НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ МОЛЕКУЛЯРНОЇ БІОЛОГІЇ І ГЕНЕТИКИ

ВАЛЬОВКА ТАРАС ЙОСИФОВИЧ

УДК 577.218

577.217

ПОРІВНЯЛЬНИЙ АНАЛІЗ ФУНКЦІОНАЛЬНИХ ТА РЕГУЛЯТОРНИХ

ОСОБЛИВОСТЕЙ КІНАЗ РИБОСОМНОГО БІЛКА S6

(S6K1 і S6K2)

03.00.03 - молекулярна біологія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

КИЇВ - 2001

Дисертацією є рукопис.

Роботу виконано на кафедрі біохімії Львівського національного університету

ім. Івана Франка та в Інституті молекулярної біології і генетики НАН України, м. Київ

Науковий керівник: кандидат медичних наук,

Гут Іван Тарасович

Інститут молекулярної біології і генетики

НАН України, м. Київ,

провідний науковий співробітник відділу структури і

функцій нуклеїнових кислот

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор

Стойка Ростислав Степанович

Інститут біології клітини НАН України, м. Львів,

завідувач відділу клітинної проліферації

доктор біологічних наук, старший науковий співробітник

Негруцький Борис Сергійович

Інститут молекулярної біології і генетики

НАН України, м. Київ,

провідний науковий співробітник відділу механізмів трансляції генетичної інформації

Провідна установа: Київський національний університет імені Тараса

Шевченка, біологічний факультет, м. Київ

Захист відбудеться "27" березня 2001 року о 10 годині

на засіданні спеціалізованої Вченої Ради Д 26.237.01

Інституту молекулярної біології і генетики НАН України

за адресою: 03143, м. Київ-143, вул. академіка Заболотного, 150.

З дисертацією можна ознайомитись в бібліотеці Інституту молекулярної біології і генетики НАН України

Автореферат розіслано 23 лютого 2001 року

Вчений секретар

спеціалізованої Вченої Ради,

кандидат біологічних наук О. В. Підпала

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Вивчення внутрішньоклітинних сигнальних механізмів, залучених до контролю процесів клітинного росту, проліферації та апоптозу є актуальною проблемою сучасної біохімії та молекулярної біології. Відомо, що координована регуляція цих процесів є необхідною умовою забезпечення нормального розвитку і життєдіяльності організму. Порушення цієї регуляції може спричинити патологічні зміни в клітині, типовим проявом яких є трансформація клітин і, як наслідок, злоякісний ріст (Conlon et al., 1999).

Рівень трансляції, як одна з регуляторних ланок білкового синтезу, є важливим чинником, який визначає інтенсивність процесів клітинного росту. Встановлено, що важливим компонентом сигнальних шляхів, залучених до контролю процесів трансляції, є серин-треонінова кіназа рибосомного білка S6 (S6K). Knock-out aнaліз S6K1 на миші та дрозофілі підтвердив значення даної кінази в регуляції клітинного росту і проліферації (Shima et al., 1998, Montagne et al., 1999). Показано також роль цієї кінази в регуляції клітинного циклу та ініціації білкового синтезу, індукованого ростовими факторами, гормонами та онкогенами (Terada et al., 1994, Jefferies et al., 1997). Поряд із цим, існують дані, які вказують на зв’язок S6 кіназного сигнального шляху з канцерогенезом. Дослідження генетичних порушень при карциномах молочної залози виявили ампліфікацію гена, який кодує S6K1 і розташований в 17q22-24 хромосомній ділянці. Ампліфікація цього гена корелює із зростанням експресії даної форми S6 кінази в цих клітинах, як на рiвні PHK так i бiлкa. Важливо також зазначити, що ампліфікація генів 17q22-24 хромосомної ділянки є характерною особливістю онкологічних захворювань даного типу (Couch et al., 1999).

Iдентифікація нової форми кінази рибосомного білка S6 (S6К2) (Gout et al., 1998, Lee-Fruman et al., 1999) обумовила необхідність дослідження механізмів регуляції та принципів функціонування S6 кіназного сигнального шляху в клітині. S6К1 та S6К2 характеризуються високим ступенем гомології послідовності амінокислот в каталітичному домені (83%), районі, який відповідає подовженню каталітичного домену (80%) і в ділянці аутоінгібіторного домену (73%) (рис.1). Поряд із цим встановлено, що їх N- та C-кінцеві ділянки характеризуються відносно низьким рівнем гомології – 28% і 25% відповідно.

Показано, що активація S6K1 опосередкована множинним фосфорилюванням регуляторних амінокислотних залишків у каталітичному і С-кінцевому доменах. Дані центри фосфорилювання є консервативними в S6K2, за винятком одного з рапаміцин-чутливих регуляторних амінокислотних залишкiв, який відповідає Thr444 в первинній структурі S6К1. Поряд із цим, важливою особливістю С-кінцевого району S6К2 є наявність Pro-багатої послідовності (залишки 459-480), яка може бути залучена у взаємодію з сигнальними білками, що містять SH3-домени (Src-гомологічні домени типу 3) (Gout et al., 1998). Показано також, що карбокси-кінцева послідовність (амінокислотні залишки 355-525) у структурі S6К1 формує ділянку зв’язування з PDZ доменом нейрабіну, який є специфічним білком нейронів і здатний взаємодіяти з F-актином. Гомологічна S6К2 є коротшою формою і не містить послідовності, критичної для розпізнавання і зв’язування PDZ домену. Описані відмінності у структурі S6К1 і S6К2 можуть визначати особливості функціонування, регуляції та компартменталізації цих ензимів у клітині.

Проведені дослідження дають підставу вважати, що на рівні S6К1 конвертуються регуляторні сигнали опосередковані ТОR/FRAP-, PKC- та РІ-3`-кіназними сигнальними шляхами (Weng et al., 1995, Burnett et al., 1998, Susa et al., 1992). З огляду на це важливо з’ясувати функціональну роль цих сигнальних шляхів у регуляції гомологічної S6К2, а також дослідити їх регуляторний вплив на фосфорилювання індивідуальних амінокислотних залишків у структурі обох форм S6 кінази. Актуальним в цій проблемі є ідентифікація Ser/Thr-специфічних протеїнкіназ, здатних фосфорилювати S6К1 і S6К2, і, таким чином, здійснювати безпосередній контроль їх активності.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота виконувалась за планом наукової роботи кафедри біохімії Львівського національного університету імені Івана Франка в співробітництві з Інститутом Ракових досліджень імені Людвіга ( Лондон, Велика Британія) та відділом механізмів трансдукції клітинних сигналів Інституту біології клітини НАН України.

Мета та завдання роботи. Метою даної роботи було вивчення функціональних особливостей та механізмів регуляції кіназ рибосомного білка S6K1 і S6K 2 у відповідь на стимуляцію клітин ростовими факторами та іншими мітогенними чинниками.

Відповідно до поставленої мети було сформульовано наступні завдання:

1. Створити рекомбінантні повнорозмірні, делетовані та мутантні форми S6K1 і S6К2 та клонувати їх в рсDNA3.1. вектор, здатний експресувати рекомбінантний білок у клітинах ссавців.

2. Проаналізувати особливості активації рекомбінантних повнорозмірних та делетованих форм S6К1 і S6К2 у відповідь клітин ембріональної нирки людини лінії НЕК293 на стимуляцію сироваткою та фібронектином.

3. Порівняти вплив специфічних інгібіторів РІ-3`-кіназного і TOR/FRAP-залежного сигнальних шляхів на активність рекомбінантних повнорозмірних та мутантних форм S6К1 і S6К2 за умов стимуляції клітин НЕК293 сироваткою і фібронектином.

4. Вивчити рівень S6 кіназної активності мутантних форм S6К1 і S6К2 у нестимульованих і стимульованих сироваткою клітин лінії НЕК293.

5. Провести аналіз особливостей активації рекомбінантних повнорозмірних та делетованих форм S6К1 і S6К2 у відповідь клітин НЕК293 на дію форболових ефірів і дослідити роль різних ізоформ РКС у регуляції обох кіназ.

Для вирішення поставлених завдань було використано такі основні методи дослідження: конструювання експресуючих векторів, спрямований мутагенез, тимчасова трансфекція клітин, імунопреципітація та імуноблот аналіз, мас-спектральний аналіз.

Oб’єктом проведеного дослідження були кінази рибосомного білка S6 типу 1 і типу 2, а предметом – функціональні властивості цих кіназ та сигнальні механізми, які опосередковують їх регуляцію в клітинах ембріональної нирки людини лінії НЕК 293.

Наукова новизна одержаних результатів. У представленій роботі вперше проведено порівняльний аналіз функціональних та регуляторних аспектів кінази рибосомного білка S6 типу 1 (S6К1) та нової гомологічної кінази рибосомного білка S6 типу 2 (S6К2). Вивчення динаміки активації S6К1 і S6К2 дозволило показати відмінності між активністю двох форм S6 кінази в початковий період ранньої відповіді клітин на дію різних позаклітинних індукторів. Виявлено також, що інгібіторний вплив імуносупресора рапаміцину носить різний характер стосовно S6К1 і S6К2 при різних концентраціях інгібітора. На підставі аналізу мутантних рекомбінантних форм S6К1 і S6К2, встановлено механізм, який пояснює відмінності в чутливості обох форм кінази до дії рапаміцину. Поряд із цим, проаналізовано активацію S6К1 і S6К2 у відповідь клітин лінії НЕК293 на дію форболових ефірів. Вперше показано специфічність фосфорилювання С-кінцевого регуляторного району S6К2 різними ізоформами протеїнкінази С in vitro.

Практичне значення одержаних результатів. Отримані результати дозволяють охарактеризувати ряд закономірностей функціонування та механізмів, які лежать в основі передачі регуляторного сигналу через S6 кіназний сигнальний шлях. Це доповнює експериментальні дані, які створюють перспективи для пошуку і впровадження в практику препаратів, які дадуть змогу корегувати патологічні зміни, повязані з порушенням функціонування S6 кіназного сигнального шляху і процесів біосинтезу білка вцілому.

Створено і охарактеризовано конститутивно-активовані мутанти цитоплазматичних та ядерних ізоформ S6К1 і S6К2, які були використані для отримання стабільних клітинних ліній. Використання цих ліній відкриває перспективи для вивчення ролі кожної з цих ізоформ у регуляції білкового синтезу, клітинного циклу і в процесах злоякісної трансформації клітин.

Матеріали дисертаційної роботи використовують при читанні спецкурсів “Молекулярні механізми інтеграції клітинного метаболізму” і “Сигнальні механізми трансдукції клітин” на кафедрі біохімії Львівського національного університету імені Івана Франка.

Особистий внесок здобувача. У процесі виконання дисертаційної роботи автор самостійно провів пошук і проаналізував теоретичні та експериментальні дані за темою проведеного дослідження у вітчизняній та зарубіжній літературі. Дисертант розробив програму для вирішення поставлених завдань, особисто виконав експериментальну частину роботи і проаналізував отримані результати. Напрямок наукової роботи, визначення експериментальних підходів, а також аналіз отриманих результатів постійно обговорювався з науковим керівником к.б.н. Гут І.Т., зав. відділу механізмів трансдукції клітинних сигналів Інституту біології клітини НАН України, к.б.н., доц. Дробот Л.Б. та зав. кафедрою біохімії Львівського національного університету імені Івана Франка д.б.н., проф. Великим М.М.

Апробація роботи. Основні положення дисертації доповідались на III Пapнaciвcькiй конференції (м.Львів, 2000), Міжнародній конференції з генетики і молекулярної біології (м.Львів, 2000), конгресі ”Oнкологія-2000” (м.Kиїв, 2000), “The Wellcome Trust” Міжнародному Симпозіумі (м.Лондон, Велика Британія, 2001), а також на засіданнях кафедри біохімії Львівського національного університету імені Івана Франка, відділу механізмів трансдукції клітинних сигналів Інституту біології клітини НАН України, спільному засіданні відділів структури та функцій нуклеїнових кислот, молекулярної генетики та відділу механізмів трансляції генетичної інформації Інституту молекулярної біології і генетики НАН України.

Публікації. За темою дисертації опубліковано 3 статті у фахових наукових журналах та тези 4 доповідeй у збірниках матеріалів з’їздів і конференцій.

Структура та обсяг роботи. Дисертація складається із вступу, огляду літератури, матеріалів і методів дослідження, результатів та обговорення, висновків і списку використаних джерел літератури. Дисертацію викладено на 129 сторінках стандартного машинопису. Вона містить 31 рисунoк, 2 таблицi. Список використаної літератури охоплює 183 найменувань.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ

МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ

При виконанні роботи використовували клітини ембріональної нирки людини лінії НЕК293 (“American Type Culture Collection”). Клітини культивували в середовищі DMEM, яке містило 10% телячої ембріональної сироватки (“Life Technologies, Inc.”), 2 мМ L-глутаміну, 10 мкг/мл пеніциліну і 0,25 мкг/мл стрептоміцину (“Life Technologies, Inc.”).

Для того, щоб створити рекомбінантні S6K1 і S6K2 та клонувати їх у pcDNA3.1. вектор, кДНК послідовності обох форм модифікували за допомогою полімеразної ланцюгової реакції. В реакції використовували специфічні олігонуклеотиди, які з 5`-кінця містили центр розпізнавання рестриктазою BamHI і безпосередньо за ініціюючим метіоніном послідовність, що кодує ЕЕ-tag епітоп (MEFMPME), а з 3`-кінця - центр розпізнавання рестриктазою EcoRI. Ампліфіковану і плазмідну ДНК розщеплювали рестриктазами BamHI і EcoRI (“New England Biolabs”). Очищені фрагменти ДНК лігували, використовуючи ДНК лігазу фірми “TaKaRa”, згідно протоколу компанії. Конструювання делетованих в N- і С-кінцевих районах ДНК послідовностей S6K1 і S6K2 проводили з використанням полімеразної ланцюгової реакції. Продукти полімеразної реакції клонували в pcDNA3.1. вектор як описано вище. Для отримання мутантних форм S6K1 і S6K2, які містили точкові мутації використовували набір для мутагенезу “Quick Change Site-Directed Mutagenesis Kit” фірми ”Stratagene”. Нуклеотидну послідовність отриманих мутантів перевіряли за допомогою автоматичного секвенатора ABI 377 (“Applied Biosystem”).

Трансфекцію клітин НЕК293 плазмідними ДНК здійснювали, використовуючи ліпофектамін (Life Technologies, Inc.) згідно протоколу компанії. Через 20 годин після трансфекції клітини переводили на безсироваткове середовище і після 28 годин голодування стимулювали, інкубуючи їх у присутності 10% сироватки чи 500 нМ 12-О-тетрадеканоїл-форбол-13-асетатом (ТРА, “Calbiochem”) протягом зазначеного періоду часу. У випадку стимуляції фібронектином (“Calbiochem”) клітини попередньо трипсинізували і витримували в суспензії протягом 1 години при 370С. В експериментах із використанням інгібіторів, клітини інкубували у присутності зазначених концентрацій рапаміцину чи вортманіну протягом 15 хв перед стимуляцією.

Лізис клітин проводили як описано в роботі Malik et al., 1996. Імунопреципітацію рекомбінантних кіназ здійснювали, інкубуючи лізати клітин з анти-ЕЕ-tag моноклональними антитілами і білок-G-сефарозою (“Pharmacia”). S6 кіназну активність визначали в імунопреципітатах (Lane et al., 1992), використовуючи як субстрат 40S рибосоми, очищені з гомогенату печінки щура (Thomas et al., 1978). Білкові продукти кіназної реакції розділяли електрофорезом в 12,5% поліакриламідному гелі, а рівень фосфорилювання S6 білка визначали за допомогою PhosphorImager (Molecular Dynamics). S6 кіназну активність виражали в імпхв-1 32Р, включеного в S6 білок.

Фосфорилювання С-кінцевих пептидів та повнорозмірних рекомбінантних S6K1 і S6K2, імунопреципітованих із лізатів клітин НЕК293, здійснювали різними рекомбінантними ізоформами протеїнкінази С (“Calbiochem”), використовуючи протокол компанії. Продукти кіназної реакції аналізували як описано вище. Ідентифікацію центрів фосфорилювання проводили мас-спектральним аналізом за допомогою MALDI-TOF приладy фірми “PE Biosystems”.

Двомірний електрофорез здійснювали як описано в роботі Gorg et al., 1985. Імуноблот аналіз рекомбінантних білків проводили згідно методичних рекомендацій Ausubel et al., 1992.

Всі досліди проводили 3-5 рази. В роботі наведено середні значення величин і стандартні похибки (Х ).

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕННЯ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

1. Експресія та функціональна характеристика рекомбінантних S6K1 і S6K2

Одним із сучасних експериментальних підходів для вивчення механізмів функціонування та регуляції сигнальних білків є тимчасова експресія рекомбінантних форм цих білків в клітині (Roop et al., 1983). З цією метою було створено рекомбінантні повнорозмірні, а також делетовані в регуляторних N- чи C-кінцевих районах форми S6K1 і S6К2 (табл.1). Отримані конструкти клонували у рсDNA3.1. вектор, який здатний ефективно експресувати рекомбінантний білок у клітинах ссавців. Детальний аналіз рекомбінантних форм обох кіназ, експресованих в клітинах НЕК293, виявив, що базальний і стимульований сироваткою рівень S6 кіназної активності S6К2 є на 20-35% нижчим в порівняні з S6K1. Це може вказувати як на різну спорідненість до субстрату, так і на відмінності функціональної активності цих форм S6 кінази, пов’язані з особливостями їх структури.

Відомо, що активація S6K1 in vivo зумовлена множинним фосфорилюванням специфічних залишків Ser і Thr у структурі цього ферменту. Фосфорилювання та функціональна кооперація двох із них, а саме Thr252 і Thr412, є домінантним фактором активації S6K1 (Alessi et al., 1997). З метою проаналізувати функціональну значимість гомологічних амінокислотних залишків у структурі S6К2 було створено і охарактеризовано мутантні форми кінази, в яких треонін замінено на глутамінову кислоту (табл.1). Проведений аналіз виявив, що мутація Thr412 чи Thr401 в S6K1 і S6К2, відповідно, зумовлює 2,3-3,0 кратне зростання S6 кіназної активності цих мутантів. Поряд із цим, аналогічна заміна Thr252 чи Thr241, відповідно, виявляє протилежний ефект і спричиняє повне інгібування активності у випадку обох форм кінази. Одночасна мутація обох регуляторних залишків не відновлює кіназну активність цих ферментів. Аналогічне інгібування активності спостерігалось у випадку заміни залишків Lys123 чи Lys112 на Ser в районі зв’язування АТФ S6K1 і S6К2, відповідно. Отримані дані дозволяють зробити припущення про те, що залишок Thr252/241 у структурі каталітичного домену є функціонально необхідним для прояву кіназної активності, тоді як фосфорилювання Thr412/401 може бути етапом, який лімітує величину цієї активності.

Відомо, що фосфорилювання S6K1 спричинює появу додаткових форм з нижчою електрофоретичною рухливістю, які відповідають активованому статусу кінази. Нами проаналізовано зміни фосфорилювання S6K2 та мутантної форми цієї кінази (Т401Е) у відповідь клітин НЕК293 на стимуляцію сироваткою (рис.2). Показано, що сироватка індукує зростання і появу нових високофосфорильованих форм S6K2. У випадку заміни Thr401 на Glu високофосфорильовані форми ферменту виявляли незалежно від присутності ростових факторів у культyральному середовищі, що підтверджує конститутивно активований стан даного мутанта. Отримані результати корелюють з літературними даними стосовно фосфорилювання S6K1 і постулюють подібність молекулярних механізмів активації цих форм S6 кінази.

Порівняльний аналіз первинної структури обох форм кінази вказує на те, що поряд із високою консервативністю центрів фосфорилювання, S6K2 характеризується відсутністю одного

Характеристика рекомбінантних форм S6K1 і S6K2 Таблиця 1.

Рекомбінантна форма | Нуклеотидна послідовність в районі мутації | S6 кіназна активність, %

S6K1 | 383пн GACTTTCAT 391пн

1252пн TTTACATAT 1260пн

772пн CACACATTT 780пн |

100*

S6K1N75 | делеція 54 амінокислотних

залишків з N-кінця | 26

S6K1C104 | делеція 104 амінокислотних

залишків з С-кінця | 100 | S6К1(K123S) | 385пн ATGAGGGTG 393пн | 2-3 | S6K1(T412E) | 1252пн TTTGACTAT 1260пн | 230 | S6K1(T252E) | 772пн CACGACTTT 780пн | 2-3 | S6K1(T252/412E) | 772пн CACGACTTT 780пн

1252пн TTTGACTAT 1260пн2-3 |

S6K2 | 403пн GACTTTCAT 411пн

1270пн TTCACATAC 1278пн

790пн CACACATTT 798пн |

65-80

S6K2N64 | делеція 43 амінокислотних

залишків з N-кінця | 28

S6K2C86 | делеція 93 амінокислотних

залишків з С-кінця | 90-100 | S6К2(K112S) | 403пн GACCCTCAT 411пн | 2-3S6K2(T401E) | 1270пн TTCGACTAC 1278пн | 200 | S6K2(T241E) | 790пн CACGACTTT 798пн | 2-3S6K2(T241/401E) | 790пн CACGACTTT 798пн

1270пн TTCGACTAC 1278пн | 2-3

центру фосфорилювання, який відповідає Thr444 в S6K1. Крім цього, N- i С-кінцевий регуляторні

райони S6K1 і S6К2 характеризуються низьким ступенем гомології, що дає підставу зробити припущення про існування відмінностей в регуляції обох форм S6 кінази в клітині.

2. Вивчення внутрішньоклітинних сигнальних механізмів залучених до контролю активації S6K1 і S6K2

2.1. Порівняльний аналіз динаміки активації S6K1 і S6K2 при стимуляції клітин НЕК293 сироваткою та фібронектином. Попередні дослідження показали, що S6К1 активується у відповідь клітин на стимуляцію різними ростовими факторами, зокрема епідермальним фактором росту (EGF), фактором росту з тромбоцитів (PDGF), інсуліном і сирoваткою (Chou et al., 1995). Встановлено, також, що 6A1 і 6B1 інтегрини індукують активацію S6К1 в клітинах макрофагів лінії Р388D1 та фібробластах REF52 при взаємодії з фібронектином чи ламініном (Malik et al., 1996, Wei et al., 1998).

У даній роботі проведено аналіз динаміки активації цитоплазматичних рекомбінантних форм S6К1 і S6K2 у відповідь клітин НЕК293 на стимуляцію сироваткою та фібронектином. Отримані нами результати вказують на двофазний характер мітоген-індукованої активації обох форм S6 кінази (рис.3). Профіль кривої активації рекомбінантної форми S6K1 добре узгоджується з опублікованими раніше даними з питань активації ендогенної S6K1 у клітинах гепатоми лінії Нер G2 та ембріональної нирки людини лінії НЕК293 (Weng et al., 1998). Ранній пік активації S6K1 припадає на 20-ту хв і переходить у повільну інактивацію. Тривала фаза пізньої активації починається після 60 хв і спостерігається впродовж наступних 2 год інкубації клітин у середовищі з 10% сироваткою.

На відміну від S6K1, ранній пік активації S6K2 спостерігається вже на 10-ту хв і характеризується стрімким зростанням і спадом. Нами було виявлено також другий незначний пік активації S6K2,

поява якого спостерігалась в трьох незалежних експериментах. Важливо наголосити, що максимум активності S6K1 збігається в часі з першою стадією інактивації S6K2, що вказує на різний в часовому відношенні прояв їх функціональної активності in vivo.

У випадку інтегрин-опосередкованої активації максимальний рівень активності обох форм S6 кінази досягається на 90 хв після переведення клітин на культуральні чашки вкриті фібронектином і характеризується 3,5-4 кратним зростанням їх кіназної активності (рис.4). Поряд із цим, нами виявленно відмінності в динаміці активації S6К1 і S6К2 впродовж першої години стимуляції клітин фібронектином. Для S6К2 властивий додатковий пік швидкої активації, максимум якої припадає на 40 хв. Упродовж наступних 20 хв відбувається інактивація кінази і графік часової залежності активації ферменту має чітко виражену двофазність. Крива, яка описує активацію S6К1 впродовж першої години стимуляції, зміщена вправо стосовно кривої активації S6К2, що вказує на більш повільне зростання кіназної активності цієї форми в період ранньої відповіді клітин на дію індуктора. У випадку S6К1 не спостерігається інактивації ферменту при досягненні 40 хв, а кіназна активність продовжує зростати до 90 хв інкубації клітин на фібронектині.

Таким чином, виявлені відмінності в кінетиці активації S6K1 і S6К2 свідчать про здатність S6К2 забезпечувати ранню відповідь клітини на дію індуктора, в той час як S6K1 здійснює більш пізню регуляцію стану фосфорилювання S6 білка і, не виключено, ініціацію біосинтезу білка вцілому.

2.2. Вплив специфічних інгібіторів РІ-3`-кіназного і TOR/FRAP-залежного сигнальних шляхів на активність S6К1 і S6К2. Відомо, що S6К1 є чутливою до інгібіторної дії рапаміцину, який є специфічним інгібітором ТOR/FRAP кінази (Price et al., 1992, Dennis et al., 1996). Нами було досліджено вплив різних концентрацій рапаміцину на ступінь пригнічення кіназної активності цитоплазматичних рекомбінантних форм S6К1 і S6К2. З рис.5.(А) і рис.5.(B) видно, що рапаміцин в концентрації 0,2 нМ суттєво не впливає на активність обох форм кінази. Однак при збільшенні концентрації рапаміцину чутливість обох форм ферменту до інгібітора проявляє різну тенденцію. При концентрації рапаміцину 20 нМ інгібування активності S6К1 складає близько 80%, а S6К2 – лише 65%. Ця різниця стає більш вираженою при збільшені концентрації рапаміцину в культyральному середовищі до 200 нМ (інгібування S6К1 становить 96%, а S6К2 – 70%). Таким чином, нами показано, що інгібування активності S6К1 і S6К2 залежить від концентрації рапаміцину в культуральному середовищі і ця залежність є різною для досліджених форм ферменту. S6К2 проявляє нижчу чутливість до високих концентрацій рапаміцину порівняно з S6К1. Виявлені відмінності можуть бути пов’язані із специфікою активації S6К1 і S6К2 через TOR/FRAP-залежний сигнальний шлях.

Попередні дослідження показали, що одночасна делеція N- та C- регуляторних районів спричинює резистентність S6К1 до рапаміцину, однак не впливає на чутливість даної форми кінази до дії специфічного інгібітора РІ-3`-кінази вортманіну. Це вказує на участь N- і С-кінцевих доменів в TOR/FRAP-залежній регуляції активності S6К1 (Weng et al., 1995). Даний факт спонукав нас дослідити вплив рапаміцину на активність делетованих форм S6К1 і S6К2 (рис.6). Показано, що делеція 75 чи 64 амінокислотних залишків з N-кінця S6К1 і S6К2, відповідно, проявляє сильний інгібіторний ефект на базальний чи стимульований сироваткою рівень активності обох форм кінази. На противагу цьому делеція С-кінцевого фрагмента не змінює базальний і стимульований рівень активності S6К1 і S6К2, однак понижує чутливість S6К1 до інгібування рапаміцином. Даний факт узгоджується з літературними даними із вивчення делетованих мутантів S6К1 (Weng et al., 1995). Поряд з цим, нами показано, що аналогічна делеція С-кінцевого фрагмента S6К2 не впливає суттєво на чутливість даної форми до рапаміцину. При концентрації рапаміцину 50 нМ делетовані в С-кінцевому районі форми S6К1 і S6К2 проявляють однаковий рівень інгібування, який становить 63 і 60%, відповідно.

Вірогідним поясненням отриманих закономірностей може бути відсутність одного з рапаміцин-чутливих регуляторних центрів фосфорилювання в С-кінцевому районі S6К2, який відповідає Thr444 в первинній структурі S6К1. Нами проведено реконструювання даного регуляторного залишку в структурі S6К2 і показано, що це корелює із зростанням чутливості

отриманого мутанта до інгібування високими концентраціями рапаміцину. Як видно з рис.5.(C) інгібування мутантної форми S6К2(V-T433) при концентрації рапаміцину 200нМ складає 94%, що є співмірним з величиною інгібування S6К1 при зазначених концентраціях інгібітора. Таким чином, показано, що відсутність регуляторного залишку Thr433 в S6К2 (аналог Thr444 в S6К1) зумовлює нижчу чутливість даної форми кінази до високих концентрацій рапаміцину порівняно з S6К1.

Порівняльний аналіз інгібіторного впливу вортманіну на активність повнорозмірних та делетованих форм S6К1 і S6К2 не виявив суттєвих відмінностей в інгібуванні цих форм кінази.

2.3. Дослідження молекулярних механізмів регуляції S6К1 і S6К2 опосередкованої протеїнкіназою С. Протеїнкіназa С залученa до контролю клітинної відповіді на дію різних агоністів, включаючи гормони, нейромедіатори та деякі поліпетидні фактори росту (Newton, 1995). Встановлено, що інкубація клітин з 12-О-тетрадеканоїл-форбол-13-асетатом (ТРА) індукує активацію S6K1. Враховуючи той факт, що класичні і нові ізоформи РКС є внутрішньоклітинними рецепторними молекулами для форболових ефірів, роблять припущення, що ефект ТРА опосередкований через активацію цих ізоформ РКС (Bell et al., 1991).

Нами було проведено дослідження особливостей активації рекомбінантних повнорозмірних та делетованих форм S6К1 і S6К2 при короткочасовій інкубації клітин з форболовими ефірами (рис.7). Показано, що обидві форми S6 кінази активуються у відповідь клітин НЕК293 на дію форболових ефірів. Зростання активності, як S6К1 так і S6К2, становить близько 2,5 раза. Однак

виявлено, що делеція С-кінцевого фрагмента інгібує ТРА-індуковану активацію S6К2 і не проявляє суттєвого впливу на активацію S6К1. Так активація S6K1C104 становила 2,3 раза, тоді як S6K2C86 проявляла лише 1,4 кратне зростання активності. Важливо наголосити, що величина активації S6K2C86 при стимуляції клітин сироваткою не різнилась від величини активації повнорозмірної конструкції цієї форми кінази і перебувала на рівні 2,7 разів. Отримані результати вказують на існування диференційних механізмів РКС-опосередкованої активації S6K1 і S6K2.

Враховуючи виявлені відмінності в активації S6K1C104 і S6K2C86, було досліджено здатність різних ізоформ протеїнкінази С фосфорилювати С-кінцевий регуляторний район S6K1 і S6К2. Для цього проведено in vitro РКС кіназну реакцію, в якій як субстрат використано рекомбінантні Ніs-tag кон’юговані С-кінцеві пептиди S6К1 і S6К2, очищені з бактеріальних клітин. З рис.8 видно, що С-кінцевий пептид S6К2 ефективно фосфорилюється різними ізоформами протеїнкінази С, тоді як жодна з досліджених ізоформ РКС не фосфорилює С-кінцевий пептид S6К1.

Нами також проведено аналіз in vitro фосфорилювання рекомбінантних повнорозмірних, а також делетованих форм S6K1 і S6K2, експресованих та імунопреципітованих з клітин лінії НЕК293 (рис.9). Виявлено, що специфічність до повнорозмірної S6К2 виявляє ізоформа РКС, яка ефективно фосфорилює дану форму кінази. Делеція N-кінцевого фрагмента не впливає на рівень і

специфічність фосфорилювання S6К2, тоді як делеція С-кінцевого фрагмента повністю знімає це фосфорилювання. Як і прогнозувалось жодна досліджена ізоформа РКС не фосфорилює S6К1, що узгоджується із запропонованою нами гіпотезою існування диференційних молекулярних механізмів РКС-опосередкованої активації S6K1 і S6K2.

Використання мас-спектрального аналізу дозволило ідентифікувати в структурі S6К2 три амінокислотні залишки – Ser481, Thr483 і Ser486, які фосфорилюються in vitro ізоформою протеїнкінази С. Ідентифікація цих центрів фосфорилювання дозволила розпочати роботу з отримання фосфоспецифічних антитіл, використання яких дасть змогу дослідити механізми РКС-опосередкованої регуляції S6К2 в умовах in vivo.

ВИСНОВКИ

1. Вперше проведено порівняльний аналіз динаміки активації обох форм S6 кінази у відповідь клітин лінії НЕК293 на дію мітогенних факторів. Показано, що S6К1 характеризується більш повільним зростанням кіназної активності, у порівняні з S6К2, в період ранньої відповіді клітин на стимуляцію сироваткою чи фібронектином.

2. Досліджено вплив специфічних інгібіторів РІ-3`-кіназного, МАРК і TOR/FRAP-залежного сигнальних шляхів на активність S6К1 і S6К2. Показано, що інгібування активності S6К1 і S6К2 залежить від концентрації рапаміцину в культуральному середовищі і ця залежність є різною для досліджених форм ферменту. Встановлено, що при концентрації 200 нМ рапаміцин більш ефективно інгібує S6К1, тоді як чутливість S6К2 до дії рапаміцину при зазначених умовах є на 30 % нижчою.

3. З використанням сайт-спрямованого мутагенезу встановлено, що відсутність регуляторного центру фосфорилювання в позиції 433 в структурі S6К2 зумовлює нижчу чутливість даної форми кінази до високих концентрацій рапаміцину, в порівняні з S6К1.

4. Виявлено відмінності активації S6K1 і S6К2 у відповідь клітин лінії НЕК293 на дію форболових ефірів. Встановлено, що делеція С-кінцевого фрагмента інгібує ТРА-індуковану активацію S6К2, однак не проявляє суттєвого впливу на активацію S6К1. Це вказує на існування диференційних механізмів РКС-опосередкованої регуляції S6K1 і S6K2 в клітинах ембріональної нирки людини лінії НЕК293.

5. Показано здатність ізоформи протеїнкінази С специфічно фосфорилювати C-кінцеву ділянку S6K2, але не S6K1. Мас-спектральний аналіз дозволив ідентифікувати амінокислотні залишки Ser481, Thr483 і Ser486 в структурі S6К2, як центри in vitro фосфорилювання протеїнкіназою С.

СПИСОК НАУКОВИХ ПРАЦЬ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Вальовка Т.Й., Філоненко В.В., Пальчевський С.С., Великий М.М., Дробот Л.Б., Вотерфілд М., Мацука Г.Х., Гут І.Т. Функціональні та регуляторні особливості кінази рибосомного білка S6 типу // Биополимеры и клетка.-1999.-15, N 5.-С.1-7.

2. Погребной П.В., Кухаренко А.П., Тихонкова И.А., Пальчевский С.С., Савинська Л.А., Погребная А.П., Вальовка Т.И., Маркеева Н.В., Солдаткина М.А., Мацука Г.Х., Гут І.Т., Филоненко В.В. Получение и характеристика моноклональных антител против p70 S6 киназы // Экспериментальная онкология.-1999.-21.-С.232-238.

3. Вальовка Т. Й., Філоненко В. В., Великий М. М., Дробот Л. Б., Вотерфілд М., Мацука Г. Х., Гут І.Т. Особливості фібронектин-залежної активації кіназ рибосомного білка S6 (S6K1 i S6K2) // Укр. біохім. журн.- 2000.-72, N93.-С.31-37.

4. Valovka T. Comperative analysis of functional and regulatory properties of p70S6 kinase and // Conference on Genetics and Molecular Biology.- Lviv (Ukraine).-2000.-P.39.

5. FilonenkoV., Valovka T., Kiyamova R., Matsuka G., Waterfield M., Gout I. Molecular cloning and characterization of a novel p70 S6 kinase (p70) // The 2nd Congress of Oncologist from the CIS member States “Oncology-2000”.- Kiev (Ukraine).-2000.- P.208.

6. Gout I., Valovka T., Petrushenko Z., Drobot L., Savins’ka L., Kukharenko O., Ovcharenko H., Palchevskii S., Filonenko V., Matsuka G. The role of ribosomal S6 kinases in the regulation of cell growth and proliferation // The 3rd Parnas Conference “ Mechanisms of cellular signal transduction and communication”.-Lviv (Ukraine).-2000.-P.27.

7. Zhyvoloup A., Nemazany I., Valovka T., Griffin M., Filonenko V., Matsuka G., Gout I. Identification and functional characterisation of ribosomal S6 kinase binding proteins // The Wellcome Trust International Meeting.-London (United Kingdom).-2001.-P36.

АНОТАЦІЇ

Вальовка Т.Й. Порівняльний аналіз функціональних та регуляторних особливостей кіназ рибосомного білка S6 (S6К1 і S6К2).-Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.03 – молекулярна біологія. Інститут молекулярної біології і генетики НАН України, Київ, 2000.

В представленій роботі проведено порівняльний аналіз функціональних та регуляторних особливостей кінази рибосомного білка S6 типу 1 (S6К1) та недавно ідентифікованого гомолога – S6К2. Виявлено відмінності динаміки мітоген-індукованої активації S6К1 і S6К2 в період ранньої відповіді клітин на дію індуктора. Показано також, що активність S6К2 є менш чутливою до високих концентрацій специфічного інгібітора рапаміцину в порівняні з S6К1. Детальний аналіз мутантних рекомбінантних форм S6К1 і S6К2, дозволив запропонуватити механізм, який пояснює різну чутливість цих форм кінази до інгібування рапаміцином. Поряд із цим, проаналізовано особливості активації рекомбінантних повнорозмірних та делетованих форм S6К1 і S6К2 у відповідь клітин на дію форболових ефірів. Вперше показано специфічність фосфорилюння С-кінцевого регуляторного району S6К2 за участю різних ізоформ протеїнкінази С. Використовуючи мас-спектральний аналіз, в С-кінцевому районі S6K2 було ідентифіковано три центри фосфорилювання (Ser481, Thr483 і Ser486) протеїнкіназою С типy .

Отримані дані вказують на існування диференційних механізмів модуляції сигнальних шляхів, які опосередковують активацію S6К1 і S6К2 в клітині.

Ключові слова: кіназа рибосомного білка S6, рекомбінантний білок, мутації, фосфорилювання, мітогенний стимул, рапаміцин, протеїнкіназа С.

Вальовка Т.И. Сравнительный анализ функциональных и регуляторных особенностей киназ рыбосомного белка S6 (S6К1 и S6К2).-Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.03. – молекулярная биология. Институт молекулярной биологии и генетики НАН Украины, Киев, 2000.

В роботе представлен сравнительный анализ функциональных и регуляторных аспектов киназы рыбосомного белка S6 типа 1 и новой гомологичной киназы – S6К2. Показано отличие динамики митоген-индуцированой активации S6К1 и S6К2 в период раннего ответа клеток на действие индуктора. Установлено также, что активность S6К2 менее чувствительна к высоким концентрациям рапамицина в сравнении с S6К1. Исследования мутантных рекомбинантных форм S6K1 и S6K2 привели к установлению механизма, который лежит в основе виявленых различий в ингибировании этих форм кинази. Нами также виявлено различия в активации рекомбинантных полнорозмерных и делетированых форм S6К1 и S6К2 при действии на клетку форболовых эфиров. Впервые показано специфичность фосфорилирования С-концевого регуляторного района S6K2 различными изоформами протеинкиназы С. С помощью мас-спектрального анализа идентефицировано в С-концевом районе S6K2 три центра фосфорилирования (Ser481, Thr483 і Ser486) протеинкиназой С.

Получение данные свидетельствуют о существовании дифференциальных механизмов модуляции сигнальных путей, которые опосредуют активацию S6K1 и S6K2 в клетке.

Ключевые слова: киназа рибосомного белка S6, рекомбинантный белок, мутации, фосфорилирование, митогенный стимул, рапамицин, протеинкиназа С.

Valovka T. Comparative analysis of functional and regulatory properties of ribosomal S6 kinases (S6K1 and S6K2). – Manuscript.

The thesis is to obtain a PhD degree in molecular biology.- Institute of Molecular Biology and Genetics of National Academy of Sciences of Ukraine, Kyiv, 2000.

S6K is a serine/threonine kinase, which phosphorylates ribosomal protein S6 in the cellular response to growth factors, hormones, cytokines and oncogene activation. Recent studies have provided strong evidence for the role of S6K in ribosome biogenesis, cell growth, proliferation and oncogenic transformation.

This manuscript presents comparative analysis of regulatory and functional properties of ribosomal S6K1 and its recently identified homologue S6K2. Both kinases have very high level of homology in kinase domain, but differ significantly in the N- and C-terminus regulatory regions. These differences and some variations in the pattern of phosphorylation sites may predestine the involvement of both kinases in various signalling events and cellular responses. Wild type versions and a panel of deleted and point mutants of S6K1 and 2 were used to study the mechanisms of mitogen-induced activation of both kinases. Differential profiles of serum and fibronectin-induced activation of S6K1 and 2 at the early stages of cellular response have been detected. S6K2 was found to be less sensitive to the inhibitory action of rapamycin, when compared to S6K1. Site-directed mutagenesis was used to elucidate the mechanism of different sensitivity of S6K1 and 2 to rapamycin. Constitutively-activated forms of S6K1 (T412D substitution) and S6K2 (T401D) have been also created and used to generate stable cell lines. 2D electrophoresis and S6K assay were employed to demonstrate an activated status of these mutants.

This study also presents evidence that deletion of the C-terminus of S6K2, but not S6K1, inhibits phorbol ester induced activation of this kinase. In addition, specific phosphorylation of the C-terminus of S6K2 by various isoforms of PKC in vitro was demonstrated. Novel sites of phosphorylation (Ser481, Thr 483 and Ser486) in S6K2 by PKC were identified by mass spectroscopy.

Taken together, these results suggest the involvement of different signalling events in the regulation of S6K1 and S6K2 activities in cellular response to mitogenic stimuli.

Key words: ribosomal S6 kinase, recombinant protein, mutations, phosphorylation, mitogen stimulus, rapamycin, protein kinase C.