НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ ФІЗІОЛОГІЇ РОСЛИН І ГЕНЕТИКИ

Швартау Віктор Валентинович

УДК 581.1:632.954/632.95.02+632.95.025

ФІЗІОЛОГІЧНІ ОСНОВИ РЕГУЛЮВАННЯ АКТИВНОСТІ ГЕРБІЦИДІВ ЗА ДОПОМОГОЮ ХІМІЧНИХ СПОЛУК

03.00.12 - фізіологія рослин

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

доктора біологічних наук

Київ - 2001

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Інституті фізіології рослин і генетики НАН України, м.Київ

Науковий консультант: доктор біологічних наук, професор,

академік НАН України

Моргун Володимир Васильович

Інститут фізіології рослин і генетики НАН України,

директор інституту

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор

Головко Ераст Анатолійович

Національний ботанічний сад імені М.М.Гришка

НАН України,

завідувач відділу

доктор біологічних наук, професор

академік УААН

Гудков Ігор Миколайович

Національний аграрний університет,

завідувач кафедри

доктор біологічних наук, професор

Кур'ята Володимир Григорович

Вінницький державний педагогічний університет

імені Михайла Коцюбинського,

завідувач кафедри

Провідна установа: Київський національний університет

імені Тараса Шевченкa

Захист відбудеться 20 грудня 2001 року о 10 год. на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.212.01 Інституту фізіології рослин і генетики НАН України за адресою: 03022, Київ-22, вул. Васильківська, 31/17.

З дисертацією можна ознайомитись в бібліотеці Інституту фізіології рослин і генетики НАН України за адресою: 03022, Київ-22, вул. Васильківська, 31/17.

Автореферат розісланий “17” листопада 2001 року.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради Мордерер Є.Ю.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність проблеми. В сучасному рослинництві спостерігається інтенсивне зростання об'ємів застосування комплексних препаратів захисту рослин. В даний час кількість гербіцидів, що використовуються разом з хімічними речовинами, які модифікують їх активність, з урахуванням нефітотоксичних домішок препаративних форм, наближується до 100%. Про актуальність проблеми регулювання активності гербіцидів свідчить як велика кількість публікацій та патентів, так і чисельні спроби узагальнень даних питань - огляди [Gressel J., 1993; Hatzios K.K., 1996; Мережинський Ю.Г., Мордерер Є.Ю., 2001; Швартау В.В., 2001; та інші]. При цьому кількість комерційних антидотів гербіцидів залишається невеликою. Ще менш успішні роботи зі створення синергістів. До малодосліджених питань слід віднести і вивчення механізмів регуляції фітотоксичної дії гербіцидів у сумішах [Fedtke C., Trebst A. 1987; Abell L.M., 1996].

Відомо посилення активності гербіцидів класів антиауксинів, інгібіторів фотосинтезу, глутамінсинтетази, 5-енолпірувілшикимат-3-фосфатсинтази за допо-могою сполук азоту, амінів, ад'ювантів [Green J.M., Bailey S.B., 1989; Ладонин В.Ф., Алиев А.М., 1992]. Значно менше інформації про можливість регуляції активності гербіцидів - інгібіторів синтезу ліпідів, ацетолактатсинтази. На думку Мережинського Ю.Г. (1971, 1992); Hatzios К.К., Penner D. (1985) використання модифікаторів активності гербіцидів, що мають синергічну або антидотну активність, зумовлює досягнення ряду важливих цілей: забезпечує більш ефективну боротьбу з бур'янами; знижує сумарний негативний вплив застосування засобів хімічного захисту рослин на навколишнє середовище; зменшує небезпеку препаратів для людини та інших теплокровних безпосередньо, або за допомогою зниження вмісту залишкових кількостей токсикантів; значно відсуває термін появи стійких видів бур'янів; сприяє зниженню надходження токсикантів у грунт та збереженню сівозмін; підвищує стійкість сортів рослин до дії токсикантів.

Слід зазначити, що сільське господарство України цілком залежить від імпорту хімічних засобів захисту рослин, у тому числі й гербіцидів. При цьому обсяги імпорту пестицидів постійно зростають – від 90 млн дол. США у 1990 до 200 млн дол. США на рік і більше у 2000-2001 (дані Мінагропрому). Величезні для України кошти вкладаються не в розвиток власної інфраструктури, яка дозволяє розробляти та виробляти субстанції та готові форми комерційних пестицидних та інших сільськогосподарських хімікатів, а використовуються для придбання імпортних, переважно невиправдано дорогих, готових препаративних форм пестицидів, у т.ч. гербіцидів.

На сьогодні вітчизняна галузь наукового пошуку, виробництва та застосування сучасних високоефективних пестицидів перебуває у занепаді і потребує негайної модернізації.

Створення модифікаторів активності гербіцидів перспективних класів, яке грунтується на базі встановлення механізмів реалізації фітотоксичної дії, є одним з основних напрямків підвищення активності і селективності засобів для хімічної прополки і забезпечує скорочення термінів та зниження витрат на їх впровадження. Можливість точного передбачення без масштабних досліджень сайта дії гербіциду та напрямку зміни його фітотоксичності у суміші з модифікатором активності для її цілеспрямованого регулювання дозволяє економити для виробництва кошти у десятки млн дол. США [Duke S.O., 2000]. Тому вивчення фізіологічних механізмів дії екзогенних хімічних регуляторів фітотоксичності гербіцидів є одним з основних напрямків підвищення ефективності засобів для хімічного прополювання і має виключне значення при створенні наукових основ для впровадження вітчизняних комерційних сільськогосподарських хімікатів. Таким чином, незаперечним є той факт, що підвищення ефективності хімічних засобів для боротьби з бур'янами нерозривно пов'язано з фундаментальними розробками в галузі фізіології рослин.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. В основу дисертаційної роботи покладені дослідження автора, що проведені протягом 1988-2001 рр. Матеріали були отримані в процесі виконання наукових планових досліджень за темами: №199, № держреєстрації 01.85.0 013472, шифр програми 2.28.5 1985-89 “Вивчити механізми взаємодії нових гербіцидів з метою розробки ефективних сумішей для промислових технологій вирощування сільсько-господарських культур. Шифр програми 2.28.5, шифр теми 2.3.6.222 1990-93 “Вивчити метаболічні і генетичні зміни у рослин при комплексуванні гербіцидів з іншими біологічно активними речовинами з метою розробки екологічно безпечних технологій застосування”. Шифр програми 2.28.5, 1994-98 “Вивчити механізми регуляції фітотоксичності перспективних гербіцидів з метою розробки екологічно безпечних систем їх застосування”. Шифр програми 2.28.5, № держреєстрації 01984007624, 1999-2003 “Вивчити фізіологічні чинники толерантності злісних багаторічних бур`янів до гербіцидів - похідних сульфонілсечовин та інших системних препаратів з метою розробки ефективних прийомів боротьби з ними в посівах зернових та інших культур”. Програми ДКНТ при Кабінеті Міністрів України: № 6/234 “Розробка наукових основ експрес-методів визначення пестицидів з використанням сенсорних систем”, 1993 ; та № 6.4/166 “Фізіологічні основи зменшення гербіцидного навантаження на агроекосистеми” 1997-99. Програма Кабінету Міністрів України, № держреєстрації 0196u021204 “Розробити засоби знищення наркотиковмісних рослин на основі нових та існуючих екологічно безпечних препаратів” 1998-1999.

Робота виконувалась також в рамках договорів про наукове співробітництво з Інститутом органічної хімії НАН України (1989-2001), з Інститутом біоорганічної хімії та нафтохімії НАН України (1999), а також зі співробітниками Інституту органічної хімії СВ РАН, Інституту хімічної фізики РАН, Інституту біології Казанського НЦ РАН та Інституту органічного синтезу АН Латвії.

Мета і задачі досліджень. Головною метою роботи являлось розкриття фізіолого-біохімічних механізмів модифікування активності сучасних гербіцидів – інгібіторів синтезу амінокислот, ліпідів та препаратів інших груп за допомогою основних регуляторів активності гербіцидів хімічної природи: елементів мінерального живлення, синергістів та антидотів.

Для досягнення зазначеної мети були поставлені наступні задачі:

1. Визначити основні етапи механізмів реалізації фітотоксичної дії, на рівні яких можливе регулювання активності гербіцидів.

2. Дослідити вплив елементів мінерального живлення на активність гербіцидів основних перспективних класів та вивчити фізіолого-біохімічні процеси, на яких базується регулювання фітотоксичної дії гербіцидів фоном живлення.

3. Провести пошук високоефективних синергістів та антидотів гербіцидів серед регуляторів основних етапів реалізації фітотоксичної дії гербіцидів - відомих та нових препаратів різних класів.

4. За допомогою фізіологічних та біохімічних тестів вивчити особливості механізму дії нових модифікаторів активності гербіцидів – синергістів та антидотів.

5. Дослідити активність синергістів та антидотів гербіцидів в залежності від їх хімічної будови, визначити структурні вимоги до будови молекули для отримання максимального ефекту синергізму, чи антидотного ефекту.

6. Розробити методи скринінгу нових сполук на гербіцидну активність та детектування присутності токсикантів в об'єктах навколишнього середовища на основі використання в якості сенсорів гербіцидів їх сайтів дії.

Об'єктом досліджень були фізіолого-біохімічні механізми дії гербіцидів, синергістів та антидотів, а предметом досліджень – фізіологічна природа модифікації фітотоксичності. В роботі використовувались загальноприйняті стандартні методи фізіолого-біохімічних досліджень: лабораторні, вегетаційні, польові досліди на рослинних об'єктах, визначення біохімічними методами ферментативної активності; проникності мембран; статистичної обробки даних.

Наукова новизна одержаних результатів. Встановлено, що інгібітори синтезу ліпідів є перспективними регуляторами активності гербіцидів – інгібіторів ацетил-КоА-карбоксилази. Вперше розроблено високоефективні синергісти протизлакових гербіцидів класу арилоксифеноксипропіонової кислоти на основі похідних пропіонатів і динітроaнілінів та досліджено механізм реалізації синергізму.

З'ясовано, що гербіциди – інгібітори ферментів синтезу амінокислот взаємодіють синергічно або адитивно, якщо вони впливають на ключові ферменти біосинтезу. Відмінності дії двох гербіцидів у механізмі чи величині інгібування одного ферменту (сайту дії) також є основою створення синергічних сумішей. Знайдено, що гербіциди - інгібітори ацетил-КоА-карбоксилази взаємодіють синергічно, якщо вони суттєво відрізняються за ефективністю інгібування ферменту.

Запропоновано використання в якості сенсорів сайтів дії гербіцидів: ацетолактатсинтазу кукурудзи і сої та хлоропласти гороху, що іммобілізовані на ТШХ пластинах для детектування відповідно інгібіторів ацетолактатсинтази та фотосистеми ІІ, а також для скринінгу нових сполук на гербіцидну активність.

Знайдено високоефективні синергісти гербіцидів серед похідних R-амідосульфонілбензо-15-краун-5 та фосфоровмісних краун-ефірів, та виявлена залежність між синергічною дією даних препаратів і посиленням проникності мембран з відповідним накопиченням гербіцидів в тканинах чутливих видів однодольних рослин.

Гербіциди сучасних класів класифіковані на групи за механізмами посилення фітотоксичності та рівнем відклику на додавання азоту.

Виявлені нові антидоти – похідні краун-сульфонілсечовин та N-(3-піридоїл)-S,S-діалкілсульфілімінів, які захищають культурні рослини від впливу гербіцидів класів сульфонілсечовин та динітроанілінів. Встановлено, що антидотна активність краун-сульфонілсечовин до гербіцидів класу сульфонілсечовин пов'язана зі збереженням активності ацетолактатсинтази чутливих видів рослин.

Відкрито новий клас гербіцидів – інгібіторів ацетолактатсинтази: похідні арилсульфамідів ізоніпекотинової кислоти; та знайдені 2 нові гербіциди інших класів: цис-ди-R-дибензо-18-краун-6 біс(трихлорацетат) та 5-(4-метилфеніл)-4-феніл-1,2,4-триазол-3-тіо)-ефір 2,4-дихлорфеноксіоцтової кислоти.

Новизна та практична значимість роботи захищена авторськими свідоцтвами: АС 1566687, АС 1623153, АС 1649795, АС 1637249, АС 1766926; патентом України № 34258 А, рішенням на видачу патенту України №39983 від 15.10.2001 по заявці №2000116265 від 06.11.2000 та 2 заявками на патенти України.

Теоретичне та практичне значення одержаних результатів. На основі узагальнення отриманих даних розроблена стратегія фізіологічних основ регулювання активності гербіцидів на основних етапах реалізації фітотоксичної дії за допомогою елементів мінерального живлення, синергістів і антидотів .

Знайдені нові гербіциди та високоефективні синергісти і антидоти перспективних груп гербіцидів.

Запропоновано для експрес-визначення вмісту гербіцидів та скринінгу нових сполук на гербіцидну активність використовувати зміни активності сайта дії – ферменту ацетолактатсинтази. Розроблено високочутливий метод детектування гербіцидів – інгібіторів фотосистеми ІІ та препаратів інших класів з використанням в якості сенсорів хлоропластів, які іммобілізовані на пластинах для ТШХ з подальшим проведенням визначення вмісту токсикантів методом реєстрації змін індукції флуоресценції або спектрофотометрично - реакцією з 2,6-дихлорфеноліндофенолом.

Гербіциди сучасних класів класифіковані за механізмами посилення фітотоксичності при додаванні азоту, що визначило вимоги до структури діючої речовини для отримання синергічного ефекту при взаємодії із амонійними сполуками.

Представлені напрямки і засоби регулювання активності гербіцидів можуть знайти застосування в практиці рослинництва та в подальшому цілеспрямованому пошуку гербіцидів та модифікаторів їх активності.

Основні положення, що виносяться на захист

1. Гербіциди – інгібітори різних ферментів синтезу амінокислот взаємодіють синергічно, якщо вони впливають на ключові ферменти рослин. Відмінності дії двох інгібіторів одного ферменту також зумовлюють модифікацію гербіцидної активності.

2. Гербіциди – похідні арилоксифеноксипропіонової кислоти синергічно по відношенню до злакових видів бур'янів взаємодіють з інгібіторами синтезу ліпідів, у тому числі з представниками класу інгібіторів ацетил-КоА-карбоксилази.

3. Синергісти класу краун-ефірів - R-сульфоніламіди і фосфорвмісні структури 12-краун-4 та амонійні сполуки ефективно підвищують фітотоксичність гербіцидів, що супроводжується змінами проникності клітинних мембран та посиленням накопичення гербіцидів в чутливих однодольних видах рослин.

4. Розроблений метод експрес-скринінгу сполук на гербіцидну активність та швидкого детектування гербіцидів - інгібіторів ацетолактатсинтази (сульфонілсечовин), який грунтується на реєстрації змін вмісту ацетолактату в листках кукурудзи та сої.

Особистий внесок здобувача. Автор особисто розробив концепцію роботи, визначив мету, завдання та об`єкти досліджень, спланував та виконав експерименти, провів аналіз одержаних результатів та підготував матеріали до друку. Нові теоретичні та експериментальні ідеї дисертації належать автору. Основні експериментальні матеріали роботи одержані автором самостійно. У виконанні окремих експериментів приймали участь співробітники відділу фізіології дії гербіцидів Інституту фізіології рослин і генетики НАНУ, Інституту органічної хімії НАНУ, Інституту біоорганічної хімії та нафтохімії НАНУ. Це відзначено на сторінках дисертації.

Синтез більшості наведених у роботі нових фізіологічно активних сполук був виконаний співробітниками Інституту органічної хімії НАНУ та Інституту біоорганічної хімії та нафтохімії НАНУ.

Апробація результатів дисертації. Основні положення роботи доповідались на III Всесоюзній конференції по хімії та біохімії макроциклічних сполук (Іваново, 1988), на Всесоюзній конференції "Химия и технология пиридинсодержащих пестицидов" (Черноголовка, 1988), на конференціях "Проблемы повышения плодородия почв в условиях интенсивного земледелия" (Москва, 1988), " Изучение, охрана и рациональное использование природных ресурсов" (Уфа, 1989), "Экологические вопросы рационального природопользования" (Рига, 1989), "Синтез и исследование биологически активных соединений" (Рига, 1989), "Агроэкологическая обстановка на сельскохозяйственных угодьях УССР и пути снижения их загрязнения токсичными веществами" (Черкаси, 1989), Всесоюзній нараді "Проблема азота в интенсивном земледелии" (Новосибирськ, 1990), ІІІ і IV Всесоюзніх конференціях молодих вчених по фізіології рослинної клітини (Петрозаводськ, 1988 і Мінськ, 1990), на конференціях "Экологические проблемы защиты растений" (Ленінград, 1990), "Деградация пестицидов при комплексной защите сельскохозяйственных культур от вредных организмов" (Ленінград, 1990), на XIV науково-координаційній нараді та симпозіумі спеціалістів країн-членів РЕВ по темі 12.Х.2 "Разработка комплексных мер борьбы с сорняками" (Москва, 1988), на Республіканській конференції "Биологическая фиксация молекулярного азота и азотный метаболизм бобовых растений" (Тернопіль, 1991), на міжрегіональній науково-практичній конференції "Экологические проблемы аграрного производства. Симпозиум 2: эколого-ландшафтное районирование, развитие адаптивного растениеводства и производство экологически чистой продукции" (Дніпропетровськ, 1992), на 9th Congress of the Federation of European Societies of Plant Physiology, Brno, 1994, на конгресі "Problemele fiziologiei si biochimiei plantelor" (Shisinau, 1994), на Міжнароднiй науково-практичній конференції "Геоекологічні дослідження: стан і перспективи" (Івано-Франкiвськ, 1995), на Міжнароднiй нарадi "Актуальні питання фізіології рослин в аспекті екологічних проблем України" (Чернівці, 1995), на Міжнародній науково-практичній конференції "Экологические аспекты загрязнения окружающей среды" (Київ, 1996), Всеукраїнському науково-практичному семінарі (Інститут землеробства, Чабани, 1999).

Матеріали дисертації багаторазово доповідались на засіданнях і наукових семінарах відділу фізіології дії гербіцидів, науково-теоретичних семінарах Інституту фізіології рослин і генетики НАНУ.

Результати досліджень нових фізіологічно активних сполук багаторазово доповідались на наукових семінарах Інституту органічної хімії НАНУ.

Публікації. За темою дисертації опубліковано 51 наукову працю, із них 1 глава у монографії, 21 експериментальна стаття у провідних фахових виданнях; отримано 7 авторських свідоцтв і патентів. Подано 2 заявки на патенти.

Структура і об'єм роботи. Дисертаційна робота складається із вступу, 7 розділів, аналізу та узагальнення результатів досліджень, основних висновків. Список цитованої літератури містить 599 джерел. Дисертація має об'єм 398 сторінок, проілюстрована 74 таблицями та 48 рисунками.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ

ОБ'ЄКТИ, МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ

Дослідження фізіологічних механізмів регулювання фітотоксичності сполук проводили в умовах лабораторних, вегетаційних та польових дослідів на рівні інтактних рослин, окремих ферментативних чи фізіологічних реакцій. В якості тест-об'єктів використовували ячмінь ярий (Hordeum vulgare L. sensu lato) сортів Одеський-100 та Одеський-115; овес (Avena sativa L.) сортів Астор та Чернігівський 28; пшеницю озиму (Triticum aestivum L.) сортів Киянка та Київська 7 (1998-2001), Лютесценс 7; кукурудзу (Zea mays L.) гібридів Дніпровський-320 АМВ та Дніпровський 472 МВ, Сатурн, Нептун СВ; цукрові буряки (Beta vulgaris L.) сорту Ялтушковська однонасінна 045; картоплю (Solanum tuberosum L.) сорту Гатчинський; редьку олійну (Raphanus sativus L.) сорту Радуга; сою (Glycine max (L.) Merr.) сортів Нива та Київська 27; горох (Pisum sativum L. sensu lato) сортів Уладовський ювілейний та Неосипаючий 1; мак (Papaver somniferum L.) сорту Беркут; коноплі посівні (Cannabis sativa L.) сорту Золотоноські однодомні; огірки (Cucumis sativus L.) сорту Ніжинські місцеві, салат (Latuca sativa L.), просо куряче (Echinochloa crus-galli (L.) Beauv.), вівсюг звичайний (Avena fatua L.), мар білу (Chenopodium album L.), мишій зелений (Setaria viridis L.) та пирій повзучий (Elуtrigia repens (L.) Nevski). Насіння бур'янів та кореневища пирію для вегетаційних дослідів збирали на необроблених ділянках дослідно-виробничого відділу ІФРГ НАНУ, пгт. Глеваха, Васильківського р-ну Київської обл.

Гербіцидну активність сполук визначали у лабораторних умовах за модифікованим методом Сергєєвої [Швартау В.В., Мережинський Ю.Г. та ін., 1992]. Умови проведення вегетаційних та польових дослідів стандартні [Доспехов Б.А., 1985]. Польові досліди проводились в 1988-1992 та 1994-1995 роках в умовах дослідно-виробничого відділу ІФРГ НАНУ, пгт. Глеваха, Васильківського р-ну Київської обл. Насіння сої перед посівом інокулювали бульбочковими бактеріями Bradyrhizobium japonicum штам 631.

Показники якості врожаю визначали за прописом Єрмакова А.І та співавт. (1972): вміст аскорбінової кислоти - по відновленню 2,6-дихлорфеноліндофенолу, вміст крохмалю – поляриметрично.

Рівень фітотоксичності сполук визначали за змінами вмісту маси сухої речовини досліджуваних рослин, а у низці дослідів – візуально чи за вмістом маси сирої речовини [рекомендації ВНДІЗР, Ленінград, 1980; Лой Н.П., Кукаленко С.С., 1983].

Антиауксинову активність сполук визначали потенціометрично по ауксин(дикотекс)-індукованому виходу протонів з колеоптилів етіольованих паростків вівса в умовах водної культури [Fitzsimons P.J., 1987]. Паростки рослин в умовах водної культури отримували на середовищі Хогленда-Арнона ІІ [Гродзинский А.М., Гродзинский Д.М., 1973].

Проникність мембран визначали кондуктометрично за змінами виходу електролітів [Vanstone D.E., Stobbe E.H., 1977] в модифікації [Швартау В.В., 1988].

Вміст гербіцидів у грунті та рослинах визначали за методами ГХ та ТШХ [Клисенко М.А., Александрова Л.Г., 1983] з подальшою денситометрією на хроматоденситометрі фірми “Kamag”.

Визначення вмісту гербіцидів - інгібіторів фотосистеми ІІ та сполук інших класів проводили також з використанням в якості сенсорів іммобілізованих на пластинах для ТШХ хлоропластів гороху [Трач В.В., Швартау В.В. та ін., 1994], колориметрично чи шляхом реєстрування впливу сполук на варіабельну флуоресценцію хлорофілу [Федоренко Ю.П., Швартау В.В., 1988; Швартау В.В., Корнеев Д.Ю., Трач В.В., 1997].

Вплив сполук на активність симбіотичної азотфіксації визначали ацетиленовим методом по [Hardy R.W.F., Holsten R.D., Jackson E.K., Burns R.C., 1968] у пропису [Алисова С.М., Чундрова А.И., 1974].

Ацетолактатсинтазу виділяли з листків кукурудзи і сої при 4 оС: відфільтровували екстракт, виділяли фракцію 0,5 насичення сульфатом амонію, знесолювали на Sephadex G-50SF з відбором зон з ферментативною активністю, ліофілізували. Вміст білка визначали за методом [Bradford M.M., 1976]. У якості стандарту використовували БСА (Merck KgaA) чи альбумін людини (Біофарма, Київ). Визначення активності ацетолактатсинтази проводили шляхом спектрофотометричного реєстрування змін вмісту ацетолактату після його термічного та кислотного декарбоксилювання до ацетоїну [Singh B.K., Stidham M.A., Shaner D.L, 1988]. Вміст ацетоїну визначали при 530 нм реакцією з перекристалізованим 1-нафтолом та креатином [Westerfeld W.W., 1945] чи аргініном. В якості стандарту використовували ацетоїн (Flucka). Максимальний рівень накопичення ацетолактату досягали шляхом інгібування 1,1-циклопропандикарбоновою кислотою (ЦПК) (Aldrich) ферменту ацетолактатмутази (редуктоізомерази гідроксикетокислот) (ЕС 1.1.1.86) [Schwartau V.V., Trach V.V., 1994). Рослини обробляли інгібітором за 15 год до початку дослідів по визначенню впливу гербіцидів класу сульфонілсечовин на активність ацетолактатсинтази.

Активність ацетил-КоА-карбоксилази (ЕС 6.4.1.2) листків злакових видів рослин визначали по включенню [14C]НСО3 [Lichtenthaler Н.К., 1993].

Для визначення протеазної та естеразної активності наважки листків паростків рослин гомогенізували у 0,15 М фосфатному буфері при +4 оС та центрифугували 30 хв при 8000 об/хв. Загальну естеразну активність у листках паростків рослин визначали за гідролізом Na-бензоїл-L-аргінін-4-нітроаніліду гідрохлориду (Merck KgaA) по [Schwert G.W., Takenaka J.A., 1955] за прописом фірми Merck, KGaA (1990).

Протеазну активність визначали за величиною розщеплення субстрату з гемоглобіном великої рогатої худоби за Ансоном [Нортроп Д., Кунитц М., Хэрриот Р., 1950] з наступним осадженням білків 5 % розчином трихлороцтової кислоти та спектрофотометричним реєструванням при 670 нм продуктів гідролізу після їх фарбування робочим розчином реактиву Фоліна-Чокальтеу за Ансоном [Швартау В.В., Трач В.В., 1996].

Аналіз взаємодії гербіцидів та інших сполук при спільному застосуванні проводили за методом [Colby S.R., 1963].

Базу даних для розрахункового комп'ютерного пошуку нових сполук з використанням взаємозв'язку структура-активність готували за прописом USDA [Creager R.A., Osborne E.M., Wiswesser W.J, 1985; Creager R.A., Wiswesser W.J., 1987]. Комп'ютерні розрахунки проводили співробітники Інституту біоорганічної хімії та нафтохімії НАНУ.

Статистичну обробку отриманих результатів проводили за Доспєховим Б.А. (1985). Статистичний аналіз проводили в Exсel [Лапач С.Н., Чубенко А.В., Бабич П.Н., 2000] та з використанням комп'ютерних програм ANOVAд, SP7,0, ChemOffice Proд, Isisд.

Автор щиро вдячний наставникам – зав. відділом фізіології дії гербіцидів Мережинському Юрію Георгійовичу та академіку Моргуну Володимиру Васильовичу за багаторічну допомогу та підтримку, а також академіку Марковському Леоніду Миколайовичу, академіку Лозинському Мирону Онуфрійовичу та співробітникам Інституту фізіології рослин і генетики НАНУ, Інституту органічної хімії НАНУ і Інституту біоорганічної хімії та нафтохімії НАНУ за плідну співпрацю.

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

ВПЛИВ ЕЛЕМЕНТІВ МІНЕРАЛЬНОГО ЖИВЛЕННЯ НА ФІТОТОКСИЧНУ ДІЮ ГЕРБІЦИДІВ

Детальний огляд власних і літературних даних свідчить, що основним елементом мінерального живлення, який суттєво впливає на зростання фітотоксичності гербіцидів, є азот [Ладонін В.Ф., 1980; Hatzios K.K., Penner D., 1985; Швартау В.В., 1988; та інші].

За даними вегетаційних дослідів на одно- та дводольних видах культурних рослин та бур'янів (Hordeum vulgare L. sensu lato, Avena sativa L., Triticum aestivum L., Zea mays L, Raphanus sativus L., Papaver somniferum L., Cucumis sativus L., Latuca sativa L., Echinochloa crus-galli (L.) Beauv., Avena fatua L., Chenopodium album L., Setaria viridis L.) та польових дослідів на Glycine max (L.) Merr., Solanum tuberosum L., Cannabis sativa L. встановлено, що додавання сполук азоту до розчинів гербіцидів для обприскування зумовлює посилення активності похідних феноксиалканкарбонових кислот, інгібіторів 5-енолпірувілшикимат-3-фосфат-синтази, глутамінсинтетази. Помітно нижчий рівень відгуку на азот визначено для негалогензаміщеного похідного сульфонілсечовин - нікосульфурону. Для хлорсульфурону встановити посилення гербіцидної дії азотом не вдалося.

Введення до розчинів для обприскування сполук азоту мало впливало на активність протизлакових гербіцидів – похідних арилоксифеноксипропіонової кислоти. В той же час підвищення рівня фону азотного живлення до 100 кг/га азоту призводить до достовірного посилення активності гербіцидів класу арилоксифеноксипропіонової кислоти.

Основні класи сучасних гербіцидів можна розподілити на групи за рівнем відгуку на фон азотного живлення (рис. 1):

·

Гербіциди першої групи об'єднує механізм надходження у рослини. У структурі молекул цих гербіцидів є кислотний фрагмент (див. рис. 1), тому стимуляція катіонами амонію чи іншими фізіологічно активними речовинами Н+-АТФази плазмалеми зумовлює підкислення клітинної стінки, що стимулює (синергічно) надходження токсикантів, вірогідно шляхом котранспорту з протоном. Наприклад, вважають, що фосфінотрицин транспортується в клітину за системою глутамат/Н+ котранспорту [Ullrich W.R., Ullrich-Eberius C.I., Kocher H., 1990].

·

Рис. 1. Схема впливу іонів амонію на фітотоксичність гербіцидів основних сучасних класів.

Досходове застосування гербіцидів – інгібіторів синтезу ліпідів (тіокарбамати [Швартау В.В., Трач В.В., 1999], ?-хлороацетаміди [Scott R.C., Shaw D.R., Ratliff R.L., Newsom L.J., 1998]) зумовлює посилення активності посходових гербіцидів – похідних арилоксифеноксипропіонової кислоти і рівень зростання активності посходових протизлакових препаратів при додаванні сполук азоту до розчинів для обприскування.

До третьої групи відносяться гербіциди з низьким рівнем підвищення активності при додаванні азоту – галогензаміщені сульфонілсечовини, тіокарбамати, ?-хлорацетаміди, динітроаніліни. Посилення активності гербіцидів даної групи сполуками азоту спостерігається рідко. Для ряду гербіцидів зростання активності при застосуванні з азотом пов'язано з пошкодженням культурних рослин [Швартау В.В., 1988].

Таким чином, активність гербіцидів різних класів може бути посилена азотом, якщо сполуки надходять в рослини за механізмом стимуляції катіонами амонію Н+-АТФази плазмалеми і підкислення клітинної стінки, що сприяє надходженню токсикантів шляхом котранспорту з протоном. Невід'ємним елементом молекули гербіциду при цьому є кислотний фрагмент. Тому речовини, які впливають на структуру та функціональні властивості мембран є потенційними модифікаторами активності гербіцидів. Це положення також підтверджується при вивченні фізіологічних механізмів взаємодії краун-ефірів з гербіцидами.

ФІЗІОЛОГІЧНІ ОСОБЛИВОСТІ ВЗАЄМОДІЇ КРАУН-ЕФІРІВ ТА ГЕРБІЦИДІВ

При вивченні незаміщених краун-ефірів та їх похідних як регуляторів фітотоксичності встановлено, що сполуки загальної формули R-амідосульфонілбензо-15-краун-5 та фосфорвмісний бензо-12-краун-4 є ефективними синергістами тіокарбаматів та гербіцидів інших класів. Синергізм при взаємодії R-амідосульфонілбензо-15-краун-5 та ептаму спостерігається при концентрації поліефіру на 1 - 3 порядки нижче, ніж концентрація гербіциду. Селективність дії гербіцидів під впливом краун-ефірів підвищується чи залишається незмінною. Так для протизлакових досходових гербіцидів класу тіокарбаматів при додаванні синергістів похідних R-амідосульфонілбензо-15-краун-5 визначено посилення активності на 12 – 44 % до однодольних видів: Echinochloa crus-galli (L.) Beauv., Setaria viridis L., Triticum aestivum L., Hordeum vulgare L. sensu lato, при незмінній токсичності до Glycine max (L.) Merr.

Синергічна активність краун-ефірів корелює з величиною впливу сполук на проникність клітинних мембран та посиленням накопичення гербіциду у чутливих видів рослин. При додаванні синергістів класу R-амідосульфонілбензо-15-краун-5 до ептаму встановлено зростання накопичення гербіциду у паростках Hordeum vulgare L. sensu lato до 180 % при незмінній величині або зниженні накопичення у паростків Glycine max (L.) Merr. При цьому на варіантах з ептамом, який використовували в якості контролю, знайдено у Hordeum vulgare L. sensu lato 3,37 х 10-10 г гербіциду/г сирої маси, у Raphanus sativus L. – 7,26 х 10-9 г гербіциду/г сирої маси.

Адитивне підвищення виходу електролітів при внесенні гербіциду і краун-ефіру спостерігалося в чутливого виду злакової рослини - Triticum aestivum L. (рис. 2) і не було відмічено у стійкого виду - Glycine max (L.) Merr.

Адитивне посилення виходу електролітів при дії суміші синергіста класу краун-ефірів та протизлакового гербіциду знайдено також в дослідах на паростках Echinochloa crus-galli (L.) Beauv., Setaria viridis L., Hordeum vulgare L. sensu lato.

Пошук гібридних за будовою сполук загальної формули краун-ефір+гербіцид призвів до знаходження нового високоактивного неселективного гербіциду - цис-ди-R-дибензо-18-краун-6 біс(трихлорацетату).

В той же час спроба створити гібридні препарати на основі сполучення молекул краун-ефіру з молекулами, що мають сульфонілсечовинний фрагмент, не призвела до появи нових гербіцидів. При цьому встановлено, що краун-сульфонілсечовини є потенційними антидотами гербіцидів – інгібіторів ацетолактатсинтази класу сульфонілсечовин. Серед досліджених сполук найбільш активний в якості антидоту відомого гербіциду хлорсульфурону 4-N-[2-(5-метилтіодіазил)амінокарбоніл]-амідосульфонілбензо-15-краун-5 – структурний макроциклічний аналог гербіцидів класу сульфонілсечовин. Ефективна дія антидоту спостерігається як при застосуванні одночасно з хлорсульфуроном, так і перед внесенням гербіциду. При внесенні антидоту після обробки гербіцидом величина захисної активності значно знижується. Доведено, що антидотна дія краун-сульфонілсечовин пов`язана зі збереженням активності ацетолактатсинтази чутливої до гербіциду культури - Zea mays L. (табл. 1).

Таблиця 1

Вплив 4-N-[2-(5-метилтіодіазил)амінокарбоніл]амідосульфонілбензо-15-краун-5 (сполука IV) і хлорсульфурону на активність ацетолактатсинтази Zea mays L.

Хлорсуль-фурон, мкМ Сполука IV, мкМ Маса сухої речовини паростків, г/варіант, Активність ацето-лактатсинтази, %*

- - 14,5 100

0,5 - 2,7 9

1,0 - 0,3 3

3,0 - 0,1 1

5,0 - 0,1 0

- 0,5 14,8 95

- 1,0 14,1 94

- 3,0 13,5 92

- 5,0 9,3 77

А. Обробка хлорсульфуроном з наступною обробкою сполукою IV

0,5 1,0 0,4 10

0,5 5,0 0,3 11

Б. Обробка сполукою IV з наступною обробкою хлорсульфуроном

0,5 1,0 12,1 51

0,5 5,0 14,0 63

В. Одночасна обробка хлорсульфуроном і сполукою IV

0,5 1,0 11,9 41

0,5 5,0 12,7 44

НІР 0,95 0,75 5

m, % 3,7 3,9

Примітка. * - На необробленому речовинами контролі активність ферменту становить 100% (45 нМ/мг білка/хв).

Намочування насіння в розчинах антидоту (10-3 – 10-5 М протягом 24 год при 20 оС) було більш ефективним, ніж обприскування вегетуючих рослин чи внесення препарату в грунт. Можна припустити, що краун-сульфонілсечовини реалізують антидотну активність шляхом блокування взаємодії хлорсульфурону із сайтом дії на ацетолактатсинтазі, що співпадає з даними про застосування антидотів шляхом внесення до-, разом та після хлорсульфурону.

Селективність дії антидотів класу похідних краун-сульфонілсечовин може бути підвищена шляхом обробки насіння культури.

Таким чином, сполуки, які близькі за структурою до гербіцидів – інгібіторів ферментів (ацетолактатсинтази), але не мають гербіцидних властивостей є потенційними антидотами інгібіторів ацетолактатсинтази класу сульфонілсечовин.

ФІЗІОЛОГІЧНІ ПРИНЦИПИ РЕГУЛЮВАННЯ АКТИВНОСТІ ОСНОВНИХ КЛАСІВ ГЕРБІЦИДІВ – ІНГІБІТОРІВ СИНТЕЗУ АМІНОКИСЛОТ

Базуючись на численних дослідженнях сполук різних класів в якості модифікаторів активності сульфонілсечовин можна стверджувати, що основною сучасною тенденцією розвитку інгібіторів ацетолактатсинтази є створення нових гербіцидів – похідних відомих класів (наприклад – сульфонілсечовин), а також пошук гербіцидів нових класів - інгібіторів ацетолактатсинтази. Пошук модифікаторів активності інгібіторів ацетолактатсинтази має значення при створенні препаративних комерційних форм гербіцидів.

В зв'язку з високою селективністю дії та низькими нормами застосування для широкомасштабного скринінгу нових сполук в якості інгібіторів ацетолактатсинтази доцільно використовувати детектування змін активності ферменту чутливих до гербіцидів видів рослин. При цьому для досягнення максимального рівня вмісту ацетолактату в листках, що робить можливим реєстрацію його наступного зниження під дією сполук – інгібіторів ацетолактатсинтази, доцільно використовувати селективні інгібітори ацетолактатмутази – похідні карбонових кислот, наприклад - 2-диметилфосфіноїл-2-гідроксіоцтову кислоту, 1,1-циклопропандикарбонову кислоту та інші. Так, обробка рослин Glycine max (L.) Merr. 1,1-циклопропандикарбоновою кислотою у концентрації 100 мкМ за 15 год до обробки сульфонілсечовинами зумовлює близьке до максимального рівня накопичення ацетолактату в клітинах листків, який визначають спектрофотометрично після термічного та кислотного декарбоксилювання до ацетоїну (табл. 2). Обробка хлорсульфуроном по фону 1,1-циклопропандикарбонової кислоти викликає швидке зниження вмісту ацетолактату, що робить можливим експрес-визначення присутності інгібітору ферменту. Застосування методу дозволило значно прискорити роботи по скринінгу фізіологічно активних сполук на гербіцидну активність, внаслідок яких було встановлено, що R-піперазинсульфоаніліди з атомом азоту у гетероциклі є новими високоефективними гербіцидами - інгібіторами ацетолактатсинтази. Сполуки класу R-піперазинсульфоанілідів ХН-1 - ХН-5 фітотоксичні до дводольних видів рослин: Raphanus sativus L. та Chenopodium album L. при застосуванні у дозах 10-50 г/га. При цьому величина інгібування ферменту (ІД50) варіює від 245 (ХН-2) до 88 (ХН-5) нМ. Вважаємо, що новий клас інгібіторів ацетолактатсинтази - R-піперазинсульфоаніліди - перспективний для подальшого вивчення та запровадження у практику рослинництва.

Таблиця 2

Вплив 1,1-циклопропандикарбонової кислоти та хлорсульфурону на накопичення ацетоїну у листках Glycine max (L.) Merr.

Варіанти досліду, мкМ Вміст ацетоїну мкг . г-1 . ч-1 Напрямок зміни фітотоксичності при сумісному застосуванні

1,1-циклопро-пандикарбонова кислота Хлорсульфурон

1 - 0,2 -

10 - 3,3 -

100 - 3,9 -

1000 - 4,1 -

100 0,1 1,3 Антагонізм

100 1 0,2 Антагонізм

100 10 0,1 Антагонізм

- 0,1 0,1 -

НІР 0,95 0,4

m, % 3,9

При досліджені взаємодії гербіцидів - інгібіторів ацетолактатсинтази з іншими інгібіторами синтезу амінокислот встановлено, що синергічний або адитивний ефект спостерігається при застосуванні інгібіторів ацетолактатсинтази (ключовий фермент шляху синтезу амінокислот з розгалуженим вуглецевим ланцюгом) з інгібіторами глутамінсинтетази (ключовий фермент асиміляції амонію) чи 5-енолпірувілшикимат-3-фосфатсинтази (ключовий фермент шикиматного шляху) (табл. 3).

Таблиця 3

Вплив гербіцидів - інгібіторів синтезу амінокислот на Raphanus sativus L.

Варіанти досліду Фітотоксичність*, % до неушкодже-ного контролю Тип взаємодії

Гербіцид Доза, мг/посудину

Гранстар 0,01 80 -

Раундап 0,1 5 -

Баста 0,1 5 -

ЦПК 0,5 0 -

Гранстар+раундап 0,01 + 0,1 100** Синергізм (S)

Гранстар+баста 0,01 + 0,1 100** Синергізм (S)

Гранстар+ЦПК 0,01 + 0,5 75 Антагонізм

Баста + раундап 0,1 + 0,1 30** Синергізм (S)

Баста + ЦПК 0,1 + 0,5 5 (Антагонізм)

Раундап + ЦПК 0,1 + 0,5 5 (Антагонізм)

НІР 0,95 10 -

Примітка. * - візуальна оцінка величини ураження за тиждень після обробки. S - у взаємодії гербіцидів визначений синергізм по Colby S.R. (1963). ** - Посилення активності статистично достовірне.

Гербіциди - інгібітори ацетолактатсинтази взаємодіяли з інгібіторами ацетолактатмутази антагоністично. Зважаючи на значимість даних ферментів у синтезі амінокислот можна стверджувати, що гербіциди - інгібітори синтезу амінокислот взаємодіють синергічно або адитивно, якщо обидва активні стосовно двох різних ключових у біосинтезі ферментів.

Відомо, що відмінності у метаболізмі гербіцидів в рослинах, зокрема класу сульфонілсечовин, є одним із елементів їх селективності. Основною групою ферментів, для яких встановлена участь у деструкції молекул сульфонілсечовин, є цитохром Р450 монооксигенази (ЕС 1.14.14.1) [Schuler M.A., 1996]. В умовах польових дослідів на Cannabis sativa L. показано, що застосування відомого інгібітору мікросомального окислення піперонілбутоксиду сприяє підвищенню активності ряду гербіцидів класу сульфонілсечовин. Ці дані узгоджуються з гіпотезою [Fedtke С., Trebst A., 1987], згідно якої інгібітори мікросомальних монооксигеназних систем є синергістами гербіцидів, а індуктори – антидотами. Розробка та застосування селективних регуляторів мікросомального окислення, як модифікаторів метаболізму гербіцидів, має перспективу в майбутньому. Даний напрямок може базуватися на використанні інгібіторів чи індукторів мікросомального окислення, що запозичені з галузі фармакології.

ДОСЛІДЖЕННЯ АНТИДОТНОЇ АКТИВНОСТІ ПОХІДНИХ

N-(3-ПІРИДОЇЛ)-S,S-ДІАЛКІЛСУЛЬФІЛІМІНІВ ПО ВІДНОШЕННЮ ДО СОЇ

Відомо, що нікотинамід та деякі його похідні сполуки є індукторами мікросомальних оксидаз тварин, зокрема цитохрому Р450 [Zollner H., 1993]. Встановлено, що похідні нікотинаміду володіють антидотною активністю для теплокровних до нітрофенолів. Серед них також виявлені антидоти гербіцидів [Левченко Е.С., Слюсаренко Е.И., Марковский Л.Н. та ін., 1990]. Тому були досліджені в якості модифікаторів активності гербіцидів нові похідні нікотинаміду загальної формули N-(3-піридоїл)-S,S-діалкилсульфіліміни.

Похідні N-(3-піридоїл)-S,S-діалкилсульфілімінів проявляють антидотну активність до гербіцидів класу динітроанілінів, тіокарбаматів, арилоксифеноксипропіонової кислоти та сульфонілсечовин (наведене у порядку зниження величини захисної дії). Знайдено, що найбільш ефективним в якості антидоту є йодид N-(3-піридоїл)-S,S-діізопропилсульфіліміну. Сполука ефективно запобігає токсичній дії трефлану на рослини Glycine max (L.) Merr., що показано в умовах лабораторних, вегетаційних та польових дослідів. Внесення речовини в грунт виявилось більш ефективним, ніж обприскування вегетуючих рослин.

Показано, що антидотна дія похідних R-сульфіліміну пов'язана з підвищенням активності нітрогеназного комплексу бульбочкових бактерій Glycine max (L.) Merr. В наших дослідах азотфіксувальна активність нітрогеназного комплексу бульбочкових бактерій контрольних рослин Glycine max (L.) Merr. складала 12,7 мкМ С2Н2/(рослину х год-1) (прийняте за 100 %), а на варіанті з трефланом - 11,9 мкМ (93 %). Водночас у рослин сої на фоні 0,05 мг/кг йодиду N-(3-піридоїл)-S,S-діізопропилсульфіліміну + трефлан рівень азотфіксувальної активності значно підвищувався, до 20,3 мкМ С2Н2/(рослину х год-1) (158 %). Можливо, одним із чинників посилення азотфіксувальної активності бульбочкових бактерій Glycine max (L.) Merr. під впливом R-сульфілімінів є підвищення деградаційної активності мікроорганізмів, що було виявлено Пароменською Л.Н., Васильченко В.Ф. (1974). Це підтверджується і більш високим ступенем деградації трефлану в грунті в присутності йодиду S,S-діізопропілу-N-(1-метил-3-піридоїл)сульфіліміну (табл. 4).

Обприскування вегетуючих рослин водним розчином антидоту класу R-сульфіліміну в концентрації 0,01 % також посилювало рівень деградації трефлану в грунті. Дещо нижча величина метаболізму гербіциду при додаванні R-сульфілімінів виявлена в рослинах.

Селективність дії антидотів класу похідних сульфіліміну може бути підвищена шляхом обробки насіння культури. Відомі комерційні антидоти картолін та R-25788 (дихлормід) вірогідно не впливали на рівень деструкції трефлану в грунті і значно поступалися за ефективністю дії новим похідним нікотинаміду.

Таблиця 4

Вплив антидота йодиду S,S-діізопропілу-N-(1-метил-3-піридоїл)сульфіліміну на деградацію трефлану у грунті у посівах Glycine max (L.) Merr.

Варіанти досліду Вміст трефлану, мг/кг грунту

Фаза 3-х справжніх листочків* Фаза бутонізації Фаза дозрівання

Контроль** - трефлан, 6,25 мг/кг 5,26а 1,94а 0,05а

Трефлан, 6,25 мг/кг + йодид S,S-діізопропілу-N-(1-метил-3-піридоїл)сульфіліміну концентрацією, мг/кг грунту:

0,05 2,70б 1,79б Не визначено

5,0 4,16в 1,75б Не визначено

500 5,11а 1,69б Не визначено

Трефлан, 6,25 мг/кг грунту + антидоти,