НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ БІООРГАНІЧНОЇ ХІМІЇ ТА НАФТОХІМІЇ

Казачков Михайло Геннадійович

УДК 541.183:577.15.03

КІНЕТИЧНІ ОСОБЛИВОСТІ ФЕРМЕНТАТИВНОГО ОКИСНЕННЯ

ЛІНОЛЕВОЇ КИСЛОТИ ТА ЛІНОЛЕВОГО СПИРТУ

В ПРИСУТНОСТІ 5-ЛІПОКСИГЕНАЗИ

02.00.10 - біоорганічна хімія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Київ - 2001

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Інституті біоорганічної хімії та нафтохімії НАН України.

Науковий керівник кандидат хімічних наук

Бутович Ігор Анатолійович,

Інститут біоорганічної хімії та нафтохімії НАН України,

завідувач лабораторії хімічної ензимології

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор

Кібірєв Володимир Костянтинович,

Інститут біоорганічної хімії та нафтохімії НАН України,

завідувач відділу хімії білка

доктор біологічних наук, професор

Костерін Сергій Олексійович,

Інститут біохімії ім. О.В.Палладіна НАН України,

завідувач відділу біохімії м'язів

Провідна установа – Київський національний університет імені Тараса Шевченка,

кафедра біохімії

Захист відбудеться 28 вересня 2001 року о 10 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.220.01 в Інституті біоорганічної хімії та нафтохімії НАН України (02094, Київ, вул. Мурманська 1)

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту біоорганічної хімії та нафтохімії НАН України (02094, Київ, вул. Мурманська 1).

Автореферат розісланий 28серпня 2001 року

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради Д.М. Федоряк

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Вивчення молекулярних механізмів ферментативного каталізу є одним з актуальних завдань сучасної біохімії й ензимології. Ліпоксигенази (ЛО) відносяться до групи ферментів, що відіграють важливу роль в регуляції багатьох фізіологічно важливих функцій тваринних та рослинних організмів. Каталізуючи перекисне окиснення поліненасичених жирних кислот (ПНЖК), у складі яких є 1,4-цис,цис-пентадієнові фрагменти, ферменти сімейства ліпоксигеназ займають ключові позиції в біосинтезі ряду біологічно активних сполук, таких як лейкотриєни, ліпоксини, гепоксиліни, та інші похідні ПНЖК із широким спектром дії. В організмах людини та тварин, продукти ліпоксигеназної реакції беруть участь у розвитку багатьох патологічних процесів, серед яких слід зазначити такі як атеросклероз, інфаркт міокарда, алергія, запальні процеси, канцерогенез. У рослинах ЛО метаболіти ПНЖК беруть участь у регуляції росту, диференціації, формуванні генеративних органів, реакціях рослинного імунітету і т.д.

Важливість зазначених процесів обумовлює актуальність вивчення перебігу ліпоксигеназної реакції. Незважаючи на широке розповсюдження ЛО в рослинних та тваринних організмах, механізми каталізу та його регуляції in vivo дотепер багато в чому залишаються не з’ясованими. Таким чином, вивчення, порівняльний аналіз та моделювання кінетичних механізмів 5-ліпоксигеназної реакції в присутності різноманітних субстратів і модуляторів ферментативної активності є вельми актуальною проблемою сучасної біоорганічної хімії. Одним з інформативних підходів до вивчення ферментативних реакцій є створення штучних реакційних систем, що імітують природне мікрооточення ферментів (біоміметичних систем).

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дана робота є розвитком досліджень по вивченню ферментів і метаболітів каскадів поліненасичених жирних кислот рослин, тварин та людини і спрямована на вивчення механізмів дії, регуляції активності та моделювання дії ферментів.

Робота виконувалась згідно з тематикою лабораторії хімічної ензимології ІБОНХ НАН України (тема №2.1.10.25-99в, № держ. реєстрації 009U003956).

Мета і задачі дослідження. Мета роботи полягала в порівняльному аналізі впливу субстратів, які можуть іонізуватись або не спроможні до цього, на перебіг 5-ліпоксигеназної реакції, вивченні кінетичних особливостей цієї реакції, її механізму, та способів регуляції. Для цього необхідно було вирішити наступні задачі:

·

· вивчити роль деяких уловлювачів вільних радикалів (УВР) в реакції окиснення лінолевого спирту (ЛС) в присутності 5-ліпоксигенази з бульб картоплі;

· з'ясувати особливості окиснення ЛС в присутності 5-ліпоксигенази з бульб картоплі.

Об’єктом дослідження є ліпоксигеназний каталіз поліненасичених жирних кислот.

Предмет дослідження - механізм окиснення субстратів які спроможні, та не спроможні до іонізації при фізіологічних значеннях pH, в присутності 5-ліпоксигенази з бульб картоплі.

Методи дослідження. Для визначення якісного і кількісного складу продуктів 5-ЛО в модельних реакційних системах застосовувалися хроматографічні, спектрофотометричні та потенціометричні методи дослідження.

Наукова новизна одержаних результатів. У роботі проведені вивчення і порівняльний аналіз кінетичних параметрів окиснення 5-ліпоксигеназою субстратів, які здатні іонізуватися або, навпаки, не іонізуються при фізіологічних значеннях рН на міцелярних моделях, а також у модельних системах на основі хімічно модифікованого кремнезему. Показано, що карбоксильна група ПНЖК у ході реакції 5-ліпокси-геназного окиснення виконує функції донора протонів, формує негативний заряд необхідної щільності, та потрібна для правильної орієнтації субстрату в активному центрі ферменту. Вперше проведене дослідження кінетичних механізмів окиснення лінолевого спирту 5-ліпоксигеназою і вплив 4-гідрокси-2,2,6,6-тетраметилпіперідин-N-оксиду (4-гідрокси-ТЕМПО) на перебіг цієї реакції. Встановлено, що 5-ліпоксигеназна реакція може супроводжуватись формуванням великої кількості неспецифічних продуктів вільнорадикальних реакцій, які ініціюються ферментом. Встановлено, що 5-ЛО з картоплі в міцелярній системі виявляє позитивну кооперативність по субстрату - лінолевому спирту. Додецилсульфат натрію (ДДС) та природна амфіфільна сполука - фосфатидна кислота підвищують стаціонарну швидкість реакції окиснення лінолевого спирту 5-ЛО (максимальний ступінь активації - 200 і 6 разів). При поступовому збільшенні концентрації активатора, відбувається заміщення субстрату в алостеричному центрі ферменту на молекули ДДС. У присутності активатора з молекулою ферменту зв'язуються від двох до трьох молекул лінолевого спирту.

Практичне значення одержаних результатів. Одержані результати розширюють наші уявлення про механізм функціонування унікальних ферментів ліпідного обміну - ліпоксигеназ. Це дозволяє використовувати отримані дані, а також запропоновані модельні системи, для вивчення дії нових регуляторів ферментів in vitro з метою створення потенційних лікарських засобів, що могли б бути використані при патологічних станах організму, зв'язаних із зміною рівня ліпоксигеназних метаболітів та їх похідних (лейкотриєни і т.д.), і при подальшій оптимізації методики синтезу, для напівпрепаративного отримання продуктів реакції 5-ліпоксигеназного окиснення. Формування великої кількості неспецифічних продуктів вільнорадикальних реакцій необхідно приймати до уваги при вивченні фізіологічної ролі ліпоксигеназних метаболітів у регуляції різноманітних біологічних процесів в клітинах рослин, тварин та людини.

Особистий внесок здобувача. Експериментальна частина роботи, обробка, аналіз отриманих даних, встановлення механізмів реакцій та формулювання висновків дисертаційної роботи виконані особисто дисертантом. Матеріали дослідів, що опубліковані в статтях із співавторами та увійшли до дисертації, одержані за безпосередньою участю дисертанта. Частину експериментальних досліджень проведено у співпраці з The Pennsylvania State University (USA).

Апробація результатів дисертації. Результати роботи доповідались на конференціях FEBS (Барселона, червень 1996 та вересень 1997), конференції “Life and Death of Cell” (Единбург, серпень 1996), ІX та XI наукових конференціях з біоорганічної хімії та нафтохімії (Київ, 1997 і 1999 рр.), 11 конференції “Advances in Prostaglandin and Leukotriene Research: Basic Science and New Clinical Applications” (Флоренція, червень 2000).

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 3 статті у фахових наукових журналах та 3 тези доповідей на міжнародних конференціях.

Структура та об’єм роботи. Дисертаційна робота складається з вступу, огляду літератури, опису матеріалів і методів, результатів та обговорення, висновків, списку цитованої літератури, який включає 210 найменувань. Дисертація викладена на 132 сторінках друкованого тексту і проілюстрована 2 таблицями та 22 малюнками.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

1. Визначення та ідентифікація продуктів реакції 5-ліпоксигеназного окиснення лінолевої кислоти хроматографічними методами в модельній системі на основі хімічно модифікованого кремнезему.

З метою подальшого вивчення впливу ступеня іонізації карбоксильної групи ЛК на перебіг 5-ліпоксигеназної реакції була проведена серія експериментів в модельній системі на основі хімічно модифікованого кремнезему. Маючи характерну двошарову структуру клітинних мембран, ця біоміметична система завдяки жорстко закріпленому на кремнеземній матриці нижньому модельному шарі дозволяє більш точно оцінити ряд параметрів досліджуваних ліпідних молекул.

Склад продуктів 5-ліпоксигеназної реакції визначали за допомогою ТШХ та ОФ ВЕРХ. При проведенні ТШХ варіювалась кількість оцтової кислоти, яка містилась в елюаті в концентрації від 0 до 1%. Фарбування проводилось незалежно трьома різними реагентами: йодом, анісовим альдегідом та N,N-диметил-п-фенілендіаміном – реактивом на пероксидні групи. Додатково хроматограми проявлялись в ультрафіолетовому промінні. За результатами ТШХ та ОФ ВЕРХ в реакційній суміші були виділені та ідентифіковані шість різних сполук.

Встановлено, що для ідентифікації продуктів ЛО реакції найбільш доцільно використовувати анісовий альдегід, бо він дає специфічне забарвлення майже для всіх продуктів ліпоксигеназної реакції, а також надає субстрату - ЛК, характерний зелений колір. На відміну від анісового альдегіду, йод неспецифічно сорбується багатьма сполуками, надаючи їм однаковий бурий колір, який відрізняється, в залежності від кількості речовини, лише своєю інтенсивністю. Третій реагент, який використовувався - N,N-диметил-п-фенілендіамін – виявляє тільки ті сполуки, які містять в своєму складі гідро- та перокси-групи, що було використано для селективного визначення гідропероксидів жирних кислот.

Таким чином, на основі характерного забарвлення специфічними реактивами і за значеннями Rf можна стверджувати, що серед продуктів 5-ЛО реакції у модельній системі на основі хімічно модифікованого кремнезему 9-гідропероксид ЛК зустрічається в найбільшій кількості та, що реакція не зупиняється на первинному продукті реакції – 9-гідропероксиді ЛК, а йде далі до утворення кето- та епоксипродуктів.

Більш детально продукти ліпоксигеназної реакції вивчались методом ОФ ВЕРХ. Серед різних речовин реакційної суміші особливо виділяються два піки, зі значеннями часу виходу 9хв. та 21,5хв., які відповідають ЛК та її гідропероксиду, відповідно. Наявність плеча на головному з них (часу виходу 20хв.) свідчить про те, що 9-гідропероксид ЛК присутній в цис,цис- та цис,транс-формах. Додаткові невеликі піки свідчать про присутність в суміші інших окислених похідних ЛК, які знаходяться в дуже невеликій кількості.

Підсумовуючи дані, отримані при проведенні різних хроматографічних досліджень, можна зазначити, що в біоміметичній системі на основі хімічно-модифікованого кремнезему реакція 5-ліпоксигеназного окиснення проходить достатньо ефективно та з помітною швидкістю. Продукти, які були синтезовані в ході цієї реакції, піддаються точному якісному та кількісному визначенню. Таким чином, обрана нами система задовольняє висунутим до неї вимогам, тобто може бути використана для вивчення впливу іонізації карбоксильної групи ЛК на перебіг 5-ЛО реакції та при подальшій оптимізації методики синтезу для напівпрепаративного отримання продуктів реакції 5-ЛО окиснення, зокрема, для одержання 9-гідропероксиду ЛК.

2. Дослідження впливу карбоксильної групи поліненасичених жирних кислот на реакцію 5-ліпоксигеназного окиснення

Для визначення констант іонізації карбоксильної групи субстрату, вбудованого в біоміметичну систему на основі хімічно модифікованого кремнезему, використано метод кислотно-основного титрування. Показано, що отримана в ході експерименту крива рис.1 є результуючою чотирьох кривих титрування приналежних різним речовинам, що знаходяться в реакційній суміші. Знайдені значення рКа цих сполук становлять 5,28, 7,24, 8,92 і 10,69 для силанольних груп матриці, що не прореагували, одиночних молекул адсорбованої ЛК, асоціатів ЛК та комплексу фосфоліпід/лінолева кислота, відповідно.

Надалі було визначено положення діапазону рН оптимуму реакції 5-ЛО окиснення в тій же модельній системі (рН 6,5–7,3) та порівняно його з даними, отриманими в ході визначення рКа. Як субстрат реакції модель містила ЛК, крім якої до складу реакційної системи входили фосфатидилхолін або фосфатидилінозитол. Проводячи паралель між даними, отриманими при титруванні ЛК в складі модельної мембрани (рис.1) та даними по визначенню залежності швидкості 5-ліпоксигеназного окиснення ЛК від рН середовища видно, що діапазону рН оптимуму реакції відповідає значення рКа 7,24, яке належить одиночним ізольованим молекулам лінолевої кислоти, що входять до складу модельної мембрани. Логічно допустити, що 5-ЛО в даних умовах переважно окиснює неіонізовану форму ПНЖК, яка входить до складу ліпідного шару у вигляді поодиноких молекул; це підтверджується достатньо високою активністю ЛО при кислих значеннях рН. Нові дані добре узгоджуються з опублікованим раніше висновком про те, що в складі міцелярної модельної системи кращим субстратом для 5-ліпоксигенази також є поодинокі молекули ПНЖК, які, втім, можуть перебувати як в протонованій так і депротонованій формі, і так само вбудовані в міцелу [І.А.Бутович та ін. 1991].

Існують два погляди на проблему орієнтування субстрату в активному центрі ферменту та роль в цьому процесі карбоксильної групи. Перший спирається на припущення, що для зв'язування з “якірною” ділянкою ферменту необхідна присутність саме карбоксильної групи. Другий основну роль у зв'язуванні субстрату надає віддаленій метильній -групі ПНЖК; в цьому випадку карбоксильна група відіграє набагато менш важливу роль у процесі зв'язування субстрату з ферментом. Для внесення ясності в цю проблему у якості субстрату доцільно використати аналог ПНЖК, що не здатний до іонізації при будь-яких фізіологічних значеннях рН у реакційному середовищі, а саме лінолевий спирт.

Разом з співробітниками Центру молекулярної токсикології Пенсільванського університету (США) нами були виконані роботи з ЛС як субстратом ліпоксигеназної реакції. Залежність швидкості реакції окиснення ЛС від рН має дзвоноподібну форму, що вказує на участь у реакції двох груп ферменту, які здатні іонізуватися. Нами були визначені дві константи іонізації рКа1 і рКа2 з уявними значеннями 5,24+0,15 та 6,67+0,12. Наведені значення рКа були розраховані відповідно до (f-) рН-функції Міхаеліса за рівнянням: Vst =(Vst)opt/(1+[H+]/K1 +K2/[H+]), де (Vst)opt - стаціонарна швидкість реакції при оптимальному значенні рН; [H+] - концентрація іонів водню; К1 і К2 - константи дисоціації іоногенних груп.

Порівнюючи значення рКа, розраховані з залежностей швидкості реакції 5-ліпоксигеназного окиснення від рН середовища для таких субстратів як ЛК, ЛС та метиловий ефір лінолевої кислоти (табл.1) видно, що істотних розходжень у значеннях рКа немає. Отже, швидкість ферментативної реакції, головним чином, контролюється двома групами, які спроможні до іонізації і належать молекулі ферменту. Таким чином, наявність здатної до іонізації карбоксильної групи у молекулі субстрату не є важливою вимогою для зв'язування молекули ферменту з субстратом.

Проте присутність негативно заряджених іоногенних груп у мікрооточенні молекули ферменту вкрай необхідна для ліпоксигеназного каталізу. По-перше, ці групи створюють на поверхні мембрани локальні негативно заряджені кластери, що сприяють сорбції ліпоксигенази на поверхні мембрани та надають ферменту необхідну для здійснення каталізу конформацію. З такого погляду стає легко вмотивованою наявність 40% ферментативної активності в ізоелектричній точці 5-ліпоксигенази для реакції, що проходить на твердофазній модельній системі з адсорбованими фосфоліпідами. По-друге, карбоксильні групи субстрату виступають як донори протонів. Наші результати також вказують і на набагато більше значення додецилсульфату натрію для реакції окиснення ЛС в порівнянні з реакцією окиснення ЛК. Ці дані можна пояснити компенсаційним впливом негативно зарядженої молекули ДДС при відсутності спроможної до іонізації групи в складі ЛС. Підтвердженням цієї точки зору може служити і той факт, що в міцелярній системі без ДДС рН-залежність окиснення ЛС 5-ліпоксигеназою (неочищений препарат) на відміну від окиснення ЛК має два рН оптимуми (3,8 та 6,5). Розраховані за рівнянням: Vst=Vst1/(1+[H+]/K2+K1/[H+])+Vst2/(1+[H+]/K4+K3/[H+]), Vst1, Vst2, pK1, pK2, pK3 і pK4 склали 4,71 і 2,67 опт.од.235/хв. (при =235нм) та 4,86, 2,75, 7,48 і 5,57 одиниці рН. Як видно, другий із рН-оптимумів (рН 6,5) стандартний для 5-ЛО з бульб картоплі. Значення для першого рН оптимуму (рН 3,8) досить незвичайне для будь-якої ЛО й пояснюється присутністю надлишку протонів у реакційному середовищі, а також стабілізацією нативної конформації ферменту в міцелярній системі. На користь другого допущення свідчить також і розширення рН-профілю реакції в модельній системі на основі модифікованого кремнезему.

Таблиця 1

Значення рКа іоногенних груп 5-ліпоксигенази в реакції окиснення різних субстратів

Субстрат | рКа1 | рКа2

лінолева кислота | 4,75+0,05 | 7,58+0,05

метиловий ефір лінолевої кислоти |

4,96+0,09 |

7,54+0,11

лінолевий спирт | 5,24+0,15 | 6,67+0,12

Таким чином, з великою долею ймовірності можна допустити, що карбоксильна група ПНЖК у ході реакції 5-ліпоксигеназного окиснення виконує функції донора протонів, формує негативний заряд необхідної щільності і хоча, як нами було показано, її роль у субстратному зв'язуванні невелика, вона необхідна для правильної орієнтації субстрату в активному центрі ферменту. Так, у ході реакції 5-ліпоксигеназного окиснення ЛК утворюються як 9-гідропероксид, так і продукт зворотної орієнтації субстрату в активному центрі ферменту – 13-гідропероксид у співвідношенні 9:1. У ході тієї ж реакції, але з використанням субстрату, що не має карбоксильної групи (ЛС), 9- та 13-гідропероксипохідні (продукти нормальної та зворотної орієнтації) утворюються в майже еквімолярних кількостях. Цілком імовірно, що здатність карбоксильної групи ЛК до утворення щонайменше двох водневих зв'язків на відміну від одного, який спроможна утворювати гідроксильна група ЛС, є визначальною для правильної орієнтації субстрату в активному центрі ферменту.

Таким чином, в присутності негативно заряджених груп а також амфіфільних кислот - донорів протонів, роль карбоксильної групи ПНЖК суттєво знижується. У відсутності подібних сполук у реакційному середовищі роль карбоксильної групи ПНЖК значно зростає, і заміна її на гідроксигрупу лінолевого спирту, або метильну групу метилового ефіру лінолевої кислоти приводить до значного уповільнення швидкості ферментативної реакції.

3. Роль 4-гідрокси-ТЕМПО в реакції окиснення лінолевого спирту

5-ліпоксигеназою з бульб картоплі

Дослідження 5-ЛО окиснення лінолевого спирту проводили в системі, що містила змішані міцели ЛС, Lubrol PX та ДДС, який значно прискорює перебіг реакції 5-ліпоксигеназного окиснення ЛС. Так, в присутності 0,1-0,15 мМ ДДС в реакційній суміші стаціонарна швидкість реакції окиснення лінолевого спирту підвищується майже в 200 разів (рис. 2).

Раніше було встановлено, що до складу продуктів 5-ліпоксигеназного окиснення ЛС входять позиційні (9- та 13-) і просторові (цис,транс-, транс,транс-, R- та S-) ізомери гідропероксидів ЛС. Ми вважали, що значна частина сумарного продукту утворюється в ході неферментативних окиснювальних перетворень, які відбуваються у реакційному середовищі. Для перевірки можливості проміжної дисоціації радикалів з активного центру картопляної ЛО та імовірну ініціацію неферментативного окиснення ЛС в реакційному середовищі були використані уловлювачі вільних радикалів ТЕМПО та 4-гідрокси-ТЕМПО в діапазоні концентрацій до 0,2 мM, що призводило до інгібування реакції 5-ЛО окиснення ЛС на 80%. Крім того було виявлено, що в присутності 4-гідрокси-ТЕМПО спостерігалось істотне зниження частки неферментативно трансформованих первинних продуктів окиснення лінолевого спирту - (транс,транс)-ізомерів та (R)-стереоізомерів гідропероксидів.

Отже, утворення ізомерів ефективно блокується уловлювачем вільних радикалів - 4-гідрокси-ТЕМПО, в присутності якого в основному виявлено продукти ферментативного перетворення субстрату - 9(S)-гідроперокси-10E,12Z-октадекадієн-1-ол та 13(S)-гідроперокси-9Z,11E-октадекадієн-1-ол (продукт зворотної орієнтації субстрату в активному центрі ферменту). Головний продукт - 9-гідропероксид ЛС, що становив основну частку сумарного кінцевого продукту, складався на 88% з (S)- та на 12% з (R)-стереоізомерів. Другий продукт - 13-гідропероксид лінолевого спирту, являв собою суміш 58% (S)- та 42% (R )-стереоізомерів. Ці результати свідчать про те, що молекули ЛС можуть зв’язуватись з каталітичним центром ліпоксигенази як в нормальній (-метильна група перша), так і в оберненій (гідроксильна група перша) орієнтації, причому взаємодія за останньою схемою відбувається значно рідше. Основна частка 13-гідропероксиду утворюється неферментативно, у той час як високий ступінь хіральності 9-гідропероксиду ЛС передбачає його утворення в ферментативній реакції. Було доведено, що за досліджених умов ДДС не впливає на профіль продуктів реакції.

З метою з’ясування кінетичного механізму впливу 4-гідрокси-ТЕМПО на 5-ЛО було досліджено залежності стаціонарних швидкостей 5-ліпоксигеназної реакції від кількості уловлювача вільних радикалів при різних концентраціях субстрату - лінолевого спирту (рис. 3). Встановлено, що 4-гідрокси-ТЕМПО справляє незалежну від кількості субстрату в реакційній суміші інгібуючу дію на активність 5-ЛО. Тобто, за даних умов, не спостерігалось субстратного захисту ферменту від дії інгібітору. Значення концентрацій 4-гідрокси-ТЕМПО, що зумовлювали зниження стаціонарної швидкості реакції в два рази (ІС50), становили 34, 32, 28 та 34 мкМ при різних кількостях ЛС в реакційних сумішах (75, 150, 220 та 300 мкМ). Таким чином, при підвищенні концентрації ЛС не спостерігались істотні зміни в значеннях ІС50, що свідчить про відсутність конкуренції між інгібітором та субстратом за функціональні групи ферменту, з якими зв’язується ЛС.

Було вивчено вплив 4-гідрокси-ТЕМПО на значення коефіцієнта Хілла, який вказує на кількість зайнятих субстратом місць на молекулі ферменту. На рис.4 наведено залежності стаціонарної швидкості реакції ліпоксигеназного окиснення ЛС від концентрації субстрату у відсутності та в присутності 40 і 400 мкМ 4-гідрокси-ТЕМПО. Сигмоїдна форма кривих свідчить, що ферменту властива позитивна кооперативність до ЛС. Підвищення концентрації 4-гідрокси-ТЕМПО суттєво не впливало на значення коефіцієнта Хілла (h), обчислені за рівнянням Хілла, та призводило до зменшення максимальної швидкості реакції (Vmax) 5-ліпоксигеназного окиснення ЛС. Так, значення цих параметрів ЛО реакції окиснення лінолевого спирту у відсутності уловлювача вільних радикалів становили - h=1,6; Vmax=0,13 опт.од.235/хв; а при 40 та 400 мкМ 4-гідрокси-ТЕМПО - відповідно h=1,5; Vmax=0,062 опт.од.235/хв та h=1,4; Vmax=0,022 опт.од.235/хв. Таким чином, як за наявності уловлювача вільних радикалів, так й без нього, у присутності 100 мкМ ДДС з молекулою 5-ліпоксигенази зв’язувалось до двох молекул ЛС, тобто 4-гідрокси-ТЕМПО не перешкоджав зв’язуванню субстрату з молекулою ферменту.

Досліджено вплив 4-гідрокси-ТЕМПО на залежність стаціонарної швидкості 5-ліпоксигеназного окиснення ЛС від рН реакційної суміші. Дзвоноподібна форма кривих вказує на участь в реакції двох іоногенних груп ферменту з уявними значеннями pKa 5,240,15 та 6,670,12, які суттєво не змінюються в присутності 4-гідрокси-ТЕМПО і становлять 5,510,16 та 6,750,15. Отже, форма залежності Vst від рН реакційної суміші та положення рН-оптимуму реакції в присутності уловлювача вільних радикалів - 4-гідрокси-ТЕМПО практично не змінюються, що свідчить про відсутність впливу цієї речовини на дисоціацію іоногенних груп ферменту. Стаціонарні швидкості реакції окиснення ЛС 5-ліпоксигеназою без уловлювача радикалів та в його присутності при оптимальному значенні рН відповідно складали 0,1310,016 та 0,0580,009 опт.од.235/хв. Наведені значення pKa та (Vst)opt розраховані у відповідності з (f -) pH-функцією Міхаеліса за рівнянням: Vst = (Vst)opt/(1 + [H+]/K1 + K2/[H+]), де (Vst)opt - стаціонарна швидкість реакції при оптимальному значенні рН; [Н+] - концентрація протонів; K1 та K2 - константи дисоціації іоногенних груп ферменту.

Таким чином, вивчення 5-ліпоксигеназного окиснення ЛС показало, що 4-гідрокси-ТЕМПО ефективно блокує неферментативні вільно-радикальні реакції, які ведуть до утворення позиційних та стереоізомерів окиснених похідних ЛС, не змінюючи при цьому основних функціональних властивостей 5-ліпоксигенази. Отже, проведені дослідження дають підставу вважати, що 4-гідрокси-ТЕМПО, в присутності якого утворюється переважна більшість продукту ферментативного перетворення ЛС - 9(S)-гідроперокси-10E,12Z-октадекадієн-1-олу - перехоплює незв’язані з активним центром ферменту радикали, тобто процес блокування неферментативної трансформації первинних продуктів 5-ліпоксигеназного окиснення ЛС відбувається не в каталітичному центрі ферменту, а в розчині.

4. Вивчення особливостей реакції окиснення

лінолевого спирту, що каталізується 5-ліпоксигеназою з бульб картоплі

Для з’ясування впливу ДДС, який за своєю хімічною природою є аніоногенною амфіфільною сполукою, на перебіг реакції 5-ліпоксигеназного окиснення ЛС, було отримано залежність стаціонарної швидкості реакції від концентрації ДДС (рис.2) Досліди проводили в умовах рН-оптимуму дії ферменту (6.3) в присутності 0,3 мМ концентрації ЛС, яка є насичуючою для роботи ферменту. Вплив ДДС вивчали у діапазоні концентрацій 0.003-0.5мM. Дана сполука має двоякий вплив на активність ферменту. В концентрації від 0.003мМ до 0.15мМ ДДС прискорює перебіг реакції; найбільший ефект активації спостерігається при концентрації 0.15мМ (збільшення Vst в 200 разів). Подальше підвищення концентрації ДДС викликає зменшення ефекту активації.

Для визначення механізму реакції та обчислення кінетичних констант були отримані залежності Vst від концентрації субстрату при різних концентраціях ДДС, які зображені на рис.5. S-подібний вигин кривих характерний для випадку позитивної кооперативності до субстрату. Розрахунки кінетичних констант 5-ЛО реакції проводились за рівнянням Хілла. Допускали, що ступінь насичення білка лігандом, тобто доля центрів зв’язування, зайнятих лігандом в довільний проміжок часу дорівнює відношенню стаціонарної швидкості реакції до максимальної (Vst/Vmax). Тоді рівняння Хілла має такий вигляд: Vst=Vmax[X]h/(1/Kh+[X]h). Результати обрахунків кінетичних констант 5-ЛО реакції при різних концентраціях ДДС подані в табл. 2. В дослідженому інтервалі концентрацій активатора коефіцієнт Хілла більше одиниці, що свідчить про здатність ферменту приєднувати декілька молекул субстрату, а саме від двох до трьох.

Кінетичний аналіз показав, що вплив ДДС на перебіг реакції 5-ліпоксигеназного окиснення лінолевого спирту має алостеричний характер.

Таблиця 2

Кінетичні константи реакції 5-ліпоксигеназного окиснення лінолевого спирту при різних концентраціях додецилсульфату натрію

[ДДС], мкМ | Максимальна швидкість, опт.од./хв. | Коефіцієнт Хілла

20 | 0,004 | 2.61

60 | 0.08 | 1.87

100 | 0.12 | 1.68

150 | 0.13 | 1.63

320 | 0.11 | 1.63

500 | 0.008 | 1.77

Оскільки in vivo 5-ліпоксигеназа функціонує в стані асоціації з мембраною, основним компонентом якої є іонні та неіонні ліпіди, останні можуть впливати на активність ферменту. Нами досліджено вплив фосфатидної кислоти на 5-ліпоксигеназне окиснення ЛС. Знайдено, що цей природний аніоногенний фосфоліпід, як і синтетична сполука - ДДС, здатен прискорювати перебіг ліпоксигеназної реакції (рис.6). Показано, що фосфатидна кислота при додаванні в реакційну суміш зменшує лаг-період, одночасно підвищуючи значення Vst реакції. Отримані дані добре узгоджуються з раніше опублікованими матеріалами про вплив фосфатидної кислоти на перебіг реакції 5-ліпоксигеназного окиснення ЛК [Бутович И.А. та ін. 1989]. В цьому випадку також спостерігалося зменшення лаг-періоду та збільшення Vst реакції. Додавання фосфатидної кислоти в обох випадках призводить до зникнення перегину на графіку залежності Vst від концентрації ЛК та ЛС, та підвищення значення Vmax.

Наведені результати добре пояснюються в рамках теорії адсорбційно-міцелярного механізму 5-ліпоксигеназної реакції, яка передбачає наявність в складі молекули ферменту крім каталітичного, додаткового алостеричного центру. Зміна S-подібної форми кривої на звичайну міхаелівську в присутності активатора може бути ще одним доказом алостеричності ферменту, який проявляє позитивну кооперативність до субстрату. Адсорбція ферменту на мембрані здійснюється завдяки взаємодії алостеричної (адсорбційної) ділянки з ефектором - амфіфільною сполукою. Аніоногенний характер амфіфільної сполуки, як необхідна умова здійснення регуляторного впливу на активність ферменту, свідчить про першорядну роль підвищеної кислотності в процесі адсорбції 5-ліпоксигенази на мембрані. Можливо, введення додаткового від’ємного заряду на поверхню мембранної структури шляхом вмонтовування від’ємно-заряджених амфіфільних сполук в склад міцели сприяє транслокації ферменту на мембрану та певній орієнтації молекули ферменту по відношенню до адсорбованого субстрату аналогічно до того, як це відбувається при дії деяких ліпаз на водонерозчинні сполуки. Не виключена також безпосередня участь фосфатидної кислоти або інших амфіфільних сполук в регуляції реакції ліпоксигеназного окиснення ПНЖК.

Таким чином встановлено, що 5-ліпоксигеназа з бульб картоплі в міцелярній системі проявляє позитивну кооперативність до субстрату - лінолевого спирту. ДДС в діапазоні концентрацій від 0.005 мМ до 0.15 мМ підвищує Vst реакції окиснення ЛС 5-ліпоксигеназою (max. ступінь активації - 200 разів). При подальшому збільшенні концентрації ДДС активуючий ефект поступово зникає. При збільшенні концентрації активатора відбувається заміщення субстрату в алостеричному центрі ферменту на молекули ДДС (з ферментом зв’язується від двох до трьох молекул ЛС). Активуючий ефект на 5-ліпоксигеназу в реакції окиснення ЛС справляє також природна амфіфільна сполука - фосфатидна кислота (ступінь активації - 6 разів при концентрації 120 мкМ).

ВИСНОВКИ

1.

2.

3.

4.

5.

6.

СПИСОК ОПУБЛІКОВАНИХ ПРАЦЬ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1.

2.

3.

4.

5.

6.

Казачков М.Г. Кинетические особенности ферментативного окисления линолевой кислоты и линолевого спирта в присутствии 5-липоксигеназы.-Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 02.00.10 - биоорганическая химия. Институт биоорганической химии и нефтехимии НАН Украины, Киев, 2001.

Одной из групп ферментов, играющих значительную роль в регуляции многих физиологически важных функций животных и растительных организмов, являются липоксигеназы. Катализируя перекисное окисление полиненасыщенных жирных кислот, ферменты семейства липоксигеназ занимают ключевые позиции в биосинтезе ряда биологически активных соединений, таких как лейкотриены, липоксины, гепоксилины, жасмонаты и т.д.

В данной работе впервые проведено изучение и сравнительный анализ кинетических параметров 5-липоксигеназного окисления ионизирующихся и не ионизирующихся при физиологических значениях pH субстратов в мицеллярных и модельных системах на основе химически модифицированного кремнезема, что позволило существенно расширить современные представления о механизме действия этого фермента.

Исследованы кинетические механизмы 5-ЛО окисления линолевого спирта и влияние ловушки свободных радикалов - 4-гидрокси-ТЕМПО - на прохождение этой реакции. Установлено, что 4-гидрокси-ТЕМПО эффективно блокирует нефермента-тив-ные свободно-радикальные реакции, приводящие к образованию позиционных изомеров и стереоизомеров окисленных производных линолевого спирта, не меняя при этом основных функциональных свойств 5-липоксигеназы. Проведенные исследования дают основание считать, что 4-гидрокси-ТЕМПО, в присутствии которого главным образом образуется продукт ферментативного превращения линолевого спирта - 9(S)-гидроперокси-10E,12Z-октадекадиен-1-ол, перехватывает несвязанные с активным центром фермента радикалы, т.е. процесс блокирования нефермента-тивной трансформации первичных продуктов 5-липоксигеназного окисления линолевого спирта происходит не в каталитическом центре фермента, а в растворе.

Изучена роль карбоксильной группы ПНЖК в процессе 5-липоксигеназного окисления различных субстратов. Показано, что карбоксильная группа полиненасыщенных жирных кислот в ходе реакции 5-ЛО окисления формирует отрицательный заряд нужной плотности на поверхности мембраны и необходима для правильной ориентации субстрата в активном центре фермента. Исследованы кинетические характеристики 5-липоксигеназной реакции окисления линолевого спирта и влияние на них регуляторов активности фермента - ДДС и фосфатидовой кислоты. Установлено, что 5-липоксигеназа в мицеллярной системе проявляет положительную кооперативность по субстрату - линолевому спирту. Додецилсульфат натрия и природное соединение - фосфатидовая кислота повышают стационарную скорость реакции окисления линолевого спирта 5-ЛО. При постепенном увеличении концентрации активатора значения коэффициента Хилла уменьшаются, т.е. происходит замещение субстрата в аллостерическом центре фермента на молекулы ДДС или фосфатидовой кислоты. В присутствия активатора с молекулой фермента связываются от двух до трех молекул ЛС.

Полученные результаты расширяют наши представления о механизме функционирования уникальных ферментов липидного обмена - липоксигеназ. Это позволяет использовать полученные данные, а также предложенные модельные системы биологических мембран для изучения действия новых регуляторов ферментов in vitro с целью создания потенциальных лекарственных средств, которые могли бы быть использованы при патологических состояниях организма, связанных с изменением уровня липоксигеназных метаболитов и их производных.

Ключевые слова: 5-липоксигеназа, линолевый спирт, фосфолипиды, фосфатидная кислота, додецилсульфат натрия, модели мембран.

Казачков М.Г. Кінетичні особливості ферментативного окиснення лінолевої кислоти та лінолевого спирту в присутності 5-ліпоксигенази.-Рукопис. Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 02.00.10-біоорганічна хімія. Інститут біоорганічної хімії і нафтохімії НАН України, Київ, 2001.

Вивчено та зроблено порівняльний аналіз кінетичних параметрів 5-ЛО окиснення субстратів, які можуть іонізуватися, або навпаки не спроможні до цього, на міцелярних та модельних системах на основі хімічно модифікованого кремнезему. Досліджено кінетичні механізми 5-ЛО окиснення лінолевого спирту і вплив 4-гідрокси-ТЕМРО на проходження цієї реакції. Встановлено, що 5-ЛО реакція супроводжується формуванням неспецифічних продуктів вільнорадикальних реакцій, що ініціюються ферментом. Показано, що карбоксильна група ПНЖК у ході реакції 5-ЛО окиснення формує негативний заряд необхідної щільності та необхідна для правильної орієнтації субстрату в активному центрі ферменту. Встановлено, що 5-ЛО в міцелярній системі виявляє позитивну кооперативність по субстрату - ЛС. ДДС і фосфатидна кислота підвищують стаціонарну швидкість реакції окиснення лінолевого спирту 5-ЛО. При поступовому збільшенні концентрації активатора відбувається заміщення субстрату в алостеричному центрі ферменту на молекули ДДС та фосфатидової кислоти. У присутності активатора з молекулою ферменту зв'язуються від двох до трьох молекул ЛС.

Ключові слова: 5-ліпоксигеназа, лінолевий спирт, фосфоліпіди, фосфатидна кислота, додецилсульфат натрию, моделі мембран.

Kazachkov M.G. Kinetic pecularities of enzyme oxidation of linoleic acid and linoleic alcohol in the presence of 5-lipoxygenase.-Manuscript.

Thesis for a candidate’s degree in biological sciences on specialty 02.00.10 - bioorganic chemistry. Institute of Bioorganic Chemistry and Petrochemistry of National Academy of Sciences of Ukraine, Kyiv, 2001.

The dissertation contains investigation and comparative analysis of kinetic parameters of 5-LO oxidation of ionizing and not ionizing substrates in micellar and model systems on the basis of chemically modified silicagel.

The aim of investigation was to study both kinetic mechanisms of 5-LO oxidation of linoleic alcohol (LAL) and influence of 4-hydroxy-TEMPO on this reaction. It is determined that 5-LO reaction is accompanied by formation of nonspecific products of free radical reactions initiated by the enzyme. It is shown that carboxyl group of polyunsaturated fatty acids (PUFAs) forms negative charge of required density during the reaction of 5-LO oxidation and it is necessary to proper substrate orientation in the active enzyme center. It is determined that 5-LO in micellar system represents positive cooperation on substrate — LAL. SDS and phosphatidic acid increase stationary speed of reaction of 5-LO linoleic alcohol oxidation. When increasing the activator concentration gradually, the substrate in allosteric enzyme centre is substituted for SDS molecule or phosphatidic acid. In the presence of activator enzyme molecule binds from two to three molecules of LAL.

Key words: 5-lipoxygenase, linoleic alcohol, phospholipids, phosphatidic acid, natriumdodecylsulfat, membrane models.