КИЇВСЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ

ІМЕНІ ТАРАСА ШЕВЧЕНКА

Лещинська Ірина Олексіївна

УДК 577.112:612.8

РОЗПОДІЛ БІЛКА АДГЕЗІЇ НЕРВОВИХ КЛІТИН NCAM В СТУКТУРАХ

ГОЛОВНОГО МОЗКУ ЩУРІВ ЗА УМОВ ДІЇ ІОНІЗУЮЧОГО

ОПРОМІНЕННЯ В МАЛІЙ ДОЗІ

03.00.04 - біохімія

Автореферат

Дисертації на здобуття наукового ступеня

Кандидата біологічних наук

Київ - 2001

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Науково-дослідному інституті біології Дніпропертовського

державного університету

Науковий керівник - кандидат біологічних наук,

Чорна Валентина Іванівна,

Дніпропетровський державний університет

доцент кафедри біохімії та біофізики

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук

Матишевська Ольга Павлівна

Київський національний університет імені Тараса Шевченка,

професор кафедри біохімії

доктор біологічних наук

Малишева Маргарита Костянтинівна,

Інститут фізіологічї імені О.О.Богомольця НАН України,

старший науковий співробітник, завідувач відділу нейрохімії

Провідна установа - Інститут біохімії ім.О.В.Палладіна НАН України

Захист відбудеться "21" травня 2001 року о 14 годині на засіданні спеціалізованої вченої

ради Д 26.001.24 Київського національного університету імені Тараса Шевченка за адресою:

м.Київ - 127, проспект академіка Глушкова 2, біологічний факультет, ауд. 215.

Поштова адреса: 01033, Київ - 33, вул.Володимирська, 64, Спецрада Д 26.001.24,

біологічний факультет

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Київського національного університету

імені Тараса Шевченка: м.Київ, вул. Володимирська, 58

Автореферат розісланий "14" квітня 2001 р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради Брайон О.В.

Загальна характеристика роботи

Протягом останніх років особливої актуальності набули дослідження молекулярних механізмів, які забезпечують міжклітинні взаємодії. У центральній нервовій системі (ЦНС) надмолекулярні комплекси беруть участь в утворенні контактів між нейронами, нейронами та гліальними клітинами, нейронами та позаклітинним матриксом, і таким чином, залучені до регуляції організації та функціонування нейрональних мереж (Edelman G.M., Jones F.S., 1998).

Одним із видів клітинних контактів є адгезивна взаємодія, яка здійснюється за участі трансмембранних глікопротеїнів - молекул клітинної адгезії (МКА). Регуляція даного типу взаємодій відбувається шляхом зміни розподілу МКА на поверхні клітин та їх асоціації з білками-рецепторами або цитоскелетом. У ЦНС адгезивні взаємодії контролюють розвиток та функціонування нервової системи, а саме клітинну міграцію, зростання нейритів, синаптогенез та внутрішньоклітинну сигналізацію (Rutishauser U., 1993; Fields D., Itoh K., 1996).

Однією з МКА є нейроспецифічний білок клітинної адгезії NCAM (neuronal cell adhesion molecule), який існує у вигляді трьох основних ізоформ з молекулярними масами 180 кДа (NCAM-180), 140 кДа (NCAM-140) та 120 кДа (NCAM-120). NCAM експресується на поверхні нейронів та гліальних клітин протягом усього життя, але найбільш інтенсивно - під час ембріогенезу та постнатального розвитку. Порушення експресії та посттрансляційної модифікації NCAM були виявлені при ішемічних ушкодженнях головного мозку, шизофренії, епілепсії, нейротоксичних пошкодженнях та хронічних неврозах. Ці патологічні процеси, в кінцевому підсумку, призводять до порушення вищої нервової діяльності та функцій ЦНС (Wong E.V. et al., 996; Duncan G.E., Sheitman B.B. et al., 1999). Проведені клінічні дослідження свідчать, що у малих дозах іонізуюча радіація також спричиняє розвиток нейродегенеративних процесів, які проявляються відразу або через тривалий час (Chikawa S. et al., 1991; Сердюк А.М., 1995; Барабой В.А., 1996; Нягу А.И., 1991; Абдель-Гани А.Х. и др., 1999).

У зв’язку з цим особливої актуальності набуває дослідження участі NCAM у реакціях нервових клітин головного мозку на дію іонізуючої радіації, що дозволить поглибити уявлення про біохімічні механізми патогенетичних процесів, які можуть розвиватися в ЦНС, а також розробити нові адекватні методи їх своєчасної діагностики.

Зв’язок з науковою тематикою організації. Робота відповідає плану науково-дослідної тематики НДІ біології Дніпропетровського державного університету та виконана у рамках держбюджетних тем №40-94 “Дослідження нервовоспецифічних білків у нормі та за наявності факторів ризику з ціллю розробки методів діагностики патологічних станів дітей” та №02-20-97 “Фундаментальні дослідження впливу синергічної дії екопатогених чинників та наукове обгрунтування нових комплексних методів діагностики, корекції та профілактики порушень стану здоров’я населення” Міністерства освіти України.

Мета та задачі дослідження. Метою дисертаційної роботи було з‘ясування перерозподілу білка адгезії нервових клітин NCAM в морфо-функціональних структурах головного мозку за умов розвитку біологічних ефектів, спричинених дією радіації в малій дозі, гіпоксії та стресом.

Основні задачі дослідження. Для досягнення поставленої мети необхідно було вирішити наступні задачі:

1) провести кількісну оцінку розподілу мембранної та розчинної форм NCAM в структурах головного мозку щурів різної статі;

2) вивчити вплив одноразового та фракціонованого рентгенівського опромінення в дозі 25 сГр на вміст мембранної й розчинної форм NCAM та їх розподіл у різних морфофункціональних структурах головного мозку статевозрілих щурів;

3) дослідити вміст білка адгезії нервових клітин NCAM у структурах головного мозку нащадків опромінених щурів у період раннього постнатального розвитку;

4) визначити рівень метгемоглобіна в крові щурів за умов одноразового та фракціонованого рентгенівського опромінення в дозі 25 сГр;

5) дослідити вплив експериментальної гемічної гіпоксії на вміст мембранної й розчинної форм NCAM та їх розподіл у різних структурах головного мозку статевозрілих щурів;

6) визначити вплив пренатальної гемічної гіпоксії та стресу на динаміку перерозподілу NCAM в структурах головного мозку щурів під час раннього постнатального розвитку;

7) обгрунтувати можливість застосування кількісного аналізу NCAM в сироватці крові як діагностичного тесту розвитку патологічних станів головного мозку.

Об’єкт дослідження. Об‘єктом дослідження даної дисертаційної роботи були процеси перерозподілу білка адгезії нервових клітин NCAM у структурах головного мозку. Предметом дослідження було вивчення динаміки перерозподілу NCAM за умов радіаційного опромінення, гемічної гіпоксії та стресу.

Mетоди дослідження. Для досягнення мети даної дисертаційної роботи використовували біохімічні та імунохімічні методи оцінки розподілу NCAM в різні строки після експериментального радіаційного опромінення щурів в дозі 25 сГр, гемічної гіпоксії та стресу. Комбінування фракціонування тканини мозку методом ультрацентрифугування та кількісного твердофазного імуноферментного аналізу з використанням моноспецифічної антисироватки дозволило виявити динаміку як внутрішньоклітиннього перерозподілу NCAM, так і його перерозподілу у структурах головного мозку.

Наукова новизна одержаних результатів. В результаті проведених експериментальних досліджень вперше охарактеризована біохімічна топографія білка адгезії нервових клітин NCAM за умов дії іонізуючої радіації у малій дозі. Встановлено, що рентгенівське опромінення в дозі 25 сГр спричиняє істотне підвищення вмісту та перерозподіл білка адгезії нервових клітин NCAM в головному мозку щурів, які залежать від типу опромінення, терміну після опромінення, мають фазовий характер та є відмінними для різних структур головного мозку щурів різної статі. Це підтверджує участь NCAM у розвитку неспецифічних та специфічних компонентів реакції ЦНС на дію іонізуючого випромінювання. Виявлено, що у нащадків щурів, яких було фракціоновано опромінено в дозі 25 сГр, відбувається порушення динаміки вмісту та перерозподіл NCAM у корі великих півкуль, мозочку та гіпокампі протягом перших діб постнатального розвитку. Встановлено, що одноразове та фракціоноване опромінення в дозі 25 сГр індукує розвиток гемічної гіпоксії легкого ступеня. Показано, що за умов експериментальної гемічної гіпоксії відбуваються тимчасові порушення розподілу NCAM в структурах головного мозку дорослих щурів. Виявлено зниження вмісту мембранної та розчинної форм NCAM у корі великих півкуль щурів, що зазнали пренатального впливу гемічної гіпоксії. Показано, що за умов пренатального стресу відбувається перерозподіл нейроспецифічного білка NCAM між різними структурами головного мозку під час раннього постнатального розвитку щурів. Вперше виявлено зміни вмісту NCAM в сироватці крові щурів після радіаційного та гіпоксичного впливів, що дозволило обгрунтувати можливість застосування NCAM як маркера аномального формування головного мозку та ступеня його ураження.

Теоретичне та практичне значення роботи. Отримані в роботі дані істотно доповнюють сучасні уявлення про структурно-функціональну роль білка адгезії нервових клітин NCAM. Дані про статеві відмінності у розподілі NCAM свідчать про існування механізму гормональної регуляції адгезивних взаємодій клітин ЦНС. Встановлені закономірності перерозподілу та зміни вмісту мембранної та розчинної форм NCAM за умов розвитку біологічних ефектів, спричинених дією іонізуючого випромінювання, гіпоксії та пренатального стресу мають загальнотеоретичне значення для оцінки ролі NCAM у розвитку неспецифічного та специфічного феноменологічних компонентів реакції клітин на дію цих чинників. Отримані дані вказують на можливість використання рівня глікопротеїну NCAM в сироватці крові як біохімічного параметра для оцінки розвитку та ступеня тяжкості патологічних процесів, що відбуваються в головному мозку.

Особистий внесок здобувача. Дисертантом було самостійно виконано аналіз літературних даних, розроблена методологія та проведені експериментальні дослідження, виконана статистична обробка та обговорення отриманих результатів. Дисертаційне дослідження виконано під керівництвом кандидата біологічних наук, доцента кафедри біофізики та біохімії ДДУ Чорної В.І.

Апробація результатів дисертації. Матеріали дисертації були представлені на I конференції Українського товариства нейронаук (Київ, 1998), Міжнародному об'єднаному конгресі світового та європейського нейрохімічних товариств (Німеччина, 1999), 29-й конференції Міжнародного товариства нейронаук (США, 1999), Міжнародній конференції молодих вчених (Львів, 1999), школі молодих вчених Європейського товариства нейронаук (Австрія, 1999).

Публікації. Результати досліджень представлені у 3 статтях та 6 тезах, які опубліковані у профільних вітчизняних журналах та матеріалах з’їздів та конференцій.

Впровадження результатів роботи. Результати роботи впроваджено в Центральну науково-дослідну лабораторію Дніпропетровської державної медичної академії.

Структура та обсяг дисертації. Дисертаційна робота викладена на 127 сторінках друкованого тексту і складається із вступу, основної частини, що містить огляд літератури, розділ матеріалів та методів досліджень, розділ результатів досліджень, обговорення отриманих результатів та висновки. Робота ілюстрована 10 таблицями та 26 рисунками. Перелік використаної літератури включає 239 посилань.

Основний зміст роботи

Матеріали та методи досліджень. В експериментах використовували білих лабораторних щурів та щурів лінії Вістар. Концентрацію NCAM визначали в структурах головного мозку та сироватці крові експериментальних тварин. Щурів декапітували, головний мозок вилучали та ділили на такі структури: кору великих півкуль, гіпокамп, смугасте тіло, середній мозок, мозочок та варолієв міст. Всі операції з головним мозком проводили при +4оС. Кров збирали, відстоювали 1 год при +4оС, після чого центрифугували 20 хв при 3000 об/хв.

Опромінення в дозі 25 сГр здійснювали на установці РУМ-17 (напруга 150 кВ, сила струму 6 мА, фільтри Сu 2,0 + Cu 0,5 мм, фокусна відстань 1,86 м, потужність дози 0,26 сГр/хв). Щурів тотально опромінювали одноразово або фракціоновано (по 0,01 Гр протягом 25 днів), після чого через 1, 12, 24, 120 або 168 год декапітували. Для визначення впливу радіації на вміст NCAM в структурах головного мозку нащадків, через два тижні після останнього сеансу фракціонованого опромінення групу самок зсаджували разом з інтактними самцями. Їх потомство декапітували на 6, 12 або 18 добу постнатального розвитку. Моделювання гемічної гіпоксії здійснювали за допомогою введення метгемоглобінутворюючого агента (нітриту натрію): 2% NaNO2, виготовлений на фізіологічному розчині, вводили інтраперитонеально самкам протягом 14 днів щодня з 5 по 19 добу вагітності. Загальна кількість введеного кожній тварині NaNO2 складала 0,9 мг/кг ваги. Щурят, отриманих від контрольних та гіпоксичних самок, декапітували на 1, 6 або 12 добу постнатального розвитку. Ступінь тяжкості гемічної гіпоксії оцінювали за кількістю метгемоглобіна в крові щурів за методом Евелін та Меллой. Моделювання пренатального стресу у щурів проводили згідно моделі “змушеного плавання” (Погодаев К.И., 1973).

Антисироватку до NCAM одержували шляхом імунізації кролів препаратом білка NCAM, очищеного з головного мозку щурів згідно з модифікованою методикою (Rassmusen S., 1982). Специфічність одержаної антисироватки тестували методом імуноблотінгу. Для кількісного аналізу NCAM використовували фракції білків, що були отримані за допомогою послідовної екстракції тканин структур головного мозку такими буферними розчинами: фракція розчинних білків - буфер А (25 мМ трис-буфер, рН 7,4; 1 мМ фосфометіл-сульфонілфторид; 10 мМ NaN3); фракція мембранних білків - буфер А, що містив 2% тритон Х-100. Концентрацію NCAM вимірювали методом імуноферментного аналізу, який включав етап інгібування антитіл антигеном в рідкому середовищі (Ibsen S., 1983). Оцінку вмісту загального білка проводили за методами Бредфорд (Bredford M., 1976) та Лоурі (Lowry, 1951).

Статистичну обробку результатів проводили за допомогою програми Stat-win, використовуючи t-критерій Ст‘юденту.

Результати та їх обговорення

Особливості розподілу білка клітинної адгезії NCAM в структурах головного мозку щурів різної статі. Кількісний аналіз показав неоднаковий вміст мембранної та розчинної форм NCAM у корі великих півкуль, гіпокампі, смугастому тілі, середньому мозку, мозочку та варолієвому мості - мозкових структурах, що є функціонально важливими для інтегративно-синтетичної діяльності головного мозку (Кристич Р.В., 1984). В головному мозку самців найвищий вміст мембранної форми NCAM було виявлено в підкоркових утворюваннях, а саме, гіпокампі та смугастому тілі, на які приходилось, відповідно, 20,27% та 21,38%, від загальної кількості цієї форми NCAM у досліджуваних структурах, а найменший - у середньому мозку (9,48%) (табл. 1). У самок спостерігався інший характер розподілу мембранної форми NCAM: найвищий її вміст виявлено в корі великих півкуль (31,5%), що в 2,14 разів перевищує відповідний показник самців.

Таблиця 1

Вміст мембранної форми NCAM (x10-2, мг/г тканини) у структурах головного мозку щурів різної статі (М ± m, n=6)

* - Р < 0,05, порівняно з показником у самців відповідного віку.

Вміст розчинної форми NCAM у структурах головного мозку щурів був значно меншим у порівнянні з мембранною формою NCAM. Найвище значення даного параметру спостерігали в варолієвому мості та корі великих півкуль, на які приходилось відповідно 36,6% та 25,35% від загальної кількості розчиної форми NCAM у досліджуваних структурах мозку. У смугастому тілі та мозочку вміст цієї форми NCAM був значно менший і складав 3,76% та 5,63%, відповідно (табл. 2).

Таблиця 2

Вміст розчинної форми NCAM (x10-2 ,мг/г тканини) у структурах головного мозку щурів різної статі (М + m, n=6)

* - Р < 0,05, порівняно з показником у самців відповідного віку.

В головному мозку самок вміст розчинної форми NCAM був підвищеним у порівнянні з самцями, але розподіл цієї форми NCAM між структурами головного мозку в цілому був подібний, за виключенням смугастого тіла. На цю структуру припадало 8,19% від загальної кількості розчиної форми NCAM у досліджуваних структурах головного мозку, що було у 2,9 разів вище у порівнянні з самцями. Виявлені відмінності вмісту NCAM та особливості його розподілу в структурах головного мозку щурів різної статі можуть бути зумовленими впливом статевих стероїдних гормонів, які є регуляторами генної транскрипції. Дослідження останніх років доводять, що периферійні гормони можуть впливати на зміни структури й активність нейрональної мережі та таким чином модулювати відмінності нейроендокринних функцій та поведінки (Paul S.M., Purdy R.H., 1992).

Вплив радіаційного опромінення в дозі 25 сГр на розподіл та вміст NCAM в структурах головного мозку щурів. В результаті проведених досліджень були встановлені закономірності перерозподілу NCAM після дії рентгенівського випромінювання в дозі 25 сГр. При аналізі динаміки вмісту мембранної форми NCAM у структурах головного мозку щурів після радіаційного впливу було виявлено фазність змін даного параметру як після одноразового, так і після фракціонованого опромінення. Перші 24 год після дії радіації (1-24 год) можна визначити як відносно ранній період, для якого були характерні різкі зміни вмісту NCAM, а починаючи з 24 год (24-168 год) - як відносно пізній пострадіаційний період, протягом якого різких перепадів вмісту NCAM не спостерігали (рис. 1, 2). Виявлена періодичність у динаміці вмісту NCAM може свідчити про роль цього білка у первинних та вторинних біологічних реакціях у відповідь на дію іонізуючого випромінювання. У результаті радіаційного впливу відбувається підсилення експресії білків “швидкого реагування” (наприклад, c-fos і c-jun) – неспецифічних активаторів транскрипції, максимальне збільшення рівня яких виявлено через 1 год після опромінення в дозах менших ніж 1 Гр (Gubits R.M. et al., 1993; Vrodljak E. et al., 1994; Siegel J. et al., 1999). Через 1 год після одноразового опромінення було виявлено підвищення вмісту мембранної форми NCAM в корі великих півкуль на 43,9%, середньому мозку на 32,9% та варолієвому мості на 62,9% при порівнянні з контролем, а вже через 12 год – в усіх досліджених структурах головного мозку самців, за виключенням смугастого тіла (рис. 1), що може свідчити про посилення адгезивних співвідносин між нервовими клітинами в цих структурах. Відомо, що 30-кратне посилення адгезивної взаємодії спостерігається при двократному підвищенні концентрації NCAM на поверхні клітини (Hoffman S. et al., 1983). Зміни вмісту мембранної форми NCAM у відносно пізній період, можливо, носять специфічний характер.

Рис. 1. Динаміка вмісту мембранної форми NCAM у структурах головного мозку щурів та самок, одноразово опромінених в дозі 0,25 Гр:

1 - кора великих півкуль головного мозку; 2 - гіпокамп; 3 – смугасте тіло; 4 - середній мозок; 5 - мозочок; 6 - варолієв міст;

* - Р < 0,05 при порівнянні з контролем.

Як вже відзначалося вище, протягом цього терміну відбувається збільшення вмісту мембранної форми NCAM у корі великих півкуль, гіпокампі та середньому мозку, який через 168 год після одноразового опромінення становив, відповідно, 174,0%, 173,6% та 147,7% від контролю. Можна припустити, що зміни вмісту NCAM можуть призводити до модифікації морфології синапсів та синаптичної передачі після опромінення в дозі 25 сГр, що підтверджується даними про наявність цих процесів після дії іонізуючої радіації в діапазоні доз від 1 сГр до 5 Гр (Лебединский А.В. и др., 1960; Малюкова И.В., 1958; Давыдов Б.И, Ушаков И.Б., 1987, 1991; Pellmar T.C. et al., 1993) та про підвищений вміст мембранної форми NCAM в зоні синаптичного контакту (Jorgensen O. et al., 1980). Слід відзначити, що єдиною структурою головного мозку, для якої було виявлено зниження вмісту мембранної форми NCAM після одноразового опромінення, був варолієвий міст - через 12 та 168 год після опромінення зниження вмісту досліджуваного білка складало тут відповідно 46,2% та 45,4%, у порівнянні з контролем, можливо, внаслідок активації процесів неспецифічного протеолізу (Abraham C.R. et al., 1993; Covault J. еt al., 1991; Seppard A. et al., 1991).

Зміни вмісту мембранної форми NCAM після фракціонованого опромінення в структурах головного мозку, за виключенням кори великих півкуль, були менш виражені (рис. 2). Незважаючи на те, що у деяких мозкових утвореннях спрямування змін вмісту цієї форми NCAM було протилежним при порівнянні з одноразовим опроміненням, тривалість фазних періодів не змінювалась, що може свідчити про менш виражену реакцію на опромінення.

Рис. 2. Динаміка вмісту мембранної форми NCAM у структурах головного мозку щурів, фракціоновано опромінених в дозі 25 сГр:

1 - кора великих півкуль головного мозку; 2 - гіпокамп; 3 – смугасте тіло; 4 - середній мозок; 5 - мозочок; 6 - варолієв міст;

* - Р < 0,05 при порівнянні з контролем.

У гіпокампі та мозочку відзначалось зменшення вмісту мембранної форми NCAM, особливо виражене через 1 год після опромінення (на 35,78% та 47,22% при порівнянні з контролем відповідно). У смугастому тілі, навпаки, через 1 та 120 год спостерігалось підвищення вмісту цієї форми NCAM на 50,3% та 42,1%, відповідно. Менш виражені зміни вмісту NCAM після фракціонованого радіаційного впливу, можливо, зв'язані з феноменом “захисної дії радіації”, одним з проявів якого є адаптація клітини до наступного опромінення після впливу малих доз радіації (Трещенкова И.А. и др., 1997).

Одже, в результаті одноразового радіаційного впливу відбувається перерозподіл вмісту мембранної форми NCAM в структурах головного мозку як самців, так і самок на користь гіпокампа та середнього мозку, причому різниця між розподілом мембранної форми NCAM в структурах головного мозку самців та самок через 168 годин після одноразового опромінення нівелюється. Після фракціонованого опромінення відбувається перерозподіл мембранної форми NCAM на користь варолієвого моста (через 12 год) та кори великих півкуль (через 168 год), але, на відміну від змін після одноразового опромінення, статеві особливості розподілу мембранної форми NCAM в структурах головного мозку зберігались. Після фракціонованого опромінення перерозподіл мембранної форми NCAM відбувається на користь варолієвого моста (через 12 год) та кори великих півкуль (через 168 год), але, на відміну від змін після одноразового опромінення, статеві особливості розподілу мембранної форми NCAM в структурах головного мозку зберегались.

В результаті проведених досліджень було виявлено зміни вмісту розчинної форми NCAM після дії іонізуючої радіації в дозі 25 сГр. Після одноразового опромінення рівень цієї форми NCAM змінювався через 12 год (у гіпокампі та варолієвому мості) та через 24 год (у корі великих півкуль та смугастому тілі), тобто у період, який був визначений як пізній пострадіаційний (рис. 3).

Рис. 3. Динаміка вмісту розчинної форми NCAM в структурах головного мозку щурів, одноразово опромінених в дозі 25 сГр:

1 - кора великих півкуль головного мозку; 2 - гіпокамп; 3 - смугасте тіло; 4 - середній мозок; 5 - мозочок; 6 - варолієв міст;

* - Р < 0,05 при порівнянні з контролем.

Після фракціонованого опромінення зміни вмісту розчинної форми NCAM спостерігали вже через 1 год, тобто протягом двох означених періодів (рис. 4). Аналізуючи динаміку вмісту розчиної форми NCAM, слід відзначити її різноспрямованість у різних структурах головного мозку. У корі великих півкуль та гіпокампі вміст розчинної форми досліджуваного білка знижувався та через 168 год після одноразового опромінення складав 37,2% та 57,1%, а після фракціонованого – 42,1% та 38,7% від контролю відповідно, що може бути наслідком активації внутрішньоклітинних та позаклітинних протеаз після дії іонізуючої радіації (Черная В.И., 1998, 2000). Результатом цих процесів може бути підсилення адгезивних взаємодій нервових клітин внаслідок зниження конкуренції між розчинною та мембранною формами за ділянки адгезії на цих молекулах (Nybroe O. et al., 1989; Sadone K., 1986). В смугастому тілі та середньому мозку концентрація розчинної форми NCAM, навпаки, підвищувалася, та через 168 год після одноразового опромінення була, відповідно, на 188% та 453% вище контрольної. В означених структурах головного мозку після фракціонованого опромінення спостерігалась інша динаміка вмісту розчинної форми NCAM: у смугастому тілі через 12 год після дії радіації відмічали максимальне підвищення даного показника, після чого його величина знижувалась і складала 57,12% від рівня контролю. Підвищення вмісту розчинної форми NCAM може бути результатом активації біосинтезу NCAM або посилення екстракції цього білка з мембрани внаслідок дії радіації (Nybroe O. et al.., 1989; Вольпе П., 1999).

Рис. 4. Динаміка вмісту розчинної форми NCAM в структурах головного мозку щурів, фракціоновано опромінених в дозі 25 сГр:

1 - корі великих півкуль головного мозку; 2 - гіпокампі; 3 - смугастому тілі; 4 - середньому мозку; 5 - мозочку; 6 - варолієвому мості;

* - Р < 0,05 при порівнянні з контролем.

Аналізуючи співвідношення вмісту розчинної та мембранної форм NCAM, слід відмітити, що найбільш варіабельним даний параметр був у середньому мозку та варолієвому мості (рис. 5). У цих структурах головного мозку самців і самок відбувався перерозподіл NCAM на користь її розчинної форми. Після одноразового опромінення у терміни 120 год для середнього мозку та 12 год для варолієвого моста самців співвідношення мембранна/розчинна форм NCAM змінювалось, відповідно, з 92,7:7,3% до 73,9:26,0% та з 91,8:8,2% до 73,0:27,0%. Дане співвідношення в структурах головного мозку самок було більш стабільним при порівнянні з самцями, за виключенням варолієвого мосту, в якому суттєвий перерозподіл NCAM на користь розчинної форми через 168 год спостерігався також. Після фракціонованого опромінення перерозподіл NCAM на користь її розчинної форми спостерігався у варолієвому мості самців через 168 год. У цей термін на долю цієї форми NCAM приходилось 31,9% її вмісту. Такі зміни NCAM можуть свідчити про більшу чутливість NCAM-залежної адгезії в цих структурах головного мозку до опромінення. Підвищена радіочутливість, особливо в діапазоні малих доз радіації, саме для цих структур відзначалася в роботах Давидова Б.І та Ушакова І.Б. (Давыдов Б. И., Ушаков И.Б., 1987, 1991).

Можливо, це також пов'язано з відносно високим вмістом гліальних клітин у цих структурах мозку, які є більш чутливими до впливу іонізуючої радіації (Gibson G.E et al., 1981).

Розподіл NCAM у структурах головного мозку щурят, матері яких зазнали фракціонованого опромінення в дозі 25 сГр, під час постнатального розвитку. Вміст NCAM в структурах головного мозку щурят, народжених від контрольних матерів та щурят, матері яких зазнали фракціонованого опромінення в дозі 25 сГр, істотно відрізняється (рис. 6). В корі великих півкуль головного мозку щурят, народжених від контрольних матерів, вміст мембранної форми NCAM був максимальним на 6 добу постнатального розвитку та в подальшому знижувався. В цій структурі головного мозку щурят, матері яких зазнали фракціонованого опромінення, максимальний вміст (що перевищував рівень контролю в 1,8 разів) цієї форми NCAM було зареєстровано на 12 добу постнатального розвитку. На 6 та 18 добу величина досліджуваного параметру була нижче контрольної в 1,7 та 2,0 разів, відповідно. В варолієвому мості нащадків опромінених щурів на 6 та 12 добу постнатального розвитку було виявлено зниження вмісту мембранної форми NCAM на 72% та 39% порівняно з контролем, а на 18 добу підвищення в 1,9 разів. Знижений рівень мембранної форми NCAM під час постнатального розвитку може свідчити про аномальні процеси міграції клітин, порушення процесів інтеграції нейронів в головному мозку, і як наслідок цього, виникнення дефіциту нервових клітин. Зниження товщини кори головного мозку, зумовлене дефіцитом нейронів, спостерігали після впливу іонізуючої радіації в дозах 0,25 - 1,25 Гр (Algan O. et al., 1997). До такого ж результату призводить і мутація в гені NCAM (Edelman G.M. et al., 1998; Wang Y. et al., 1996).

Рис. 6. Динаміка вмісту мембранної форми NCAM в корі великих півкуль(1); мозочку (2); гіпокампі (3); смугастому тілі (4); середньому мозку (5) та варолієвому мості (6) щурят під час постнатального розвитку:

А - контрольні щурята;

Б - щурята, матері яких зазнали фракціонованого опроміннення в дозі 25 сГр.

* - P < 0,05, при порівнянні з величиною досліджуваного параметру на 6 добу.

Вміст розчинної форми NCAM у структурах головного мозку щурят, матері яких зазнали опромінення, під час постнатального розвитку був підвищенним порівняно з контролем, але динаміка вмісту не відрізнялась від контролю, за виключенням середнього мозку (рис. 7). У цій структурі головного мозку контрольних щурят вміст розчинної форми NCAM на 12 добу постнатального розвитку зростав, а на 18 добу знижувався, тоді як у щурят, матері яких зазнали фракціонованого опромінення, підвищення вмісту цієї форми NCAM спостерігали протягом усього досліджуваного періоду, а на 18 добу цей показник перевищував контроль на 70%, що вказує на наявність внутрішньоклітинного перерозподілу NCAM в даній структурі головного мозку.

Вплив гемічної гіпоксії на розподіл NCAM в структурах головного мозку щурів. У крові щурів після дії іонізуючого випромінювання в дозі 25 сГр відбувається підвищення рівню метгемоглобіну. Вміст метгемоглобіну після одноразового опромінення складав 12-16%, а після фракціонованого - 6-9%, що свідчить про розвиток гемічної гіпоксії легкого ступеня (Середенко М.М., 1987). Індукцію цього процесу можна розглядати як вторинний ефект дії іонізуючої радіації.

Найбільш чутливими до впливу гемічної гіпоксії виявилася кора великих півкуль, у якій на 3 добу після закінчення введення NaNO2 було виявлено збільшення вмісту мембранної форми NCAM на 30%, а розчинної – на 80%. На 9 добу величина цих показників не відрізнялась від контролю. В інших досліджених структурах головного мозку також виявлені зміни вмісту розчинної форми NCAM. Так, в смугастому тілі на 9 добу після дії гемічного фактора вміст розчинної форми NCAM був зменшений на 34,8%, а на 15 добу – на 54,4% порівняно з контролем.

Рис. 7. Динаміка вмісту розчинної форми NCAM в корі великих півкуль (1); мозочку (2); гіпокампі (3); смугастому тілі (4); середньому мозку (5) та варолієвому мості (6) під час постнатального розвитку:

А - контрольні щурята;

Б - щурята, матері яких зазнали фракціонованого опроміннення в дозі 25 сГр.

*- P < 0,05, при порівнянні з величиною досліджуваного параметру на 6 добу.

В середньому мозку спостерігалась інша динаміка вмісту цієї форми NCAM: зменшення рівня розчиної форми NCAM на 170% на 9 добу змінювалось його підвищенням на 190% на 15 добу порівняно з контролем. Після інтраперитонального введення нітриту натрія, спостерігалось порушення розподілу NCAM у структурах головного мозку щурів (рис.8).

Рис. 8. Динаміка вмісту мембранної форми NCAM в структурах головного мозку щурів, що зазнали дії гемічної гіпоксії. I - кора великих півкуль; II - гіпокамп; III - смугасте тіло; IV - середній мозок; V - мозочок; VI - варолієв міст.

А - контрольні щури; Б - щури, що зазнали дії гемічної гіпоксії.

* - P < 0,05 при порівнянні з показником на 3 добу.

Рис. 9. Динаміка вмісту розчинної форми білка адгезії нервових клітин NCAM в структурах головного мозку щурів, що зазнали дії гемічної гіпоксії. I - кора великих півкуль; II - гіпокамп; III - смугасте тіло; IV - середній мозок; V - мозочок; VI - варолієв міст.

А - контрольні щури; Б - щури, що зазнали дії гемічної гіпоксії.

* - P < 0,05 при порівнянні з досліджуваним показником на 3 добу.

Рис. 10. Динаміка вмісту NCAM під час постнатального розвитку щурят, матері яких зазнали гемічної гіпоксії:

I - кора головного мозку; II - мозочок; III - середній мозок; IV - варолієв міст.

А - контрольні щури; Б - щурята, матері яких зазнали гемічної гіпоксії.

* - P < 0,05, при порівнянні із величиною досліджуваного параметру на 1 добу.

У варолієвому мості динаміка вмісту розчинної форми білка адгезії нервових клітин мала один максимум - збільшення на 82% на 9 добу після дії нітрита натрія. Головний мозок під час розвитку є особливо чутливим до кисневого голодування, тому, як і очікувалось, в структурах головного мозку щурят, матері яких зазнали дії гемічної гіпоксії, відбувався більш істотний перерозподіл білка адгезії нервових клітин NCAM внаслідок зменшення її вмісту в корі великих півкуль (рис. 10). На 6 та 12 добу постнатального розвитку, тобто у період, коли найбільш інтенсивно ідуть процеси міграції нейронів, у цьому мозковому утворенні зниження вмісту мембранної форми NCAM складало 78% та 30%, відповідно, а розчинної форми – 40% на 6 добу при порівнянні з контролем. Зміни вмісту NCAM можуть сприяти порушенню процесів синаптогенезу, що особливо важливо при розвитку та формуванні ЦНС (Edelman G. et al., 1998; Козяр В.С. и др., 1994; Moase C.E. et al., 1991).

Вміст NCAM у сироватці крові щурів після опромінення та впливу гемічної гіпоксії. Зниження концентрації NCAM, характерне для головного мозку в процесі розвитку та старіння організму, спостерігається також і в сироватці крові щурів (рис. 11), що погоджується з літературними даними (Krog L. et al., 1992; Neubauer C. et al., 1990). Подібна динаміка зміни вмісту NCAM у мозку та сироватці крові може свідчити на користь припущення про мозкове джерело цього нейроспецифічного білка в крові, хоча в невеликих концентраціях NCAM присутній в нервових клітинах інших органів (Березин В.А., Белик Я.В., 1990), а також на поверхні NK-кілерів (Lanier L.L. et al., 1991).

Рис. 11. Вміст NCAM в сироватці крові щурів під час постнатального розвитку:

а) - дані кількісного визначення NCAM методом імуноферментного аналізу;

б) - дані имуноблотінга, що вказують на присутність двох ізоформ NCAM.

Одним з важливих питань при дослідженні білків ЦНС в сироватці крові є питання про їх спроможність проходити через гематоенцефалічний бар‘єр (ГЕБ). Молекулярна маса та фізико-хімічні властивості перешкоджують проходженню NCAM через це утворення. Отримані нами дані свідчать, що найбільш висока концентрація NCAM у сироватці крові спостерігається протягом першого місяця постнатального розвитку, що, можливо, зумовлено формуванням самого ГЕБ. Існує думка, що функціональна зрілість бар‘єру настає перед народженням. Але, з іншого боку, специфічні властивості в транспорті макромолекул до мозку ембріону і в неонатальному періоді підтримують гіпотезу про незрілість ГЕБ у цей час (Горбань В.А., 1992). У деяких ділянках мозку, а саме у гіпофізі, епіфізі та підбугор’ї, ГЕБ як специфічне бар’єрне утворення відсутній (Siegel J. et al., 1999). У період функціональної зрілості ГЕБ вміст NCAM у сироватці крові є невеликим і, можливо, підтримується за рахунок немозкових джерел цього білка.

Рис. 12. Динаміка вмісту NCAM в сироватці крові щурів після:

а) - впливу одноразового (1) та фракціонованого (2) опромінення в дозі 0,25 Гр;

б) – впливу гемічної гіпоксії;

в) – впливу пренатальної гемічної гіпоксії.

- контроль; - щури, які зазнали гемічної гіпоксії.

Порушення гомеостазу головного мозку внаслідок дії будь-яких факторів фізичної або хімічної природи, як і порушення проникливості ГЕБ - це фактори, що можуть привести до появи більшої кількості нейроспецифічних білків у сироватці крові. Одним з таких агентів є іонізуюча радіація (Rubin et al., 1994; Trnovec T. et al., 1990).

Аналізуючи динаміку вмісту NCAM у сироватці крові після одноразового та фракціонованого опромінення, слід відзначити її фазність. Тривалість періодів фазності виявилася різною: ранній період після одноразового опромінення був більшим, ніж після фракціонованого опромінення (рис. 14). Звертає на себе увагу той факт, що динаміка концентрації NCAM у сироватці крові та у головному мозку опромінених тварин подібні. Цей факт дозволяє припустити, що головний мозок є джерелом NCAM, який виявляється в сироватці крові.

Схожість динаміки вмісту NCAM спостерігається не для всіх структур головного мозку, а тільки для кори великих півкуль та гіпокампа. Інші автори також спостерігали різну проникність ГЕБ у різних регіонах мозку після радіаційного впливу (Qin D.X. et al., 1990; Cicciarello R. et al., 1990; Lo E.H. et al., 1992). Це дає можливість запропонувати метод визначення рівня NCAM у сироватці крові для встановлення ступеня розвитку патологічних процесів у головному мозку, що були спричинені радіацією.

Висновки

1. Методом твердофазного імуноферментного аналізу із застосуванням моноспецифічної поліклональної антисироватки встановлено, що розподіл білка адгезії нервових клітин NCAM у стуктурах головного мозку дорослого організму є нерівномірним. Найвищий вміст цього нейроспецифічного білка виявлений в гіпокампі та смугастому тілі, найнижчий – у середньому мозку та варолієвому мості. Рівень та внутрішньоклітинний розподіл NCAM у структурах головного мозку щурів залежали від статі тварин (у корі великих півкуль самок вміст мембранної форми був вищим у 2,9 разів).

2. Після тотального одноразового рентгенівського опромінення в дозі 25 сГр виявляються зміни вмісту мембранної та розчинної форм NCAM у структурах головного мозку тварин обох статей, які носять фазний характер: максимум підвищення вмісту NCAM відмічений через 12 та 168 годин після опромінення. Встановлено перерозподіл білка NCAM на користь розчинної форми у середньому мозку та варолієвому мості після опромінення.

3. Виявлено зміни вмісту NCAM у структурах головного мозку щурів обох статей після фракціонованого (1 сГр протягом 25 днів) рентгенівського опромінення у дозі 25 сГр. На відміну від виявленого ефекту після одноразового опромінення, зміни вмісту NCAM були менш виражені в усіх структурах головного мозку, а їх фазний характер спостерігали лише у корі великих півкуль та смугастому тілі.

4. Встановлено, що після фракціонованого рентгенівського опромінення самок у дозі 25 сГр відбуваються зміни динаміки вмісту мембранної та розчинної форм NCAM у структурах головного мозку народжених ними щурят під час постнатального розвитку: у корі великих півкуль спостерігали найнижчий рівень цього білка, який становив 50% від контролю.

5. Вміст метгемоглобіну в крові щурів зростав як після введення нітриту натрія, так і після рентгенівського опромінення. Встановлено, що максимального рівня даний показник досягав на 5 добу після одноразового та фракціонованого опромінення і складав, відповідно, 14,75% та 8,54% при порівнянні з контролем, що свідчить про розвиток гемічної гіпоксії.

6. Встановлено, що внутрішньоклітинний перерозподіл та підвищення вмісту NCAM у корі великих півкуль та гіпокампі дорослих щурів спостерігаються на 3 та 9 добу після введення нітриту натрія.

7. За умов пренатальної гемічної гіпоксії відбувався перерозподіл мембранної форми білка адгезії NCAM