імені ТАРАСА ШЕВЧЕНКА

БОБРОВА НЕЛЛЯ ОЛЕКСАНДРІВНА

УДК 616.155.3:576.75

ВПЛИВ ОСНОВНИХ МЕДІАТОРНИХ СИСТЕМ ОРГАНІЗМУ НА ЕКСПРЕСІЮ ПОВЕРХНЕВИХ ГЛІКОПРОТЕЇДІВ ЛЕЙКОЦИТІВ

03.00.13 – фізіологія людини і тварин

А В Т О Р Е Ф Е РА Т

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Київ-2002

Дисертацією є рукопис

Робота виконана в Центральній науково-дослідній лабораторії Української медичної стоматологічної академії Міністерства охорони здоров'я України

Науковий керівник: доктор медичних наук, професор

Кайдашев Ігор Петрович,

Українська медична стоматологічна академія,

завідувач Центральної науково-дослідної лабораторії

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, провідний науковий співробітник

Шаповал Людмила Миколаївна,

Інститут фізіології імені О.О. Богомольця НАН України

кандидат біологічних наук, старший науковий співробітник

Шевчук Петро Миколайович,

Київський національний університет імені Тараса Шевченка

Провідна установа: НДІ кардіології імені М.Д. Стражеска АМН України, м. Київ

Захист дисертації відбудеться “ 16 “ вересня 2002 року о 14.00 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.001.38 Київського національного університету імені Тараса Шевченка (Київ, пр. акад. Глушкова, 2, біологічний факультет, ауд. 215).

Поштова адреса: 01033, Київ-33, вул. Володимирська, 64, біологічний факультет.

З дисертацією можна ознайомиться в бібліотеці Київського національного університету імені Тараса Шевченка (01033, Київ-33, вул. Володимирська, 58)

Автореферат розісланий “ 25 “ липня 2002 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради Д 26.001.38 Т.Л. Давидовська

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Останнім часом актуальним питанням фізіології є вивчення ролі основних медіаторних систем в імунологічній реактивності організму. Це важливо для розуміння механізмів підтримки гомеостазу за фізіологічних умов, а також патогенезу різних захворювань. Безумовно, що основні нейрогуморальні системи, такі як адренергічна, холінергічна, пуринергічна та інші не можуть залишатися осторонь від регуляції взаємодії лейкоцитів в імунній відповіді. Накопичено відомості про здатність медіаторів здійснювати вплив на перебіг імунних реакцій [П.Ф. Забродский, 2000; Б.А. Базанов, 1996; И.В. Нестерова, Р.И. Сепиашвили, 2000]. Встановлено, що інкубація лейкоцитів з адреналіном викликає збільшення продукції супероксидних радикалів у поліморфноядерних лейкоцитах (ПМЯЛ) [Л.С. Долматова, В.В. Ромашин, 1998] та інгібує розвиток проліферативної відповіді Т-лімфоцитів на мітогени [Ю.И. Шилов, С.В. Гейн, 1999]. Гістамін здатний стимулювати функцію Т-супресорів, інгібувати виділення лізосомальних ферментів із ПМЯЛ [Г.Н. Драннік, 1999]. А.Д. Адо і його школою (1999) доведено стимулюючий вплив ацетилхоліну на розеткоутворення лімфоцитів. Однак механізми регуляторного впливу основних медіаторів організму на активність лейкоцитів і пов'язані з ними імунні процеси висвітлені недостатньо і потребують подальшого вивчення.

На цей час отримані дані про те, що в реалізації функціональної активності лейкоцитів важливе значення мають мембранні рецептори з вуглеводним кінцевим залишком D-манозою. Здатність монозомістного мембранного рецептора з вуглеводним кінцевим залишком D-манозою функціонувати як рецептор до антигену була доведена при використанні бичачого сироваткового альбуміну, кон'югованого з різними вуглеводами [M. Cella, A. Lanzavecchia, 1995, 1996]. В останні роки багато уваги приділяється вивченню ролі манозомістного рецептора в активації комплементу, опсонізації мікроорганізмів та в посиленні процесів фагоцитозу [Г.Н. Драннік, 1999; А.Н. Маянский, 1986]. Однак відсутні дані про зв'язок між експресією манозомістних мембранних структур (МММС) лейкоцитів та відомими показниками їх функціональної активності, не вивчено, як змінюються ці структури під впливом медіаторів і регуляторних пептидів і які перетворення відбуваються в них за умов експериментальної патології.

Враховуючи важливість МММС лейкоцитів у реалізації їх функціональної активності, необхідно дослідити вплив основних медіаторів організму та регуляторних пептидів на їх експресію.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дослідження є плановою науково-дослідною роботою Української медичної стоматологічної академії (Полтава) "Вплив основних медіаторних систем організму на експресію деяких поверхневих глікопротеїдів лейкоцитів", номер держреєстрації 0196U021066, та фрагментом тем: “Вивчення механізмів взаємодії тканинних пептидів та імунокомпетентних клітин”, номер держреєстрації 0197U014012, і науково-дослідної роботи, що фінансується за Державним контрактом, “Створення лікарських біопрепаратів вермілат, панкреолат, нефролат (тваринного походження) та організація їх промислового виробництва”, № держреєстрації 0199U001598.

Мета та завдання дослідження. На основі визначення експресії МММС лейкоцитів вивчити роль основних медіаторних систем організму та пептидних комплексів у регуляції функціонального стану лейкоцитів для поглиблення знань про фізіологічну регуляцію клітин імунної системи.

Відповідно до мети роботи нами були визначені такі завдання:

Модифікувати непрямий лектин-пероксидазний метод дослідження експресії поверхневих МММС для оцінки функціонального стану лейкоцитів.

Вивчити вплив адренергічних, пуринергічних, гістамінергічних, холінергічних медіаторів та регуляторних пептидних комплексів на експресію МММС лейкоцитів.

Дослідити дію синтетичного антиоксиданту мексидолу та інсуліну, як ростового фактору, на експресію МММС лейкоцитів.

Визначити вплив активаторів та блокаторів кальцієвих каналів на експресію МММС лейкоцитів.

Вивчити вплив регуляторних пептидних комплексів на експресію МММС лейкоцитів при експериментальних патологіях (гострий стрес, інтоксикація тетрахлорметаном, фенілгідразинова анемія, аутоімунний нефрит, інфаркт міокарду).

Об’єкт дослідження – фізіологічна регуляція стану лейкоцитів за участю основних медіаторних систем організму.

Предмет дослідження - вплив основних медіаторів організму на експресію поверхневих МММС лейкоцитів.

Методи дослідження. Вирішення поставленої мети досягнуто за допомогою використання селективних та неселективних блокаторів і міметиків основних медіаторних систем організму та регуляторних пептидних комплексів в дослідах in vitro, а також регуляторних пептидних комплексів при порушенні функціонування медіаторних систем організму в дослідах in vivo. Функціональний стан лейкоцитів визначався за рівнем експресії їх МММС.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше показано, що дослідження експресії МММС лейкоцитів може бути використано як метод вивчення реакції лейкоцитів на дію різноманітних медіаторів.

Вперше проведене дослідження ролі адренергічної, пуринергічної, холінергічної, гістамінергічної медіаторних систем організму, інсуліну, а також регуляторних пептидних комплексів в регуляції експресії МММС лейкоцитів.

Встановлено, що лімфоцити та ПМЯЛ реагують на дію інсуліну посиленням експресії їх МММС.

Вперше виявлено, що синтетичний антиоксидант мексидол підвищує експресію МММС на поверхневих структурах лімфоцитів та знижує на ПМЯЛ.

Отримані нові результати про участь регуляторних пептидних комплексів у регуляції експресії МММС лейкоцитів за умов гострого стресу, інтоксикації тетрахлорметаном, фенілгідразинової анемії, аутоімунного нефриту та інфаркту міокарду.

Практичне значення одержаних результатів. Запропонований модифікований метод оцінки реакції лейкоцитів на дію різних медіаторів може бути використаний для дослідження активності лейкоцитів та для скринінгу імуноактивних речовин.

Дані про можливість впливу фармакологічних препаратів різних груп (адреноміметики, адреноблокатори, холіноміметики, гістамінні та антигістамінні засоби, активатори та блокатори кальцієвих каналів, фактори росту) на стан лейкоцитів необхідно враховувати при їх клінічному використанні.

Окремі матеріали дисертації використані в доклінічних випробуваннях пептидного комплексу "Вермілат" та пептидного комплексу нирок.

Результати роботи використовуються в навчальному процесі на кафедрах нормальної фізіології, експериментальної та клінічної фармакології з курсом клінічної імунології та алергології, патологічної фізіології Української медичної стоматологічної академії; кафедрі анатомії і фізіології сільськогосподарських тварин Полтавського державного сільськогосподарського інституту; кафедрі біології людини та тварин Полтавського державного педагогічного інституту ім. В.Г. Короленка.

Особистий внесок здобувача. Робота проведена на базі Центральної науково-дослідної лабораторії Української медичної стоматологічної академії. Автором самостійно розроблена модифікація непрямого лектин-пероксидазного методу для оцінки функціонального стану лейкоцитів та програма наукових досліджень. Особисто проведений патентно-інформаційний пошук, підбір літератури, дослідження експресії МММС лімфоцитів та ПМЯЛ, інтерпретація одержаних результатів.

Апробація результатів дисертації. Матеріали дисертації представлені на підсумкових міжнародних наукових конференціях "Фізіологія і патологія перекисного окислення, гемостазу і імуногенезу" (Полтава, 1997, 1999), IV Української науково-практичної конференції з актуальних питань алергології та клінічної імунології (Київ, 1999), ІІІ конференції "Алергія, Астма, Імунологія" (Лодзь, Польща, 2001), засіданні апробаційної ради № 1 Української медичної стоматологічної академії (Полтава, 2001).

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 5 статей у фахових вітчизняних журналах, 4 тез. Отримано деклараційний патент на винахід (№ 2001063710 від 15.03.2002 року).

Обсяг і структура дисертації. Дисертація викладена на 196 сторінках машинописного тексту, складається із вступу, огляду літератури, 3 розділів власних досліджень, обговорення одержаних результатів, висновків, списку використаних літературних джерел, що налічує 189 джерел, з яких 131 вітчизняних та 58 зарубіжних. Робота ілюстрована 20 таблицями і 23 рисунками.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріали та методи дослідження

Для вирішення поставлених завдань були проведені експерименти іn vitro на крові 83 здорових донорів віком 30-40 років та експерименти in vivo на 140 білих щурах лінії Wistar масою 180-200 г, 24 золотистих хом'яках масою 107-156 г, 20 морських свинках масою 400-500 г. Лабораторних тварин утримували в умовах віварію Української медичної стоматологічної академії на стандартному раціоні харчування у відповідності з "Санитарными правилами по устройству, оборудованию и содержанию экспериментально-биологических клиник (вивариев)" (1991).

Для виявлення МММС лімфоцитів та ПМЯЛ ми застосували непрямий лектин-пероксидазний метод у власній модифікації. Для цього кров інкубували у вологій камері протягом двох годин для прикріплення лейкоцитів до скла та відмивали еритроцити у 0,01 М фосфатному буферному розчині (рН 7,4). На фіксовані препарати з прикріпленими лейкоцитами наносили розчин лектину конканаваліну-А (30 мкг/мл) (НПК "Лектинотест"), який має специфічність до D-манози [А.Д. Луцик и соавт., 1989], і інкубували 30 хвилин. Як маркер конкаваліну-А використовували пероксидазу хрону (30 мкг/мл) ("Reanal", Угорщина), яку наносили на препарати на 30 хвилин. Активність пероксидази та відповідно локалізацію пов'язаного з глікокон'югатами конкаваліну-А виявляли в розчині, якій містить 0,05 % 3,3-діамінобензидину тетрагідрохлориду ("Chemapol", Чехiя) та 0,015 % пероксиду водню. Ядра дофарбовували в 1 % розчині сафраніну ("Chemapol", Чехія) 30 секунд. Ступінь експресії МММС оцінювали під мікроскопом "Біолам" за наявністю коричневих відкладень продуктів окисної полімерізації діамінобензидину у вигляді гранул. Обчислювали середній цитохімічний коефіцієнт окремо для лімфоцитів та ПМЯЛ.

Для визначення можливості використання модифікованого методу для оцінки функціонального стану лейкоцитів був проведений кореляційний аналіз між експресією МММС лімфоцитів і ПМЯЛ та відомими показниками їх функціональної активності. Для цього в ПМЯЛ визначали продукцію супероксидного радикалу в тесті з нітросинім тетразолієм (НСТ-тест) [Б.С. Нагоев, 1983], фагоцитоз [К.И. Лебедев, И.Д. Понякина, 1990], лізосомальні катіонні білки (ЛКБ) [В.Е. Пигаревский 1978]. На Т-лімфоцитах визначали рівень експресії мембранного маркеру CD3 і на В-лімфоцитах - CD22 за допомогою непрямого імунофлуоресцентного методу [С. Хант, 1990] з використанням моноклональних антитіл до поверхневих антигенів лейкоцитів людини (ТзОВ "Сорбент", Росія).

В дослідах in vitro ми використовували фармакологічні препарати, які модулюють активність медіаторних систем, та регуляторні пептиди. Концентрації препаратів розраховували на основі їх середніх терапевтичних доз [І.С. Чекман і співавт., 2001]. Беручи до уваги, що однією з основних характеристик дії фармакологічних препаратів, що визначає безпосередній вплив на процес, який досліджується, є наявність залежності "доза-ефект" [П.Ф. Забродский, 2000; Г. Бертрам, В. Катцунг 1998], ми застосовували препарати у трьох концентраціях (у діапазоні від мінімальної до максимальної).

За допомогою 0,1 % розчину адреналіну гідрохлориду ("Здоров'я", Україна) у концентраціях 1; 2 і 3 нМ ми викликали стимуляцію ?-, в-?дренорецепторів. 0,05 % розчином алупенту (Boehringer Іngelheim, Німеччина) в концентраціях 13,5х10-6; 20,7х10-6 i 28х10-6 мкМ здійснювали стимуляцію ?1-, в2-адренорецепторів. 4 % розчином допаміну (AWD, Німеччина) в концентраціях 0,65; 3,27 i 6,54 нM - стимуляцію дофамінових рецепторів. 5 % розчином кордарону (KRKA, Словенія) в концентраціях 98,3х10-9 нМ; 0,98х10-6 i 2,0 мкМ проводили блокаду ?-, в-?дренорецепторів. 0,25 % розчином анаприліну ("Здоров'я", Україна) в концентраціях 0,28 мкМ; 0,11 i 0,28 мМ - блокаду ?1-, в2-?дренорецепторів. 1 % розчином аденозинтрифосфату (АТФ) ("Львівлекпрепарати", Україна) в концентраціях 5; 25 і 50 нМ викликали стимуляцію пуринергичних рецепторів. За допомогою 0,1 % розчину гістамину дегідрохлориду (ЗАО "Биолекс", Україна, ) в концентраціях 39; 58 i 96 мкМ досліджували стимуляцію гістамінових Н1, Н2-рецепторів. 10 % розчин циметидину (Pharmachim, Болгарія) в концентраціях 0,45 мкМ; 1,13 і 1,8 мМ використовували для блокади гістамінових Н2-рецепторів. За допомогою ацетилхоліну йодиду (Сhemal Praha, Czechoslovakia) в концентраціях 1,0 мкМ; 0,1 мМ і 1,0 мМ здійснювали стимуляцію холінергічніх рецепторів. Синтетичним препаратом мексидолом у концентраціях 0,96; 1,92 і 9,6 мкМ досліджували вплив антиоксидантної дії. Кальцієвим іонофором А 23187 (SIGMA, США) у концентраціях 50; 100 i 200 нМ проводили активацію кальцієвих каналів, 10 % розчином ізоптину (KNOL, Німеччина) в концентраціях 0,12; 0,24 і 0,48 мкМ - блокаду кальцієвих каналів. За допомогою інсуліну 40 ОД/мл (ICN, Galenika) у концентраціях 1,4х10-3; 2,8х10-3 i 5,7х10-3 ОД/л вивчали дію факторів росту.

Дослідження ролі пептидних речовин ми проводили за допомогою регуляторного пептидного комплексу вермілат, виділеного з черв'яків Eisenia foetida [И.П. Кайдашев, 1995], у концентраціях 2,4; 12 i 24 мг/л, пептидного комплексу нирок [И.П. Кайдашев, 1997] у концентраціях 2,4; 12 i 24 мг/л, та пептидних фрагментів гемоглобіну [Т.Н. Запорожец, 1997] у концентраціях 10; 25 i 50 мг/л.

Для дослідження впливу регуляторних пептидів на експресію МММС лімфоцитів та ПМЯЛ при патологіях, пов'язаних із порушенням медіаторних систем організму, були проведені досліди in vivo.

Гострий стрес моделювали шляхом трьохгодинної іммобілізації тварин на спині [П.Д. Горизонтов и соавт., 1983]. Нейропептиди – екстракт неокортексу SNC (1 мг/кг) [А.Н. Макаренко, 1994], окситоцин (1 ОД/кг), тироліберин (40 мкг/кг), пітуітрин (1 ОД/кг) вводили тваринам одноразово за 30 хвилин до стресу. В другій серії експериментів інтактним тваринам вводили в таких же дозах ті самі нейропептиди.

Інтоксикацію тетрахлорметаном відтворювали шляхом введення тваринам розчину тетрахлорметану в рафінованій соняшниковій олії в співвідношенні 1:1 з розрахунку 0,4 мл на 100 г маси підшкірно в задню кінцівку протягом 4 діб [Ю.А. Витковский, 1990]. За п'ять днів до відтворення інтоксикаціі тетрахлорметаном тваринам вводили пептидний комплекс печінки в дозі 6,5 мг/кг [О.Л. Гаркович, 2000].

Фенілгідразинову анемію відтворювали шляхом введення тваринам 0,25 мл 2 % фенілгідразину гідрохлориду протягом 7 днів [В.П. Дударев, 1988]. Поліпептидні фрагменти гемоглобіну починали вводити тваринам за 7 днів до початку експерименту в дозі 1 мг/кг і продовжували вводити протягом усього його часу [Т.М. Запорожець, 1997].

Аутоімунний нефрит індукували введенням тваринам у подушечки задніх кінцівок суспензії аутологічної нирки в повному ад'юванті Фрейнда (''Реакомплекс'', Росія) у дозі 0,2 мл триразово на протязі трьох тижнів з інтервалом у 7 діб [Kment A. et al., 1976]. З 15-ої доби здійснювали експериментальну терапію синтетичними пептидами Про-Глу-Ліз-Асп-Cep-Арг-Ліз (PEKDSRK), Про-Глу-Ліз-Асп-Лей-Арг-Ліз (PEKDLRK), Про-Глу-Ліз-Асп-Асп-Арг-Лей (PEKDDRL) та природним пептидним комплексом нирок у дозі 0,12 мг/кг. Пептиди вводили протягом 7 днів [О.О. Гейко, 1999].

Інфаркт міокарду відтворювали шляхом одноразового введення тваринам токсичної дози ізадрину (75 мг/кг) [К.М. Резников и соавт., 1985]. Через два тижні на протязі 6 днів дослідним тваринам вводили пептидний комплекс серця - кордіалат у дозі 0,1 мг/кг [Л.О. Куценко, 1997] та "Вермілат для ін'єкцій" в дозі 0,12 мг/кг [Н.В. Данилова и соавт., 1997]. Експеримент тривав 17 діб.

Отриманий матеріал був статистично оброблений на ПЕОМ ІВМ РС/АТ-286 “Омеga”. Проводили обчислення середньої арифметичної, її помилки та вірогідності отриманих результатів за критерієм Ст’юдента (t). Коефіцієнт попарної лінійної кореляції обраховували за допомогою програми MICROSOFT Excel 97.

Результати досліджень та їх обговорення

Дослідження змін експресії манозомістних мембранних структур лімфоцитів та поліморфноядерних лейкоцитів як спосіб оцінки їх функціональної активності.

Нами було модифіковано непрямий лектин-пероксидазний метод оцінки функціонального стану лейкоцитів. На відміну від відомого методу [А.Д. Луцик и соавт., 1989], який дозволяв виявити топографію поверхневих глікопротеїдів з кінцевим залишком D-манозою в гістологічних зрізах, запропонований нами метод дає можливість здійснити напівкількісну оцінку їх експресії на поверхні клітинних мембран лейкоцитів. Він також дає змогу проводити дослідження в цитологічних препаратах крові, забезпечує можливість диференціювання лейкоцитів та одночасно оцінювати їх функціональний стан. Розроблений метод придатний для дослідження прямого впливу фізіологічно активної речовини на лейкоцити на основі змін експресії їх МММС у дослідах in vitro. Він також дозволяє виявити зрушення функціонального стану лейкоцитів за умов експериментальної патології і її корекції, що було підтверджено на прикладі гострого стресу, інтоксикації тетрахлорметаном, фенілгідразинової анемії, аутоімунного нефриту та інфаркту міокарду.

З метою валідування власної модифікації, одночасно з МММС в лейкоцитах визначили інші показники їх активності і провели аналіз взаємозв'язків між ними.

Результати кореляційного аналізу показали наявність вірогідних взаємозв'язків між експресією МММС лімфоцитів і ПМЯЛ та іншими показниками функціональної активності цих клітин. Зокрема, були виявлені кореляційні зв'язки експресії МММС лімфоцитів із мембранними маркерами Т-лімфоцитів CD3 (r=0,694), а також із фагоцитарною активністю (r=0,780) і ЛКБ (r=0,489) ПМЯЛ.

Експресія МММС ПМЯЛ корелювала з їх фагоцитарною активністю (r=0,795) і маркерами В-лімфоцитів CD22 (r=0,401) (рис.1).

Рис.1. Структура вірогідних кореляцій між показниками функціональної активності лімфоцитів та поліморфноядерних лейкоцитів у зразках донорської крові in vitro.

позитивна кореляція;

негативна кореляція.

Це дозволило зробити висновок, що між експресією МММС лімфоцитів і ПМЯЛ та відомими показниками їх функціональної активності існує тісний взаємозв'язок. Даний показник, визначений модифікованим методом, є адекватним виразом функціональної активності лейкоцитів. Його можна вважати придатним для оцінки функціонального стану лейкоцитів in vіtro та in vivo.

Вплив основних медіаторів на експресію манозомістних мембранних структур лімфоцитів та поліморфноядерних лейкоцитів в дослідах in vitrо.

Для дослідження впливу основних медіаторів організму на експресію МММС лімфоцитів і ПМЯЛ нами були використані селективні та неселективні блокатори і міметики дослідних медіаторних систем.

В дослідах на лімфоцитах стимуляція -, -адренорецепторів адреналіном у концентраціях 1 та 2 нМ викликала зниження експресії їх МММС відповідно на 13 % і 26 %, що свідчило про пригнічення функції імунокомпетентних клітин та узгоджувалось з літературними даними [Ю.И. Шилов, С.В. Гейн, 1999]. Водночас стимуляція 1-, 2- адренорецепторів алупентом у всіх досліджених концентраціях призводила до куполоподібного підвищення рівня експресії їх МММС. Зниження експресії МММС лімфоцитів, викликане стимуляцією -, -адренорецепторів і підвищення експресії МММС, викликане окремо - адреностимуляцією, свідчило про функціональний антагонізм - і - адренорецепторів лімфоцитів. Допамін викликав вірогідне підвищення експресії МММС лімфоцитів на 23 % тільки в максимальній концентрації (6,54 нМ). Імовірно, це пов'язано з тим, що допамін у великих концентраціях реалізував свої ефекти через адренорецептори (особливо -адренорецептори), а в мінімальній (0,65 нМ) та в середній (3,27 нМ) - активував специфічні допамінові рецептори (ДА1 і ДА2) [І.С. Чекман і співавт., 2001].

Блокада -, -адренорецепторів кордароном у концентрації 98,3 нМ знижувала експресію МММС лімфоцитів на 47 %, а в концентрації 2,0 мкМ – підвищувала на 31 %. Блокада -адренорецепторів анаприліном у всіх дослідних концентраціях викликала зменшення експресії МММС лімфоцитів відповідно в 1,4; 1,8 і 1,5 рази.

Дослідження відповіді ПМЯЛ на зазначені вище сигнали показало, що адреналін викликав дозозалежне підвищення експресії їх МММС. Це свідчило про посилення функції ПМЯЛ та узгоджувалось з літературними даними [Л.С. Долматова, В.В. Ромашин, 1998]. Неселективний -адреноміметик алупент і допамін теж підвищували експресію МММС ПМЯЛ. Імовірно, різниця в реагуванні лімфоцитів і ПМЯЛ на адренергічну стимуляцію пояснювалась різною роллю відповідних рецепторів у функціонуванні окремих видів лейкоцитів.

Блокада -, -адренорецепторів кордароном у концентрації 28 мкМ призводила до вірогідного підвищення експресії МММС ПМЯЛ на 25 %. В той же час, -адреноблокатор анаприлін у всіх концентраціях викликав зменшення експресії МММС ПМЯЛ відповідно на 29 %; 45 % і 33 %.

Виявлені зміни експресії МММС лімфоцитів та ПМЯЛ під впливом селективних та неселективних адреноміметиків і адреноблокаторів свідчили, що модулювання ними функціональної активності лейкоцитів відбуваються за участю МММС. При цьому ПМЯЛ були більш чутливими до адренергічних агентів, ніж лімфоцити, що узгоджується з літературними даними [Н.М. Бережная, 1988].

Вплив АТФ на поверхневі структури лейкоцитів у концентраціях 5; 25 і 50 нМ викликав дозозалежне посилення експресії МММС: на лімфоцитах – на 38 %; 31 % і 49,5 % та на ПМЯЛ – на 6 %; 12 % і 15 %. Це вказувало на участь пуринових рецепторів у реалізації функцій лейкоцитів, опосередкованих МММС.

Імуномодулюючі ефекти медіаторів гістамінергічної системи реалізуються шляхом взаємодії з Н1- і Н2-рецепторами, які виявлені практично на всіх клітинах імунної системи [Г.Н. Дранник, 1999; Н.М. Бережная и соавт. 2000]. Наші дослідження показали, що гістамін, як стимулятор гістамінових Н1-, Н2-рецепторів, та циметидін, як блокатор гістамінових Н2-рецепторів, у всіх досліджених концентраціях викликали пригнічення експресії МММС лімфоцитів. Це вказувало на неспецифічність впливу модифікації Н1-, Н2- рецепторів на МММС лімфоцитів. На ПМЯЛ активація гістамінових Н1-, Н2-рецепторів у всіх концентраціях також викликала зменшення експресії МММС на 20 %, а блокада гістамінових Н2-рецепторів у концентраціях 1,13 і 1,8 мМ призводила до її вірогідного підвищення відповідно на 17 % та 20 %.

Вплив ацетилхоліну на лімфоцити і ПМЯЛ у мінімальній концентрації 1,0 мкМ стимулював експресію МММС, що свідчило про підвищення функціональної активності лейкоцитів та узгоджується з літературними даними [А.Д. Адо, 1999].

Дослідження дії мексидолу на МММС лімфоцитів у концентраціях 0,96 та 1,92 мкМ виявило незначні коливання їх експресії. Мексидол у концентрації 9,6 мкМ вірогідно підвищував експресію МММС лімфоцитів на 13 %. Одержані результати узгоджувались з даними літератури стосовно дозозалежності прямого антиоксидантного впливу мексидолу на інші клітини [Р.В. Луценко, 2001]. На ПМЯЛ вплив мексидолу в концентраціях 0,96 та 1,92 мкМ виявився вірогідним зниженням експресії МММС на 19 %. Можна припустити, що вплив мексидолу на МММС лейкоцитів здійснювався не тільки шляхом його впливу на ліпідний склад і фізико-хімічні властивості мембран [Г.А. Базанов, Л.Д. Смирнов, 1995], а й шляхом алостеричного потенціювання бензодіазепінорецепторів, як це описано в ЦНС [М.Г. Пшенникова, 2001].

Враховуючи важливість іонів кальцію в реалізації початкових етапів активації лімфоцитів, їх проліферації та ефекторних функцій [О.П. Матышевская, 1993], а також його вплив на агрегацію, фагоцитоз та модуляцію хемотаксичної відповіді ПМЯЛ [Н.М. Бережна, 1988], було досліджено експресію МММС цих клітин на фоні активації та блокади кальцієвих каналів.

Активація кальцієвих каналів лімфоцитів та ПМЯЛ кальцієвим іонофором А 23187 у концентраціях 50 та 100 нМ сприяла посиленню експресії їх МММС. Блокада кальцієвих каналів ізоптином у мінімальній та максимальній концентраціях (0,12 і 0,48 мкМ) призводила до інгібування експресії МММС лімфоцитів та ПМЯЛ. Це узгоджувалось із літературними даними стосовно того, що блокада кальцієвих каналів веде до зниження експресії поверхневих імуноглобулінових рецепторів і відображає пригнічення функціональної активності лімфоцитів [Л.Э. Веснина, И.П. Кайдашев, 2000]. Але при цьому ізоптин у середній концентрації 0,24 мкМ викликав протилежний ефект, тобто підвищував експресію МММС. Цей суперечливий факт можна пояснити тим, що згідно з даними літератури існує кілька способів зв'язування кальцію, причому не усі вони обов'язково призводять до блокування кальцієвих каналів [И.Б. Чеглаков, П.В. Авдонин, 2000]. Таким чином, наші дослідження показали, що експресія МММС лімфоцитів та ПМЯЛ є кальцій-залежною.

Вплив ростових факторів на експресію МММС лімфоцитів та ПМЯЛ вивчали на прикладі інсуліну. Дослідження довели, що інсулін у всіх концентраціях викликав дозозалежне підвищення експресії МММС лімфоцитів та ПМЯЛ. Це вказувало на те, що дія інсуліну на лейкоцити здійснюється за участю їх МММС і узгоджується із літературними даними про те, що інсулін мав виражену стимулюючу дію на проліферацію лімфоцитів у присутності незначних добавок сироватки [Ю.Д. Иващенко, А.И. Быкорез 1990].

Відомо, що регуляторні пептиди виявляють імуномодулюючу дію [О.А. Гомазков, 1996]. В зв'язку з тим, що тонкі механізми взаємодії регуляторних пептидів та лейкоцитів залишаються невирішеними, було досліджено вплив регуляторних пептидних комплексів вермілату та нирок, а також пептидних фрагментів гемоглобіну на експресію МММС лімфоцитів і ПМЯЛ.

Проведене дослідження показало, що пептидні комплекси вермілату та нирок у мінімальній концентрації 2,4 мг/л викликали вірогідне зниження експресії МММС лімфоцитів на 11 %. Пептидні фрагменти гемоглобіну в мінімальній концентрації 10 та у середній 25 мг/л знижували експресію МММС лімфоцитів відповідно на 57 % та 20 %. На ПМЯЛ регуляторні пептидні комплекси вермілату та нирок та пептидні фрагменти гемоглобіну у мінімальній та середній концентраціях викликали вірогідне інгібування експресії МММС (рис.2).

Відсутність впливу регуляторних пептидів на експресію МММС лейкоцитів у максимальній концентрації дозволив припустити, що пептидні комплекси найбільш специфічно і активно діють у низьких концентраціях.

Таким чином, встановлено, що дія адренергічних холінергічних, гістамінергічних і пуринергічних речовин, регуляторних пептидів, ростових факторів на лімфоцити та ПМЯЛ супроводжувалось змінами експресії їх МММС. Можна скласти наступну загальну схему цих процесів. Медіатори або регуляторні пептиди взаємодіють із специфічними рецепторами. За посередництвом відповідних месенджерних систем відбувається модифікація метаболічних процесів і змінюється функціональна активність лімфоцитів і ПМЯЛ. Це, в свою чергу, викликає зміни клітинних мембран, в тому числі їх імунологічних рецепторів. Такі зміни реєструються нами як збільшення або зменшення середнього цитохімічного коефіцієнту в реакції визначення МММС лейкоцитів.

Рис. 2. Вплив пептидних комплексів вермілату, нирок та пептидних фрагментів гемоглобіну на експресію манозомістних мембранних структур поліморфноядерних лейкоцитів.

По осі ординат – середній цитохімічний коефіцієнт, по осі абсцис – дози.

К – контроль, 1 – мінімальна концентрація, 2 – середня концентрація,

3 – максимальна концентрація, * - вірогідні зміни (р < 0,05).

а – пептидний комплекс вермілат, б – пептидний комплекс нирок,

в – пептидні фрагменти гемоглобіну.

Дослідження пептидергічної регуляції експресії манозомістних мембранних структур лімфоцитів та поліморфноядерних лейкоцитів в дослідах in vivo.

Відомо, що різні фактори навколишнього середовища призводять не тільки до порушення нейрогуморальної регуляції, але й до змін функціонування пептидергічної системи та стану клітин імунної системи [А.Ш. Зайчик, Л.П. Чурилов, 1999; И.П. Кайдашев, 1995].

Розвиток стресу у тварин викликав підвищення експресії МММС лімфоцитів та ПМЯЛ. За умов гострого стресу нормалізуючу дію на експресію МММС лімфоцитів справляв пітуїтрин, якій містить вазопресин. Такий ефект був одним із механізмів захисної дії пітуїтрину стосовно лімфоїдних органів, важливою складовою стреспротективної активності цього пептидного препарату [О.М. Важничая, 2000]. Максимальну активність стосовно рівню експресії МММС ПМЯЛ за фізіологічних умов виявив тироліберин, який призвів до її підвищення на 17 %. Це узгоджувалось зі здатністю даного пептиду модифікувати цитохімічні реакції і фагоцитоз ПМЯЛ, а також порушувати окисновідновний баланс у лімфоїдних органах і крові за цих умов [О.М. Важничая, 2000].

Регуляцію експресії МММС лейкоцитів у тварин при моделюванні інтоксикації тетрахлорметаном здійснювали пептидним комплексом печінки. Розвиток інтоксикації тетрахлорметаном на тваринах не викликав змін експресії МММС лімфоцитів, але зменшував її на ПМЯЛ. Пептидний комплекс печінки знижував експресію МММС лімфоцитів на 21 %. Водночас він сприяв нормалізації рівня експресії МММС ПМЯЛ. Імовірно, в основі цих ефектів знаходилась неспецифічна мембраностабілізуюча дія тканинних пептидів печінки [О.Л. Гаркович, 2000].

Пептидні фрагменти гемоглобіну використовували при фенілгідразиновій анемії, котра веде до гемічної гіпоксії та сприяє утворенню супероксидних радикалів [В.П. Дударев, 1988]. Моделювання фенілгідразинової анемії викликало зниження рівня експресії МММС лейкоцитів. Введення тваринам пептидних фрагментів гемоглобіну на фоні фенилгідразинової анемії супроводжувалось подальшим зниженням експресії МММС лімфоцитів на 53 % та ПМЯЛ - на 32 %.

Згідно з літературними даними, пептидний комплекс нирок та його синтетичні аналогі мають ефективну дію при аутоімунній патології нирок. Одним з ймовірних механізмів їх дії – це відновлення природного стану імунологічної телерантності [О.О. Гейко, 1998]. При аутоімунному нефриті було виявлено зниження експресії МММС лейкоцитів. На цьому фоні природний пептидний комплекс нирок призводив до подальшого зниження експресії МММС лімфоцитів на 75 %, а синтетичний пептидний комплекс PEKDDRL підвищував експресію МММС ПМЯЛ на 43 % порівняно з контролем.

Моделювання інфаркту міокарду викликало підвищення експресії МММС лімфоцитів та ПМЯЛ. Введення тваринам пептидного комплексу серця – кордіалату на фоні інфаркту міокарду призводило до зниження експресії МММС лімфоцитів та ПМЯЛ на 20 %. Введення тваринам вермілату знижувало ці показники на 12 % порівняно з експериментальним інфарктом міокарду. Це вказувало на здатність даних пептидних комплексів регулювати стан поверхневих глікопротеїдів лейкоцитів при серцевій патології і узгоджувалось із позитивним впливом кордіалату та вермілату на перебіг експериментального інфаркту міокарду [Л.А. Куценко, 1997; Н.В. Данилова та соавт., 1997].

Таким чином, при експериментальних станах, пов'язаних із порушенням функціонування медіаторних систем організму, регуляторні пептидні комплекси змінювали стан мембранних структур лейкоцитів. Це було одним із механізмів їх впливу на перебіг патологічних процесів на рівні всього організму.

ВИСНОВКИ

На грунті аналізу експресії манозомістних мембранних структур лейкоцитів в модельних системах in vitro та за умов експериментальної патології показано, що досліджені медіаторні системи організму та регуляторні пептидні комплекси впливають на їх функціональний стан.

Запропонована модифікація непрямого лектин-пероксидазного методу дає можливість оцінювати функціональний стан лейкоцитів на основі аналізу експресії манозомістних мембранних структур цих клітин, яка корелює з фагоцитарною активністю та лізосомальними катіонними білками поліморфноядерних лейкоцитів і з мембранними маркерами лімфоцитів CD3, CD22.

На основі виявлення впливу модуляції адренергічної, пуринергічної, холінергічної та гістамінергічної систем організму на експресію манозомістних мембранних структур лейкоцитів показано, що ефекти адренергічної системи реалізуються переважно через ?-адренорецептори; активація пурино- і холінорецепторів викликає посилення експресії манозомістних мембранних структур лейкоцитів; ефекти гістамінергичної системи реалізуються на лімфоцитах переважно через гістамінові Н2-рецептори, на поліморфноядерних лейкоцитах – через гістамінові Н1-рецептори.

Активація кальцієвих каналів іонофором А 23187 посилює експресію манозомістних мембранних структур лімфоцитів та поліморфноядерних лейкоцитів; блокада кальцієвих каналів ізоптином у концентраціях 0,12 і 0,48 мкМ зменшує їх експресію, що свідчить про кальцій-залежний характер експресії манозомістних мембранних структур.

Інсулін, як ростовий фактор, дозозалежно збільшує експресію манозомістних мембранних структур лімфоцитів та поліморфноядерних лейкоцитів.

Антиоксидант мексидол посилює експресію манозомістних мембранних структур лімфоцитів, а поліморфноядерних лейкоцитів – знижує.

Пептидні комплекси вермілату, нирок та фрагменти гемоглобіну у нормі знижують експресію манозомістних мембранних структур лімфоцитів та поліморфноядерних лейкоцитів.

Регуляторні пептидні комплекси позитивно впливають на функціональний стан лейкоцитів при патологічних станах, зокрема пітуїтрин нормалізує експресію манозомістних мембранних структур лімфоцитів при гострому стресі; пептидний комплекс печінки – при інтоксикації тетрахлорметаном; синтетичний пептид Про-Глу-Ліз-Асп-Арг-Лей - при аутоімунному нефриті; кордіалат та вермілат нормалізує експресію манозомістних мембранних структур при інфаркті міокарду; пептидні фрагменти гемоглобіну і природний комплекс нирок здатні знижувати ці показники відповідно при фенілгідразиновій анемії та аутоімунному нефриті.

СПИСОК ОПУБЛІКОВАНИХ РОБІТ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

Боброва Н.А., Куценко Л.А. Пептидергическая регуляция экспрессии маннозосо держащих мембранных структур лейкоцитов при экспериментальном инфаркте миокарда // Проблеми екології та медицини. – 1997. – Т. 1, № 1-2.- С. 27-29.

Боброва Н.А., Кайдашев И.П. Влияние некоторых медиаторов на экспрессию маннозосодержащих структур мембран лейкоцитов in vitro // Иммунология. – 1998. - № 1. – С. 13-15.

Гейко О.А., Боброва Н.А., Кайдашев И.П. Сравнительное изучение активности естественного пептидного комплекса почек и его синтетических аналогов при аутоиммунном нефрите // Экспериметальная и клиническая фармакология. – 1998. – Т. 61, № 4. – С.44-47.

Запорожець Т.М., Боброва Н.О., Кайдашев І.П. Зміни експресії манозовміщуючих мембранних структур лейкоцитів під впливом пептидного комплексу гемоглобіну у здорових тварин та за умов гемолітичної анемії // Проблеми екології та медицини. – 1999. – Т. 3, № 1-2. – С. 132-134.

Боброва Н.А., Важничая Е.М., Кайдашев И.П. Влияние регуляторных пептидов на экспрессию маннозосодержащих мембранных структур лейкоцитов при остром стрессе // Патологическая физиология и экспериментальная терапия. – 2000. - № 4. – С. 11-13.

Пат. 45149 А України МПК 6185/14/. Спосіб оцінки функціонального стану лейкоцитів. - Боброва Н.О., Кайдашев І.П. – № 2001063710; Заявл. 01.06.2001; Опубл.15.03.2002; Бюл. № 3.

Кайдашев І.П., Боброва Н.О., Важнича О.М., Мошко Л.В. Стан манозомістких мебранних структур лімфоцитів і гранулоцитів при гострому стресі. // Тези доповідей Міжнародної конференції ''Фізіологія та патологія імунітету, гемостазу та перекисного окислення ліпідів''. – Полтава. – 1997. – С. 25.

Боброва Н.А., Соколенко В.Н. Влияние блокатора кальциевых каналов на состояние поверхностных гликопротеидов лейкоцитов человека // Матеріали конференції молодих вчених ''Фізіологія і патологія перекисного окислення, гемостазу та імуногенезу''. – Полтава. – 1999. – С. 5-6.

Кайдашев И.П., Веснина Л.Э., Гейко О.А., Боброва Н.А., Квак О.В., Рябенко В.В., Ножинова О.А., Губенко И.Я., Соколенко В.Н., Чекалина Н.И., Запорожец Т.Н. Пептиды, представляемые молекулами главного комплекса гистосовместимости, как перспективные препараты иммунотропной терапии // Матеріали IV Української науково-практичної конференції з актуальних питань алергології та клінічної імунології "Імунологія та алергологія". – Київ. - 1999. - № 3. – С. 66.

Bobrova N.A., Nozhinova O.A., Kaydashev I.P. The influence of в-adrenoreceptor agonists and antagonists on to functional state of leukocytes // Proc. the 3rd Annual Conference ''Alergy Asthma Clinical Immunology''. – Lodz (Poland) . – 2001. – P. 136.

АНОТАЦІЯ

Боброва Н.О. Вплив основних медіаторних систем організму на експресію поверхневих глікопротеїдів лейкоцитів. – Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.13–фізіологія людини і тварин. – Київський національний університет імені Тараса Шевченка, Київ, 2002.

Дисертацію присвячено вивченню впливу основних медіаторних систем організму на манозомісні мембранні структури лейкоцитів. Для оцінки експресії МММС лейкоцитів було модифіковано непрямий лектин-пероксидазний метод виявлення даних структур. За допомогою кореляційного аналізу показано, що функціональна активність лімфоцитів та поліморфноядерних лейкоцитів пов'язана з експресією їх манозомісних мембранних структур.

Основні медіаторні системи організму та регуляторні пептидні комплекси беруть участь у регуляції функціональної активності лімфоцитів та поліморфноядерних лейкоцитів.

В умовах зміни медіаторних систем організму при експериментальних станах органні пептидні комплекси та пептидні фрагменти гемоглобіну регулюють функціональний стан клітин імунної системи: пітуїтрин - при гострому стресі, пептидний комплекс печінки - при інтоксикації тетрахлорметаном, пептидні фрагменти гемоглобіну - при фенілгідразиновій анемії, природний пептидний комплекс нирок та синтетичний пептидний комплекс PEKDDRL - при аутоімунному нефриті, кордіалат та вермілат - при інфаркті міокарду.

Ключові слова: основні медіаторні системи, лейкоцити, експресія, манозомісні мембранні структури, регуляторні пептидні комплекси.

АННОТАЦИЯ

Боброва Н.А. Влияние основных медиаторных систем организма на экспрессию поверхностных гликопротеидов лейкоцитов. – Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.13–физиология человека и животных. – Киевский национальный университет имени Тараса Шевченко, Киев, 2002.

Диссертация посвящена изучению влияния основных медиаторных систем организма на маннозосодержащие мембранные структуры лейкоцитов. Для оценки экспрессии маннозосодержащих мембранных структур лейкоцитов был модифицирован непрямой лектин-пероксидазный метод определения данных структур. С помощью корреляционного анализа показано, что функциональная активность лимфоцитов и полиморфноядерных лейкоцитов связана с экспрессией их маннозосодержащих мембранных структур.

Комплексный подход влияния адреномиметиков и адреноблокаторов на экспрессию маннозосодержащих мембранных структур лейкоцитов показал существование функционального антагонизма ?-, в-?дренорецепторов.

Влияние активаторов и блокаторов гистаминовых рецепторов на экспрессию маннозосодержащих мембранных структур лейкоцитов устанавливает преобладание Н2-гистаминовых рецепторов на лимфоцитах и Н1-гистаминовых рецепторов - на полиморфноядерных лейкоцитах.

Влияние ацетилхолина, действующего на холинергическую систему, вызвало активацию экспрессии маннозосодержащих мембранных структур лейкоцитов в минимальной дозе.

Аденозинтрифосфат, влияющий на пуриновые рецепторы лейкоцитов, и инсулин, который является ростовым фактором лейкоцитов, дозозависимо усиливают экспрессию их маннозосодержащих мембранных структур.

Блокада и активация кальциевых каналов лейкоцитов модифицируют экспрессию их маннозосодержащих мембранных структур и связаны с их кальций-зависимыми внутриклеточными процессами.

Пептидные комплексы вермилат, почек и фрагментов гемоглобина влияют на экспрессию маннозосодержащих мембранных структур лейкоцитов в минимальной и средней дозах, снижая экспрессию их маннозосодержащих мембранных структур. Синтетический пептидный комплекс тиролиберин повышает экспрессию маннозосодержащих мембранных структур полиморфноядерных лейкоцитов при физиологических условиях в экспериментах in vivo.

В условиях изменения функционального состояния лейкоцитов при экспериментальных патологиях органные пептидные комплексы и пептидные фрагменты гемоглобина проявляют регуляторное влияние на функциональное состояние лейкоцитов.

Таким образом, основные медиаторные системы организма и пептидные комплексы участвуют в реализации функций лейкоцитов, опосредованных их маннозосодержащими мембранными структурами. Метод оценки функциональной активности лейкоцитов может считаться одним из надежных параметров оценки состояния данных клеток.

Ключевые слова: основные медиаторные системы, лейкоциты, экспрессия, маннозосодержащие мембранные структуры, регуляторные пептидные комплексы.

ANNOTATION

Bobrova N.O. The Influence of principal mediator systems of the organism on the expression of superficial glycoproteids of leukocytes. – Manuscript.

Tethіs for acquiring of scientific degree of candidate of biological sciences, speciality 03.00.13–physiology of human and animals. – Taras Shevchenko Kyiv National University, Kyiv, 2002.

Tethes is devoted to the study of influence of principal mediator systems of the organism on mannosecontaining membranous structures of leukocytes. To estimate the expression of mannosecontaining membranous structures of leukocytes there was modified unstraight lectinoperoxidase method of the given structures revealing. By the using of correlative analysis it was shown, that functional activity of lymphocytes and polymorphonuclear leukocytes connected with their mannosecontaining membranous structures expression.

Principal mediator