НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ МОЛЕКУЛЯРНОЇ БІОЛОГІЇ І ГЕНЕТИКИ

ПОРОННІК Оксана Олександрівна

УДК 581.143.6:576.5+663.1

ОДЕРЖАННЯ І ХАРАКТЕРИСТИКА

НОВОГО ВИСОКОПРОДУКТИВНОГО ШТАМУ КУЛЬТИВОВАНИХ КЛІТИН АРНЕБІЇ БАРВНОЇ

Arnebia euchroma (Royle) Jonst.

03.00.20 – біотехнологія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Київ – 2001

Дисертацією є рукопис.

Роботу виконано у відділі генетики клітинних популяцій Інституту молекулярної біології і генетики НАН України, м. Київ.

Науковий керівник – доктор біологічних наук, професор, член-кор. НАН України

Кунах Віктор Анатолійович,

Інститут молекулярної біології і генетики НАН України, завідувач відділу генетики клітинних популяцій.

Офіційні опоненти – доктор біологічних наук

Кучук Микола Вікторович,

Інститут клітинної біології і генетичної інженерії НАН України,

головний науковий співробітник відділу генетичної інженерії;

- кандидат біологічних наук, старший науковий співробітник

Коваленко Павло Григорович,

Інститут молекулярної біології і генетики НАН України,

старший науковий співробітник відділу молекулярної генетики.

Провідна установа: Київський національний університет імені Тараса Шевченка, кафедра фізіології і екології рослин.

Захист дисертації відбудеться 29.05.2001 р. о 10 год. на засіданні Спеціалізованої вченої ради Д 26.237.01 Інституту молекулярної біології і генетики НАН України за адресою: 03143, м. Київ-143, вул. академіка Заболотного, 150.

З дисертацією можна ознайомитися в бібліотеці Інституту молекулярної біології і генетики НАН України за адресою: 03143, м. Київ-143, вул. Академіка Заболотного, 150.

Автореферат розіслано 20.04.2001 р.

Вчений секретар

Спеціалізованої вченої ради

кандидат біологічних наук Підпала О.В.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Культура клітин є одним із ключових об'єктів у біотехнології рослин. Значний об'єм досліджень в цій галузі присвячено вивченню вторинного метаболізму культивованих клітин з метою розробки технологій отримання практично цінних сполук. Доцільність отримання продуктів з такої сировини, як культивовані in vitro клітини рослин, що є альтернативною до плантаційної чи дикорослої сировини, зумовлена цілою низкою обставин. Перш за все - це незалежність якості такої сировини від кліматичних умов, а також гарантія отримання сполук, які неможливо, або невигідно отримувати шляхом хімічного синтезу (Фаулер, 1987). Потенційні можливості клітинних культур рослин для отримання сполук, важливих для медицини і косметики, смакових і ароматичних добавок, барвників, ферментів, білків, або для отримання клітинної біомаси для спеціального (дитячого, дієтичного) харчування, є визнаними і широко обговорюються (Collin, 1988; Knorr, 1990; Zenk, 1990; Кунах, 1994; Verporte et al., 1998). Однак, до практичного втілення потенційних можливостей вдалося дійти лише в окремих випадках. Для більшості культур характерний, як правило, більш низький рівень синтезу вторинних сполук, ніж в інтактних рослинах, що робить їх вирощування економічно не вигідним. Для підвищення виходу цих сполук найбільш широко застосовується клітинна селекція, оптимізація середовищ і умов культивування, вирощування диференційованих клітин, або створення умов для їх диференціації, застосування еліситорів, а останнім часом і методи генетичної інженерії (Левенко, 2000).

Високий ступінь генетичної мінливості клітин in vitro, забезпечує достатній матеріал для створення нових високопродуктивних ліній і штамів методами клітинної селекції. Однак, суттєвою перешкодою для отримання продуктивних штамів є недостатнє знання закономірностей процесів спадкової мінливості в популяціях рослинних клітин при їх тривалому культивуванні. Донині залишаються нез'ясованими можливості визначення успадковування селектованих ознак, а також зв'язок між фізіолого-біохімічними і морфологічними показниками клітинних популяцій in vitro.

Робота спрямована на одержання та комплексне дослідження культури клітин арнебії барвної, що є джерелом червоного пігменту шиконіну. Передбачалось, зокрема, вивчити особливості фенотипової та спадкової мінливості культивованих клітин і на цій основі розробити умови, які сприяють найбільш повній реалізації ознак продуктивності.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Роботу виконано у відділі генетики клітинних популяцій Інституту молекулярної біології і генетики НАН України за бюджетною темою 2.2.4.5. "Вивчення особливостей мінливості рослинного геному в культурі in vitro та пошук шляхів її регуляції". Частина досліджень проводилась при підтримці Міністерства освіти і науки України в межах проекту 2.12/2844 "Створення нових клітинних штамів арнебії, перспективних як джерело шиконіну" № 2/960-97.

Мета та завдання дослідження. Метою роботи було отримання нового високопродуктивного штаму арнебії барвної Arnebia euchroma – продуцента шиконіну та підібрати оптимальні умови його вирощування для максимальної реалізації ознак продуктивності.

Для проведення цієї роботи необхідно було вирішити такі завдання:

1. Встановити рівень успадковування селектованої ознаки “накопичення шиконіну”;

2. Провести селекцію на підвищення продуктивності культури арнебії барвної і отримати новий штам;

3. Дослідити ріст нового штаму в різних умовах вирощування;

4. Провести комплексний аналіз отриманих варіантів та визначити оптимальні умови культивування нового штаму.

Предметом дослідження була фенотипова та геномна мінливість клітинних популяцій in vitro, продуктивність і динаміка цитоморфологічних, біохімічних та ростових показників культивованих клітин при вирощуванні в різних умовах.

Об'єкт дослідження - культивовані in vitro клітини арнебії барвної Arnebia euchroma (Royle) Jonst.

Методи дослідження: метод плейтингу та візуального добору дрібних клітинних агрегатів; цитологічні та цитоморфометричні методи аналізу; біохімічний гідролізний метод визначення вмісту шиконіну; статистичні методи аналізу: найменших квадратів, критерію медіани, парної лінійної регресії, дисперсійний для визначення коефіцієнта успадковування ознаки "накопичення шиконіну" (h2).

Наукова новизна одержаних результатів. Отримано новий штам АЕ-3 арнебії барвної, який має найвищу в світі продуктивність для цієї культури. Він перевищує за накопиченням шиконіну інтактні рослини більше, ніж в 10 разів.

Вперше визначено рівень реалізованої успадковуваності кількісної ознаки “накопичення шиконіну”, що дало змогу оцінити ефективність селекції та спланувати стратегію роботи, спрямованої на підвищення продуктивності отриманого штаму.

Із застосуванням статистичних методів дослідження вперше проведено комплексний порівняльний аналіз цитоморфологічних і фізіолого-біохімічних показників клітинної популяції в динаміці. Це дозволило вивчити особливості експресії ознак продуктивності за різних умов вирощування.

Практичне значення одержаних результатів. Отриманий штам можна пропонувати як об'єкт для біотехнологічного отримання цінної нафтохінонової сполуки - шиконіну. Штам накопичує при вирощуванні у вигляді суспензійної культури до 8% шиконіну в сухій тканині або до 1,12 г шиконіну на 1 л суспензії за пасаж.

Особистий внесок здобувача. Дисертаційну роботу виконано під керівництвом д.б.н., професора, члена-кореспондента НАН України Кунаха В.А., а також у тісному співробітництві з к.б.н. Захленюк О.В., інженером Адоніним В.І., та к.б.н. Мірютою Н.Ю, з якими автор має спільні публікації. Наведені в рукописі результати отримано здобувачем особисто або за безпосередньої участі при виконанні експериментів.

Апробація результатів дисертації. Результати роботи доповідалися на IV Міжнародній конференції з медичної ботаніки (Київ, вересень, 1997); на Міжнародній конференції “Пути решения проблем и перспективы развития биотехнологии в декоративном садоводстве” (Ялта, вересень, 1997); VII Міжнародній конференції "Биология клеток растений in vitro, биотехнология и сохранение генофонда" (Росія, Москва, листопад, 1997); Міжнародному симпозіумі з біотехнології рослин (Київ, жовтень, 1998); XXX щорічній нараді Європейської Спільноти з нових методів у сільськогосподарських дослідженнях та Міжнародної Спілки радіоекологів (Угорщина, Кеслері, серпень, 2000), а також на наукових семінарах відділу генетики клітинних популяцій ІМБіГ НАНУ.

Публікації. Результати досліджень представлені у вигляді чотирьох статей, опублікованих у фахових наукових журналах, тез доповідей у збірниках матеріалів 5-и міжнародних конференцій з питань біології, генетики культивованих клітин рослин та біотехнології та патенту України на винахід.

Структура і обсяг дисертації. Дисертаційна робота складається із вступу, огляду літератури, матеріалів і методів, результатів та їх обговорення, підсумків, висновків та переліку використаних літературних джерел. Повний обсяг роботи складає 163 сторінок друкованого тексту, що включає 54 рисунки (з них 24 фотографії), 28 таблиць та перелік використаних джерел (218, з них 117 - іноземні).

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ

Матеріали і методи дослідження

Вихідним матеріалом дослідження був клітинний штам АЕ-2 культури клітин арнебії барвної Arnebia euchroma (Royle) Jonst, одержаний в 1995 році (Захленюк, Кунах, 1998; Zakhlenjuk, Kunakh, 1998).

Штам АЕ-3 отриманий методом селекції дрібних клітинних агрегатів, одержаних методом плейтингу з найбільш продуктивного клону штаму АЕ-2. Відбирались клони, які мали інтенсивне яскраво-червоне забарвлення і характеризувались активним ростом. Частина культури росла на агаризованому середовищі у вигляді калюсу, іншу її частину перевели на рідке живильне середовище. При пересадках проводився підтримуючий добір. У калюсному варіанті для пересадки відбирались найбільш рівномірно яскраво забарвлені субкультури, в суспензійному – субкультури з рожево-червоним інтенсивно забарвленим живильним середовищем і з великою кількістю дрібних клітинних агрегатів. Під час селекції вміст шиконіну в калюсному варіанті визначали тільки в сухій тканині, в суспензійному – тільки в культуральному середовищі.

Умови вирощування. Культури вирощували в колбах об'ємом 250 мл, що містили 50 мл живильного середовища при температурі 24-26 оС, в режимі постійного перемішування (80-100 об/хв), з інтервалом пересадок в 14 днів. Частину вирощували в режимі інтенсивного перемішування (200 об/хв). Розмір інокуляту близько 2,5 г в перерахунку на суху біомасу на 1 л середовища, рН середовища до автоклавування 5,9. Використовували модифіковане середовище Лінсмайєр-Скуга (Давыденков и др., 1991). Для вирощування штаму АЕ-3 у вигляді калюсної культури використовували живильне середовище того ж складу з додаванням 8 г бактоагару на 1 л середовища.

Обробка культивованих клітин низькими температурами. В окремих дослідах калюсну культуру на 14 день росту безпосередньо перед пересадкою на свіже середовище обробляли низькими позитивними температурами (+4°С) протягом 10, 30, 120 та 180 хв. Вміст шиконіну в сухій тканині визначали в кінці першого пасажу після обробки (на 14 день росту) та, в деяких випадках, в кінці наступних послідовних чотирьох-шести пасажів.

Визначення накопичення біомаси та вмісту шиконіну. Суху біомасу визначали висушуючи тканину при температурі 55-60?С до досягнення сталої ваги.

Вміст шиконіну визначали за такою методикою: аліквоти клітинної суспензії (пропорційно відбирали тканину і культуральну рідину) або тільки культуральну рідину, отриману після фільтрування культури через капронову сітку N 74 з розміром пор 100 мкм, або суху тканину вичерпно екстрагували підкисленим спиртом (1 мл конц. H2SO4 на 1 л EtOH), додаючи свіжі порції спирту. Об'єднані спиртові екстракти обробляли гексаном і енергійно струшували протягом 5 хв. Пігменти, що містяться в гексані, гідролізували 5% розчином KOH. Лужні розчини, в яких всі ефірні похідні шиконіну гідролізовані до шиконіну, аналізували фотоколориметричним методом при l=597 нм (ФЕК-Н-56, фільтр №8). Стандартом був лужний розчин аутентичного шиконіну, отриманого з НВО “ВІЛР” (Москва).

Цитологічний аналіз. Фіксацію проводили через 1-3 дні протягом 20 днів культивування. Тканину фіксували в оцтовокислому спирті (1:3) і готували давлені оцетоорсеїнові препарати за методикою (Кунах, Левенко, 1975). Для визначення мітотичного індексу в кожній точці фіксації підраховували 5–10 тис. клітин на 5–6 препаратах із різних ділянок тканини. Водночас підраховували кількість хромосом в метафазах і проводили облік анафазних аберацій хромосом.

Розміри клітин та ядер вимірювали за допомогою окуляр-мікрометра. В кожній точці фіксації вимірювали діаметри 100 клітин та ядер. Визначали співвідношення діаметра ядра до діаметра клітини (каріо/цитотип) за формулою: , і виражали у відсотках.

Для цитогенетичного аналізу використовували мікроскоп “NU-2E Carl Zeiss”. Мікрофотографування проводили за допомогою цифрової відеокамери “SAC – 410 PA” фірми “Samsung”.

Визначення коефіцієнта успадковування ознаки "накопичення шиконіну" (генетико-статистичний метод дослідження клітинних популяцій). Суспензію клітин фільтрували через капронову сітку (розмір пор 1мм), фільтрат відстоювали. З нижньої фракції поодиноких клітин та дрібних клітинних агрегатів отримували клони методом плейтингу, заплавляючи клітини в агаризоване середовище. Частину тканини, що залишилась, використовували для визначення вмісту шиконіну. Клони (нащадки), що досягали розміру інокуляту (близько 3 г живої маси) переводили в рідке живильне середовище і визначали в них вміст шиконіну на 14-й день росту. В наступних пасажах при пересадці перевагу надавали субкультурам, які мали найбільш інтенсивне червоно-буре забарвлення культуральної рідини, зумовлене виділенням в неї пігменту. Всього проаналізовано 41 клон штаму АЕ-2 і 56 клонів штаму АЕ-3 протягом п`яти послідовних пасажів. В кожному пасажі проаналізовано від 6 до 16 клонів. Kоефіцієнт успадковування ознаки "накопичення шиконіну" (h2), що відповідав коефіцієнту кореляції "батьки-нащадки", визначали дисперсійним методом (Вахтин, 1980).

Статистичні методи обчислення результатів.

Для перевірки рівності кількох середніх застосовували дисперсійний аналіз за однією ознакою. Для визначення подібності та відмінності між середніми застосували метод множинного порівняння Шеффе. Метод найменших квадратів застосовано для згладжування експериментальних кривих. Метод критерію медіани використано для виявлення ідентичності розподілів клітин, ядер та каріо/цитотипів клітин за їх розмірами. Застосовано метод парної лінійної регресії з метою виявлення кореляцій між експериментальними кривими всіх досліджуваних показників.

Для підбору кривих за експериментальними даними за допомогою методу найменших квадратів використовували комп'ютерну програму CurveЕxpert 1.3.

Результати і обговорення

Отримання нового клітинного штаму і його характеристика

Новий клітинний штам АЕ-3 створено в результаті візуального добору найяскравіше забарвлених варіантів, шляхом багаторазових повторних клонувань дрібних клітинних агрегатів (до 2 мм) найбільш продуктивного клону, отриманого від вихідного штаму АЕ-2. Варіанти штаму АЕ-3 отримані за схемою, наведеною на рис. 1.

Отриманий штам вирощується в рідкому та на твердому живильному середовищі. Він накопичує до 8% шиконіну в сухій тканині або до 1,12 г на 1л живильного середовища за 14 днів при глибинному вирощуванні і до 15% шиконіну в сухій тканині при поверхневому вирощуванні. Він перевищує за накопиченням шиконіну вихідний штам АЕ-2 в 2,5-3,5 раза при вирощуванні в суспензійній культурі і в 3-6 разів при вирощуванні на агаризованому (твердому) середовищі у вигляді калюсної культури.

ШТАМ АЕ-2

ШТАМ АЕ-3

Суспензійна культура Калюсна культура

Стандартні умови АЕ-3(с) Інтенсивне перемішування АЕ-3(сі) Стандартні умови АЕ-3(к) Обробка холодом АЕ-3(кх)

Рис. 1. Cхема отримання штаму АЕ-3 культури клітин арнебії барвної та його варіантів.

Цитогенетичні дослідження показали, що штам є міксоплоїдним з розмахом мінливості за числом хромосом від 10 до 130. Більшість (близько 90%) клітин, що діляться, містили від 20 до 48 хромосом. Модальний клас складали клітини, в яких нараховували 30-32 хромосоми (близько 30% від загальної кількості метафаз) (рис. 2, 3). Штам характеризувався порівняно невисоким рівнем анафазних аберацій хромосом (близько 6 %).

а б в

г Рис. 2. Метафазні пластинки з різним числом хромосом в клітинах штаму АЕ-3 культури Arnebia euchroma (Royle) Jonst. (63ґ12,5): а –30 хромосом; б – 32; в – 40; г – 60 хромосом у двоядерній клітині, з яких інше знаходиться в інтерфазі.

Число хромосом

Рис. 3. Розподіл за числом хромосом клітин штаму АЕ-3 при його вирощуванні в рідкому живильному середовищі: N – кількість вивчених метафаз.

Гетерогенність клітинних штамів за ознакою “накопичення шиконіну” та її успадковуваність

Визначення гетерогенності та коефіцієнта успадковування ознаки "накопичення шиконіну" (h2) для вихідного штаму АЕ-2 дало змогу охарактеризувати його як генетично гетерогенний: він показує широкий розмах мінливості за цією ознакою (рис. 4 (1)) і високе значення коефіцієнта h2 (+0,82). Це свідчить про те, що продуктивність цієї культури може бути значно підвищена внаслідок селекції. Це знайшло своє практичне підтвердження на прикладі одержання штаму АЕ-3. Параметри мінливості вивченої ознаки штаму АЕ-3 (рис. 4 (2)) та низьке значення коефіцієнта h2 (+0,07) свідчать про те, що за цих умов новий штам практично повністю реалізує свій генетичний потенціал. Подальше підвищення його продуктивності можна досягнути, очевидно, оптимізацією умов вирощування. Це припущення було підтверджено наступними експериментами.

Рис. 4. Розподіл субкультур арнебії барвної за вмістом шиконіну в стандартних умовах вирощування: 1 - штам АЕ-2, вивчено 119 субкультур; 2 - штам АЕ-3 вивчено 112 субкультур.

Підбір умов культивування для максимальної реалізації ознак продуктивності

Зміна умов глибинного вирощування штаму АЕ-3 на поверхневе на фоні підтримуючого добору та обробка холодом перед пересадкою на свіже середовище призвели до значного підвищення його продуктивності (рис. 5). Подальші дослідження були спрямовані на те, щоб виявити та окреслити параметри, які за розглянутих умов дають найбільш високі та стабільні показники продуктивності. Всі характеристики визначались в динаміці. Досліджували суспензію, яку вирощували в стандартних умовах на качалці обертального типу зі швидкістю руху 80-100 обертів за хвилину, – варіант АЕ-3(с). В іншому експерименті суспензію вирощували на качалці обертального типу зі швидкістю руху 200 обертів за хвилину, що вдвічі більше, ніж в стандартних умовах – варіант АЕ-3(сі). Досліджували калюс, що вирощувався в стандартних умовах, – варіант АЕ-3(к), а також калюсний варіант після обробки низькими температурами – АЕ-3(кх).

Рис. 5. Продуктивність культивованих клітин арнебії за різних умов вирощування: АЕ-2 – вихідний штам (суспензія); АЕ-3 (с) – суспензія штаму АЕ-3 в стандартних умовах вирощування; АЕ-3 (сі) – суспензія штаму АЕ-3 в умовах інтенсивного перемішування; АЕ-3 (к) – калюсна культура штаму АЕ-3 в стандартних умовах вирощування; АЕ-3 (кх) – калюсна культура штаму АЕ-3 після дії нетривалої гіпотермії.

Зміна умов культивування відразу позначалась на основному показнику культури – рості. При переведенні суспензійної культури в інший режим вирощування (при збільшенні швидкості руху качалки з 100 до 200 об/хв) спостерігали зміни в динаміці накопичення біомаси. Якщо в стандартних умовах крива росту складалась із чотирьох складових (рис. 6 а) і вихід на стадію плато відповідав 15-у дню, то при збільшенні швидкості перемішування культури її ріст описувався однокомпонентною кривою (рис. 6 б), максимальна швидкість росту культури зростала майже вдвічі, а вихід на стадію плато відбувався на 9-й день росту (рис. 6 б).

а б

в Рис. 6. Крива накопичення сухої біомаси - (1) - m(t) та похідні від її складових (2) - dm(t)/dt для варіантів: АЕ-3(с) – а; АЕ-3(сі) – б; АЕ-3(к) – в.

На фоні змін в динаміці росту варіанту АЕ-3(сі) спостерігали зростання частки дрібних клітинних агрегатів, порівняно з контрольними умовами, що, на думку технологів, краще підходить для біотехнологічного виробництва за аналогією з суспензією мікроорганізмів. Ростова крива, описана для режиму інтенсивного перемішування, більше наближена до модельної: в цьому випадку клітини в культурі ростуть більш синхронізовано, а сама культура стабільніша.

При вирощуванні штаму АЕ-3 у вигляді калюсної культури крива росту є двокомпонентною з виходами на плато на 5-й і 17-й дні росту (рис. 6 в). Вцілому, загальний приріст біомаси в трьох описаних вище дослідах практично збігається. Однак, описані криві росту відрізняються кількістю і тривалістю фаз. Різницю між динамікою росту в трьох експериментах доводять не тільки підібрані методом найменших квадратів криві, але й модальність похідних від цих кривих росту: перша диференційна крива має чотири піки, друга - один і третя – два піки (рис. 6).

Для варіанту АЕ-3(с) виявлено позитивну кореляцію з динамікою мітотичного індексу для швидкостей росту всіх складових (рис. 7 а). Визначені кореляції з динамікою мітотичного індексу можуть означати, що максимальна швидкість росту культури в періоди з 0-го по 20-й день досягається за рахунок мітотично активних клітин. Перевірка кореляції для варіанту АЕ-3(сі) теж виявила наявність позитивної кореляції з динамікою мітотичного індексу (рис. 7 б). Це може свідчити про те, що швидкість росту популяції тут, як і в попередньому варіанті, забезпечується клітинами, які діляться мітотично. Для варіанту АЕ-3(к) (рис. 7 в) виявлено позитивну кореляцію з похідною від першої складової кривої росту, з другою похідною кореляцію не доведено.

Аналіз кореляцій між динамікою ознаки “вміст шиконіну” в сухій тканині з динаміками різних класів клітин і ядер виявив подібність між суспензійними культурами АЕ-3(с) та АЕ-3(сі) і їх відмінність від калюсної АЕ-3(к). В суспензії накопичення шиконіну, можливо, відбувається в частині клітин малих розмірів, тоді як в калюсі цю функцію можливо виконує частина клітин великих розмірів з великими ядрами. В суспензії АЕ-3(с), на відміну від суспензії АЕ-3(сі) та калюсу АЕ-3(к), існує клас клітин, що мають ядра великих розмірів (>30 мкм). Кількість таких ядер зростає після 7-го дня росту і різко зменшується в старіючій культурі. Це досить чітко виявляється на кривій динаміки середнього розміру ядер (рис. 8). В обох суспензіях динаміки клітин з ядрами великих розмірів негативно корелюють з

а б

в Рис. 7. Динаміка швидкостей росту складових кривої росту (1) - dm(t)/dt та динаміка мітотичного індексу (2) для варіантів: АЕ-3(с) – а; АЕ-3(сі) – б; АЕ-3(к) – в.

Рис. 8. Динаміка середніх розмірів клітинних ядер для варіантів: АЕ-3(с) – 1; АЕ-3(сі) – 2; АЕ-3(к) – 3.

вмістом шиконіну в клітинах у біомасі. В калюсі АЕ-3(к) накопичення шиконіну корелює з кількістю великих клітин з ядрами розміром понад 24 мкм (встановлено позитивну кореляцію), ці ж клітини відповідають і за приріст біомаси. Можливо, виявлена відмінність забезпечує перевагу в продуктивності за шиконіном калюсу перед суспензійними варіантами штаму АЕ-3.

а б

в Рис. 9. Крива вмісту шиконіну в сухій біомасі (1) – с(t) та її похідна (2) – dc(t)/dt для варіантів: АЕ-3(с) – а; АЕ-3(сі) – б; АЕ-3(к) – в.

Залежно від умов культивування змінювався і характер накопичення шиконіну. Якщо в суспензії, що росте в умовах інтенсивного перемішування, і в калюсі динаміку вмісту шиконіну в сухій тканині наближено двома параболами (має ознаки бімодальності) (рис. 9 б, в), то в суспензії, що росте в стандартних умовах ту саму динаміку наближено шістьма параболами (має ознаки полімодальності) (рис. 9 а).

Полімодальний характер кривої вмісту шиконіну в поєднанні з кривою росту, що має чотири складові (тобто відрізняється від стандартної сигмаподібної кривої), може свідчити про нестабільний ріст культури за таких умов і можливі коливання ознак продуктивності. Керуючись вимогами біотехнологічного виробництва робимо висновок, що оптимальним варіантом культури для отримання шиконіну може бути суспензія, що вирощується в режимі інтенсивного перемішування (варіант АЕ-3(сі)), оскільки її характеристики продуктивності більш стабільні. Це підтверджується характером відповідних кривих, подібних до модельних.

ВИСНОВКИ

1. Методами клітинної селекції отримано новий високопродуктивний штам АЕ-3 культивованих клітин арнебії барвної. Він накопичує при вирощуванні у вигляді суспензійної культури до 8% шиконіну в сухій тканині, вихід якої сягає 16-18 г/л за 14 днів росту, або до 1,12 г шиконіну з 1л суспензії за пасаж.

2. Мінливість ознаки "вміст шиконіну" в сухій тканині варіює в широких межах: від 0,8 до 3,7% з середнім значенням 2,1% у вихідному штамі та від 3,5 до 16,0% з середнім 6,3% в штамі АЕ-3. Фенотипова гетерогенність штаму АЕ-2 зумовлена, головним чином, спадковою гетерогенністю (коефіцієнт успадковування h2=+0,82), а відселектованого від нього штаму АЕ-3 – переважно паратипічною мінливістю (h2=+0,07).

3. Умови калюсної культури, порівняно з суспензійною, сприяють більш повній експресії ознаки “вміст шиконіну”, ускладнюють характер експресії ознаки “вихід біомаси” і виявляють позитивну кореляцію динаміки показників продуктивності та динаміки кількості клітин і ядер великих розмірів.

4. Вирощування штаму АЕ-3 на твердому живильному середовищі у вигляді калюсу підвищує вміст шиконіну, порівняно із суспензійною культурою, майже вдвічі – з 8% до 15% від сухої маси. Загальна продуктивність калюсу складає від 0,7 до 1,5 г шиконіну з 1 л живильного середовища або від 50,0 до 107,1 мг шиконіну з 1 л за день.

5. Обробка посадкового матеріалу позитивними низькими температурами (+4 oC протягом 30 хв.) пригнічує приріст біомаси калюсної культури, але стимулює біосинтез шиконіну: його вміст зростає до 20,2% в сухій тканині, що на 60% перевищує контроль. Вцілому, загальна продуктивність, порівняно з контролем, зростає на 9,5%, дія холоду максимально реалізується в 4-5 пасажі після обробки.

6. Вивчення розмірів клітин і ядер, їх морфології, мітотичної активності, числа хромосом, рівня і типів аберацій хромосом не показало суттєвих відмінностей між варіантами штаму АЕ-3 за різних умов вирощування. Він є міксоплоїдним з модальним числом 32 хромосоми при розмаху мінливості за числом хромосом від 10 до 130 і має порівняно невисокий рівень анафазних аберацій хромосом (близько 6 %).

7. Комплексний аналіз динаміки ростових, цитологічних, цитоморфометричних та біосинтетичних характеристик штаму АЕ-3 за різних умов вирощування дозволив визначити умови культивування в суспензійній культурі в режимі інтенсивного перемішування як оптимальні. За цих умов ріст культури стабільний, криві росту і продуктивності подібні до модельних.

8. Ростові та біосинтетичні характеристики нового штаму АЕ-3, який перевищує за накопиченням шиконіну вихідний штам АЕ-2 в 2,5-3,5 раза при культивуванні в рідкому живильному середовищі, дозволяють рекомендувати його як об'єкт для біотехнологічного отримання шиконіну.

ПЕРЕЛІК НАУКОВИХ ПРАЦЬ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Кунах В.А., Поронник О.А., Захленюк О.В., Адонин В.И. Получение и характеристика новых клеточных линий арнебии красящей Arnebia euchroma (Royle) Jonst., продуцирующих шиконин // Физиология и биохимия культ. растений. - 1999. – Т. 31, № 3. - С. 208-213.

2. Поронник О.А., Кунах В.А., Адонин В.И. Накопление шиконина и цитологические особенности высокопродуктивной клеточной линии Arnebia euchroma при поверхностном и глубинном выращивании // Биополимеры и клетка. – 1999. – Т. 15, № 6. - С. 501-509.

3. Кунах В.А., Пороннік О.О. Гетерогенність за вмістом шиконіну і підтримуючий добір у культурі клітин арнебії барвної Arnebia euchroma // Доповіді НАН України. – 2000. - № 7. – С. 191-195.

4. Пороннік О.О., Мірюта Н.Ю., Адонін В.І., Кунах В.А. Динаміка клітинних популяцій арнебії барвної Arnebia euchroma при глибинному і поверхневому вирощуванні in vitro // Физиология и биохимия культ. растений. – 2000. – Т. 32, № 5. – С. 377-385.

5. Кунах В.А., Пороннік О.О. Штам культивованих клітин арнебії барвної Arnebia euchroma (Royle) Jonst. - продуцент шиконіна // Позитивне рішення про видачу патенту за заявкою № 2000041914 від 04.04.00.

6. Захленюк О.В., Поронник О.А., Кунах В.А. Культура клеток арнебии красящей - перспективный источник получения шиконина // Тез. IV Міжнародна конференція з медичної ботаніки. – Київ (Україна). - 1997. - С. 325-327.

7. Поронник О.А., Захленюк О.В., Кунах В.А. Влияние стрессового воздействия на биосинтез шиконина в культуре клеток Arnebia euchroma (Roylе) Jonst. // Труды Междунар. Конф. “Пути решения проблем и перспективы развития биотехнол. в декоративном садоводстве и плодоводстве”. - Ялта (Украина). - 1997. - С. 22.

8. Захленюк О.В., Поронник О.А., Кунах В.А. Получение высокопродуктивной клеточной линии Arnebia euchroma - источника шиконина // Труды VII Междунар. конф. “Биология клеток раст. in vitro, биотехнология и сохранение генофонда”. – Москва (Россия). - 1997. - С. 36.

9. Poronnyk O.A., Kunakh V.A. Contribution of Mn2+ and Co2+ ions to shikonin biosynthesis in Arnebia euchroma cell culture // Proc. II International Symp. on Plant Biotechnol. - Kyiv (Ukraine). - 1998. - P. 103.

10. Poronnyk O.A. Shikonin presents a secondary metabolite as an environmental sygnal // Proc. XXX Annual meeting of ESNA and International Union of Radioecol. – Keszthely (Hungary). - 2000. - P. 96.

АНОТАЦІЇ

Пороннік О.О. Одержання і характеристика нового исокопродуктивного штаму культивованих клітин арнебії барвної Arnebia euchroma (Royle) Jonst. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.20 – біотехнологія. - Інститут молекулярної біології і генетики НАН України, Київ, 2001.

Методами клітинної селекції отримано новий високопродуктивний штам АЕ-3 культивованих клітин арнебії барвної. Він накопичує при вирощуванні у вигляді суспензійної культури до 8% шиконіну в сухій тканині, вихід якої сягає 16-18 г/л за 14 днів росту, або до 1,12 г шиконіну з 1л суспензії за пасаж. Штам при вирощуванні в рідкому живильному середовищі перевищує за накопиченням шиконіну вихідний штам АЕ-2 в 2,5-3,5 раза. Дослідження мінливості ознаки "вміст шиконіну" в сухій біомасі в клітинному штамі АЕ-2 та отриманому від нього штамі АЕ-3 показало її варіювання в широких межах. Встановлено, що фенотипова гетерогенність штаму АЕ-2 зумовлена, головним чином, спадковою гетерогенністю (коефіцієнт успадковування h2=+0,82), а відселектованого від нього штаму АЕ-3 – переважно паратипічною мінливістю (h2=+0,07). Проведено порівняльний аналіз динаміки клітинних популяцій за параметрами росту, накопичення шиконіну, розмірів клітин і клітинних ядер та пошук можливих кореляцій між параметрами продуктивності та структурою клітинних популяцій при вирощуванні їх в суспензійній і калюсній культурі. Встановлено, що умови калюсної культури сприяють більш повній експресії ознаки “вміст шиконіну”, ускладнюють характер експресії ознаки “накопичення біомаси”, виявляють кореляцію показників продуктивності й динаміки кількості клітин і ядер великих розмірів. Такі ж ознаки як характер похідних від кривої накопичення шиконіну, а також негативна кореляція між кривими накопичення біомаси і динамікою середніх за розмірами клітин і ядер, мала залежать від умов (способу) вирощування ізольованих клітин арнебії барвної. Вони, очевидно, більшою мірою визначаються спадковими факторами. Ростові та біосинтетичні характеристики нового штаму АЕ-3 дозволяють рекомендувати його як об'єкт для біотехнологічного отримання шиконіну.

Ключові слова: Arnebia euchroma (Royle) Jonst., шиконін, клітини рослин in vitro, динаміка клітинних популяцій in vitro.

Поронник О.А. Получение и характеристика нового высокопродуктивного штама культивируемых клеток арнебии красящей Arnebia euchroma (Royle) Jonst. - Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.20 – биотехнология. - Институт молекулярной биологии и генетики НАН Украины, Киев, 2001.

Методами клеточной селекции получен новый высокопродуктивный штамм АЕ-3 культивируемых клеток арнебии красящей. Он накапливает при выращивании в виде суспензионной культуры до 8% шиконина в сухой ткани, выход которой достигает 16-18 г/л за 14 дней роста, или до 1,12 г шиконина с 1л суспензии за пассаж. Штамм при выращивании в жидкой питательной среде превышает по накоплению шиконина исходный штамм АЕ-2 в 2,5-3,5 раза. Исследование изменчивости признака "содержание шиконина" в сухой биомассе в исходном штамме АЕ-2 и полученном от него штамме АЕ-3 показало ее варьирование в широких пределах. Установлено, что фенотипическая гетерогенность штамма АЕ-2 обусловлена, главным образом, наследственной гетерогенностью (коэффициент наследования h2=+0,82), а отселектированного от него штамма АЕ-3 – преимущественно паратипической изменчивостью (h2=+0,07). Проведен сравнительный анализ динамики клеточных популяций по параметрам роста, накопления шиконина, размеров клеток и клеточных ядер и поиск возможных корреляций между параметрами продуктивности и структурой клеточных популяций при выращивании их в суспензионной и каллусной культуре. Установлено, что условия каллусной культуры способствуют более полной экспрессии признака “содержание шиконина”, усложняют характер экспрессии признака “накопление биомассы”, обнаруживают корреляцию показателей продуктивности и динамики количества клеток и ядер больших размеров. Такие же признаки, как характер производных от кривой накопления шиконина, а также отрицательная корреляция между кривыми накопления биомассы и динамикой средних по размерам клеток и ядер, очевидно, мало зависят от условий (способа) выращивания изолированных клеток арнебии красящей. Они, очевидно, в большей мере определяются наследственными факторами. Ростовые и биосинтетические характеристики нового штамма АЕ-3 позволяют рекомендовать его как объект для биотехнологического получения шиконина.

Ключевые слова: Arnebia euchroma (Royle) Jonst., шиконин, клетки растений in vitro, динамика клеточних популяций in vitro.

Poronnyk O.O. Obtaining and characterization of the novel highly productive strain of Arnebia euchroma (Royle) Jonst. cultured cells. - Manuscript.

Thesis for a candidate's degree by the specialty 03.00.20 – biotechnology. -Institute of Molecular Biology and Genetics of National Academy of Sciences of Ukraine, Kyiv, 2001.

Through the cell selection technique novel highly productive strain of Arnebia euchroma (Royle) Jonst. cultured cells has been obtained. If maintained as a suspension culture it may accumulate up to 8% of shikonin per dry tissue, whose yield would amount to 16-18 g/l for 14 days of growth, or 1.12 g of shikonin per 1 l of suspension for passage. The strain upon maintenance in liquid nutrient medium may exceed by the shikonin accumulation the original AE- strain 2.5-3.5 fold.

Evaluation of the "shikonin content" trait variability within the dry biomass of AE-2 strain and AE-3 strain derived from it showed its variation within wide range: from 0.8 to 3.7% with average value being 2.1% in strain AE-2 and from 3.5 to 16.0% with average value –6.3% in AE-3 strain. The phenotypic heterogeneity of AE-2 strain was found to be mainly due to hereditary heterogeneity (coefficient of inheritance h2=+0.82), while that of in AE-3 strain, selectively derived from it, resulted from paratypical variability (h2=+007).

Callus culture conditions as compared with suspension ones favor more complete expression of the "shikonin content" trait, complicate mode of expression for "biomass yield" trait, show positive correlation between the dynamics for productivity indices and those of cell number and large nuclear sizes. AE-3 strain maintenance on solid nutrient medium as a callus would increase shikonin content in comparison with the suspension culture almost twice as high – from 8% to 15% per dry mass. Total callus productivity seems to account for between 0.7 and 1.5 g of shikonin from 1 l of nutrient medium or between 50.0 and 107.1 mg of shikonin from 1 l for day.

Estimation of the cell and nuclear sizes, their morphology, level and type of chromosome aberrations failed to display any essential variations of the strain variants with differing conditions. The strain appears to be mixoploid with modal number of 32 chromosomes to show range of variation by chromosome number between 10 and 130. It is distinguished by relatively low level of anaphase chromosome aberrations (around 6%).

Comprehensive analysis of the dynamics for growth, cytological, cytomorphometric and biosynthetic characteristics of AE-3 strain in varying conditions of maintenance enabled to consider maintenance conditions in suspension culture in the regime of the extensive blending as optimal ones. In conditions of extensive blending growth of culture seems to be stable, curves of growth and productivity are comparable to model ones. As against the callus culture and suspension to be maintained in standard conditions, the suspension growth mode may be described as a monocomponent curve, while shikonin accumulation curve is bimodal in character.

Growth and biosynthetic characteristics of the novel AE-3 strain allow to recommend it as an object for the biotechnological shikonin production.

Key words: Arnebia euchroma (Royle) Jonst, shikonin, plant cells in vitro, cell population dynamics in vitro.