УКРАЇНСЬКА АКАДЕМІЯ АГРАРНИХ НАУК

ІНСТИТУТ ВИНОГРАДУ І ВИНА "МАГАРАЧ"

ГІашвІлІ Малхаз ДАВИДОВИЧ

УДК 66 3.252.6:636.087.24

РОЗРОБКА БІОТЕХНОЛОГІЇ
ОтриманНЯ КОРМОВОГО БІЛКОВОГО ПРОДУКТУ
З ВИНОГРАДНИХ ВичавОК

03.00.20 – Біотехнологія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня
доктора технічних наук

Ялта - 2001

Дисертацією є рукопис.

Виконана в Інституті винограду і вина "Магарач" УААН (м.Ялта).

Науковий консультант: | Єжов Валерій Микитович – доктор технічних наук, професор, академік УААН,
Нікітський ботанічний сад – Національний науковий центр УААН, директор.

Офіційні опоненти: | Бур'ян Надія Іванівна – доктор технічних наук, професор, Інститут винограду і вина "Магарач" УААН, науковий консультант;

Маринченко Віктор Панасович – доктор технічних наук, професор, член-корес-пондент УАТН, Український держуніверситет харчових технологій МОН України,
професор кафедри біотехнології продуктів бродіння, екстрактів і напоїв;

Кулик Михайло Федорович – доктор сільськогосподарських наук, професор, член-кореспондент УААН, Інститут кормів
УААН, заступник директора.

Провідна організація: | - Український науково-дослідний інститут спирту і біотехнології продовольчих продуктів Міністерства аграрної політики України, м. Київ.

Захист відбудеться 14.03.2002 р. о 10 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 53.365.02 в Інституті винограду і вина "Магарач" УААН за адресою: 98600, АР Крим, м. Ялта, вул. Кірова, 31.

З дисертацією можна ознайомитись в науковій бібліотеці Інституту винограду і вина "Магарач" УААН.

Автореферат дисертації розісланий 12.02.2002 р.

Вчений секретар спеціалізованої ради,

доктор сільськогосподарських наук,

старший науковий співробітник Якушина Н.А.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Одним з перспективних напрямків розвитку сучасної біотехнології є мікробіологічне виробництво лікувально-профілактичних, харчових і кормових продуктів на основі лигноцелюлозних відходів переробки сільськогосподарської сировини.

Аналіз стану переробки рослиної сировини, у тому числі винограду показує, що утилізація твердих відходів виноробства в Україні, на відміну від рівня високорозвинених виноробних країн, мало ефективна. Наявні в складі солодких вичавок фруктоза і глюкоза трансформуються в основному в етанол, хоча їхня біологічна цінність незмірно вище. Виноградна лоза і гребені практично не переробляються, а через дефіцит засобів в останні роки найчастіше і вичавки використовуються як добриво. Через відсутність комплексної переробки відходів виноробства спостерігається підвищене забруднення навколишнього середовища.

У той же час, завдяки науковим дослідженням, існують реальні підходи і розробки якісно нових технологій переробки вичавок на харчові і кормові продукти з високим змістом біологічно активних речовин.

Завдяки широкому набору вітамінів, мікроелементів, амінокислот і мінеральних речовин, виноградна вичавка здатна доповнити чи замінити зерно злакових культур, що вважаються основним джерелом рослинного білка. У цьому плані найбільш перспективним є культивування вищих дереворуйнуючих базидіальних грибів на вичавці з одержанням кормового білкового продукту, який не потребує додаткового збалансування за амінокислотним складом.

Результати досліджень вчених у цій області (Соломко і ін., 1981; Билай і ін., 1982; Бисько і ін., 1983; Милстеин і ін., 1984; Скрябін, Головлев, 1985; Ханг, Вудамс, 1986; Єжов і ін., 1987; Гибонс, Уитби, 1988) свідчать, що технологічні методи вироблення харчових і кормових білкових продуктів економічно вигідні, не залежать від погодних умов, піддаються механізації, автоматизації і відносяться до високоінтенсивних виробництв.

Таким чином, розробка і апаратурне забезпечення біотехнології одержання кормового білкового продукту (КБП) з виноградних вичавок методом твердосубстратного культивування (ТСК) вищих базидіальних грибів, на сьогоднішній день є актуальною проблемою.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами і тематикою. Дослідження проведені відповідно до тематичних планів ІВіВ "Магарач", Технічному завданню і Програмі науково-дослідних робіт Державного агропромислового комітету СРСР, ВАСГНІЛ, Української академії аграрних наук, Науково-технічній програмі "Продовольство-95" і Республіканській науково-технічній програмі "Фундаментальні дослідження" УААН (№№ держреєстрації: 0186012666, UA 01003485Р, UA 01003486P, UA 01003517P, UA 01003518P).

Мета і завдання досліджень. Основною метою даної роботи є наукове обґрунтування і розробка біотехнології виробництва кормового білкового продукту методом ТСК вищих базидіальних грибів на виноградній вичавці. Конкретні завдання досліджень полягають у наступному:

1. дати розгорнуту характеристику біологічної і кормової цінності виноградної вичавки;

2. вивчити кількісні і якісні зміни компонентів вичавки в процесі її біотрансформації в кормовий білковий продукт;

3. обґрунтувати режими підготовки субстрату і посівної культури, розробити технологічні параметри твердосубстратного культивування вищих базидіальних грибів на виноградній вичавці;

4. розробити і випробувати в умовах виробництва технологію, технічне оснащення і апаратуру для виробництва кормового білкового продукту;

5. розробити об'єктний і оперативний метод оцінки якості кормового білкового продукту;

6. виробити дослідно-промислові партії кормового білкового продукту, провести їхні випробування, одержати експертні токсикологічний і зоотехнічний висновки на їхню придатність у годівлі сільськогосподарських тварин;

7. на основі результатів випробувань біотехнології виробництва кормового білкового продукту у виробничих умовах і показників його кормових якостей, розробити відповідну нормативну документацію і рекомендації щодо впровадження.

Наукова новизна. Уперше науково обґрунтовані режими і параметри ТСК вищих дереворуйнуючих базидіальних грибів штаму ИБК-226 Pleurotus ostreatus (Jacq.:Fr.) Kummer на екстрагованій виноградній вичавці без гребенів, збагаченою органічною і азотофосфорною добавкою, способом стерилізації за 2 години під тиском пару 0,15-0,18 МПа, протягом процесу 10-15 діб. (патент України 23177 А).

Вивчено особливості якісних і кількісних змін компонентів хімічного складу в системі "виноградна вичавка – кормовий білковий продукт", що відбиває процес біотрансформації лигноцелюлозного комплексу в протеїн.

Проведений скрининг базидіальних грибів щодо здатності накопичувати біомасу в умовах росту на виноградній вичавці і виявлено 5 кращих штамів – продуцентів кормового білка, на які отримано авторські посвідчення СРСР на винаходи (№№ 1676265, 1676266, 1676267, 1676268, 1676269).

Уперше встановлена ефективність біологічного кислотозниження на стадії передобробки вичавки, що дозволяє підвищити живильну цінність КБП за рахунок збільшення кількості біологічно активних речовин: амінокислот, вітамінів, мінеральних речовин і мікроелементів. У результаті оптимізації процесу біоконверсії забезпечується одержання цільового продукту, який значно переважає вихідний субстрат за індексом кормових одиниць – у 2 рази, перетравності – 2,5 рази і енергетичної цінності – 1,5 рази (патент України 9027А).

Практична значимість і реалізація результатів досліджень. Розроблено і випробувано дослідно-промисловий зразок біореактора. Оригінальне технічне рішення його конструкції з розташуванням субстрату у вигляді вертикальних коаксіальних поверхонь, а також автоматизована вимірювальна система АВС "Біотехнологія" регулювання і контролю технологічних параметрів захищені патентами України (20499А і 23176А).

Біореактор корисною ємністю 80 дм3 складається: з робочих вузлів перемішування субстрату, дренажної системи для відводу надлишкової вологи, видалення газоподібних метаболітів, подачі стерильного і відводу відпрацьованого повітря, а також термостабілізуючої сорочки, оглядового вікна, що служить за призначенням і для нанесення в середовищі культивування вертикальних коаксіальних поверхонь. Оснащений комп'ютерною системою АВС "Біотехнологія" для збору, обробки, зберігання і видачі інформації, біореактор забезпечує стабільне проходження процесу біоконверсії виноградних вичавків у кормовий білковий продукт у заданому технологічному режимі.

Розроблено апаратурно-технологічна схема процесу і відповідна НД: технологічна інструкція ТИУ46.75 К23.009-96, технічні умови ТУУ00334830.007-96, інструкція з експлуатації біореактора і правилам техніки безпеки, практичні рекомендації за виробництво КБП з виноградних вичавків. Розроблено технологічні вимоги щодо біореактора, процесу біоконверсії, посівному міцелію, субстрату і КБП.

Проведено виробничі і приймальні випробування технології переробки вичавок у КБП на експериментальній лінії (продуктивністю 1 т вичавки за технологічний цикл) і в дослідно-промисловому біореакторі. Технологія рекомендована для широкого впровадження, а КБП випробуваний у тваринницьких господарствах південної України і Криму. У виробничих умовах перероблено 8,5 т виноградної вичавки. З вироблених партій у годівлі сільськогосподарських тварин випробувано 1,76 т КБП в оптимальній дозі 5-10% від маси комбікорму замість адекватної кількості фуражного зерна пшениці. У результаті зекономлено 50-100 кг високоцінного зернофуражу на кожну тонну комбікорму. Сумарний річний економічний ефект від упровадження КБП у виробництво складає 235грн на 1 т комбікорму.

Розроблена і випробувана в раціонах молодняку свиней і великої рогатої худоби (ВРХ) нова рецептура комбікорму з включенням оптимального дозування КБП. Отримано експертні медичний і зоотехнічний висновки на його токсикологічну чистоту і відповідність стандартам кормовиробництва. Підтверджено кормові і лікувально-профілактичні властивості вичавочного борошна і КБП у безпосередній годівлі свиней, ВРХ, вівцематок, лактуючих корів і бройлерних курчат. Результати розробок документально оформлені у відповідних актах випробувань та впровадженнях, затверджених керівництвом ПО "Кримрадгоспвинпром", НДІТ ім. М.Ф.Іванова "Асканія-Нова" і ІВіВ "Магарач" УААН.

Конкретна особиста участь дисертанта полягає в підборі і аналізі вітчизняних і зарубіжних джерел літератури з проблеми, проведенні патентного пошуку, виборі напрямку досліджень, плануванні експериментів, у зборі і аналізі отриманих даних, формулюванні висновків і наукових положень, у розробці режимів і параметрів технологічних процесів і апробації у виробничих умовах, у розробці і затвердженні НД і впровадженні технології у виробництво.

Особистий внесок дисертанта в одержанні результатів досліджень складає не менш 70%, а написаних у співавторстві публікаціях - не менш 80%.

Апробація результатів досліджень. Матеріали дисертації повідомлені і обговорені на засіданнях секції вченої ради з виноробства і вченої ради Інституту винограду і вина "Магарач" УААН у 1994, 1996 і 2000 роках, на науково-технічних нарадах і конференціях молодих вчених і фахівців (Запорожжя, 1988; Чернівці, 1991; Київ, 1991, 1993; Донецьк, 1993; Ялта, 1993; Херсон, 1994; Дніпропетровськ, 1995; Вінниця, 1995); на інтернаціональному симпозіумі "Mixing in chemical and bioreactors" (Рига, 1992); на міжнародному конгресі "Біоконверсія біологічних відходів і охорона навколишнього середовища" (Київ, 1996); на технічних радах ПО "Кримрадгоспвинпром" і Мінсільгосппроду Криму (Сімферополь, 1998). Результати досліджень експонувалися на ВДНГ СРСР і УРСР (1990-1991), в УААН (1997) і Національному виставковому центрі України (1999).

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 55 робіт, у тому числі 6 авторських посвідчень на винаходи, позитивне рішення на видачу патенту Росії і 4 патенти України.

Обсяг і структура дисертації. Робота складається з вступу, літературного огляду, шести розділів, висновків і рекомендацій виробництву, а також списку літератури, що включає 351 джерело, у тому числі 100 іноземних авторів. Зміст дисертації викладений на 274 сторінках машинописі. У тексті міститься 57 таблиць, 18 рисунків і 8 фотографій, додатки містять 30 найменувань.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Висвітлюються літературні дані вітчизняних і зарубіжних дослідників в області біотехнології, переробки рослинних лігноцелюлозних відходів, у тому числі вторинних ресурсів виноробної промисловості, у кормові білкові продукти за допомогою поверхневого культивування вищих дереворуйнуючих базидіальних грибів. На основі аналізу попередніх робіт показано, що розробка промислової біотехнології отримання з виноградної вичавки кормового білкового продукту актуальна і вимагає практичного рішення.

Місце, умови, матеріали, об'єкти і методи досліджень. Наукові дослідження і дослідно-експериментальні роботи проведені у 1989-1999 р. у відділі біотехнології ІВіВ "Магарач" УААН. Розроблені технічні рішення випробувані на дослідно-промисловому біореакторі в ІВіВ "Магарач", у виробничих умовах радгоспу-заводу "Нижнєгірський", НВФ "Санас", фірми "Ампелос" і агрофірми "Перемога" Білогірського району Криму, тваринницьких господарствах Харківської області, радгоспу ім. В.П.Чкалова Бахчисарайського району, Харківського НВО "Племеліта" і ІЕКіВМ УААН, ДВГ Житомирського СГІ, НДІТ "Асканія-Нова" УААН.

При здійсненні процесу ТСК базидіальних грибів на виноградній вичавці об'єктами досліджень були: як субстрат - виноградна вичавка з суміші технічних сортів винограду (Ркацителі, Аліготе, Рислінг, Сапераві, Каберне Совіньон, Мерло) після її екстрагування і сушіння без гребенів; як інокулят - штами вищих дереворуйнуючих базидіальних грибів, люб'язно нам наданих з колекції Інституту ботаніки ім. М.Г.Холодного НАН України; як цільовий продукт - кормовий білковий продукт.

Для оперативного аналізу розроблено, опробувано і рекомендовано експрес-метод визначення якості КБП (Гіашвілі і ін., 1996). В аналітичній роботі також використані загальноприйняті хімічні методи аналізу ("Методи технологічного і мікробіологічного контролю у виноробстві" під ред. Г.Г.Валуйко, 1980; "Збірник технологічних інструкцій... з виноробної промисловості" під ред. Г.Г.Валуйко, 1985).

Аналізи фізіологічного стану дослідних тварин і якості кормів проведені в зоохімлабораторіях НВФ "Санас" (кер. Толоконіков Ю.О.), ІЕКіВМ (кер. Голуб Ю.С.) і НДІТ "Асканія-Нова" (кер. Д'яченко Л.С.), відповідно до затверджених програм з загальноприйнятих методик зоотехнії і ветеринарії (Томе М.Ф. "Методика визначення перетравлення кормів і раціонів", 1969; Овсянніков О.І. "Основи дослідної справи у тваринництві", 1976; Марнов Д.І. і ін. "Керівництво з аналізу кормів", 1982; Разумов В.А. "Довідник лаборанта-хіміка з аналізу кормів", 1986; Довідник: деталізовані норми годування сільськогосподарських тварин, під ред. Ноздріна М.Т., 1991).

Токсикологічна перевірка КБП виконана в НВО "Гідролізпром" ММП СРСР у 1990-1991 р. (кер. Курис Н.М.) і ІЕКіВМ УААН у 1996 р. (кер. Малінін О.О.), а додатковий тест – в ІВіВ "Магарач" у 2001 р.

Вірогідність дослідно-експериментальних результатів, що одержани, їхня теоретична інтерпретація і практичне узагальнення на кожному етапі досліджень забезпечувалася за допомогою наступних математичних і статистичних методів обробки даних:

- проведення дослідів у 3-5-кратних повторностях за визначенням середньої помилки;

- визначення вірогідності різниць між порівнювальними варіантами за критерієм Стьюдента в модифікації Доспехова Б.О. (1985);

- використання критерію найменшої істотної різниці (НІР) і стандартних таблиць процентилей при довірчої імовірності Р=0,95;

- обробку результатів забезпечували на ПЕОМ типу IBM PC/AT.

Результати досліджень і їхнє обговорення

Роль структурних елементів і сортових особливостей виноградної вичавки у формуванні її кормової цінності

У проведених нами експериментах як субстрат біоконверсії використовувалася екстрагована виноградна вичавка без гребенів. Відповідно до результатів аналізу, у структурних складових субстрату, що застосувався – шкірочці та насіннях винограду представлений широкий спектр біологічно активних компонентів: полісахаридів (ПС), азотистих, фенольних, мінеральних речовин, вітамінів, жирних кислот, амінокислот. Вочевидь, що в них закладений основний потенціал кормової цінності майбутнього білкового продукту.

Вичавка, що піддавалася біоконверсії, була отримана в основному з червоних технічних сортів винограду, які володіють високим запасом вуглеводів, фенольних і екстрактивних речовин.

З метою визначення впливу сортового складу вичавки на процес твердосубстратного культивування, був проведений ряд дослідних технологічних циклів біоконверсії. Було встановлено, що вичавка з перевагою червоних сортів у більшій мірі сприяє проходженню цього процесу (табл. 1).

Таблиця 1

Показники порівняльних дослідів біоконверсії вичавки

Показники
вичавок | Трива-лість ТСК, діб. | Вміст в КБП, %

суми ПС | ліг-ніну | золи | каль-цію | фос-фору | сирого протеїну | білку

Вар.1. Суміш білих сортів: Ркацителі, Ріслінг, Аліготе | 17 | 20,6 | 43,2 | 3,8 | 0,64 | 0,38 | 19,8 | 16,9

18 | 21,1 | 39,9 | 4,1 | 0,70 | 0,42 | 23,2 | 17,6

18 | 16,0 | 39,9 | 4,5 | 0,78 | 0,31 | 21,7 | 15,8

Вар.2. Суміш червоних сортів: Каберне Совіньон, Сапераві, Мерло | 16 | 17,5 | 36,7 | 5,2 | 0,91 | 0,39 | 25,6 | 19,0

15 | 18,8 | 40,2 | 4,8 | 0,85 | 0,52 | 26,5 | 19,5

16 | 20,2 | 38,6 | 5,1 | 0,85 | 0,46 | 24,9 | 18,8

Примітка. Доля білка у сирому протеїну перерахована за кількістю амінокіслот за допомогою коефіціенту 6,25.

Отримані дані свідчать, що у варіанті 2 за менші терміни ТСК забезпечується більш високе накопичення важливіших компонентів грибної біомаси: мікроелементів, сирого протеїну і білка. В результаті встановлено, що КБП, отриманий на основі багатих біологічно активними речовинами насінні та шкірок з червоних технічних сортів винограду, при внесенні у складі комбікорму дозволяє підвищити середньодобовий і абсолютний приріст живої маси сільськогосподарських тварин.

Дослідження лікувально-профілактичної цінності
виноградної вичавки

Всебічний аналіз специфічних особливостей складових частин винограду підтвердили перспективність вичавки, як джерела збагачення комбікорму і стимулювання фізіологічного стану тваринного організму. Тому було важливо вивчити її потенційні лікувально-профілактичні властивості у нативному стані.

З цією метою разом з НПФ "Санас" було зроблено випробування вичавкового борошна дисперсністю 1 мм, як профілактичний кормовий інгредієнт. На базі ДВГ Житомирського СГІ вичавочне борошно із суміші сортів винограду застосовувалося в раціоні лактуючих корів. Аналіз даних підтвердив здатність вичавочного борошна підвищувати надої молока на 0,74%, жирність на 0,27%, а також вміст у цьому важливіших компонентів: вітамінів на 95 мг/кг, ненасичених жирних кислот – на 1,65 мг%, мінеральних речовин – на 11,05 мг%, у тому числі мікроелементів – на 3,05 мг%. Кількість холестерину в молочному жирі, порівняно з контрольним показником, було знижено на 22,6%. Разом з підвищенням кількості молочної продукції, вичавкове борошно забезпечило високу стійкість дослідного поголів'я до вірусних і респіраторних захворювань (у контрольній групі тварин – 3 випадки, у дослідної – жодного).

У результаті апробації вичавкового борошна в раціоні бройлерних курчат було зафіксоване збільшення збереження поголів'я на 2-3% і приросту живої маси на 9-19%. Витрати на корм птах були знижені на 2-7%.

За повідомленням Смоляра і ін. (1991), обмеження вітамінів, мінеральних речовин, мікроелементів у раціонах с-г тварин, особливо в зоні радіоактивного зараження, веде до накопичення в їхньому організмі радіоактивного стронцію і цезію. З наших даних (Єжов, Гіашвілі, Толоконіков, 1995) випливає, що підвищений вміст біологічно активних речовин в вичавці при її внесенні в раціон лактуючих корів додає молоку адсорбуючі захисні властивості.

Випробування лікувально-профілактичних властивостей виноградної вичавки були проведені разом за ІЕКіВМ УААН у тваринницьких господарствах Харківської області. Вичавкове борошно разом з антимікробними, адсорбуючими і детоксикуючими добавками включали до складу дослідних препаратів "Ековін", "Ентеровер", "Ентеровер-2" і згодовували дослідні групи новонароджених телят (табл.2).

Результати випробувань підтвердили ефективність виноградного борошна в складі препаратів як у профілактиці, так і в лікуванні шлунково-кишкових захворювань молодняку ВРХ. Від класичних захворювань були захищені всі тварини дослідної групи, а лікування забезпечило видужання 90% дослідного поголів'я.

Таблиця 2

Результати випробування вичавкового борошна
в складі препарату "Ековін"

Показники

Група тварин |

Застосу-вання
засобу | Кіль-кість голів |

Кіль-кість голів, які видужали, % | Продовжено лікування іншими засобами, % | Кількість тварин,
які видужали

всього голів, % | в легкій формі, голів | в класичної формі, голів

Контрольна | Профілактика | 12—— | 4

33,3 | 1 | 3

Дослідна | Профілактика | 14—— | 2

14,3 | 2—

Контрольна | Лікування | 20 | 12

60 | 8

40———

Дослідна | Лікування | 20 | 18

90 | 2

10———

На підставі отриманих даних рекомендується використання вичавкового борошна в кормовому раціоні як перспективний засіб, що сприяє збільшенню резистентності до хвороб молодняку ВРХ.

Дослідження закономірностей росту базидіоміцетів в умовах ТСК
на виноградній вичавці

Ефективність проходження процесу ТСК базидіоміцетів безпосередньо зв'язана з характеристикою використаного штаму грибів. Враховуючи на складність вмісту виноградної вичавки як субстрату, украй важливо застосовувати штами, що володіють здатністю інтенсивної деструкції лігноцелюлозного комплексу, швидкого росту і максимального накопичення білка біомаси грибів.

У лабораторних і виробничих умовах нами були випробувані штами виду Pleurotus ostreatus (Jacq.: Fr.) Kummer (колекційні №№ 12, Дон-103, Дон-112, 226), Pleurotus florida, а також штами базидіоміцетів виду Funalia trogii ИБК-0799 і Coriolus villosus ИБК-0276.

Скрининг досліджених штамів показав, що за технологічними особливостями варто виділити штам ИБК-226 гриба Pleurotus ostreatus. Маючи низький індекс мікогенного ксілолізу, цей штам при однакових умовах культивування на виноградній вичавці виявляє найбільш прийнятні ознаки характеристики росту за швидкістю адаптації до субстрату, деструкції лігноцелюлозного комплексу та накопичення грибної біомаси за високим вмістом білка (рис. 1). Вказаний штам має токсикологічну експертизу і протягом ряду років широко застосовується для отримання плодових тіл грибів (Бухало, 1988).

Рис. . Динаміка накопичення білка при ТСК базидіоміцетів на виноградній вичавці (Т=26±1°С, вологість середовища – 50-75%)

Умовні позначки:
· – · – Funalia trogii ИБК-0799 (Y1);
– – – Coriolus villosus ИБК-0276 (Y2);
—— Pleurotus ostreatus ИБК-226 (Y3).

Оцінку динаміки білка проводили кореляційно-регресивним методом аналізу, реалізованим на ПЭОМ у програмі Coplot у режимі Polinomial regression. Вірогідність рівнянь оцінювали за коефіцієнтом детермінації і критерію Фишера. Відповідно до статистичної обробки отриманих даних зроблені наступні висновки:

1. між факторами часу і накопиченням білка біомаси гриба Funalia trogii існує залежність, що описується рівнянням параболи III ступеня:

Y1= 9,6 – 2,357 + 0,5752 - 0,027783;

R2=0,998; Fфакт.=147,9; Рфакт.=0,940.

2. зв’язок факторів для гриба Coriolus villosus шт. ИБК-0276, описується рівнянням параболи II ступеня:

Y2= 0,2 + 4,0286 - 0,19052;

R2=0,953; Fфакт.=20,1; Рфакт.=0,952.

3. для гриба Pleurotus ostreatus шт. ИБК-226 знайдена залежність факторів, яку характеризує рівняння параболи III ступеня:

Y3= 4,8 + 2,730 - 0,992 – 0,003093;

R2=0,999; Fфакт.=905,0; Рфакт.=0,975.

Таким чином, у результати досліджень закономірностей росту на виноградній вичавці дозволили відібрати штам ИБК-226 вищих дереворуйнуючих базидіальних грибів виду Pleurotus ostreatus (Jacq.: Fr.) Kummer.

Розробка біотехнології отримання КБП з виноградних вичавок
і її апаратурного оформлення

Найбільш розповсюдженим і широко описаним у літературі способом вирощування базидіоміцетів на лігноцелюлозних субстратах є поверхневе культивування з обмеженням висоти насипного шару культивуємого середовища. Можливість використання цього способу стосовно виноградної вичавки була оцінена на початковому етапі досліджень.

За умовою багаторазових повторностей, порівнянні технологічних характеристик процесу ТСК і якості цільового продукту були встановлені оптимальні режими стерилізації субстрату у варіанті глибинного культивування: 0,11-0,13 МПа протягом 1 години для вироблення посівного міцелію і поверхневого культивування 0,15-0,18 МПа протягом 2 годин для отримання біомаси грибів.

Ступінь зволоження субстрату оцінювалася в межах гідромодуля 0,5; 1,0; 2,0; 3,0; 4,0 (рис. 2).

Рис. . Вплив міри зволоження вичавки на хімічний склад КБП

Примітка. Кожний розподіл на осі абсцис відповідає гідромодулю: 0,5; 1,0; 2,0; 3,0; 4,0. Заштриховане позначення відповідає
оптимальній величині гідромодулю 2,0.

Встановлено, що оптимальною є міра зволоження вичавки в межах 50-75% за гідромодулем 2,0-3,0.

Згідно даним досліджень з визначення висоти насипної маси субстрату для процесу ТСК базидіоміцетів оптимальна висота його шару 101 cм дисперсністю дрібнення 1,50,5 см, при якій зафіксовано інтенсивний ріст міцелію грибів і максимальне накопичення білка (рис. 3).

Рис.3. Хімічні показники КБП при різній висоті насипного шару вичавки

Примітка. Кожен розподіл на осі абсцис відповідає насипному шару вичавки висотою 4, 6, 8, 10, 12 см. Заштриховане позначення відповідає оптимальній висоті шару вичавки – 10 см.

Результати експериментів свідчать, що швидкість росту біомаси при ТСК базидіоміцетів на вичавці максимальна в межах Т=24-26оС і істотно знижується при досягненні 33оС. Встановлено, що оптимальним температурним режимом є 261оС, яким і користалися в подальших дослідженнях. Поряд з цим відзначено, що базидіальні гриби ростуть в широкому діапазоні рН середовища 2-10, максимальна ж швидкість росту зафіксована при вихідній величині рН 8,5. Отримані нами дані підтверджують тезу про те, що базидіальні гриби здатні в процесі культивування самостійно регулювати рН середовища за рахунок виділення продуктів метаболізму (Даниляк і ін., 1989).

У лабораторних дослідах нами досліджувалася посівна культура базидіальних грибів штаму ИБК-226 у дозі 5% від маси вичавки, що сприяла швидкому росту міцелію. Проте, у виробничих умовах треба було збільшити дозу інокулята до 10%. Практичний дослід одержання КБП показав, що саме доза посівного міцелію 10% від маси субстрату забезпечує інтенсивний розвиток культури і високе накопичення білка грибної біомаси.

З метою стимулювання азотофосфорного харчування базидіоміцетів були проведені досліди з ТСК з внесенням у субстрат діамонійфосфату (ДАФ), а також здрібненої до 10 мм виноградної лози і пшеничної соломи для підвищення дренажних властивостей субстрату. Найкращі результати були отримані при внесенні у вичавку перед стерилізацією 15% соломи в сполученні з 5% ДАФ. Подібна підготовка субстрату сприяла прискореному одержанню КБП за високою концентрацією білка в порівнянні з контролем (табл.3).

Таблиця 3

Вплив азотофосфорного харчування і рослинних добавок на процес ТСК
і хімічний склад КБП

Варіанти
досліду | Термін одержання КБП, діб. | Вміст, %

ПС | лігніну | лі-підів | загаль-ного азоту | сирого протеїну | білка | золи

ЛГ | ВГ

Контроль: субстрат - 100% вичавки | 21 | 8,5 | 9,0 | 42,6 | 3,2 | 1,88 | 11,8±1,16 | 6,2±0,4 | 6,5

1.Субстрат +ДАФ 5% | 17 | 7,0 | 7,5 | 41,8 | 5,0 | 3,42 | 21,4±2,0 | 16,2±0,6 | 4,5

2.Субстрат

+ лоза 15% | 19 | 9,7 | 12,1 | 52,0 | 4,9 | 3,23 | 20,2±1,6 | 16,0±0,5 | 5,2

3.Субстрат +солома 5% | 19 | 8,8 | 10,0 | 43,1 | 5,0 | 3,12 | 19,5±1,4 | 15,5±0,8 | 3,5

4.Субстрат
+ солома 15% | 16 | 7,5 | 8,4 | 33,3 | 5,0 | 3,34 | 20,9±2,0 | 16,8±0,9 | 5,2

5.Субстрат
+ солома 20% | 20 | 9,2 | 10,1 | 45,6 | 4,8 | 3,0 | 18,8±1,5 | 15,8±0,8 | 4,0

6.Субстрат
+ лоза 15 %
+ ДАФ 5% | 19 | 8,4 | 9,1 | 47,2 | 4,1 | 3,26 | 20,4±1,8 | 15,7±0,8 | 5,1

7.Субстрат +солома 15% + ДАФ 5% | 14 | 5,6 | 7,2 | 30,0 | 4,7 | 4,91 | 30,7±2,2 | 20,6±1,0 | 4,5

Примітка. ЛГ- полісахариди, що легко гідролізуються;

ВГ- полісахариди, що важко гідролізуються.

За результатами статистичної обробки даних варіанту 7 значно перевершує усі варіанти досліду.

Встановлені оптимальні параметри були використані в розробці нового способу комбінованої підготовки збагаченого субстрату до процесу біоконверсії в режимі ступеневої вологотермообробки (706050оС) і кислотозниження термотолерантними дріжджами Schizosaccharomyces pоmbe (раса КП-1), що забезпечують прискорене і стабільне одержання якісної грибної біомаси.

Таким чином, встановлені режими і параметри біотехнології виробництва КБП з виноградних вичавок: зволоження 50-75% за гідромодулем 2,0-3,0 або вологотермообробка з кислотозниженням, насипний шар 10±1 см до дисперсності частин 1,5±0,5 см, початкове визначення рН 8,5, температура 26±1оС, внесення в вичавки 15% пшеничної соломи та 5% ДАФ, інокуляція 10% дозою штама ИБК-226 базидіальних грибів виду Pleurotus ostreatus (Jacq.:Fr.) Kummer.

Встановлені режими та параметри біотехнології виробництва КБП з виноградних вичавок були перевірені у виробничих умовах експериментальної лінії, яка змонтована на дослідній базі Євпаторійської фірми "Ампелос" (рис.4).

Рис.4. Апаратурно-технологічна схема виробництва КБП з виноградної вичавки на експериментальній лінії |

Специфікація щодо рис.4

1- підвезення вичавки;

2- перфорований
кошик;

3- дно, яке самостійно розкривається;

4- подача води;

5- електротельфер
0,5 т;

6- автоклав Б6-КАВ-4;

7- контактний манометр;

8- скидання пару;

9- злив води і конденсату; | 10- вікно для подачі вичавки з автоклаву на змішувач;

11- живлення від ел. мережі;

12- вентиль подачі пару;

13- змішувач З-7;

14- бункер змішувача;

15- двері у стерильну зону;

16- обмежувач кошика;

17- бактерицидна лампа ЛБ-15;

18- сходи;

19- тамбур; | 20- подача стерильного повітря вентилятором ВЦ4 через аерозольний фільтр ЛАІК СПВ 3/15;

21- сітчатий лоток;

22- злив у каналізацію;

23- двері до блоку інкубатора;

24- платформа для лотків;

25- інкубатор ІУВ-15;

26- подача води;

27- живлення від ел. мережі.

Приймальні випробування технології виробництва КБП на цій лінії охопили три технологічних цикли ТСК. Отримані партії КБП були апробовані в дослідній годівлі ВРХ на тваринницькій базі радгоспу ім.В.П.Чкалова Бахчисарайського району Криму.

Результати експериментів ТСК базидіоміцетів на виноградній вичавці в поверхневому шарі показали обмеженість можливостей цього способу в плані його промислового втілення. Очевидно, при висоті насипної маси не більш
10 см субстрат мусить бути розподілений на великій площі при забезпеченні раціональних умов за параметрами вологості, температури, стерильності, а також герметичності процесу в біореакторі. Такі умови різко звужують можливості здійснення біоконверсії і вимагають її модифікації.

Як основу подібної модифікації було обрано рідинносубстратне культивування (РСК). Дослідження дозволили обґрунтувати схему проведення процесів РСК і ТСК шляхом механічного і автоматичного здійснення технологічних операцій: одержання посівного міцелію і внесення у вертикальні коаксіальні поверхні твердого субстрату, перемішування субстрату і аерування середовища культивування, усунення надлишкової вологи і газоподібних метаболітів.
Відвід останніх передбачений через витяжну вентиляцію, а в умовах експериментальної лінії – за допомогою зрошувальної системи скруберної установки.

Для контролю процесу розростання міцелію створена і випробувана комп'ютерна система візуального спостереження і спеціальних датчиків АВС "Біотехнологія".

У біореакторі передбачене вивантаження кінцевого продукту з нижнього люка мішалкою. Далі продукт сушать при Т=90-100оС до залишкової вологості 10%, аналізують склад і якість. У випадку зараження біомаси сторонньою мікрофлорою відбракована партія використовується в компостуванні органічного добрива в сполученні з обрізками лози і гребенів (рис.5).

Результати аналізу дослідних партій КБП підтверджують ефективність біоконверсії виноградних вичавок в умовах біореактора (рис.6). Стабільність проходження процесу в ході випробувань підтверджена як у цілому для ферментера, так і його складових частин, що моделюють вузол ТСК, а також вузла культивування мікроорганізмів за АВС "Біотехнологія".

Виробництво КБП з виноградних вичавок повинно здійснюватися відповідно щодо розроблених нами технологічних вимог для процесу біоконверсії. У табл. 4 представлені техніко-технологічні показники дослідно-промислового зразка біореактора і основні параметри його функціонування в процесі конверсії вичавок.

За технічним виконанням і експлуатаційній характеристиці біореактор відповідає вимогам ДСТ 12.2.003-91 "Устаткування виробниче. Загальні вимоги безпеки".

Комісією з проведення виробничих випробувань дослідно-промисловий біореактор рекомендовано для експлуатації, а отримані дані – для використання при розробці серійних зразків.

Рис.6. Конструктивна і функціональна схема дослідно-промислового біореактора

Таблиця 4

Техніко-технологічна характеристика дослідно-промислового біореактора

Показники | Одиниця виміру | Граничне значення

Корисна місткість | дм3 | 80

Габаритні розміри: висота-довжина-ширина-внутрішній діаметр | мм | 1990х840х720х500

Маса | кг | 319,7

Площа, що займається | м2 | 1,95

Швидкість обертання мішалки | об./хв.(С-1) | 8-14 (0,5-1,5)

Потужність двигуна мішалки | квт | 0,25

Тиск пару при стерилізації | мпа (кг с/см2) | 0,15-0,18 (1,5-1,8)

Витрати води за 1 технологічний цикл | м3 | 0,19

Витрати електроенергії термогенератором | квт/год. | 2,88

Маса субстрату, що завантажується | кг | 25±5

Оптимальна вологість субстрату | % / гідромодуль | 50 - 75 / 2

Оптимальна температура середовища ТСК | °С | 26 ± 1

Кількість одержуваної біомаси | % від вихідного субстрату | 80 ± 5

Тривалість ТСК за 1 технологічний цикл | діб. | 15 - 18

Зміни хімічного складу вичавки при отриманні КБП

В процесі ТСК базидіоміцетів на виноградній вичавці відбувається збагачення субстрату за рахунок збільшення в середовищі культивування білка при одночасному зниженні кількості вуглеводів, лігніну і у цілому сухих речовин. Зростання в КБП концентрації амінокислот, у тому числі незамінних, указує на проходження процесу трансформації азотистих речовин у рамках білкового синтезу. Відзначене істотне підвищення кількості лізину, аргініну, проліну, валіну, лейцину, треоніну, фенілаланіну, аспарагінової кислоти.

У складі КБП слід зазначити збільшення вмісту вітаміну Е (- токоферолу) і групи В (тіаміну, рибофлавіну, пірідоксину) при порівняльній сталості концентрації інших.

У підвищенні кормової цінності КБП важливу роль грають мінеральні речовини і мікроелементи, масова концентрація яких у результаті біоконверсії вичавок, за винятком заліза, марганцю, кобальту і цинку, зростає. Подібний ефект, імовірно, зв'язаний з частковим їх концентруванням при деструкції субстрату.

Тенденція щодо зниження вмісту в цільовому продукті більшості жирних кислот (28,5<39,9%) і особливо насичених є позитивний фактор. Концентрація ненасичених жирних кислот (5%), як і нуклеїнових кислот (1,3%), відносно невелика. З погляду фахівців тваринництва (Бартс і ін., 1984; Кушнир, 1990), подібний вміст жирних і нуклеїнових кислот не знижує достоїнства корму (рис.7).

Рис. 7. Вміст основних хімічних компонентів у субстраті (1) і КБП (2)

Приведені дані свідчать, що в процесі ТСК базидіальних грибів виноградна вичавка трансформується в кормовий білковий продукт, збагачений широкою гамою біологічно активних речовин.

Зоотехнічні випробування кормового білкового продукту

З метою перевірки достоїнств одержуваного з виноградних вичавок КБП нами були вироблені дослідні партії в загальному обсязі 1,76 т. Зразки КБП були апробовані в складі комбікормів замість злакових культур у спільних з тваринниками виробничих випробуваннях на експериментальній базі НДІ тваринництва степових районів ім.М.Ф.Іванова "Асканія-Нова" УААН. Перед цим були отримані експертні висновки за результатами токсикологічної (НВО "Гидролізпром", 1990-1991 р., Інститут експериментальної і клінічної ветеринарної медицини УААН, 1996) і зоотехнічної (НДІТ "Асканія-Нова" УААН, 1993 р.) перевірки на придатність КБП у годівлі.

У результаті випробування КБП був визнаний якісно новим високобілковим кормом і рекомендований для використання в щоденному раціоні сільськогосподарських тварин. Дослід згодовування лактуючих корів, вівцематок, молодняку овець і свиней показав, що КБП на перетравність сухої речовини, сирого жиру, клітковини і безазотистих екстрактивних речовин (БЄР) негативно не впливає. Встановлено високий економічний ефект, що дозволяє зберегти адекватну кількість більш високоцінного корму, збільшити продуктивність тварин і жирність коров'ячого молока (табл.5).

Таблиця 5

Вплив КБП на продуктивність лактуючих корів

Показники | Значення показників (х ±tm)

група контролю | група досліду

Валовий надій молока натуральної жирністі, кг | 492 ± 5,1 | 553,5 ± 4,9

Натуральна жирність молока, % | 3,33 ± 0,05 | 3,51 ± 0,06

Валовий надій у перерахунку на
4 % молоко, кг | 409,76 + 10,1 | 485,70 ± 15,1

Середньодобовий надій молока натуральної жирністі, кг | 12,96 | 13,18

Середньодобовий надій у перера-хунку на 4 % молоко, кг | 10,76 | 11,57

У % до контролю | 100 | 107,3

Результати попередніх випробувань слугували основою для проведення розширеного науково-господарського досвіду в 1993-1994 рр. годування КБП молодняку свиней асканійскої м'ясної породи. Кращі показники перетравності протеїну, органічних речовин і золи були відзначені при 5-10% дозах КБП. Ступінь перетравності сирого жиру, сирої клітковини і БЄР при цьому знаходилася на рівні контролю. Переваги дози КБП 5-10% підтвердилися також результатами середньодобового балансу азоту і споживання дослідними тваринами основних мінеральних компонентів.

Аналіз біохімічних показників крові, що характеризують білковий, вуглеводно-жировий і мінеральний обмін в організмі тварин, показав, що використаний у раціоні КБП на фізіологічні норми негативного впливу не має. Відзначено, що продукт біоконверсії вичавок істотно стимулює інтенсивність обміну речовин і процесу кровотворення.

За результатами аналізу фізіологічного стану, перетравності, середньодобового балансу обміну азоту і мінеральних компонентів, була встановлена оптимальна доза КБП – 5-10% від маси комбікорму. На цій підставі розроблена і випробувана нова рецептура комбікорму для молодняку свиней (табл.6).

Таблиця 6

Рецептура комбікорму молодняку свиней

Компоненти | Група | Групи досліду, %

контролю, % | 5 | 10 | 15 | 20

Ячмінь, % | 56,7 | 56,7 | 56,7 | 55,4 | 50,4

Пшениця, % | 13,7 | 8,7 | 3,7 | - | -

Кормовий білковий продукт | - | 5 | 10 | 15 | 20

Пшеничні висівки, % | 13 | 13 | 13 | 13 | 13

Соняшникова лузга, % | 7,6 | 7,6 | 7,6 | 7,6 | 7,6

М'ясокістна мука, % | 8 | 8 | 8 | 8 | 8

Преципітат, % | 0,5 | 0,5 | 0,5 | 0,5 | 0,5

Сіль поварена, % | 0,5 | 0,5 | 0,5 | 0,5 | 0, 5

Вміст в 1 кг:

сухих речовин, г |

860 |

860 |

850 |

850 |

860

сирого протеїну, г | 159 | 171 | 166 | 162 | 167

перетравленого протеїну, г | 137 | 139 | 124 | 123 | 122

сирого жиру, г | 34 | 40 | 44 | 42 | 47

сирої клітковини, г | 60 | 74 | 83 | 116 | 119

золи, г | 41 | 62 | 60 | 59 | 71

кальцію, г | 8,3 | 8,7 | 8,8 | 9,9 | 9,2

фосфору, г | 7,4 | 10,1 | 8,6 | 8,4 | 10,5 | __

калію, г | 6,8 | 6,2 | 6,3 | 6,5 | 6,4

натрію, г | 1,5 | 2,8 | 1,6 | 1,8 | 1,8

Перевага оптимальної дози КБП підтвердилася в процесі випробувань нової рецептури комбікорму результатами росту і продуктивності піддослідного поголів'я (табл.7).

Комісією з представників ПО "Кримрадгоспвинпром", НДІТ "Асканія-Нова" і ІВіВ "Магарач" УААН у результаті дегустації і аналізу був установлений позитивний вплив КБП на забійні, м'ясо-сальні, фізико-хімічні і органолептичні показники продукції свиней асканійскої м'ясної породи, а загальні дегустаційні оцінки дослідних зразків виявилися вище контрольних.

Таблиця 7

Динаміка приросту живої маси свиней за період випробувань

Показники | Група
контролю, % | Групи досліду, %

5 | 10 | 15 | 20

Жива маса:

на початку досліду, кг |

52,5 |

52,1 |

51,9 |

52,0 |

52,3

наприкінці досліду, кг | 98,0 | 105,0 | 101,0 | 94,0 | 96,5

у % до контролю | + 7,1 | + 3,1 | - 4,1 | -1,5

Середньодобовий приріст, | 495 | 575 | 533 | 457 | 480

у % до контролю | +16,0 | + 8,0 | - 8,0 | - 3,0

Абсолютний приріст, кг | 45,5 | 52,9 | 49,1 | 42,0 | 44,2

у % до контролю | - | 116,3 | 107,9 | 92,3 | 97,1

У ході випробувань були вивчені економічні аспекти дослідної годівлі. Дані кормових витрат на 1 голову тварини свідчать про ефективність внесення КБП у раціоні замість фуражних кормових культур. Використання 5-10% дози визволяє зекономити