НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ ФІЗІОЛОГІЇ РОСЛИН ТА ГЕНЕТИКИ

Охріменко Світлана Михайлівна

УДК 581.557.631.84

СИМБІОТИЧНІ ВЛАСТИВОСТІ, ФОТОСИНТЕЗ ТА ПРОДУКТИВНІСТЬ

РОСЛИН ГОРОХУ, ІНОКУЛЬОВАНИХ СТІЙКИМИ ДО МІНЕРАЛЬНОГО

АЗОТУ КЛОНАМИ БУЛЬБОЧКОВИХ БАКТЕРІЙ

03.00.12 – фізіологія рослин

Автореферат дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Київ - 2000

Дисертацією є рукопис

Робота виконана в Інституті фізіології рослин і генетики

НАН України

Науковий керівник: доктор біологічних наук, професор,

Старченков Юхим Полікарпович

Інститут фізіології рослин та генетики

НАН України, завідувач відділу

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор

Головко Ераст Анатолійович

Центральний ботанічний сад

Ім. М.М.Гришка НАН України

Завідувач відділу

Кандидат біологічних наук,

Малиновська Ірина Михайлівна

Інститут землеробства УААН,

Старший науковий співробітник

Провідна установа: Національний аграрний університет

Захист відбудеться 14 квітня 2000 р. о 12 годині на

засіданні спеціалізованої вченої ради Д. 26.212.01 Інституту

фізіології рослин і генетики НАН України за адресою: 03022,

м. Київ-22, вул. Васильківська 31/17.

З дисертацією можна ознайомитися у бібліотеці Інституту

фізіології рослин і генетики НАН України.

Автореферат розісланий 13 березня 2000 р.

Вчений секретар

Спеціалізованої вченої ради Труханов В.А.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Азот є одним з основних елементів мінераль---ного живлення рослин, а тому азотним добривам за характером їх впливу на врожай належить провідна роль серед інших видів добрив. Проблема азотного живлення не може бути вирішена тільки за рахунок хімічної промисловості, в значній мірі вона повинна вирішуватись при допомозі азотфіксаторів, тобто біологічним шляхом (Прянишников Д.Н.1945). Засвоєння азоту біологічним шляхом має велике народно---господарське значення для вирішення задачі збільшення виробництва харчового і кормового білку, який в наш час є дефіцитом. Основною зернобобовою культурою і важливим постачальником рослинного білку в кліматичних умовах України є горох. Він містить багато цінних поживних речовин, зерно його використовується в харчовій промисло---вості, а кормові сорта переробляються на борошно - цінний концент---рований корм для сільськогосподарських тварин.

Як відомо, гороху властива дуже низька чутливість на інокуля---цію бульбочковими бактеріями. В роботах Доросинського (1973, 1979) і Кожемякова (1981, 1989) це явище пояснюється такими факторами, як наявність в грунті великої кількості спонтанних і часто віру---лентних, але менш ефективних штамів бульбочкових бактерій гороху. Крім цих факторів, негативний вплив на чутливість рослин гороху проявляють залишки азотних мінеральних добрив, що знаходяться в грунті після вирощування таких просапних культур як кукурудза, цукровий буряк, картопля, оскільки останні часто є попередниками гороху.

На протязі багатьох років сільськогосподарські культури виро---щували за інтенсивною технологією із внесенням різні культури під---вищених доз азотних добрив, що привело до зміни мікробних ценозів, появи нових штамів бульбочкових бактерій, які характеризувались більшою вірулентністю, конкурентоздатністю, але меншою ефективніс---тю по відношенню до виробничих штамів бульбочкових бактерій.

Бобово-ризобіальна система гороху - Rhizobium leguminosarum є більш чутлива до впливу азоту при порівнянні з симбіотичними сис---темами інших бобових культур. Літературні дані (Streeter J.G., 1985а, 1985, Waterer J.G., 1993) свідчать про те, що навіть при відносно незначних дозах азоту в середовищі вирощування, спостері---гається пригнічення процесу симбіотичної азотфіксації в рослинах гороху.

У зв'язку з цим актуальною є проблема підвищення рівня симбіо---тичної азотфіксації у рослин шляхом створення і застосування для інокуляції штамів, здатних забезпечувати ефективну азотфіксацію в присутності мінерального азоту в субстраті. Слід відмітити, що в літературі відсутні роботи про бульбочко---ві бактерії гороху, одержані шляхом обробки мутагенами, які здатні утворювати ефективний бобово-ризобіальний симбіоз з рослинами го---роху при підвищеному вмісті азоту в субстраті.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисер---таційна робота виконувалась у відповідності з планами відділу сим---біотичної азотфіксації на 1991 - 1995 рр. по темі "Вивчити меха---нізми фізіолого-генетичних процесів фіксації азоту з метою форму---вання високопродуктивних азотфіксуючих систем бобових рослин" (N держ. реєстрації 01.09.10 019962).

Мета і задачі дослідження. Мета роботи полягала в дослідженні симбіотичних властивостей, фотосинтезу та продуктивності рослин гороху при застосуванні для інокуляції клонів бульбочкових бакте---рій, стійких до мінерального азоту.

Для вирішення цієї мети були поставлені такі завдання:

- одержати клони бульбочкових бактерій гороху, стійкі до під---вищеного вмісту азоту в субстраті, та вивчити їх симбіотичні влас---тивості;

- дослідити вплив одержаних клонів на інтенсивність фотосинте---зу, темнового дихання, накопичення азоту і пігментівв рослинах го---роху;

- вивчити вплив нових клонів на продуктивність та якість зерна гороху.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше методом хімічно---го мутагенезу одержані стійкі до підвищеного вмісту азоту клони бульбочкових бактерій гороху на основі виробничого штаму Rhizobium leguminosarum bv. viciae 250а.

Дослідні клони бульбочкових бактерій в присутності азоту в субстраті проявляють покращену вірулентну, азотфіксуючу активність і ефективність при порівнянні з вихідним штамом 250а.

Встановлено, що клони М-1 і М-4 та їх ізоляти із бульбочок рослин гороху, інокульованих даними клонами, показують підвищені симбіотичні властивості по відношенню до контролю (вихідного штаму 250а) на середовищах з 1,2 норми азоту по Гельрігелю, що свідчить про наслідуємість одержаних властивостей і дає можливість вважати ці клони мутантами.

Інокуляція одержаними клонами бактерій підвищує інтенсивність фотосинтезу і темнового дихання рослин.

Застосування нових клонів бактерій збільшує вміст азоту і піг---ментів на протязі вегетації в рослинах гороху.

Симбіотична система рослин гороху і стійких до азоту клонів бульбочкових бактерій характеризується більш інтенсивним процесом утворення біомаси і покращеною якістю зерна.

Цінність досліджень. Отримані результати досліджень дозволяють стверджувати можливість одержання ефективних стійких до підвищено---го вмісту азоту клонів бульбочкових бактерій гороху методом хіміч---ного мутагенезу і дають уявлення про вплив їх на фізіологічні про---цеси і продуктивність рослин, вирощених в присутності азоту в субстраті. Дослідні клони бактерій можуть бути об'єктами в модель---них системах бобові рослини - ризобії для вивчення процесів стій---кості симбіозу до мінерального азоту, розпізнавання партнерів при утворенні симбіозу і функціонування симбіотичної системи. Одержані клони також можуть бути рекомендовані для розробки і виготовлення препаратів бульбочкових бактерій, які забезпечували б максимальне використання біологічного азоту і одержання екологічно чистої про---дукції.

Особистий внесок здобувача. Дисертант особисто проробила від---повідну літературу та оволоділа необхідними методами досліджень, брала участь у плануванні дослідів, підготовці матеріалів до друку в наукових журналах. Матеріали дисертаційної роботи одержано здо---бувачем самостійно.

Апробація результатів дисертації. Результати досліджень були представлені на Республіканській конференції, присвяченій пам'яті чл. кор. АН УРСР Манорика А.В. (Тернопіль, 1991); доповідались і обговорювались на конференції молодих вчених "Актуальные проблемы физиологии растений и генетики" (Киев, 1992), а також на конферен---ції молодих вчених "Актуальні проблеми фізіології рослин і генети---ки", присвяченій 50-й річниці з дня заснування Інституту фізіоло---гії рослин і генетики НАН України (Київ, 1996).

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 6 робіт, у тому числі 3 статті у провідних фахових виданнях.

Структура та обсяг дисертації. Дисертація складається із пере---ліку умовних скорочень, вступу, шести розділів основної частини, заключення, висновків, списку використаних джерел. Робота викладе---на на 174 сторінці машинописного тексту, з них 50 сторінок займа---ють 43 таблиці та 7 ілюстрацій. Список використаних у роботі літе---ратурних джерел містить 271 найменування, в тому числі 137 зару---біжних, загальним обсягом 33 сторінки.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

У вступній частині обгрунтована актуальність проблеми, подано коротку характеристику роботи, цінність роботи та апробацію ре---зультатів досліджень.

В першому розділі представлений огляд вітчизняної та зарубіж---ної літератури по впливу мінерального азоту на процес симбіотичної азотфіксації у бобових рослин, методах одержання бактерій з новими властивостями та взаємозв'язку основних фізіологічних процесів з фіксацією атмосферного азоту.

Другий розділ включає об'єкти і методи досліджень. Досліди проводились протягом 1992 - 1994 рр. на спеціально обладнаному ве---гетаційному майданчику Інституту фізіології рослин і генетики НАН України. Об'єктами досліджень були горох (Pisum sativum L.) сорту Солара, бульбочкові бактерії гороху (Rhizobium leguminosarum bv. viciae) штаму 250а, клони бактерій, стійкі до підвищеного вмісту азоту в субстраті, та ізоляти клонів М-1 і М-4 із бульбочок рослин гороху, інокульованих даними клонами. Як мутаген використовували етилметансульфонат (ЕМС) - С2Н5ОSO2CH3. Обробку бактерій проводили по методиці, розробленій у ВНДІСГМ. Життєздатність клонів виражали в процентах колоній, які виросли в розсіві обробленої суспензії клітин, до числа колоній, які виросли в розсіві необробленої сус---пензії.

Клони відбирали за ознакою бульбочкоутворення в умовах мікро---вегетаційних дослідів в піщаній культурі. В дослідах використову---вали посудини на 0,5 кг з промитим стерильним піском, куди вносили 0,2 або 1,2 норми азоту та інші мінеральні елементи по 1,0 нормі за Гельрігелем. Титр суспензії бактерій для інокуляції становив 10я59 я0кл/мл. Досліди проводили в 4-кратній повторності. Для подаль---шої роботи відбирали клони бактерій, які утворювали найбіль кількість бульбочок, після 30 діб вегетації.

Ефективність відібраних клонів бактерій та вплив їх на хід фі---зіологічних процесів в рослинах вивчали в умовах вегетаційних до---слідів в піщаній і грунтовій культурах. В субстраті вирощування рослин містилось 1,2 норми азоту та інших мінеральних елементів в дозі 1,0 норми за Гельрігелем. Простерілізоване 70 % - ним етило---вим спиртом і промите стерильною водою насіння гороху інокулювали відібраними клонами бактерій. Оптичну густину суспензії бактерій вимірювали на спектрофотометрі СФ-26 при довжині хвилі 560 нм, ін---фекційне навантаження всіх дослідних клонів і штаму складало 109 кл/мл. В схему досліду були включені контрольні варіанти - без інокуляції (абсолютний контроль) і з обробкою насіння суспензією бульбочкових бактерій штаму 250а (контроль) та інокуляція окремими одержаними клонами бактерій. Повторність досліду шестикратна. В кожній посудині після проривки залишали по п'ять рослин. Ефектив---ність клонів визначали по масі сухої речовини надземної частини і коренів на протязі вегетації та по масі зерна і його якості. Про---водилось дослідження динаміки утворення і наростання кореневих бульбочок гороху та вивчення їх азотфіксуючої активності по від---новленню ацетилену в етилен за методом Харді [Hardy R.W.F. еt al., 1968] на газовому хроматографі "Chromatograph - 504".

Азотфіксуючу активність виражали в наномолях утвореного етиле---ну на рослину за годину.

Інтенсивність фотосинтезу та дихання вимірювали за допомогою включеного по диференційній схемі оптико-акустичного газоаналіза---тора ГІАМ - 5 [Киризий Д.А., 1981]. Вміст загального азоту визна---чали методом К'єльдаля в модифікації Чмельової і Тютєревої [Плеш---ков Б.П., 1985]. Вміст хлорофілу визначали спектрофотометричним методом [Починок Х.Н., 1976]. Процентний вміст білку вираховували шляхом множення показника вмісту азоту на коефіціент 5,7 [Петер---бургский А.В., 1968].

При вивченні впливу клонів бактерій на інтенсивність фізіоло---гічних процесів в рослинах гороху зразки для аналізів відбирали в фазах 6-8 листків, бутонізації, цвітіння і утворення бобів. Ста---тистична обробка даних проведена за Доспєховим (1985).

У третьому розділі "Реакція бульбочкових бактерій на дію ЕМС і симбіотичні властивості одержаних клонів бульбочкових бактерій го---роху" показано, що життєздатність бульбочкових бактерій гороху штаму 250а на бобовому агарі залежить від дози мутагену: зі збіль---шенням дози відбувається зниження числа клітин, що вижили. Так, найбільший процент життєздатності бактерій (39,48 %) відмічено при обробці самою низькою концентрацією ЕМС (0,5 %). У варіанті з най---більшою концентрацією мутагену - 3,0 % спостерігався найнижчий ступінь життєздатності - 1,18 %. Встановлено, що процент життє---здатності бульбочкових бактерій гороху, не оброблених мутагеном, знижується в залежності від концентрації мінерального азоту в се---редовищі росту культур, а обробка мутагеном сприяє збільшенню жит---тєздатності ризобій на цих середовищах.

Внаслідок проведеної серії дослідів було відібрано 540 клонів, здатних утворювати колонії в присутності підвищеної дози азоту ---мМ/л. Після 4-5 пасажів здатність до росту і утворення колоній зберігається у 79,5 %. Попередня оцінка вірулентності цих бактерій проведена в умовах мікровегетаційного досліду при підвищеному вмісті мінерального азоту в субстраті. Встановлено, що із дослід---жених клонів 22 % не утворювали бульбочок, 54 % клонів утворювали 3-20 бульбочок на рослину на 30-у добу вирощування і тільки у 24 % клонів кількість утворених бульбочок досягала 15-40 на рослину, які й були використані в наших експериментах.

Дані вегетаційних дослідів (табл. 1) свідчать, що на варіантах з одержаними клонами спостерігалось більш інтенсивне протікання процесу бульбочкоутворення на протязі онтогенезу при порівнянні з контрольними варіантами, де утворювались дрібні, неактивні буль---бочки в невеликій кількості. Найбільша маса бульбочок на рослину на протязі вегетації спостерігалась в фазі бутонізації і перевищу---вала в середньому в 2-3 рази масу бульбочок контрольних рослин.

Згідно даним по нітрогеназній активності (табл. 2), досліджу---вані клони бульбочкових бактерій здатні активно фіксувати атмос---ферний азот в симбіозі з рослинами гороху, які вирощувались на підвищеному фоні азоту в піщаній культурі. В умовах грунтової культури спостерігалось також збільшення інтенсивності процесу азотфіксації при застосуванні дослідних клонів бактерій. В конт---рольних варіантах азотфіксуюча активність була відсутня або не---значна.

Вивчався вплив клонів бактерій М-1, М-3 і М-4 на інтенсивність процесу азотфіксації при різних дозах нітратного азоту в субстраті (0,2 норми і 1,2 норми азоту по Гельрігелю). В варіантах з засто---суванням клонів спостерігалось збільшення кількості і маси бульбо---чок при порівнянні з інокуляцією штамом 250а . Інокуляція дослід---ними клонами сприяла значному підвищенню ацетиленвідновлюючої ак---тивності при 0,2 нормах азоту. На середовищі з внесенням 1,2 норми азоту в контрольних варіантах бульбочки не утворювались, тоді як дослідні клони виявили вірулентну і азотфіксуючу активність. При даній нормі азоту найбільші показники симбіотичної активності від---мічені при застосуванні клону М-1. Інокуляція одержаними клонами приводить до збільшення інтенсивності прирісту біомаси при різних рівнях азотного живлення. Більш ефективними були клони М-1 і М-4.

Проводились досліди по впливу умов вирощування ризобій в чис---тій культурі на бульбочкоутворення рослин гороху. Показано, що бульбочкові бактерії, які вирощували на живильних середовищах з підвищеним вмістом азоту в чистій культурі, знижують здатність до бульбочкоутворення, що, можливо, пов'язано з порушенням біосинтезу позаклітинних вуглеводів (Косенко Л.В., 1995).

Для вивчення наслідуємості симбіотичних властивостей одержаних клонів проводили досліди із вихідним штамом 250а, клонами М-1 і М-4 та ізолятами даних клонів із бульбочок рослин гороху. Як свід---чать дані досліду, клони М-1 і М-4 та їх ізоляти із бульбочок рос---лин гороху проявляють підвищені симбіотичні властивості по відно---шенню до контролю (вихідного штаму 250а) на середовищах з 1,2 нор---ми азоту по Гельрігелю, а також є більш ефективними по відношенню до контролю (вихідного штаму 250а), що показує спадковий характер симбіотичних властивостей клонів і дає можливість вважати ці клони мутантами.

Таким чином, клони бульбочкових бактерій гороху, одержані ме---тодом обробки їх етилметансульфонатом, які вирощували на живильно---му середовищі з підвищеним вмістом азоту, здатні утворювати сим---біотичну систему з рослинами гороху, яка фіксує азот в присутнос---ті цього елементу в середовищі росту.

Четвертий розділ "Інтенсивність вуглекислотного газообміну рослин гороху при інокуляції дослідними клонами бактерій" містить результати вегетаційних дослідів, які показують вплив одержаних клонів на інтенсивність фотосинтезу, вміст пігментів і на дихальну активність рослин на протязі вегетаційного періоду. Так, на варі---антах з інокуляцією клонами бактерій спостерігалась більш висока інтенсивність фотосинтезу на протязі онтогенезу при порівнянні з контрольним варіантом, інокульованим штамом 250а (табл. 3). Серед вивчених клонів найбільшою активністю фотосинтезу на протязі онто---генезу виділявся варіант з інокуляцією клоном М-1, на ньому спос---терігалась також більш активна фіксація молекулярного азоту, що свідчить про тісний зв'язок цих двох фізіологічних процесів. Іно---куляція рослин гороху стійкими до підвищеного вмісту мінерального азоту клонами бульбочкових бактерій сприяє збільшеню інтенсивності фотосинтезу також при розрахунку в мг СО2 на грам сухої речовини за годину на протязі вегетаційного періоду.

Дослідження вмісту хлорофілу в онтогенезі рослин гороху пока---зали, що в фазі бутонізації вміст хлорофілу "a" в варіантах з іно---куляцією клонами бактерій був вищий, порівнюючи з вмістом в конт---рольних рослинах на 17,2 - 34,2 %. Більш значне накопичення піг---ментів при розрахунку на рослину відмічалось в фазі утворення бо---бів. Дослідні рослини в цю фазу мали хлорофілу "а" і "в" на 12,1 ---,8 % більше у порівнянні з контролем. Більш інтенсивно накопичу---вали хлорофіл на протязі вегетації рослини, інокульовані клонами М-4 і М-6. На цих варіантах спостерігалась також максимальна ак---тивність азотфіксації (табл. 2), що підтверджує існування позитив---ного зв'язку цих двох процесів. Застосування одержаних клонів при---водило також до збільшення вмісту пігментів при розрахунку на грам сухої речовини на протязі вегетації. Проведений кореляційний ана---ліз даних інтенсивності фотосинтезу і вмісту хлорофілів "a" і " в" виявив існування значного позитивного зв'язку в фазі бутонізації (r = 0,90).

Одержані дані по впливу досліджуваних клонів бульбочкових бак---терій на інтенсивність темнового дихання, яке поруч з фотосинте---зом і азотфіксацією є важливим елементом продукційного процесу рослин, показали, що на варіантах з інокуляцією клонами спостері---галось підвищення дихальної активності рослин в онтогенезі при по---рівнянні з контролем в розрахунку на рослину, особливо на варіан---тах із застосуванням клонів М-1 і М-2 (табл. 3). Аналогічна тен---денція спостерігалась і при розрахунку на грам сухої речовини.

Таким чином, одержані дані свідчать, що інокуляція гороху но---вими клонами бульбочкових бактерій сприяє підвищенню інтенсивності фотосинтезу, темнового дихання і вмісту пігментів в рослинах горо---ху.

У п'ятому розділі "Вплив стійких до підвищеного вмісту міне---рального азоту клонів бульбочкових бактерій на нагромадження за---гального азоту в надземній частині рослин гороху на протязі веге---таційного періоду" встановлено, що дослідні клони бульбочкових бактерій позитивно впливали на вміст азоту в надземній масі в пе---ріод їх вегетації (табл. 4). Так, рослини, інокульовані клонами М-1, М-2, М-3 і М-4, в фазі бутонізації містили його відповідно 3,24; 3,07; 3,01 і 2,98 %. В контрольних рослинах, інокульованих штамом 250а, азоту було 2,78 %, в рослинах абсолютного контролю (без інокуляції) - 2,74 %. В фазі утворення бобів досліджувані рослини мали азоту більше по відношенню до контролю на 12,4 ---,2 %. Аналогічні дані одержані нами і в умовах наступного дос---ліду. Максимальний вміст азоту спостерігався в фазі бутонізації, рослини, інокульовані клонами містили більше азоту при порівнян---ні з контролем на 4,17 - 15,48 %. Кореляційний аналіз даних по---казує присутність значної позитивної залежності в фазі бутонізації між процесами азотфіксації і накопиченням азоту в надземній части---ні (r = 0,93), між вмістом хлорофілів і накопиченням азоту (r = 0,93), а також між процесом фотосинтезу і накопиченням азоту (r = 0,89).

Шостий розділ "Продуктивність рослин гороху, оброблених дос---лідними клонами бульбочкових бактерій, при підвищеному вмісті мі---нерального азоту в середовищі вирощування" включає вегетаційні дослідження по впливу клонів бактерій на інтенсивність утворення біомаси рослин гороху і на масу зерна рослин гороху та його якість. В результаті підвищення інтенсивності фізіологічних проце---сів в рослинах під впливом дослідних клонів збільшувалось утворен---ня надземної маси рослин на протязі вегетаційного періоду (табл. 4). Більш інтенсивний приріст надземної маси в фазі бутонізації , порівнюючи з контролем, спостерігався в рослинах, інокульованих клонами М-4, М-5 і М-6, прибавка маси по даному показнику відпо---відно складала 38,3 %, 32,7 % і 40,8 %. Інтенсивність приросту біомаси надземної частини в неінокульованих рослинах на протязі вегетаційного періоду була дещо нижча відносно контрольних рос---лин, інокульованих штамом 250а.

Наростання кореневої системи на протязі вегетації було менш інтенсивним і в меншій мірі розрізнялось по варіантам при порів---нянні з надземною масою. Отже, співвідношення сухих речовин над---земної маси і коренів на протязі вегетації збільшувалось. Згідно даним вегетаційного досліду, проведеного в умовах грун---тової культури, всі досліджувані клони, як і в піщаній культурі, сприяли підвищенню інтенсивності утворення біомаси в період веге---тації. Більш позитивний ефект був при інокуляції клонами М-1 і М-4.

Аналіз результатів досліджень (табл. 5) дозволяє зробити ви---сновок про позитивний вплив одержаних клонів на масу зерна рослин гороху і його якість. Встановлено, що під впливом клонів М-1, М-2 і М-4 маса зерна на рослину в середньому за два роки по відношенню до контролю, підвищувалась на 26,9 - 29,8 %, вміст білку в зерні ---на 7,0 - 10,9 %. Більш помітний вплив на масу зерна і вміст білку спостерігався в рослинах з інокуляцією клоном М-4, прибавка при порівнянні з контролем складала відповідно 29,8 % і 10,9 %.

Таким чином, результати досліджень дають підставу стверджувати про можливість одержання ефективних стійких до підвищеного вмісту азоту клонів бульбочкових бактерій методом хімічного мутагенезу із застосуванням етилметансульфонату, і вперше показати вплив цих клонів на фізіологічні процеси і продуктивність рослин, які куль---тивувались в присутності мінерального азоту.

ВИСНОВКИ

1. Вперше методом хімічного мутагенезу одержані клони бульбоч---кових бактерій гороху, здатні утворювати ефективний бобово-ризобі---альний симбіоз з рослинами гороху, вирощуваних при підвищеному вмісті мінерального азоту.

2. Одержані клони мають покращену вірулентну і азотфіксуючу активність при порівнянні з вихідним штамом 250а в присутності мі---нерального азоту в середовищі вирощування.

3. Клони М-1, М-4 та ізоляти даних клонів із бульбочок рослин гороху, проявляють підвищені симбіотичні властивості по відношенню до контролю на середовищах з 1,2 норми азоту по Гельрігелю. Отже, властивість клонів підвищувати інтенсивність симбіотичної азотфік---сації є спадковою, що дає можливість вважати ці клони мутантами.

4. Дослідні клони бактерій підвищують інтенсивність фотосинте---зу на 7,2 - 66,8 %, дихальну активність на 8,4 - 54,2 %, вміст хлорофілів "a+в" на 6,1 - 47,4 % при порівнянні з контрольними ва---ріантами.

5. Інокуляція новими клонами бактерій сприяє зростанню інтен---сивності нагромадження азоту в рослинах гороху на 3,3 - 20,4 % на протязі онтогенезу.

6. Застосування одержаних клонів бактерій при внесенні міне---рального азоту збільшує наростання надземної частини на 5,5 ---,0 %, масу зерна на рослину - на 22,8 - 29,8 %, вміст білку в зерні на 7,0 - 10,9 %.

СПИСОК ОПУБЛІКОВАНИХ ПРАЦЬ

1. Мандровская Н.М., Охрименко С.М., Старченков Е.П. Симбиоти---ческие свойства клубеньковых бактерий гороха, образующих клубеньки на фоне повышенного содержания минерального азота // Физиология и биохимия культурных растений. - 1994. - т. 26, N 3. - С. 240 - 245.

2. Мандровская Н.М., Охрименко С.М., Киризий Д.А., Старченков Е.П. Влияние инокуляции азотустойчивымы клонами клубеньковых бак---терий на интенсивность фотосинтеза и азотфиксации у гороха // Фи---зиология и биохимия культурных растений. - 1995. - т. 27, N 3. ---С. 169 - 173.

3. Охріменко С.М. Вплив клонів бульбочкових бактерій, стійких до мінерального азоту, на фізіологічні процеси і продуктивність рослин гороху // Физиология и биохимия культурных растений. ---. - т. 30, N 2. - С. 138 - 143.

4. Мандровская Н.М., Охрименко С.М. Влияние минерального азота на жизнедеятельность клубеньковых бактерий в чистой культуре // Тез. докл. конф. "Биологическая фиксация молекулярного азота и азотный метаболизм бобовых растений". - Киев, 1991. - С. 44.

5. Охрименко С.М. Использование этилметансульфоната для полу---чения клонов клубеньковых бактерий гороха, устойчивых к высоким дозам азота // Конференция молодых учсных "Актуальные проблемы фи---зиологии растений и генетики", Киев, 26-28 мая 1992 г.: Тез. докл. - К.: ИФРГ НАН Украины, 1992. - С. 46.

6. Охріменко С.М. Вплив азотстійких клонів бульбочкових бакте---рій гороху на інтенсивність деяких фізіологічних процесів в росли---нах гороху // Конференція молодих вчених "Актуальні проблеми фізі---ології рослин і генетики", Київ, 9-11 жовтня 1996 р.: Тези доп. ---К.: ІФРГ НАН України, 1996. - С. 26.

АНОТАЦІЯ

Охріменко С.М. Симбіотичні властивості, фотосинтез та продук---тивність рослин гороху, інокульованих стійкими до мінерального азоту клонами бульбочкових бактерій. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.12 - фізіологія рослин. - Інститут фі---зіології рослин і генетики НАН України, Київ, 2000.

Дисертацію присвячено одержанню клонів бульбочкових бактерій гороху, вивченню їх здатності до утворення симбіозу в присутності підвищеного вмісту мінерального азоту в субстраті вирощування рос---лин і впливу їх на основні фізіологічні процеси рослин гороху. Вперше методом хімічного мутагенезу одержані клони бульбочкових бактерій гороху, які утворюють ефективний симбіоз з рослинами го---роху при даних умовах, що дає підставу вважати ці клони бактерій стійкими до підвищеного вмісту мінерального азоту.

В умовах вегетаційних дослідів (піщана і грунтові культури) вивчено вплив одержаних клонів бульбочкових бактерій гороху на ін---тенсивність фізіологічних процесів в рослинах гороху сорту Солара, які вирощувались на підвищеному фоні азоту (1,2 норми по Гельріге---лю) в субстраті. Показано, що передпосівна інокуляція зерна гороху дослідними клонами сприяла збільшенню інтенсивності процесів буль---бочкоутворення, азотфіксації, фотосинтезу, темнового дихання, на---ростання біомаси, нагромадження в ній азоту і пігментів, підвищен---ню маси і якості зерна рослин гороху.

Ключові слова: стійкі до підвищеного вмісту мінерального азоту клони бульбочкових бактерій гороху, симбіоз, інтенсивність фізіо---логічних процесів.

АННОТАЦИЯ

Охрименко С.М. Симбиотические свойства, фотосинтез и продук---тивность растений гороха, инокулированных устойчивыми к минераль---ного азоту клонами клубеньковых бактерий. - Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологичес---ких наук по специальности 03.00.12 - физиология растений. - Инсти---тут физиологии растений и генетики НАН Украины, Киев, 2000.

Дисертация посвящена получению клонов клубеньковых бактерий гороха, изучению их способности к образованию симбиоза в присутс--- твии повышенного содержания минерального азота в субстрате выращи--вания растений и влиянию их на основные физиологические процессы растений гороха. Впервые методом химического мутагенеза получены клоны клубеньковых бактерий гороха с такими свойствами, что даст основание эти клоны бактерий считать устойчивыми к повышенному со---держанию минерального азота.

Установлено, что жизнеспособность клубеньковых бактерий гороха штамма 250а на бобовом агаре зависит от дозы мутагена: при увели---чении дозы происходит снижение числа выживших клеток. В результате проведенной серии опытов было отобрано 540 клонов, способных обра---зовывать колонии в присутствии повышенной дозы азота - 50 мМ/л. После 4-5 пассажей способность к росту и образованию колоний со---хранялась в 79,5 %. Предыдущая оценка вирулентности этих бактерий проведена в условиях микровегетационного опыта в субстрате. Уста---новлено, что из опытных клонов 24 % клонов образовывали 15-40 клу---беньков на растение, эти бактерии и были использованы в наших по---следующих экспериментах.

В условиях вегетационных опытов (песчаные и почвенные культу---ры) изучено влияние полученных клонов на интенсивность физиологи---ческих процессов в растениях гороха сорта Солара, которые выращи---вались на повышенном фоне азота (1,2 нормы по Гельригелю) в субс---трате. Данные свидетельствуют, что на вариантах с полученными кло---нами наблюдается более интенсивное протекание процесса клубенько---образования на протяжении онтогенеза при сравнении с контрольными вариантами, где образовывались мелкие, неактивные клубеньки в не---большом количестве. Опытные клоны бактерий более активно фиксиро---вали атмосферный азот в симбиозе с растениями гороха, В контроль---ных вариантах азотфиксирующая активность отсутствовала или была незначительной. Инокуляция полученными клонами бактерий увеличива---ла интенсивность азотфиксации и образование биомассы не только при повышенном содержании азота (1,2 нормы ), но и при низкой концент---рации азота (0,2 нормы). Обнаружено, что клоны М-1, М-4 и изоляты данных клонов из клубеньков растений гороха проявляют повышенные симбиотические свойства по отношению к контролю (исходному штамму 250а), что свидетельствует о наследуемости полученных свойств и дает возможность считать эти клоны бактерий мутантами. На вариан---тах с инокуляцией клонами наблюдалася более высокая интенсивность фотосинтеза при расчете в мг СО2 на растение за час и в мг СО2 на грамм сухого вещества за час. Применение клонов приводило также к увеличению содержания пигментов на протяжении вегетации. Опытные клоны повышают дыхательную активность растений в онтогенезе при сравнении с контролем. Установлено, что инокуляция полученными клонами увеличивает содержание азота в надземной массе в период их вегетации. Максимальное содержание азота наблюдалось в фазу буто---низации. Растения, инокулированные клонами содержали больше азота при сравнении с контролем на 4,17-15,48 %. Обнаружено, что в ре---зультате повышения интенсивности физиологических процессов в рас---тениях под влиянием клонов увеличивалось образование надземной массы и корней растений на протяжении вегетационного периода как в песчаной, так и в почвенной культурах. Наиболее положительный эф---фект был при инокуляции клонами М-1, М-4, М-6. Анализ результатов исследований свидетельствует о том, что применение клонов повышает массу зерна растений гороха и улучшает его качество.

Результаты исследований полученных клонов бактерий, по влиянию их на уровень симбиотического питания и интенсивность физиологи---ческих процессов в растениях показывают возможность создания штам---мов клубеньковых бактерий гороха, устойчивых к повышенному содер---жанию минерального азота, с целью максимального использования био---логического азота для выращивания экологически чистой продукции. Опытные клоны могут быть объектами в модельных системах бобовые растения - ризобии для изучения процессов устойчивости симбиоза к минеральному азоту, распознавания партнеров при образовании симби---оза и функционирования симбиотической системы.

Ключевые слова: устойчивые к повышенному содержанию минераль---ного азота клоны клубеньковых бактерий гороха, симбиоз, интенсив---ность физиологических процессов.

ANNOTATION

Oкhrimenko S.M. Symbiotic properties, photosyntesis and productivity of pea plants, inoculated with clones of nodule bacteria, resistant to mineral nitrogen. - Manuscript.

The thesis for Ph. D. degree (Biology), speciality 03.00.12 --physiology. - Institute of Plant Physiology and Genetics, National Academy of Sciences of Ukraine, Kyiv, 2000.

The thesis is devoted to the reception of pea nodule bacterium clones and to investigating of their ability to create effective symbiosis in the presence of the increased content of combined nitrogen in growth medium. Pea nodule bacterium clones with properti to form effective symbiosis with pea plant under these growth conditions were obtained for the first time owing to chemical mutagene. This indicates gives reason to consider that these clones are resistant to heightened mineral nitrogen content.

The effect of the clones under investigation on the intensity of physiological processes in pea plant (Solara cv) grown against the heightened nitrogen background (1,2 of Gelrigel normal) in the substrate was studied in vegetative experiments (sand and soil cultures). It has been shown that the presowing inoculation of pea grain grown by the above mentioned clones contributted to the increase in the intensity of nodule development, nitrogen fixation, photosynthesis, dark respiration processes, biomass and nitrogen and pigment accumulation, the rise in grain weight and protein contents in it.

Key words: pea nodule bacterium clones, resistant to heightened nitrogen content, symbiosis, intensity of physiological processes.