних органах R.luteum Sweet біологічно активних сполук очевидним є перспективність їх використання в фармакологічній промисловості.

Особистий внесок дисертанта. Дисертантом особисто проаналізовано наукову літературу по темі дисертації, розроблено програму досліджень, проведені лабораторні досліди, здійснена статистична обробка та узагальнення одержаних результатів. Експерементальні дані, висновки та рекомендації отримані дисертантом самостійно.

Апробація роботи. Отримані автором матеріали доповідались та обговорювались на конференціях: “Екологія. Людина. Суспільство”(Київ,1999), “Saponins in Food Feedstuffs and Medicinal Plants” (Pulawy, Poland,1999),”VII молодежная конференция ботаников”(Санкт-Петербург,2000),”Актуальні проблеми ботаніки та екології” (Чернігів, 2000 ), VII Конференція молодих вчених “Проблеми фізіологіі рослин та генетики на рубежі третього тисячоліття”(Київ,2000), Четвертий міжнародний науковий конгрес ”Олімпійський спорт і спорт для всіх. Проблеми здоров'я, рекреації, спортивної медицини та реабілітації” (Київ,2000).

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 12 робіт, з них 4 статті у провідних фахових виданнях..

Структура та обсяг дисертації. Дисертація складається з вступу, 5 розділів, висновків, списку використаних літературних джерел (158 публікацій, у тому числі 44 іноземні). Дисертація містить 130 сторінок друкованого тексту. Робота ілюстрована 38 рисунками, 16 таблицями.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

АНАЛІТИЧНИЙ ОГЛЯД ЛІТЕРАТУРИ

Цей розділ складається з 4 підрозділів, в яких викладено огляд відомостей про морфологію, систематику, поширення та біологічні особливості рододендрона жовтого. Наведено дані досліджень останніх років у галузі вивчення будови та біологічної активності фенольних сполук, сапонінів і лектинів. На підставі аналізу літературних даних про основні напрямки в вивченні алелопатично активних сполук обгрунтовується необхідність вивчення питання про роль окремих біологічно активних речовин і їх сумішей в “алелопатичному ефекті”, намічаються напрямки та завдання досліджень.

ОБ`ЄКТИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ

Дослідження фізіолого-біохімічних особливостей R. luteum Sweet та його алелопатичний аналіз здійснювався за схемою (рис.1).

Об'єктами досліджень були рослини Rhododendron luteum Sweet, що зростають в природному ареалі на Словечансько-Овруцькому кряжі, та рослини, які були інтродуковані в НБС ім.М.М.Гришка в різний час. Матеріал досліджень - ризосферний грунт, листовий опад, корені, квітки, листки, пагони, насіння, коробочки R. luteum Sweet, які використовувались для біологічних та хімічних аналізів. Зразки рослинного матеріалу відбирали одновікові відповідно до ярусності, з урахуванням специфіки культури (Кондратович, 1981; Александрова, 1989).

Для визначення алелопатичної активності грунту, рослинного матеріалу, екстрактів та індивідуальних сполук користувалися методом біотестування (Гроздинський, 1973). Як тест-об'єкти використовували одноденні проростки крес-салату (Lepidium sativum L.), пшениці (Triticum vulgare L.) сорту "Миронівська-31", редису ( Raphanus sativus L.) сорт "Червона з білим кінчиком" (Гродзинський, 1991), амаранту (Amaranthus paniculatus L.) (Власов та ін., 1979), помідору (Lycopersicon esculetum Mill.), капусти (Brassica oleracea L. сорт "Білокачанна") (Кинтя, 1988). огірка (Cucumis sativus L.) сорту "Далекосхідний" (Иванов, 1986)

Рис.1. Загальна схема досліджень.

Дослідження токсичності грунту здійснювалось за Гродзинським (1973,1991). Первинний скринінг колінів здійснювався шляхом послідовної екстракції рослинного матеріалу розчинниками в залежності від їх полярності (Mazzuca et.al.,1996). Контроль активності кожного екстракту здійснювали за допомогою ТШХ та біотестуванням (Гродзинський А.М., Гродзинський Д.М., 1973, Блажей, Шутий, 1977). Визначення суми фенольних сполук (ФС) проводили з реактивом Фоліна-Чокальте, кількісний і якісний вміст амінокислот і фенолкарбонових кислот (ФКК) у грунті робили за оригінальним методом (Гродзинский, Горобец, Крупа, 1988). Вміст ФКК в рослині проводили за (Мийдла, Халдре, Сависаар, 1975). В дослідах суму сапонінів і рутин брали в концентраціях 0.1, 0.025, 0.0015 мг/л, ФС в концентрації 1x10-4 М (Мороз, 1990). Визначення цитостатичних властивостей проводили за методикою В.Б.Іванова (1986). Для ідентифікації речовин користувалися мітчиками фірми Sigma. Маштабування розділення на колонці проводили на основі даних ТШХ по методу Бідлінгмеєра (1990). Сапоніни осаджували з водної фази н-бутанолом за методикою Блажея (1977). Кількісний вміст сапонінів визначався за методикою розробленою Санкт-Петербургською державною хіміко-фармацевтичною академією (1998). Ідентифікацію рутину проводили УФ-спектрометрією за Mabry (1970). УФ-спектри були зняті на Becman DB-G спектрофотометрі з Sargent model SRL recorder.

Виділення лектинів проводили по методу М.Д. Луцика та Є.Н.Панасюк (1981). Фракціонування і діаліз проводили за Лазур'євським (1961). Лектини матриксу екстрагували 0,05Н НCl, лектини клітинної стінки- 0,05% розчином тритона Х-100 (Чулкова и др., 2000).

Вміст вільного проліну визначали в листках R. luteum Sweet за методикою Стаценко (1994). Вміст хлорофілу а, хлорофілу в і каротиноїдів визначали спектрофотометричним методом за Починком (1986).

Дослідження антибактеріальної активності проводилось методом паперових дисків (Lacaille-Dubois, 1999). Для визначення протипухлинної активності сапонінів використовували культуру клітин епідермоїдної карциноми ротової порожнини людини КВ.

Статистична обробка проводолась за допомогою програм Exel 7.0 i Statistica 5.0, статистичні помилки в дослідах коливались в межах 5%. Дисперсійний аналіз здійснено за Плохінським (1980).

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ

АЛЕЛОПАТИЧНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОДОДЕНДРОНА ЖОВТОГО

(R. luteum Sweet)

Дослідження алелопатичного потенціалу рододендрона жовтого показали, що рослина має досить високу алелопатичну активність. Досліди показали, що водні витяжки з різних органів рослини мають різний вміст водорозчинних алелопатично активних сполук. Як видно з рис.2 найбільшу алелопатичну активність серед вегетативних органів мали листки, а серед генеративних насіння та коробочки. Отримані результати узгоджуються з даними Гродзинського (1973), Юрчак (1971) про розподіл алелопатично активних речовин в рослинному організмі – в надземній частині вказаних речовин значно більше, ніж в коренях. Та найбільша активність була характерна для опаду, що можна пояснити накопиченням в процесі вегетації в листках та інших органах інгібіторів росту, які готують рослину до періоду спокою та токсичних продуктів життєдіяльності, від яких рослина звільняється при листопаді (Осипова, 1999). Дослідженнями встановлено, що протягом вегетаційного періоду активність алелопатично активних сполук змінювалась (рис.3.). Виявлено два піки алелопатичної активності рододендрона жовтого протягом вегетації. Перший пік активності спостерігається в червні в період найбільш інтенсивного росту рослини, коли всі метаболічні процеси проходять на високому рівні і в листках міститься максимальна кількість фізіологічно активних речовин.

Рис.2. Вплив водних витяжок з різних органів та опаду рододендрона жовтого (R. luteum Sweet) на приріст коренів амаранту.

Приріст коренів тест-об'єктів в червні коливався від 18% для крес-салату до 64% для амаранту. Після цього, протягом липня і серпня, активність витяжок зменшується і починає зростати восени по мірі затухання ростових процесів, старіння листків і пов'язаного з ним зниження оводненості тканин. На жовтень припадає другий пік активності, що пов'язано з тим, що стимулятори росту в кінці вегетації або зникають, або переходять в неактивну форму (Мороз, 1990).

Рис.3. Динаміка алелопатичної активності водних витяжок з листків R. luteum Sweet.

Така ж закономірність була виявлена і при аналізі летких виділень з надземної частини рододендрона жовтого. Велику цікавість викликали леткі виділення квіток, так як в них міститься значна кількість ефірної олії (Белова, 1968). А як відомо з літератури, ефірні олії та їх компоненти виявляють біологічну активність як алелохімікати (Юрчак, 1971). Найбільш активними виявились леткі виділення квіток, причому їх активність від початку до кінця цвітіння зростає. Це можна пояснити тим, що в квітах міститься більше летких речовин ніж в листках і тим, що ефірні олії та їх компоненти в вигляді парів більш токсичні, ніж їх водні розчини. Таким чином, можна зробити висновок, що в усіх органах рододендрона жовтого містяться алелопатично активні речовини, динаміка активності яких змінюється протягом вегетаційного періоду.

АЛЕЛОПАТИЧНА АКТИВНІСТЬ РИЗОСФЕРНОГО ГРУНТУ

R.luteum Sweet

Як відомо, грунт є одним з найважливіших учасників і посередників в алелопатії (Гродзинський, 1991). Дослідження алелопатичної активності водних витяжок розосферного грунту R.luteum Sweet показали, що загалом грунт менш активний самої рослини. Так як і для рослини характерні два піки активності протягом вегетації, але виражені вони не так сильно, хоча сама закономірність зберігається для всіх тест-об'єктів.

Результати дослідження токсичності грунту по методу Нейбауера- Шнейдера показують, що найменш токсичним грунт є навесні, а саме в травні, а найбільш активним в жовтні. Як видно з табл.1 загалом ризосферний грунт рододендрона жовтого токсичніший контрольного грунту. Найбільшу токсичність грунт виявляв восени, коли середня довжина надземної частини складала 12,3 см, а коренів- 10,2 см. Середня повітряно - суха маса надземної частини і коренів в тих же варіантах складає відповідно 0,06 і 0,07г. Отже, ризосферний грунт рододендрона жовтого акумулює в собі алелопатично активні речовини, що приводить до деякої його токсичності. Вміст колінів у грунті зазнає постійних змін. Протягом вегетації алелопатична активність грунту зростає і восени є максимальною, але коліни не накопичуються, а на нашу думку, протягом зими і ранньою весною частково вимиваються опадами з ризосферного шару грунту, частково розкладаються мікроорганізмами, частково зв'язуються з гумусовим комплексом, що і приводить до зниження токсичності грунту навесні. Це підтверджує думку багатьох вчених про здатність грунту не тільки до поглинання колінів, але й до детоксикації їх (Гродзинський, 1973, Мороз,1990).

Таблиця 1.

БІОЛОГІЧНА АКТИВНІСТЬ НАСІННЯ РІЗНИХ ВИДІВ РОДУ

Rhododendron L

З літератури відомо, що метаболіти насіння відіграють важливу ендогенну і екзогенну роль як в забезпеченні процесу проростання насіння, так і в рості, розвитку і продуктивності рослини (Наумов, Воронков,1983). Як вихідний матеріал використовували насіння 13 видів рододендронів різних років збору.

Дослідження показали, що активність насіння залежить як від його віку так і від видової приналежності. Найбільш чутливими до дії водорозчинних сполук виявились амарант і крес-салат, найбільш стійким огірок. Хімічний аналіз спиртових екстрактів показав, що всі екстракти містили оксибензойні, оксикоричні кислоти, флавоноїди. Помічено, що в насінні вічнозелених рододендронів вміст ФС нижчий ніж у листопадних видів, а найвищий їх вміст у видів, які можуть бути листопадними, напіввічнозеленими і вічнозеленими в залежності від умов вирощування, що є, очевидно, еволюційним пристосуванням.

Дослідження цитостатичних властивостей водних та спиртових витяжок з насіння показало, що спиртові екстракти більшою мірою ніж водні витяжки пригнічують проліферацію клітин. Насіння рододендрона жовтого, в порівнянні з іншими видами, містило значну кількість цитостатиків. Дослідження лектинів насіння різних видів рододендронів показали, що всі вони в різній мірі викликають аглютинацію еритроцитів. Була помічена видова специфічність лектинів до груп крові. Виявили, що з збільшенням концентрації лектинів їх гальмуюча дія на приріст коренів зростає, хоча загалом їх активність нижча активності водних і спиртових витяжок з насіння.

Таким чином, можна зробити висновок, що насіння представників різних видів роду Rhododendron L. характеризується досить високим алелопатичним потенціалом, обумовленим як якісним так і кількісним вмістом речовин фенольної природи і наявністю лектинів. Просліджується кореляція між вмістом ФС та алелопатичною активністю водних, спиртових витяжок та лектиномістких екстрактів з насіння і гемолітичною активністю лектинів. Показано, що з часом, в процесі зберігання вміст ФС в насінні підвищується; алелопатична активність водорозчинних сполук знижується, а спирторозчинних підвищується (з роками в насінні накопичуються інгібітори фенольної природи, що негативно відбивається на схожості насіння); цитостатична дія збільшується; гемолітична активність лектинів зменшується.

ХІМІЧНА ПРИРОДА АЛЕЛОПАТИЧНО АКТИВНИХ РЕЧОВИН R. luteum Sweet

Як вже було показано, рододендрон жовтий та його ризосферний грунт має досить високу алелопатичну активність водорозчинних та летких виділень, але така інформація не дає можливості судити про роль окремих груп колінів в фітотоксичному ефекті. Тому закономірно постає питання про хімічну природу алелопатично активних речовин рододендрона жовтого. Описаний в літературі хімічний склад рододендрона жовтого дає змогу припустити, що деякі з описаних раніше речовин можуть бути алелохімікатами і обумовлювати високий алелопатичний потенціал рослини. Алелопатично активні речовини розподілялись нами на фракції залежно від їх полярності (рис.4). Найбільшу активність мала сума сапонінів та ФС (етилацетатний екстракт).

Рис.4. Вплив різних екстрактів з листків R.luteum Sweet на приріст коренів крес-салату. 1—ефірний екстракт, 2—етилацетатний екстракт, 3 – метанольний екстракт, 4—неочищена сума сапонінів, 5—сума сапонінів, очищена на поліаміді, 6—надосадна рідина, після осадження сапонінів диетиловим ефіром.

Майже не спостерігалось зміни активності та маси суми сапонінів після вилучення з неї ФС шляхом адсорбції на поліаміді, що свідчить про те, що саме сапоніни зумовлюють активність цих фракцій. І крім того, що сапоніни були більш активними за ФС, їх маса теж була більшою. Отже, саме сапоніни та ФС обумовлюють алелопатичну активність рододендрона жовтого. Ще Е.Райс (1986) відмічав, що феноли є найбільш поширеними токсинами вищих рослин, які приймають участь в алелопатичній взаємодії. Кількісне визначення вмісту ФС показало (рис.5), що найбільше їх міститься в коробочках. Значну кількість ФС виявлено в листках, які є активно вегетуючим органом, в якому проходять активні процеси і накопичуються продукти метаболізму. Низький вміст ФС відмічений в коренях. Ці дані позитивно корелюють з показниками алелопатичної активності цих органів (рис.2). Динаміка вмісту ФС в листках та ризосферному грунті характеризується двома піками- в липні і жовтні (рис.6), що корелює з результатами дослідження алелопатичної активності R.luteum Sweet в динаміці (рис.3).

Серед ФС значну роль як алелохімікати грають ФКК, які вважаються найбільш активними серед природних інгібіторів росту фенольної природи, так як мають порівняно просту будову, рухомі і тому легко можуть поглинатися рослинами. ФКК виявлені у листках рододендрона жовтого протягом всього вегетаційного періоду. Вміст ФКК в листках невисокий, виділено як вільні так і глікозидовані кислоти. Найвищий їх вміст в червні –15,92 мкг на 1г маси сухої речовини та жовтні --10,42 мкг, а найменший в травні—5,68 мкг, що знову таки корелює з алелопатичною активністю водних витяжок з листків (рис.3). Як відомо, ФКК поступають в грунт з листового опаду, є продуктами мікробної деградації лігніну в грунті і попередниками гумінових кислот (Гродзинський, Горобець, 1989).

Рис.5. Вміст фенольних сполук в різних органах R.luteum Sweet.1-коробочки,2-опад, 3-листки, 4-пагін, 5-стебло, 6-насіння, 7- корінь, 8-квітки.

Тому їх розглядають як можливих носіїв грунтовтоми. Виділення та ідентифікація їх з ризосферного грунту R.luteum Sweet показала, що в грунті міститься значно більше ФКК ніж в рослині: в квітні—67,67 мг/кг, в червні—110,5 мг/кг, а в жовтні—102,9 мг/кг.

Рис.6. Динаміка вмісту фенольних сполук в листках та грунті R.luteum Sweet.

Було ідентифіковано вільні ФКК: параоксибензойна, ванілінова, паракумарова (цис-,транс-форми), метакумарова (цис-,транс-форми), ортокумарова кислоти (цис-,транс-форми). Крім цих ФКК в грунті привезеному з природного ареалу R.luteum Sweet була виявлена ферулова кислота в кількості-15,05 мг/кг, загальна кількість ФКК в цьому грунті була—118,76, що дещо переважало показники рослин, які ростуть у ботанічних садах Києва. Це пов'язано з тим, що склад ФКК, які накопичуються в грунті, залежить від характеристик самого грунту та різноманіття мікроорганізмів в ньому (Головко, 1984).

Крім ФКК з фенольних сполук рододендрона жовтого був виділений і ідентифікований кверцетин-3-глюкорамнозид (рутин). Кількісне визначення вмісту рутину показало, що динаміка його накопичення збігається з динамікою вмісту ФС та сапонінів. Виявилось, що гальмівна дія рутину на тест-об'єкти проявляється в досить низьких концентраціях, що може бути пов'язано з його мембраностабілізуючими властивостями (Комісаренко, Чернобай, 1965).

Серед багатьох груп хімічних сполук, які відносять до алелохімікатів, виділяють і амінокислоти, які можуть виявляти різну фізіологічну дію на всі системи життєзабеспечення рослини. Нами проведений якісний та кількісний аналіз амінокислот ризосферного грунту R.luteum Sweet в динаміці. Було ідентифіковано 7 вільних амінокислот: аспарагінова, гістидин, гліцин,серін, фенілаланін, лейцин та лізин, вміст яких вар'ював протягом вегетації. Найвищий їх вміст виявився в жовтні—3597,07мг/100г грунту, досить високий в квітні—2872,8 мг, найнищий у червні—2702,6 мг.

Серед речовин білкової природи, як нову групу алелохімікатів, вчені розглядають і лектини (Королёв,1989) Нами вперше було встановлено, що R. luteum Sweet є лектиномісткою рослиною. Лектини мають високий титр аглютинації. Активність лектинів варіює в залежності від вегетативного органу, фенофази та групи крові. Яскраво вираженої специфічності виділених лектинів до моносахаридів не виявлено. Алелопатична активність лектинів позитивно корелює з їх гемолітичною активністю та з алелопатичною активністю водних витяжок протягом вегетації, що дозволяє нам зробити припущення про участь лектинів як алелохімікатів в створенні алелопатичного потенціалу рододендрона жовтого.

В подальших дослідах послідовно з рослинного матеріалу вилучали лектини (фізіологічний розчин), фенольні сполуки (ацетон), сапоніни (метанол). При цьому спостерігали значне зниження активності витяжок (рис.7). Все це свідчить про те, що алелопатична активність R. luteum Sweet обумовлена речовинами фенольної природи, сапонінами, лектинами, амінокислотами.

Щоб дізнатись яким саме чином відбувається пригнічення росту коренів тест-об'єктів досліджувалась цитостатична активність колінів R. luteum Sweet. Як відомо, цитостатики представляють собою речовини різної хімічної будови, які вибірково пригнічують проліферацію клітин, і майже не впливають на процеси росту і метаболізму клітин. Виявилось, що найбільше цитостатичні властивості виражені у сапонінів та лектинів, слабіше у інших груп колінів.

Рис.7. Алелопатична активність різних витяжок з листків R. luteum Sweet.1—вихідна витяжка, 2—фракція фенольних сполук, 3—фракція сапонінів, 4—фракція лектинів, 5—витяжка після вилучення ФС, сапонінів та лектинів.

ДОСЛІДЖЕННЯ БІОЛОГІЧНОЇ АКТИВНОСТІ КОЛІНІВ ТА ЇХ ФІЗІОЛОГО-БІОХІМІЧНИХ ОСОБЛИВОСТЕЙ

Після встановлення того, що рододендрон жовтий є лектиномісткою рослиною та дослідження гемолітичної та алелопатичної активності лектиномістких екстрактів проводили їх очищення методом діалізу та фракціонування (Лазурьевский, 1961). Було виявлено, що альбумінова фракція менш активна ніж глобулінова. Після очищення лектинів титр їх гемолітичної активності дещо збільшився. Виявилось, що цитоплазматичні, і мембранозв'язані лектини характеризуються високим титром активності.

Було виявлено, що R. luteum Sweet синтезує сапоніни, причому в листках їх міститься до 5,5% в перерахунку на суху масу. Методом ТШХ виявлено, що в отриманій суміші сапонінів є як тритерпенові так і стероїдні глікозиди. Вперше була досліджена алелопатична активність сапонінів R. luteum Sweet, сила і характер якої (гальмування або стимуляція) залежить не тільки від біологічних особливостей тест-об'єктів але й від концентрації розчинів. Антибіотична активність виявлена як проти грампозитивних (Staphylococcus aureus АТСС 25923), так і проти грамнегативних (Pseudomonas aeruginosa АТСС 27853) бактерій, а також показана антифунгальна активність проти Candida albicans 260/886, що вказує на досить широкий діапазон антибіотичної дії суми сапонінів з листків R. luteum Sweet. При вивченні гемолітичної активності виявлено, що сума сапонінів R. luteum Sweet має досить високий титр аглютинації еритроцитів. При високих концентраціях сапонінів спостерігався гемоліз червоних кров'яних клітин.

Дослідження цитостатичної та цитотоксичної дії суми сапонінів рододендрона жовтого на клітинах лінії КВ з епідермоїдної карциноми ротової порожнини людини показали, що дія ця має дозозалежний ефект. При морфологічному дослідженні цитоцентрифужних препаратів виявлено, що під дією суми сапонінів клітини гинуть в результаті некрозу. Високі дози суми сапонінів (50 і 25 мкг/мл) через 48 годин інкубації пригнічують ріст клітин в декілька меншій мірі, ніж через 24 години, однак морфологічне дослідження показало наявність в клітинах, виражених різною мірою, дистрофічних явищ. Цікавою особливістю суми сапонінів рододендрона жовтого є стимуляція росту клітин при дії низьких доз сапонінів ( 0,05, 0,1 і 0,2 мкг/мл). Індекс ІС—(inhibitable concentration 50%) для суми сапонінів рододендрона жовтого і клітинної культури КВ є – 18 мкг/мл на 24 години інкубації і – 37 мкг/мл для 48 годин інкубації. Отримані результати свідчать про високу біологічну активність отриманої суми сапонінів та перспективність подальшого вивчення стероїдних та тритерпенових глікозидів рододендрона жовтого.

Як відомо, в природі фітотоксини ніколи не діють ізольовано, тому при вивченні біологічної активності речовин необхідно враховувати також комбіновану дію даних речовин з другими колінами, які зустрічаються в грунті біоценоза. Вивчення комбінованої дії суми сапонінів і фенолкарбонових кислот показало, що при невисокій концентрації сапонінів спостерігався адитивний еффект або антагонізм, а при високій – синергізм. Вірогідною для першого рівня значимості виявилась взаємодія суми сапонінів з m-кумаровою, m-оксибензойною і феруловою кислотами. В цілому сила взаємодії сапонінів і ФКК виявилась значно нижче, чим вплив кожного фактора окремо і сумарного ефекту.

Відомо, що обробка фітогормонами цілих органів і тканин змінює функціональну активність плазмалеми (Harnborn, 1995). Сапоніни і ФС, будучи мембрано-активними речовинами, можуть модифікувати властивості мембран рослинної клітини, що в свою чергу може змінювати активність фітогормонів. Досліди по спільній дії колінів і фітогормонів дали можливість зробити висновок, що сапоніни в суміші з фітогормонами здатні посилювати дію останніх на 38-52%, а рутин в низьких концентраціях може посилювати дію фітогормонів від 40 до 58% при використанні як тест-об'єкту амаранту. Крес-салат виявився менш чутливим до сумісної дії рутину та фітогормонів. Помічено, що при концентрації рутину 0,1мг/л і 0,025 мг/л спостерігається навіть деяке пригнічення активності фітогормонів.

АДАПТИВНІ ОСОБЛИВОСТІ РОДОДЕНДРОНА ЖОВТОГО ПРИ ІНТРОДУКЦІЇ

В літературі зустрічаються дані про те, що в стресових умовах відбуваються зміни метаболічних процесів рослини, що веде до збільшення синтезу деяких речовин, серед яких фенольні сполуки, деякі амінокислоти (Гродзинський, Горобець, 1989). Так, як ці групи речовин розглядають як алелохімікати, то ми припустили, що в стресовому стані, повинна підвищуватись алелопатична активність рослини. Результати дослідження динаміки алелопатичної активності водних витяжок з листків R. luteum Sweet представлено на рис.8. Найбільша алелопатична активність була у витяжок, отриманих з рослин першого року після пересадки. Рослини другого року після пересадки виявляли меншу активність. І лише на третій рік цей показник наблизився до показників рослин стійкого фітоценоза. Така ж закономірність спостерігалась і для ризосферного грунту. Ми встановили амплітуду реакції рододендрона жовтого на дію алелопатичного фактора (водні витяжки з листків) в межах досліджуваних нами концентрацій. Найбільшою амплітуда реакції була у рослин першого року після пересадки. У рослин другого року після пересадки вона була менша. У рослин третього року після пересадки цей показник був ще меншим, і наближався до рослин стійкого фітоценоза.

Визначення загального вмісту ФС в цих рослинах та грунті показало, що найвищий їх вміст у рослин, що ростуть перший рік після пересадки, а найнищий у рослин стійких фітоценозів та тих, що ростуть третій рік після пересадки.

Рис.8.Динаміка алелопатичної активності витяжок з листків рододендрона жовтого при інтродукції. 1—рослини стійкого фітоценозу, 2—рослини першого року після пересадки, 3—рослини другого року після пересадки, 4—рослини третього року після пересадки.

Для перевірки нашого припущення про стресовий стан рослин при інтродукції, ми перевірили його, взявши за основу загальновідомі показники стресового стану рослин—вміст, співвідношення пігментів та вміст проліну (Гродзинський, 1973, Починок, 1986). Результати цих дослідів показали, що рослини першого року після пересадки мають підвищений вміст проліну, хлорофілу в, каротиноїдів, що свідчить про їх стресовий стан.Всі ці дані підтверджують наше припущення, що алелопатична активність рослин може бути показником їх стресового стану.

Отже, лише на третій рік після перенесення з природного ареалу, рослини виходять з стресового стану, що необхідно враховувати при інтродукції та вирощуванні цієї рослини.

ВИСНОВКИ

1.Вегетативні і генеративні органи рододендрона жовтого синтезують алелопатично активні речовини, динаміка активності яких змінюється протягом вегетаційного періоду.

2.Показано, що алелопатично активні сполуки рододендрона жовтого виявляють видоспецифічність дії до тест-об'єктів: найбільш чутливими виявились амарант, крес-салат і корені пшениці.

3. Встановлено, що насіння представників різних видів роду Rhododendron L. характеризується високим алелопатичним потенціалом. Просліджується кореляція між вмістом фенольних сполук та алелопатичною активністю водних, спиртових витяжок та лектиномістких екстрактів з насіння. Показано, що з часом, в процесі зберігання вміст фенольних сполук в насінні підвищується, алелопатична активність водорозчинних сполук знижується, а спирторозчинних підвищується.

4. Алелопатична активність рододендрона жовтого обумовлена наявністю сполук фенольної природи, амінокислот, лектинів і сапонінів, які виділяються в навколишнє середовище в кількостях, не здатних гальмувати ріст самої рослини, що свідчить про аутотолерантність R.luteum Sweet.

5. В R.luteum Sweet та в його ризосферному грунті виявлені прості і складні фенольні сполуки, зокрема флавоноїди (рутин), фенолкарбонові кислоти: ферулова, орто-кумарова, сирінгова, ванілінова, п-оксибензойна, п-кумарова, м-кумарова, кофейна, галова, 2,4-диоксибензойна, ?-резорцилову. В ризосферному грунті рододендрона жовтого ідентифіковано 7 вільних амінокислот: аспарагінову, гістидин, гліцин, серін, фенілаланін, лейцин та лізин.

6.Встановлено, що рододендрон жовтий є лектиномісткою рослиною. Лектини R.luteum Sweet мають досить високий титр аглютинації та виявляють гальмуючу дію на приріст коренів тест-об'єктів.

7. Одержано суму сапонінів рододендрона жовтого, яка містить стероїдні та тритерпенові сполуки, та показана їх алелопатична, гемолітична, антибіотична та протипухлинна дія.

8.Досліджені адаптаційні особливості рододендрона жовтого при інтродукції. Показано, що рослини першого року після пересадки мають підвищений вміст проліну, хлорофілу в, каротиноїдів.

9.Виявлено, що алелопатична активність рослин може бути показником їх стресового стану. Найбільша алелопатична активність і амплітуда реакції на дію алелопатичного фактора проявляється в рослин першого року після пересадки і лише на третій рік після пересадки всі показники стресового стану наближаються до рівня рослин стійкого фітоценоза.

СПИСОК РОБІТ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Дзюба О.І., Головко Е.А. Сапоніни рододендрона жовтого та їх біологічна активність //Фізіологія та біохімія культурних рослин.-2000.-т.32,№6.-С.469-473.

2.Дзюба О.І., Соляник О.В. Біологічно активні сполуки Rhododendron luteum Sweet : лектини та їх активність // Питання біоіндикації та екології.- Запоріжжя.-1999.-вип.4.- С.161-165.

3.Дзюба О.І., Дерев'янко В.А. Порівняння алелопатичної активності екстрактів з листків та квіток рододендрона жовтого (Rhododendron luteum Sweet) // Вісник Київського університету ім. Т.Шевченка.-1999.-вип.2.-С.67-68.

4.Дзюба О.І., Дерев'янко В.А., Соляник О.В. Фізіолого-біохімічні особливості насіння різних видів роду Rhododendron L.// Інтродукція рослин.—2001.- № 1.-С.148-150.

5.Головко Е.А., Дзюба О.І. Rhododendron luteum Sweet-морфологія, систематика, поширення та біологічні особливості // Екологія і ноосферологія.-1999.-т.7, № 3-4.-С. 107-113.

6.Дзюба О.І., Галієнко П.В. Деякі алелопатичні особливості суміші сапонінів Rhododendron luteum Sweet // Збірка тез доповідей ІІ Всеукраїнської науково-практичної конф. студентів, аспірантів та молодих вчених "Екологія. Людина. Суспільство." пам'яті проф. О.П.Шутька.-Київ: НТУУ "КПІ".-1999.-С.11-12.

7.Dzuba O.I. Saponins from Rhododendron luteum Sweet: Their Biological activity // Abstracts. Saponins in Food, Feedstuffs and Medicinal Plants.-Pulawy.-1999.-р.105.

8.Гудзь.Ю.П., Дзюба О.І., Ахов Л.С., Мегалінська Г.П. Алелопатична активність різних екстрактів з листків та квіток рододендрона жовтого (Rhododendron luteum Sweet) // Сучасний стан та перспективи розвитку природничо- географічних наук і освіти.-Київ.-1999.- С. 29-33.

9.Дзюба.О.И. Биологическая активность сапонинов Rhododendron luteum Sweet // Тезисы VII молодежной конференции ботаников в Санкт- Петербурге.: Санкт-Петербург.-2000.-С.223.

10. Дзюба О.І., Соляник О.В. Зміна активності лектинів представників роду Rhododendron L. в процесах кріоадаптації // Актуальні проблеми ботаніки та екології.: Київ.- 2000.-С. 87.

11.Дзюба О.І, Соляник О.В. Біологічна активність лектинів деяких представників родини Еricaceae // Тези доповідей VII Конф. молодих вчених “Проблеми фізіологіі рослин та генетики на рубежі третього тисячоліття”.- Київ.-2000.- С.29.

12.Головко Э., Ахов Л., Дзюба О. Биологически активные вещества высших растений: скрининг и идентификация // Тези доповідей Четвертого міжнародного наукового конгресу ”Олімпійський спорт і спорт для всіх. Проблеми здоров'я, рекреації, спортивної медицини та реабілітації”.-Київ.-2000.-С.182.

Дзюба О.І. Фізіологічні та біохімічні особливості рододендрона жовтого (Rhododendron luteum Sweet): алелопатичний аналіз.- Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.12—фізіологія рослин.—Інститут фізіології рослин і генетики НАН України, Київ,2001.

Дисертацію присвячено питанням дослідження фізіолого-біохімічних особливостей рододендрона жовтого (Rhododendron luteum Sweet). Вперше дана алелопатична характеристика рододендрона жовтого, вивчені його фізіолого-біохімічні особливості та адаптаційні процеси при інтродукції, вивчені алелопатичні особливості насіння різних видів роду Rhododendron L.

З'ясована хімічна природа алелопатично активних сполук рододендрона жовтого. Встановлено, що алелопатична активність обумовлена наявністю сполук фенольної природи, амінокислот, лектинів і сапонінів. Вивчена сезонна динаміка накопичення алелопатично активних сполук в рослині та ризосферному грунті. Вперше виділена сума сапонінів рододендрона жовтого і досліджена їх біологічна активність та показано, що рододендрон жовтий є лектиномісткою рослиною. Досліджена динаміка активності лектинів з різних органів рослини. Отримані результати розширюють існуючі погляди відносно збереження R.luteum Sweet в природних фітоценозах, як реліктового виду флори України, а також дозволяють рекомендувати рододендрон жовтий для інтродукції в ботанічні сади, дендропарки та використання в ландшафтній архітектурі. Враховуючи накопичення в наземних органах R.luteum Sweet біологічно активних сполук очевидним є перспективність їх використання в фармакологічній промисловості.

Ключові слова: Rhododendron luteum Sweet, алелопатія, сапоніни, лектини.

Дзюба О.И. Физиологические и биохимические особенности рододендрона желтого (Rhododendron luteum Sweet): аллелопатический анализ.- Рукопись.

Дисертация на соискание научной степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.12—физиология растений.—Институт физиологии растений и генетики НАН Украины, Киев,2001.

Дисертация посвящена вопросам исследования физиолого-биохимических особенностей рододендрона желтого (Rhododendron luteum Sweet). Впервые дана аллелопатическая характеристика рододендрона желтого, изучены его физиолого-биохимические особенности и адаптационные процессы при интродукции. Показано, что растения первого года после пересадки имеют повышенное содержание пролина, хлорофилла в, каротиноидов. Наибольшая аллелопатическая активность и амплитуда реакции на действие аалелопатического фактора проявляется у растений первого года после пересадки и только на третий год после пересадки все показатели стрессового состояния приближаются к уровню растений стойкого фитоценоза.

Изучены аллелопатические особенности семян разных видов рода Rhododendron L. Установлено, что семена характеризуются высоким аллелопатическим потенциалом. Прослеживается корелляция между содержением фенольных веществ и аллелопатической активностью водных, спиртовых вытяжек и лектиносодержащих экстрактов из семян. Показано, что со временем, в процессе хранения содержание фенольных соединений в семенах увеличивается, аллелопатическая активность водорастворимых соединений снижается, а спирторастворимых увеличивается. Показано, что аллелопатически активные соединения рододендрона желтого проявляют видоспецифичность действия к тест-объектам: наиболее чувствительными оказались амарант, крес-салат и корни пшеницы.

Определена химическая природа аллелопатически активных веществ рододендрона жовтого. Установлено, что его аллелопатическая активность обусловлена наличием веществ фенольной природы, аминокислот, лектинов и сапонинов. В R.luteum Sweet и в ризосферной почве определены простые и сложные фенольные соединения, в часности, флаваноиды (рутин), фенолкарбоновые кислоты: феруловая, орто-кумаровая, сиреневая, ванилиновая, пара-оксибензойная, пара-кумаровая, мета-кумаровая, кофейная, галловая, 2,4-диоксибензойная, ?-резорциловая. В ризосферной почве рододендрона желтого идентифицировано 7 свободных аминокислот: аспарагиновую, гистидин, глицин, серин, фенилаланин, лейцин и лизин. Изучена сезонная динамика накопления аллелопатически активных веществ в растении и ризосферной почве. Впервые выделена сумма сапонинов рододендрона желтого, которая содержит стероидные и тритерпеновые соединения, и показана их аллелопатическая, гемолитическая, антибиотическая и антираковая активность. Показано, что рододендрон желтый лектиносодержащее растение. Изучена динамика активности лектинов из разных органов растения. Лектини R.luteum Sweet имеют достаточно высокий титр агглютинации и проявляют ингибирующее действие на прирост корней тест-объектов.

Полученные результаты расширяют существующие взгляды относительно сохранения R.luteum Sweet в природных фитоценозах, как реликтового вида флоры Украини, а также разрешают рекомендовать рододендрон желтый для интродукции в ботанические сады, дендропарки и использования в ландшафтной архитектуре. Учитывая накопление в наземных органах R.luteum Sweet биологически активных соединений очевидной есть перспектива использования их в фармакологической промышленности.

Ключевые слова: Rhododendron luteum Sweet, аллелопатия, сапонины, лектины.

Dzuba.O.I. The physiоlogical and biochemical properties of Rhododendron luteum Sweet: allelopathic analysis. - Manuscript.

The thesis for Ph.D.degree (Biology) on speciality 03.00.12. – plant physiology. - Institute of Plant Physiology and Genetics, National Academy of Sciences of Ukraine, Kyiv, 2001.

The thesis is devoted to the questions of research the physiоlogically-biochemical properties of Rhododendron luteum Sweet. It is given for the first time the allelopathic characteristic of R. luteum Sweet, study of its physiоlogical and biochemical properties, adaptation processes of introduction and study of allelopathic properties of seeds for different species of genus Rhododendron L. The chemical nature of alellopathic active substanses of R.luteum Sweet is established. Also, is established, that alellopathic activity is caused by presence of phenolic compounds, amino acids, lectins and saponins. Seasonal dynamics of accumulation of alellopathic active compounds in the plant and in soil's risosphere has been investigated. For the first time the mixture of saponins of R.luteum Sweet has been isolated of and their biological activity has been investigated. For the first time it has been shown that R.luteum Sweet containes the lectins Dynamics of activity of lectins in different organs of the