МІНІСТЕРСТВО ОХОРОНИ ЗДОРОВ'Я УКРАЇНИ

ТЕРНОПІЛЬСЬКА ДЕРЖАВНА МЕДИЧНА АКАДЕМІЯ

ім. І.Я. ГОРБАЧЕВСЬКОГО

КУБАНТ РУСЛАН МИРОСЛАВОВИЧ

УДК: 616.36-002-099:541.48/546.3-039.38:612.015]-092.9

ПОРУШЕННЯ ВІЛЬНОРАДИКАЛЬНОГО ТА ЕНЕРГО-

ЗАБЕЗПЕЧУВАЛЬНОГО ПРОЦЕСІВ У ПАТОГЕНЕЗІ

ТОКСИЧНОГО ГЕПАТИТУ ПРИ ІНТОКСИКАЦІЇ

ХЛОРИДОМ КАДМІЮ І СОЛЯНОКИСЛИМ

ГІДРАЗИНОМ ТА ЇХ КОРЕКЦІЯ

14.03.04 – патологічна фізіологія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата медичних наук

Тернопіль - 2002

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Тернопільській державній медичній академії

ім. І.Я.Горбачевського Міністерства охорони здоров'я України.

Науковий керівник: доктор медичних наук, професор Гонський Ярослав Іванович,

Тернопільська державна медична

академія ім. І.Я. Горбачевського,

завідувач кафедри медичної хімії

Офіційні опоненти:

доктор медичних наук, професор, Лауреат Державної премії України Середенко Михайло Михайлович, Інститут фізіології ім. О.О Богомольця НАН України, завідувач відділу по вивченню гіпоксичних станів, м. Київ;

доктор медичних наук, доцент Ткачук Світлана Сергіївна, Буковинська державна медична академія МОЗ України, професор кафедри нормальної фізіології, м. Чернівці.

Провідна установа: Національний медичний університет ім. О.О. Богомольця МОЗ України, кафедра патологічної фізіології, м. Київ.

Захист відбудеться 26 квітня 2002 р. о 1200 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради К 58.601.01 у Тернопільській державній медичній академії ім.І.Я.Горбачевського ( 46000, м.Тернопіль, майдан Волі, 1).

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Тернопільської державної медичної академії ім. І.Я. Горбачевського (м. Тернопіль, вул.Руська, 12 ).

Автореферат розісланий 23 березня 2002 р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради

докток медичних наук, професор Боднар Я.Я.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. За останні десятиріччя у зв'язку з інтенсивним розвитком науково-технічного прогресу значно зросло хімічне навантаження на біосферу, що призвело до виникнення нових форм патології людини та змін типового перебігу ряду захворювань людини (Григор'єва Г.С., Киричок Л.М., Конахович Н.Ф., 1998; Губский Ю.И., Долго-Сабуров В.Б., Храпак В.В., 1993; Goyer R. A., 1997). Шкідливі викиди хімічних та інших промислових виробництв, внесення в грунт добрив, широке використання хімії в побуті, екологічні катастрофи – далеко не весь перелік джерел токсикантів у повітрі, воді, їжі. Потрапляючи в організм людини, хімічні сполуки викликають ушкодження різних органів і тканин, у тому числі найважливіших біоструктур: мембран і генетичного апарату (Губський Ю.І., 1999).

Печінка є основним органом, в якому відбувається метаболізм і знешкодження ксенобіотиків. Цей факт і визначає ту обставину, що саме вона є основною мішенню при дії токсичних хімічних речовин (Загорскин П. П., Калашников С. П., Рубанова И. А., Хватова Е. М., 1992; Абрагамович О.О., Грабовська О.І., Терлецька О.І. та ін., 2000).

Одним з таких гепатотропних чинників, що знайшли широке застосування на виробництві, у сільському господарстві та в медицині, є гідразин (Scales M.D., Timbrell J.A., 1982; Белов А.А., 2000). Одним з механізмів реалізації токсичного впливу похідних гідразину вважають збільшення концентрації супероксидрадикалів шляхом безпосередньої участі гідразинів в їх генерації і інгібування мікросомальної системи захисту (супероксиддисмутаз), яке в кінцевому результаті також призводить до підвищення генерації суперооксидних радикалів (Авакян А.Х., 1990).

Не менш небезпечними та поширеними ксенобіотиками вважають важкі метали, зокрема кадмій (Гильденскиольд Р.С., Новиков Ю.В., Хамидулин Р.С., 1992; Руденко С. С., 1999; Nordberg G.F., 1999). Механізм токсичної дії кадмію обумовлений його прямою гепатотоксичною дією та здатністю активувати перекисне окиснення ліпідів при одночасному інгібуванні сульфгідрильних груп білків, у тому числі ферментів-антиоксидантів (Михалева Л. М., 1990; Спиридонова Е.Я., 1991). Вплив сполук кадмію на здоров'я на сучасному етапі розцінюється не лише як професійна шкідливість, але і як потенційна небезпека для населення в цілому.

Як кадмій, так і гідразин надзвичайно поширені в природі, побуті та на виробництві, тому існує реальна загроза поєднаного їх впливу на організм людини.

На основі аналізу значної кількості публікацій вітчизняних та закордонних фахівців можна стверджувати, що дані про поєднаний вплив гепатотоксичних агентів на процеси енергозабезпечення та вільнорадикального окислення нечисельні і часто суперечливі, а повідомлень про стан цих процесів за ураження солянокислим гідразином на тлі кадмієвої інтоксикації, у доступній нам літературі ми взагалі не зустрічали. Не з'ясованою залишається роль окиснювальної модифікації білків в умовах токсичного ураження печінки. Недостатня увага з боку науковців приділяється віковому аспекту в динаміці розвитку уражень гепатотоксинами, хоча відомо, що з віком змінюється відповідь організму на вплив ксенобіотиків. Все ще залишається складною і далекою до задовільного вирішення проблема корекції біохімічних змін, викликаних дією ксенобіотиків. Таким чином, значне погіршення екологічної ситуації, відсутність чітких діагностичних критеріїв метаболічних порушень та ефективної фармакотерапії комбінованих уражень печінки хімічними чинниками зумовлює актуальність проведення експериментальних досліджень в даному напрямку.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота є фрагментом комплексної планової наукової міжкафедральної теми “Вивчення стану окисних процесів при дії на організм ксенобіотиків” кафедр медичної хімії та загальної гігієни і екології Тернопільської державної медичної академії ім. І.Я.Горбачевського (№ держреєстрації 0101U001311), у виконанні якої автором проведені дослідження динаміки змін вільнорадикального та енергозабезпечувального окиснення в печінці і плазмі крові щурів різного віку за комбінованої дії хлориду кадмію та солянокислого гідразину та їх корекції за допомогою металокомплексів і унітіолу, що викладено у матеріалах дисертації.

Мета і завдання дослідження. З'ясувати роль вільнорадикального та енергозабезпечувального окиснення в динаміці розвитку токсичного ураження печінки солянокислим гідразином на тлі інтоксикації хлоридом кадмію в щурів різних вікових груп і довести ефективність корекції порушень цих процесів за допомогою металокомплексів та унітіолу.

Відповідно до мети було поставлено такі основні завдання:

1. Вивчити в динаміці зміни вільнорадикального і енергозабезпечувального окиснення в печінці та плазмі крові щурів різного віку за умов комбінованої дії хлориду кадмію та солянокислого гідразину.

2. З'ясувати роль окиснювальної модифікації білків та встановити взаємозв'язок між процесами вільнорадикального окиснення ліпідів та білків у динаміці розвитку токсичного ураження печінки у тварин різних вікових груп.

3. Дослідити антиоксидантні властивості гістидину та його металокомплексів з міддю і цинком та їх вплив на стан енергозабезпечувального і вільнорадикального окиснення на різних стадіях розвитку токсичного ураження печінки в щурів різного віку.

4. Застосувати з метою корекції порушень унітіол та порівняти його ефективність з металокомплексами.

Об'єкт дослідження – хімічне ураження печінки солянокислим гідразином на тлі інтоксикації хлоридом кадмію у тварин різного віку.

Предмет дослідження – показники вільнорадикального та енергозабезпечувального окиснення у тварин з хімічним ураженням печінки солянокислим гідразином на тлі інтоксикації хлоридом кадмію та в процесі їх корекції.

Методи дослідження – активність вільнорадикального окиснення ліпідів оцінювали за показниками вмісту продуктів перекисного окиснення ліпідів ПОЛ (малонового діальдегіду, дієнових і триєнових кон'югатів) та методом спонтанної і індукованої хемілюмінесценції; ступінь окиснювальної модифікації білків плазми крові – за вмістом альдегідо- та кетонопохідних білків нейтрального та основного характеру; стан енергозабезпечувального окиснення – полярографічним методом і за активністю сукцинатдегідрогенази, цитохромоксидази та протонної АТФ-ази; антиоксидантну активність гістидину та гістидинатів міді і цинку оцінювали за ступенем інгібування ними світлосуми залізоініційованої хемілюмінесценції.

Наукова новизна одержаних результатів. В п е р ш е комплексно досліджено у віковому аспекті стан вільнорадикального окиснення ліпідів і білків та енергозабезпечувальних процесів за умов комбінованого впливу хлориду кадмію та солянокислого гідразину. Встановлено патогенетичний взаємозв'язок між активністю окиснювальних процесів за умов дії на організм хлориду кадмію і солянокислого гідразину та віком експериментальних тварин. В п е р ш е застосовано і доведено в експериментах in vivo та in vitro антиоксидантну дію синтезованих гістидинатів міді і цинку за умов токсичного ураження печінки. Доведено ефективність корекції металокомплексами гістидину з міддю та цинком порушень вільнорадикального окиснення ліпідів і білків та енергозабезпечувальних процесів у тварин різних вікових груп. Виражена антиоксидантна та пов'язана з нею мембраностабілізуюча дія гістидинатів міді і цинку відкриває нові перспективи для їх подальшого дослідження та застосування в експериментальній та клінічній медицині .

Практичне значення одержаних результатів. Результати проведених досліджень розширюють і поглиблюють існуючі уявлення про механізми токсичного впливу кадмію та гідразину на організм.

Показники вмісту окиснено-модифікованих білків можна застосовувати як додатковий діагностичний критерій для оцінки тяжкості перебігу токсичного ураження печінки ксенобіотиками.

Гістидин та його металокомплекси з міддю і цинком, зважаючи на їх виражену антиоксидантну дію, можуть бути рекомендовані для подальшого вивчення і можливого використання з метою корекції біохімічних порушень за патології, що супроводжується активацією вільнорадикальних та мембранодеструктивних процесів.

Результати досліджень впроваджені в навчальний процес на кафедрах патофізіології, медичної хімії, фармакології та загальної гігієни і екології Тернопільської державної медичної академії ім. І.Я.Горбачевського, що підтверджено відповідними актами впровадження.

Особистий внесок здобувача. Автором самостійно проведено експерименти, біохімічні дослідження, статистичну обробку одержаних даних, написання і оформлення дисертації. Формулювання завдань та інтерпритацію результатів здійснено сумісно з науковим керівником.

У п'яти наукових працях, опублікованих у співавторстві, автору належить аналіз літератури, дані експериментальних досліджень, їх статистична обробка та підготовка матеріалу до друку.

У шести актах впровадження в тій частині, що стосується наукової новизни, використано власний матеріал автора.

Апробація результатів дисертації. Результати досліджень, що включені до дисертації, оприлюднені на ІV та V Міжнародних медичних конгресах студентів та молодих вчених (Тернопіль, 2000, 2001).

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 7 наукових праць, з них 3 – у фахових виданнях рекомендованих ВАК України та 4 – у матеріалах і збірниках конференцій та конгресів.

Структура дисертації. Дисертація викладена на 156 сторінках і складається із вступу, 6 розділів, висновків, практичних рекомендацій, списку використаних літературних джерел (всього 219 найменувань). Робота проілюстрована 39 таблицями та 13 рисунками і містить 6 додатків. Ілюстрації, таблиці, список використаних джерел, додатки викладені на 37 сторінках.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріали та методи дослідження. Досліди проведені на білих безпородних щурах - самцях, які утримувалися на стандартному раціоні віварію. Для дослідження використовували щурів трьох вікових періодів: статевонезрілі (3-місячні тварини), статевозрілі (6-місячні тварини) та старі (тварини 18-місячного віку). В кожну експериментальну групу було включено 5-6 тварин.

Iнтоксикацiю тварин кадмієм створювали шляхом триразового внутрішньошлункового введення хлориду кадмію в дозi 3,5 мг/кг маси тіла, що становить 1/25 LD50 (Бандман А.Л., Гудзовскій Г.А., Дубейковская Л.С., 1988) з iнтервалом в одну добу. Розчин солянокислого гiдразину вводили одноразово внутрiшньочеревно з розрахунку 90 мг/кг маси тiла тварини (Блюгер А.Ф., Карташова О.Я., 1983) на тлі кадмієвої інтоксикації (на восьму добу після першого введення кадмію).

Піддослідні тварини були поділені на такі групи: 1 - інтактні щурі; 2 - уражені хлоридом кадмію та солянокислим гідразином, 3, 4, 5, 6 - групи уражених тварин, в яких для корекції біохімічних порушень використовували відповідно: гістидин, гістидинати міді та цинку, унітіол. Тварин декапітували під ефірним наркозом на 1-у, 4-у, 7-у та 10-у доби з моменту введення солянокислого гідразину.

З метою корекції метаболічних порушень через добу після кожного введення хлориду кадмію тварини одержували внутрішньошлунково: гістидин в дозі 2 мг/кг (концентрація гістидину в крові) або відповідно гістидинат міді (0,94 мг/кг) чи гістидинат цинку (0,34 мг/кг). При цьому ми виходили із біотичних доз використаних металів - мікроелементів. Металокомплекси синтезовані на нашій кафедрі за методом проф. Я.І.Гонського з гістидину та гідроксидів металів, взятих в еквімолярних концентраціях. Унітіол вводили через годину після ін'єкції солянокислого гідразину в дозі 100 мг/кг (Карп В.К., Данова І.В., 1997).

Як матеріал для дослідження брали плазму крові та гомогенат печінки.

Показники активністі вільнорадикального окиснення ліпідів визначали наступними методами: вміст малонового діальдегіду (МДА) визначали фотоколориметричним методом за інтенсивністю забарвленого комплексу, який утворюється при взаємодії малонового діальдегіду з тіобарбітуровою кислотою в кислому середовищі (Владимиров Ю.А., Арчаков А.И., 1972); концентрацію дієнових (ДК) і трієнових (ТК) кон'югатів – за методом, який грунтується на здатності екстрагованих гептан-ізопропіловою сумішшю гідроперекисів проявляти відповідний максимум поглинання: ДК при l=232 нм, ТК – l=275 нм (Волчегорский И.А. и соавт., 1989); методом реєстрації світлосуми спонтанної і індукованої перекисом водню хемілюмінесценції (Бабенко Г.А., Гонский Я.И., Матияш Ю.М., 1986). Ступінь окиснювальної модифікації білків плазми крові оцінювали за вмістом альдегідо- та кетонопохідних білків нейтрального та основного характеру, які утворюються при взаємодії альдегідних і кетонних груп окиснено-модифікованих білків з 2,4-динітрофенілгідразином з утворенням 2,4-динітрофенілгідразонів, що мають характерний спектр (Мещишен І.Ф., 1998). Показники активності енергозабезпечувального окиснення визначали наступними методами: швидкість дихання та окиснювального фосфорилювання виділених методом диференційного центрифугування мітохондрій печінки – полярографічним методом з використанням відкритого платинового електроду (Франк Г.М., Кондрашева Е.И., Мохова Е.И., 1973); активність сукцинатдегідрогенази (СДГ) оцінювали за кількістю відновленого сукцинатом ферроціаніду калію під дією СДГ (Ещенко Н.Д., Вольский Т.Г., 1982); активність цитохромоксидази (ЦО) визначали за кількістю пігменту червоного кольору, який утворюється в результаті окиснення диметил-п-фенілендиаміну при взаємодії останього з цитохромом С в присутності ЦО мітохондрій печінки (Кривченкова Р.С., 1977); активність протонної АТФ-ази – за вмістом неорганічного фосфату, який звільняється при гідролізі АТФ на мг білка за 1 хв (Губский Ю.И.,1982). Антиоксидантні властивості гістидину та гістидинатів міді та цинку визначали за ступенем інгібування ними світлосуми залізоініційованої хемілюмінесценції в модельній системі, що містила суспензію жовткових ліпопротеїнів (ЖЛП) у присутності родаміну Ж (Владимиров Ю. А., Шерстнев М.П., Азимбаев Т.К., 1992).

Результати досліджень піддавали статистичному аналізу (Гублер Е.В., 1978). Достовірність отриманих результатів визначали, використовуючи критерій Ст'юдента. Зміни вважали достовірними при р<0,05. Для розрахунків використовували комп'ютерну програму Exel (Microsoft, США).

Основні результати досліджень. Результати проведених досліджень показали, що в здорових тварин з віком інтенсивність перекисного окиснення ліпідів знижується, про що свідчить достовірне зниження вмісту продуктів ліпопероксидації (МДА, дієнових і триєнових конюгатів) у дорослих та старих інтактних щурів у порівнянні з 3-х міс. тваринами як у плазмі, так і в печінці. Ці дані узгоджуються з дослідженнями інших авторів (Лемешко В. В., Никитченко Ю. В., Свич И. В., Овсянников С. Е., 1987; Кліщ І.М., 1998) і підтверджуються аналогічними змінами, встановленими при вивченні показників інтенсивності спонтанної та ініційованої перекисом водню хемілюмінесценції.

Введення тваринам хлориду кадмію та солянокислого гідразину супроводжувалось істотним підвищенням інтенсивності вільнорадикальних процесів як у плазмі, так і печінці тварин усіх вікових груп. Проте найбільшого ураження зазнавали статевонезрілі та старі щури. Активність перекисного окиснення ліпідів (ПОЛ), оцінена за параметрами світлосуми спонтанної ХЛ та вмістом МДА, зростала вже на першу добу експерименту, однак максимальних величин досягала на четвертий день (табл.1). Зважаючи на той факт, що перетворення гідразину і його похідних супроводжується утворенням АФК (Авакян А.Х., 1990) та що інтенсивність цього процесу прямозалежна від активності системи мікросомального окиснення, яка за даними деяких авторів (Лемешко В.В., 1980; Парамонова Г.И., 1983), вища в молодих тварин, то цілком зрозумілим стає максимальне підвищення ПОЛ саме в 3-місячних щурів. У старих тварин ці зміни обумовлені в більшій мірі зниженням системи антиоксидного захисту внаслідок її вікової недосконалості (Гонский Я. И., Корда М. М., Клищ И. Н., 1996) та інактивації кадмієм SH груп білків-ферментів (Михалева Л. М., 1990).

Утворені під впливом ксенобіотиків АФК викликають також окиснювальну модифікацію білків (ОМБ). При дослідженні ОМБ ми встановили, що з віком у здорових тварин вміст окиснених білків зростає, свідченням чого є підвищення рівня альдегідо- і кетонопохідних нейтрального та основного характеру у 18-місячних тварин над аналогічними показниками у молодих та дорослих тварин. Нагромадження з віком у клітинах окиснених білків може бути частково обумовлене зниженням активності внутрішньоклітинних протеаз, які гідролізують модифіковані протеїни.

Таблиця 1.

Динамiка показників вмiсту малонового діальдегіду (мкмоль/кг) та світлосуми (УСХЛ) спонтанної хемілюмінесценції (ум.од.) у печінці щурів різного віку за умов комбінованої дії хлориду кадмію та солянокислого гідразину (M±m; n = 6)

Вiк Показник Група тварин

Інтактнi щури Ураженi щури, доба експерименту

1 4 7 10

3-х мiс. МДА 42,48±0,56 49,15±1,00* 67,81±1,80* 47,24±1,18* 42,88±0,56

(УСХЛ) 44,3±1,9 65,6±2,0* 92,2±2,5* 55,8±1,6* 47,2±0,9

6-и мiс. МДА 39,02±1,24 44,07±1,50* 50,90±1,67* 43,27±1,38 40,02±0,88

(УСХЛ) 36,2±2,0 48,5±2,3* 56,5±2,1* 43,6±2,2 38,4±1,6

18-и міс. МДА 36,80±1,03 42,95±1,02* 55,18±2,14* 41,45±0,75* 40,10±0,63*

(УСХЛ) 28,6±1,7 41,2±2,3* 54,8±2,4* 36,3±1,5* 34,1±1,0*

Примiтка. * - результати достовірні вiдносно iнтактних тварин (р<0,05)

Значних змін зазнавали також показники ОМБ в уражених тварин різного віку. Зростання альдегідо- і кетонопохідних нейтрального характеру відмічено вже на 1-у добу експерименту в усіх вікових групах, однак максимальних змін ОМБ зазнають 3-х та 18-місячні тварини на четверту добу.

Відомо, що рівень окиснених протеїнів відображає баланс між швидкістю окиснення і швидкістю деградації окиснених білків (Дубинина Е.Е., 1989). Тому підвищення ОМБ у 18-міс щурів можна розцінити як можливий наслідок посилення металкаталізованого окиснення білків, за рахунок нагромадження в тканинах з віком металів змінної валентності, вікової недосконалості антиоксидної системи та зниження активності специфічних протеаз.

Також вивчався комбінований вплив хлориду кадмію та солянокислого гідразину на стан процесів енергозабезпечення, який оцінювали за інтенсивністю тканинного дихання, окисного фосфорилювання та активністю маркерних ферментів мітохондрій печінки – сукцинатдегідрогенази, цитохромоксидази і протонної АТФ-ази. Отримані результати вказують на суттєве пригнічення швидкості окиснення сукцинату уже через 24 год після останнього введення отрути. Інтенсивність вироблення енергії залежить також від активності останнього ферменту дихального ланцюга – цитохромоксидази. Було показано, що за дії хлориду кадмію і солянокислого гідразину відбувається пригнічення активності ЦО, що вказує на порушення транспорту електронів у термінальній ділянці дихального ланцюга. Зниження активності ЦО під впливом використаних ксенобіотиків можна пов'язати не лише з втратою ферментом іонів міді, як було показано в роботі (Корда М.М., 1998), але й з ймовірною окиснювальною модифікацією ферменту.

Активність енергозабезпечувальних процесів у печінці здорових тварин теж має певні вікові особливості. Встановлено, що швидкість поглинання кисню в метаболічних станах (V2, V3, V4) мітохондріями статевонедозрілих тварин вища, ніж статеводозрілих та старих, що може бути пов'язане з підсиленням анаболічних процесів у молодих тварин і підвищеною потребою їх в енергії. За наявності в середовищі інкубації 2,4-ДНФ показник (VДНФ) максимального значення досягав у статеводозрілих щурів, найвищим у даної групи був і дихальний контроль, що свідчить про високу поєднаність тканинного дихання та окисного фосфорилювання в дорослих тварин (табл.2).

Ураження щурів хлоридом кадмію та солянокислим гідразином призводило до суттєвих порушень процесів енергозабезпечення уже на першу добу експерименту у тварин всіх вікових груп, проте максимальних змін зазнавали ці процеси у старих тварин на 4-ту добу. Зокрема, у них погіршувались процеси спряження тканинного дихання та окиснювального фосфорилювання, свідченням чого є пригнічення дихання мітохондрій в "активному" (V3) стані (55 % від рівня інтактних щурів) та зниження (в 1,6 раз) дихального контролю за Чансом (ДхК).

Таблиця 2.

Динаміка інтенсивності поглинання кисню (мг/(кг·хв) та параметрів спряження дихання і фосфорилювання мітохондрій печінки щурів за умов комбінованої дії хлориду кадмію та солянокислого гідразину (M±m; n = 6)

Вiк Показ- ник Група тварин

інтактнi щури Ураженi щури, доба експерименту

1 4 7 10

3-х мiс. V2 42,6±2,2 30,2±2,0* 26,1±1,3* 32,1±2,5* 40,5±3,1

V3 96,8±5,7 69,2±3,6* 53,8±4,2* 82,4±6,6 89,7±4,8

VДНФ 143,5±7,6 125,5±7,6 116,3±6,2* 132,8±7,8 139,3±8,7

ДхК 2,92±0,12 2,40±0,14* 1,93±0,10* 2,61±0,18 2,73±0,18

6-и мiс. V2 38,4±2,1 33,6±2,2 28,5±2,0* 34,4±2,3 37,7±2,6

V3 93,5±6,5 79,3±5,2 64,2±4,2* 81,5±6,3 86,7±7,2

VДНФ 156,2±8,2 136,4±7,8 125,6±5,8* 136,3±7,8 148,8±10,6

ДхК 3,14±0,18 2,82±0,13 2,28±0,12* 2,81±0,16 3,02±0,20

18-и мiс. V2 32,2±1,8 25,2±1,7* 20,3±1,4* 27,1±2,0 29,1±2,1

V3 75,6±4,3 54,6±2,3* 41,8±3,2* 62,0±3,3* 65,6±4,5

VДНФ 119,4±8,6 68,2±4,2* 52,7±3,7* 77,1±4,6* 91,4±7,4

ДхК 2,63±0,20 2,03±0,10* 1,61±0,10* 2,22±0,13 2,33±0,09

Примiтка. * - результати достовірні вiдносно iнтактних тварин (р<0,05)

Відмічалося також достовірне падіння швидкості дихання мітохондрій у "вільному" (V2) та "роз'єднаному" (VДНФ) метаболічних станах (відповідно в 1,6 і 2,3 раза). Це вказує на значні порушення в старих тварин під впливом кадмію та гідразину транспорту електронів по дихальному ланцюгу. Пригнічення тканинного дихання спостерігалось і в статевонедозрілих щурів, але в меншій мірі, ніж у старих.

Нами зафіксоване також значне підвищення активності протонної АТФ-ази в мітохондріях печінки уражених щурів, що, очевидно, може бути наслідком "компенсаторної" реакції органел, які для власних енергетичних потреб та підтримання трансмембранного потенціалу на певному критичному рівні використовують у більшій мірі енергію гідролізу АТФ за одночасного інгібування синтезу макроергу.

Таким чином, одержані результати свідчать про пригнічення в уражених хлоридом кадмію та солянокислим гідразином тварин процесів тканинного дихання та окисного фосфорилювання, що призводить до зниження синтезу АТФ і пов'язаних з цим порушень ряду енергозалежних життєвоважливих процесів.

Зрозуміло, що для об'єктивної оцінки комбінованого впливу двох ксенобіотиків на організм, необхідно враховувати особливості метаболізму кожного з них, так як від їх поєднання значною мірою залежатиме тяжкість та динаміка перебігу патологічного процесу. Тому становило інтерес дослідити у віковому аспекті вплив окремо солянокислого гідразину на показники перекисного окиснення ліпідів та окисної модифікації білків та порівняти отримані дані з такими, встановленими для комбінованого ураження. Було показано, що під впливом окремо солянокислого гідразину, як і в поєднанні його з хлоридом кадмію, спостерігається значне підвищення ПОЛ і ОМБ у тварин усіх вікових груп, однак з властивими в кожному випадку особливостями. Так, максимального вільнорадикального окиснення зазнавали ліпіди за умов гідразинового гепатозу на першу добу експерименту у тварин усіх вікових груп, тоді як при комбінованому ураженні – на четверту добу. Очевидно, моделюючи кадмієву інтоксикацію до моменту введення тваринам солянокислого гідразину, ми тим самим сприяли пригніченню кадмієм активності мікросомальної системи (Михалева Л. М., 1990), від якої головним чином залежить інтенсивність утворення АФК в процесі метаболізму гідразину, що сприяло зсуву максимуму ураження в пізніші терміни експерименту. Аналогічна закономірність простежується і в показниках окиснено-модифікованих білків.

Зважаючи на вищевказане, особливості біотрансформації хімічних речовин повинні бути одним з визначальних факторів у вирішенні проблеми адекватного підбору коригуючих чинників як в експерементальній, так і клінічній медицині.

Виходячи із встановлених в експерименті біохімічних порушень, що виникають в організмі щурів за комбінованої дії хлориду кадмію і солянокислого гідразину, повинна вирішуватися проблема корекції. З цією метою нами було синтезовано і використано металокомплекси гістидину з міддю та цинком. У роботі (Западнюк В.И., Купраш Л.П., Заика М.У., 1982) вказується на можливу здатність гістидину виконувати функцію ендогенного хелатора іонів металів змінної валентності та пастки супероксиданіон-радикалів, що робить перспективним вивчення цієї амінокислоти та її комплексів з метою використання як середників з антиоксидантними та гепатопротекторними властивостями.

Результати досліджень показали, що введення гістидину та гістидинатів міді і цинку, починаючи з четвертої доби і до кінця експерименту (10-й день), ефективно сприяло нормалізації вмісту продуктів перекисного окиснення ліпідів (МДА, ДК та ТК), що дозволило припустити наявність у застосованих середників антиоксидантних властивостей. На користь останнього свідчить також доведена нами в експерименті здатність гістидину та його металокомплексів зменшувати інтенсивність спонтанної та ініційованої хемілюмінесценції в плазмі крові та гомогенаті печінки уражених тварин.

Введення гістидину і його металокомплексів також певною мірою запобігало утворенню окиснено-модифікованих білків у плазмі крові уражених тварин різного віку. Причому металокомплекси гістидину більш ефективно, ніж сам гістидин інгібували утворення окиснено-модифікованих білків, серед яких кращий ефект на ОМБ справив гістидинат міді (табл.3).

Таблиця 3.

Динаміка вмісту альдегідо- та кетонопохідних нейтрального (ОМБ370нм) й основного (ОМБ430нм) характеру (моль/кг) в плазмі крові лікованих гістидинатом міді щурів різного віку за комбінованої дії хлориду кадмію та солянокислого гідразину (M±m; n = 6)

Вік Показ- ник Група тварин

Ін-такт-ні Доба експерименту

1 4 7 10

ура- же- ні ліковані гістиди- натом міді ура- же- ні ліковані гістиди- натом міді ура- же- ні ліковані гістиди- натом міді ура- же- ні ліковані гістиди- натом міді

3-х міс ОМБ370 0,79± 0,02 0,89± 0,03# 0,93± 0,03 0,98± 0,05# 0,83± 0,03* 0,84± 0,02 0,82± 0,01 0,81± 0,01 0,79± 0,02

ОМБ430 0,50± 0,01 0,57± 0,02# 0,60± 0,02 0,62± 0,03# 0,54± 0,02* 0,54± 0,02 0,51± 0,02 0,52± 0,01 0,50± 0,02

6-и міс ОМБ370 0,80± 0,04 0,85± 0,02 0,88± 0,05 0,95± 0,03# 0,84± 0,03* 0,83± 0,02 0,81± 0,02 0,81± 0,01 0,79± 0,02

ОМБ430 0,51± 0,02 0,56± 0,02 0,59± 0,02 0,59± 0,02 0,54± 0,03 0,55± 0,02 0,52± 0,02 0,52± 0,01 0,50± 0,02

18-и міс ОМБ370 0,96± 0,04 1,18± 0,04# 1,22± 0,03* 1,32± 0,05# 1,08± 0,04* 1,12± 0,04# 0,98± 0,03* 1,09± 0,04 0,98± 0,03

ОМБ430 0,62± 0,02 0,77± 0,03# 0,79± 0,03 0,86± 0,04# 0,70± 0,03* 0,70± 0,02# 0,62± 0,03* 0,66± 0,01 0,62± 0,03

Примітки: 1.* – зміни достовірні відносно інтактних тварин, р<0,05;

2..# – зміни достовірні відносно уражених тварин, р<0,05

Ефективне інгібування процесів вільнорадикального окиснення лежить, очевидно, в основі позитивного впливу коригуючих чинників на стан енергозабезпечення. Так, введення гістидину та гістидинатів запобігало пригніченню активності сукцинатдегідрогенази, починаючи з першої доби і до кінця експерименту. Сприятливий вплив справила застосована корекція і на активність цитохромоксидази, причому найкращого лікувального ефекту зазнавали молоді та старі тварини. Серед застосованих чинників більш ефективною була дія гістидинату міді (табл.4).

Таблиця 4.

Динаміка активності сукцинатдегідрогенази та цитохромоксидази (ммоль/(кг · хв) в печінці лікованих гістидинатом міді щурів різного віку за комбінованої дії хлориду кадмію та солянокислого гідразину (M±m; n = 6)

Вік Показ-ник Група тварин

Інтакт-ні Доба експерименту

1 4 7 10

ура- же- ні ліковані гістиди- натом міді ура- же- ні ліковані гістиди- натом міді ура- же- ні ліковані гістиди- натом міді ура- же- ні ліковані гістиди- натом міді

3-х міс СДГ 10,14± 0,26 7,05± 0,24* 8,08± 0,32# 6,24± 0,23* 8,82± 0,28# 8,04± 0,28* 9,88± 0,34# 9,39± 0,18 10,08± 0,31

ЦО 8,98± 0,20 6,88± 0,11# 7,76± 0,24* 6,22± 0,14# 8,28± 0,22* 7,55± 0,28# 8,83± 0,16* 8,42± 0,15 9,10± 0,12*

6-и міс СДГ 9,30± 0,24 7,54± 0,25* 8,18± 0,22 6,62± 0,19* 8,97± 0,26# 7,94± 0,26* 8,93± 0,28# 8,76± 0,32 9,12± 0,20

ЦО 8,55± 0,21 7,16± 0,23# 7,59± 0,16 6,68± 0,25# 7,82± 0,18* 7,64± 0,20 8,42± 0,14* 8,17± 0,16 8,58± 0,11

18-и міс СДГ 8,09± 0,29 5,10± 0,17* 5,85± 0,16# 4,72± 0,18* 6,46± 0,14# 5,52± 0,16* 6,58± 0,21# 7,24± 0,14* 7,60± 0,18

ЦО 7,88± 0,16 5,52± 0,15# 6,18± 0,21* 5,24± 0,18# 6,71± 0,28* 6,12± 0,26# 7,16± 0,18* 7,10± 0,18# 7,64± 0,12*

Примітки: 1.* – зміни достовірні відносно інтактних тварин, р<0,05;

2..# – зміни достовірні відносно уражених тварин, р<0,05

Під впливом гістидину та гістидинатів значно покращувалися також показники тканинного дихання, особливо ті, які характеризують спряженість процесів дихання і фосфорилювання, про що свідчить нормалізація швидкості поглинання кисню в метаболічних станах V2 (вільний), V3 (активний) та показника

дихального контролю за Чансом. Однією з причин виявленого ефекту може бути встановлене нами зниження, за умов корекції, вмісту продуктів перекисного окиснення ліпідів (гідроперекисів та ін.), що є активними роз'єднувачами дихання і фосфорилювання. Корекція гістидином та гістидинатами міді і цинку протягом усього експерименту призводила до нормалізації активності протонної АТФ-ази та підвищення резервних можливостей дихального ланцюга, особливо в старих тварин, в яких, за результатами наших досліджень, дана ланка тканинного дихання виявилася надзвичайно чутливою до дії ксенобіотиків.

Враховуючи, що більшість ферментних комплексів тканинного дихання локалізовані саме в мітохондріях, можна припустити, що здатність гістидину та його металокомплексів гальмувати вільнорадикальне окиснення і таким чином стабілізувати мембрани органел є найбільш вірогідним механізмом нормалізації процесів енергозабезпечення в уражених хлоридом кадмію та солянокислим гідразином тварин.

Наявність у гістидину та гістидинатів міді і цинку антиоксидантних властивостей була доведена нами в експерименті in vitro на моделі залізоініційованої хемілюмінесценції (ЗХЛ). Встановлено, що всім досліджуваним препаратам притаманна певна антиоксидантна активність, яка підвищується паралельно із збільшенням концентрації препарату в модельній системі. Причому найбільшу здатність інгібувати показник світлосуми ЗХЛ проявив гістидинат міді, а найменшу – сам гістидин.

Таким чином, узагальнюючи отримані результати можна стверджувати, що гістидин та його металокомплекси з міддю і цинком здатні ефективно нормалізувати процеси як вільнорадикального, так і енергозабезпечувального окиснення в печінці, уражених ксенобіотиками щурів, справляючи антиоксидантний та мембраностабілізуючий вплив, що дозволяє говорити про певні гепатопротекторні властивості препаратів.

Зважаючи, що одним із шляхів знешкодження ксенобіотиків, зокрема і кадмію, в організмі є кон'югація їх з меркаптогрупами біосубстратів (глутатіон, цистеїн та ін.), деякі дослідники вказують на ефективність використання при токсичних гепатитах тіолвмісних препаратів (Карп В. К., Данова I. В., 1997). Однак, механізми впливу таких препаратів, зокрема унітіолу, на вільнорадикальні та енергозабезпечувальні процеси, у тому числі за комбінованого впливу токсичних агентів, ще до кінця не з'ясовані.

Результати проведених досліджень показали, що введення отруєним тваринам унітіолу сприяє нормалізації активованих ксенобіотиками реакцій вільнорадикального окиснення, про що свідчить зниження вмісту проміжних (ДК, ТК) та прикінцевого (МДА) продуктів ПОЛ. Найкраще вказаний ефект проявлявся в ранні терміни експерименту (1– 4 доба), зберігаючи в наступні дні лише тенденцію до нормалізації. Подібна закономірність зберігалась і в показниках світлосуми спонтанної (еСХЛ) та ініційованої хемілюмінесценції (еН2О2), що свідчить про відносно низьку ефективність препарату на пізніх стадіях отруєння ксенобіотиками. При зіставленні показників ефективності унітіолу з такими, характерними для гістидинатів, відмічалося, що металокомплекси переважно проявляють кращий і більш пролонгований ефект. Такі особливості впливу можна пов'язати з ймовірною здатністю гістидину та іонів міді і цинку включатися у фізіологічні метаболічні шляхи, і тим самим триваліший час знаходитись в організмі, тоді як унітіол, будучи стороннім агентом, швидко біотрансформується та втрачає свою активність.

Особливої уваги заслуговує показана нами в роботі здатність унітіолу інгібувати, активовані за комбінованої дії хлориду кадмію та солянокислого гідразину, процеси пероксидації білків, доказом чого є нормалізація в уражених щурів, особливо старих тварин, рівня окиснено-модифікованих білків. Як було показано вище, в інтактних старих та уражених ксенобіотиками щурів різного віку посилюються процеси ОМБ, однією з причин чого є зниження з віком активності протеаз, що розщеплюють модифіковані білки. Однак, згідно існуючих припущень, при старінні може знижуватись не лише активність ферментів, що беруть участь в протеолітичній деградації, але й здатність самих білків-субстратів до руйнування (Шепотиновская И.В., 1986). Серед причин, що впливають на швидкість розщеплення протеїнів, відносяться внутрішньо- і міжмолекулярні зшивки різної природи, в тому числі дисульфідні. Ймовірно, що такі зв'язки можуть формуватися в білках і за дії ксенобіотиків, зокрема хлориду кадмію. Тому застосування препаратів, які містять SH-групи, повинно сприяти підтриманню сульфгідрильних груп білків у відновленому стані та підвищувати чутливість протеїнів до дії протеолітичних ферментів. На цьому, очевидно, і грунтується встановлена в роботі ефективність унітіолу, як препарату, який нормалізує процеси окиснювальної модифікації білків, що відкриває нові можливості його застосування в експериментальних дослідженнях та медичній практиці.

Введення унітіолу впливало також на стан функціонування мітохондрій. Достовірно на першу і четверту добу підвищувалась активність сукцинатдегідрогенази та протонної АТФ-ази, тоді як активність цитохромоксидази істотної нормалізації зазнавала лише в перший день експерименту. Позитивний лікувальний вплив препарату відмічено і на процеси тканинного дихання та окиснювального фосфорилювання. Показано, що реакція мітохондрій на введення коригуючого чинника залежить від метаболічного стану органел, віку тварин та доби експерименту.

Таким чином, результати проведених досліджень показали, що з віком в інтактних тварин інтенсивність ПОЛ знижується, тоді як ступінь окиснювальної модифікації білків зростає. Також з віком у клітинах печінки порушується енергетичний баланс, що знижує функціональні і адаптивні можливості організму за умов токсичного впливу ксенобіотиків. Комбінована дія гідразину і кадмію хлориду призводить до значних порушень процесів тканинного дихання та окисного фосфорилювання на фоні значної активації вільнорадикального окиснення не лише ліпідів, а й білків. Використання унітіолу, гістидину та гістидинатів міді і цинку, з метою корекції біохімічних порушень, сприяло частковій нормалізації виявлених змін в організмі уражених тварин різного віку. На основі одержаних результатів можна стверджувати, що синтезовані нами металокомплекси гістидину з міддю і цинком, як складові компоненти організму з добре вираженими антиоксидантними властивостями, заслуговують уваги для подальшого вивчення з метою використання за умов токсичного впливу на організм ксенобіотиків.

ВИСНОВКИ

У дисертаційній роботі експериментально обгрунтовано теоретичне узагальнення та накреслені практичні шляхи вирішення наукового завдання – з'ясувати у віковому аспекті вплив хлориду кадмію та солянокислого гідразину на енергозабезпечувальні і вільнорадикальні процеси організму щурів та використати одержані результати для розробки ефективних методів корекції.

У результаті вирішення наукового завдання зроблено наступні наукові та прикладні висновки:

1. З віком у здорових тварин відбувається пригнічення процесів вільнорадикального окиснення ліпідів у печінці та плазмі крові, про що свідчить зниження в старих щурів у порівнянні з статевонезрілими показників світлосуми спонтанної і ініційованої хемілюмінесценції та вмісту продуктів перекисного окиснення ліпідів (малонового діальдегіду, дієнових і трієнових кон'югатів).

2. Спрямованість змін показників окиснено-модифікованих білків в усіх вікових групах здорових щурів носить протилежний характер порівняно з такими ПОЛ (рівень альдегідо- і кетонопохідних нейтрального та основного характеру плазми крові найвищий у старих тварин).

3. Інтенсивність енергозабезпечувальних процесів у печінці здорових тварин змінюється з віком: швидкість поглинання кисню мітохондріями в метаболічних станах V2, V3, V4 у статевонезрілих тварин вища, ніж у статевозрілих і старих. Найкраща спряженість тканинного дихання і окиснювального фосфорилювання спостерігається у 6-місячних щурів.

4. Ураження тварин солянокислим гідразином на тлі кадмієвої інтоксикації супроводжується активацією вільнорадикального окиснення як ліпідів, так і білків печінки та плазми крові, ступінь якої залежить від віку. У старих тварин в більшій мірі підлягають окисненій модифікації білки, тоді як в молодих – ліпіди.

5. За умов комбінованої дії гідразину і кадмію хлориду значно порушуються процеси енергозабезпечення в усіх трьох вікових групах тварин. Найбільших змін вони зазнають в старих щурів на 4-у добу експерименту.

6. Використання з метою корекції гістидину, гістидинатів міді і цинку сприяє наближенню до норми показників активності вільнорадикального і енергозабезпечувального окиснення у тварин усіх вікових груп, що пов'язане з їх антиоксидантними властивостями.

7. Унітіол проявляє найкращий коригуючий вплив на 1-у добу після застосування. Дія гістидину і металокомплексів характеризується більшою, порівняно з унітіолом, ефективністю та тривалістю з максимумом вираженості на 4-й день.

ПРАКТИЧНІ РЕКОМЕНДАЦІЇ

1. Враховуючи виражену антиоксидантну активність гістидину та його металокомплексів з міддю і цинком, вважати доцільним їх подальше вивчення з метою визначення можливості корекції біохімічних порушень за умов активації вільнорадикальних та мембранодеструктивних процесів.

2. Дослідження показників вмісту окиснено-модифікованих білків можна вважати додатковим діагностичним критерієм для оцінки тяжкості перебігу токсичного ураження печінки ксенобіотиками.

3. При оцінці токсичних уражень печінки слід враховувати вікові особливості організму.

4. Використовувати результати проведених досліджень у навчальному процесі на кафедрах патологічної фізіології, медичної хімії, фармакології, загальної гігієни і екології медичних вузів України.

СПИСОК ОПУБЛІКОВАНИХ ПРАЦЬ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Кубант Р.М. Вікові особливості порушень енергозабезпечувального окиснення у печінці щурів уражених хлоридом кадмію і солянокислим гідразином та їх корекція за допомогою металокомплексів // Вісник наукових досліджень. – 2001.– №2 (22). – С. 104-106.

2. Гонський Я. І., Кубант Р.М. Корекція порушень вільнорадикальних процесів у щурів з токсичним ураженням печінки за допомогою металокомплексів// Наук. вісник Ужгородського університету. Серія “Медицина”. – 2001. – Вип. 15.– C. 6-10.

3. Динаміка перекисного окислення ліпідів та окислювальної модифікації білків у щурів різного віку за умов токсичного ураження печінки солянокислим гідразином / Гонський Я. І., Кубант Р.М., Кліщ І.М., Михалкiв М.М., Дмухальська Є.Б. // Вісник наукових досліджень. – 2001.– №1(21). – С. 104-106.

4. Гонський Я.І., Кубант Р.М., Михалків М.М. Вплив деяких ксенобіотиків in vitro на активність супероксиддисмутази та вміст малонового диальдегіду в гомогенаті печінки// Здобутки клінічної та експериментальної медицини. – Вип. 6.– Тернопіль, 2001. – С. 82.

5. Вікові зміни показників антиоксидантної системи та вільнорадикального окиснення у тварин з експериментальним гепатитом на фоні інтоксикації хлоридом кадмію/ Михалків М., Дмухальська Є., Кубант Р., Кубант О, Гранківська С. // Тези доповідей IV Міжнародного медичного конгресу студентів і молодих вчених. – Тернопіль, 2000. - С. 175.

6. Дмухальська Є., Михалків М., Кубант Р. Корекція унітіолом біохімічних порушень у тварин уражених хлоридом кадмію та солянокислим гідразином // Тези доповідей V Міжнародного медичного конгресу студентів і молодих вчених. – Тернопіль, 2001. - С. 157.

7. Кубант Р.М. Порівняльна характеристика гістидину та його металокомплексів хемілюмінесцентним методом// Тези доповідей V Міжнародного медичного конгресу студентів і молодих вчених. – Тернопіль, 2001. – С. 161.

АНОТАЦІЯ

Кубант Р.М. Порушення вільнорадикального