Київський національний університет імені Тараса Шевченка

Лизогубов Валерій Вікторович

УДК 591.533+591.8

МОРФОФУНКЦІОНАЛЬНІ ЗМІНИ В ЩИТОВИДНІЙ ЗАЛОЗІ

НОВОНАРОДЖЕНИХ ЩУРІВ ЗА УМОВ МАТЕРИНСЬКОГО

ГІПОТИРЕОЗУ, СПРИЧИНЕНОГО 131І.

03.00.11 – цитологія, гістологія

АВТРОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Київ – 2002

Дисертацією є рукопис.

Роботу виконано в Дніпропетровському національному університеті Міністерства освіти і науки України

Науковий керівник: доктор біологічних наук, професор

Корогод Сергій Михайлович

Дніпропетровський національний університет, фізичний факультет, завідувач кафедри експериментальної фізики

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор

Богданова Тетяна Іванівна

Інститут ендокринології та обміну речовин

ім. В.П. Комісаренка АМН України,

завідувач лабораторії морфології ендокринної системи

доктор медичних наук, професор

Гордієнко Вадим Максимович

Київський національний університет імені Тараса Шевченка, професор кафедри цитології, гістології та біології розвитку

Провідна установа: Інститут експериментальної патології,

онкології і радіобіології ім. Р.Є.Кавецького

НАН України, м. Київ

Захист відбудеться “23” грудня 2002 року о 14 годині

На засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.001.38

Київського національного університету імені Тараса Шевченка

(м. Київ, пр. акад. Глушкова, 2, біологічний факультет)

Поштова адреса: 01033, м. Київ-33, вул. Володимирська, 64, біологічний факультет

З дисертацією можна ознайомитись в бібліотеці Київського національного університету (01033,

м. Київ-33, вул. Володимирська, 58)

Автореферат розіслано 21 листопада 2002 року

Вчений секретар спеціалізованої

вченої ради Д 26.001.38 Т.Л. Давидовська

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Материнський гіпотиреоз негативно впливає на розвиток плода. Комбінована дія радіації та материнського гіпотиреозу призводить до порушень розвитку плода та функцію його щитовидної залози (Артемова и др., 1976; Bachrach et al., 1983). Клінічні спостереження впливу терапевтичних доз радіоактивного 131I при лікуванні патології щитовидної залози жінок (Exss et al., 1974; Richards et al., 1981; Einhorn et al., 1972) вказують на те, що характерним для такого роду пошкоджень є відсутність чуттєвих змін в тиреоїдному стані в період новонародженості і розвиток симптомів кретинізму в другому півріччі життя дитини. В теперішній час спостерігається зростання радіоактивного навантаження на організм людини. Це призводить до зростання можливості розвитку патології щитовидної залози у плодів та дітей раннього віку. Численні наукові праці присвячені різним аспектам наслідків радіаційного опромінення щитовидної залози пов`язаного з техногенними катастрофами (Богданова и др., 1994, 1997; Гофман, 1994; Двойрин и др., 1995; Демидчик и др., 1996; Черствой и др., 1993; Ashizawa et al., 1997; Nikiforov et al., 1996). Проте, мало вивченою проблемою є вплив тиреоїдного стану матері на розвиток щитовидної залози ембріонів при надходженні низьких доз 131I. Існуючі дані суперечливі і досить важко на клінічних прикладах наведених в літературі визначити термін найбільшої небезпеки 131I для розвитку щитовидної залози в період ембріогенезу. Морфологічні зміни в щитовидній залозі ембріонів під впливом материнського гіпотиреозу спричиненого 131I в різні строки гестації не досліджувались. Виходячи з цього, необхідно розробити експериментальну модель материнського гіпотиреозу спричиненого 131І та дослідити морфологічні зміни в щитовидній залозі матері та новонароджених.

Проведення фундаментальних наукових досліджень, спрямованих на встановлення основних закономірностей виникнення та розвитку патологічних змін в організмах людей та тварин, які зазнали радіаційного впливу є важливим і актуальним, оскільки дає змогу розробити нові методи діагностики, профілактики і лікування шкідливих наслідків (Руднєв, 1997). Таким чином, актуальність теми дисертації зумовлена необхідністю вивчення морфологічних змін в щитовидній залозі, що виникли під дією материнського гіпотиреозу спричиненого 131I у внутріутробний період. Такі дослідження доцільні, перш за все, для розвитку фундаментальних уявлень в галузі гістології, цитології, ембріології, радіобіології та патологічної анатомії.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота виконувалась згідно спільних програм Дніпропетровського відділення Міжнародного центру молекулярної фізіології Національної академії наук України, морфологічної лабораторії БІОНТЕК та відділення анатомії Дрезденського Технічного університету за темами "Дослідження ефекту експериментального гіпотиреоідизму у самок щурів на розвиток мозку та щитовидної залози ембріонів" та "Дослідження морфогенезу щитовидної залози за умов норми та патології".

Мета і задачі дослідження. Метою даної роботи було встановити закономірності морфофункціональних змін в щитовидній залозі новонароджених щурів за умов материнського гіпотиреозу спричиненого 131I у період внутріутробного розвитку.

Відповідно до поставленої мети було сформульовано наступні задачі дослідження:

1. Розробити експериментальну модель материнського гіпотиреозу спричиненого мінімальною ефективною дозою 131I у щурів.

2. Дати морфофункціональну характеристику щитовидним залозам новонароджених щурів та народивших самок в нормі.

3. Дати кількісну морфофункціональну характеристику змін в щитовидній залозі самок щура під впливом радіоактивного опромінення при дії 131I до запліднення та в різні строки вагітності.

4. Дати кількісну морфофункціональну характеристику змін в щитовидній залозі новонароджених щурів під впливом 131I та спричиненого ним материнського гіпотиреозу.

Об’єкт дослідження - вплив материнського гіпотиреозу, спричиненого 131I на щитовидну залозу ембріонів.

Предмет дослідження - щитовидна залоза новонароджених щурів та народивших самок, підданих впливу 131I до запліднення та в критичні строки вагітності.

Методи дослідження - гормонометрія з використанням імуноферментного аналізу, органометрія, світлова та електронна мікроскопія, імуногістохімія на парафінових зрізах, морфометрія гістологічних структур, комп’ютерний аналіз зображень гістологічних зрізів, дисперсійний та регресійний аналіз отриманих даних.

Наукова новизна одержаних результатів. Наукова новизна роботи полягає в тому, що на основі аналізу структурних компонентів щитовидної залози самок та новонароджених щурів одержані нові наукові факти та сформульовані нові положення. 1. Уточнена мінімальна ефективна доза 131I, що призводить до стійкого материнського гіпотиреозу і не впливає на здатність щурів до запліднення і виношування ембріонів. Експериментально доведено, що такою дозою є 5,5 МБк 131I, введених одноразово у м'язи стегна. 2. Вперше у самок щурів, які народили, продемонстровано, що вагітність та пологи в нормі призводять до пошкодження тиреоїдного епітелію з компенсаторним підвищенням пролiферативної активності тироцитів. Встановлено, що А-клітини щитовидної залози самок щура під час вагітності приймають участь в синтезі кальцитоніну. 3. Уточнена ступінь зрілості щитовидної залози новонароджених щурів в нормі. Отримані докази функціональної та морфологічної незрілості органу. 4. Вперше in vivo продемонстровано порушення полярності тироцитів під впливом радіаційного опромінення у народивших самок щурів. Показано, що мінімальна ефективна доза 131I призводить до транзиторного порушення бар'єрних властивостей тиреоїдного епітелію у самок щурів. 5. Материнський гіпотиреоз, спричинений дією 131I до запліднення, призводить до компенсаторного підвищення функціональної активності щитовидної залози новонароджених щурів, передусім на периферії органу. Тканинні базофіли приймають активну участь у регуляції продукції гормонів щитовидної залози в період внутріутробного розвитку щурів. 6. Надходження радіоактивного 131І до організму вагітної самки в період початку органогенезу (10 доба вагітності) призводить до підвищення смертності плодів. Вплив низької дози опромінення на фоні материнського гіпотиреозу проявляється підвищенням вмісту ядерного антигену клітинної проліферації в тироцитах без зростання числа клітин на одиницю площі зрізу, ваги щитовидної залози та зростанням вмісту фібронектину в сполучній тканині. 7. При введенні 131I в період початку функціонування щитовидної залози ембріонів (16 доба вагітності) на момент народження щурів існують морфологічні ознаки гострого пошкодження нормально сформованих структур щитовидної залози.

Практичне значення одержаних результатів. Результати роботи мають теоретичне і прикладне значення при вирішенні дослідницьких та практичних завдань в області біології та медицини. Наведена модель радіаційного пошкодження щитовидної залози ембріонів в період внутріутробного розвитку може бути застосована для вивчення впливу 131I та материнського гіпотиреозу радіаційного походження в постнатальному онтогенезі щитовидної залози та інших органів та систем. Встановлена залежність морфологічних змін в щитовидній залозі новонароджених щурів від строку надходження 131I в організм вагітної самиці. Виявлені закономірності дозволяють більш досконало розуміти патогенез захворювань щитовидної залози у дітей і повинні враховуватися при вивченні патології цього органу. Запропоновані в даній роботі нові підходи до кількісної оцінки імуногістохімічно виявлених антигенів в щитовидній залозі можуть бути використані в практиці патологоанатомів та гістологів. Результати дисертації впроваджені в навчальному процесі та дослідницькій роботі кафедр експериментальної фізики, біохімії та біофізики Дніпропетровського національного університету, морфологічного центру міської багатопрофільної клінічної лікарні №4 м. Дніпропетровська, відділення патоморфології Українського НДІ гастроентерології м. Дніпропетровська.

Особистий внесок здобувача. У процесі виконання дисертаційної роботи автор самостійно провів пошук і проаналізував теоретичні та експериментальні дані за темою проведеного дослідження у вітчизняній та зарубіжній літературі. Дисертант розробив програму для вирішення поставлених завдань, особисто виконав експериментальну частину роботи і проаналізував отримані результати. Напрямок наукової роботи, визначення експериментальних підходів, а також аналіз отриманих результатів постійно обговорювались з науковим керівником д.б.н., проф. Корогодом С.М., зав. кафедри експериментальної фізики Дніпропетровського національного університету, к.м.н. Усенко В.С., директором морфологічної лабораторії БІОНТЕК, та к.б.н., доц. Ушаковою Г.О.

Апробація роботи. Основні положення дисертаційної роботи були викладені та обговорені на: ІІІ конгресі по радіобіології (Москва, Росія, 1997); 24 щорічних зборах Європейської тиреоїдної асоціації (Мюнхен, Німеччина, 1997); ІV міжнародній конференції "Франція та Україна" (Дніпропетровськ, 1997); 4 Європейському конгресі по ендокринології (Севілья, Іспанія, 1998); 2-й міжнародній медичній конференції студентів та молодих лікарів (Люблін, Польща, 2000).

Публікації. За темою дисертації опубліковано 5 статей у фахових наукових журналах, 1 в збірнику наукових праць, 6 в матеріалах і тезах конференцій.

Структура та обсяг роботи. Дисертація складається з вступу, огляду літератури, матеріалів і методів дослідження, результатів та обговорення, висновків і списку використаних джерел літератури. Дисертацію викладено на 137 сторінках стандартного машинопису. Вона містить 36 рисунків, 24 таблиці. Список використаної літератури охоплює 161 найменування.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріали та методи дослідження

В серії експериментів було використано 35 самок білих щурів лінії Вістар (з вагою тіла від 170 до 220 г.) та 168 новонароджених щурят. Тварини були поділені на чотири групи в залежності вд терміну введення 131I. І група - більш нж за 12 діб до запліднення. ІІ, ІІІ та ІV групи - отримували ін'єкцію 131I на 5-ту, 10-ту та 16-ту добу вагітності, відповідно. Тварин утримували при температурі повітря 26оС та відносній вологості повітря 60%, при контрольованому світловому режимі (10 годин – ніч, 14 годин - день). Щури отримували стандартний раціон та вільний водний режим. Спарювання самок та самців проводили на протязі двох годин з 7 до 9 години ранку. Першим днем вагітності вважали день виявлення сперми у вагінальному мазку самки при мікроскопічному дослідженні.

Для досягнення материнського гіпотиреозу була відтворена модель з використанням мінімальної ефективної дози радіоактивного ізотопу йоду 131I згідно з Reilly (Reilly et al., 1986). Самкам вводили 5,5 МБк 131I у вигляді ізотонічного розчину йодиду натрію в м'язи стегна.

Декапітацію всіх тварин проводили пд гексаналовою анестезією через 3-20 годин після пологв. Визначали вагу тіла, мозку, щитовидної залози новонароджених щурят та самок. Концентрацію тироксину, тироїдстимулюючого гормону (ТСГ) та тиреоглобуліну в сироватці крові було визначено за допомогою імуноферментного аналізу. Морфологію щитовидних залоз піддослідних тварин досліджували на фіксованих рідиною Буена парафінових зрізах та на тонких зрізах за допомогою електронної мікроскопії. Для світлової мікроскопії зрізи забарвлювали за Слінченком, імпрегнацію сріблом виконували за Гоморі, тканинні базофіли виявляли толуідиновим блакитним. Проводили імуногістохімічне виявлення фібронектину, тиреоглобуліну, кальцитоніну, та ядерного антигену клітинної проліферації (ЯАКП).

Морфологічне вивчення препаратів виконували за допомогою мікроскопу Axioplan (Carl Zeiss, Yena). Для аналізу вмісту плазматичного фібронектину на зрізах застосована система комп’ютерного аналізу зображень. Для отримання зображень використовували відеокамеру Sony DCC-150AP та комп’ютер Pentium ІІІ з відповідним програмним забезпеченням. Для кількісної оцінки стану структур щитовидної залози піддослідних тварин застосовували комплекс морфометричних методик. Виміри на гістологічних препаратах виконували за допомогою стандартної окулярної лінійки, підрахунки - за допомогою окулярних вставок. Досліджували окремо в центральній та периферійній зоні щитовидної залози такі параметри: частка площі зрізу, що займає залозистий компартмент, строма та тиреоглобулін-позитивний колоїд; загальне число на 1 мм2 площі зрізу та відсоток ЯАКП-позитивних ядер строми та тиреоїдного епітелію; відсоток площі зрізу та інтегровану оптичну щільність фібронектин-позитивного забарвлення; відсоток площі зрізу, де локалізовані С-клітини, число С-клітин, число С-клітин, що утворювали групи та число С-клітин з відростками на 1 мм2 площі зрізу; число тканинних базофілів на 1 мм2 площі зрізу.

На основі первинних даних морфометричного дослідження і системи коефіцієнтів перерахунку визначали середні значення морфометричних параметрів по кожному препарату. Подальшу обробку даних проводили за допомогою програми Statistika 3.0, яка дозволила провести розрахунки середніх значень для груп, похибок середніх значень. Достовірність отриманих автором результатів забезпечується проведенням повторних серій експериментів, оцінки достатності вибірки, рандомизації досліджуваного матеріалу. Для порівняння результатів морфометрії використовували тест Фішера, критерії вірогідності Ст’юдента (t) та Манн-Уітні (U). Враховували три рівня значимості (р): 0,05, 0,01 та 0,001.

Результати дослідження та їх обговорення

Морфологія щитовидної залози тварин в нормі. Виявлені особливості будови щитовидної залози народивших самок контрольної групи на 1 добу після пологів: наявність кальцитоніну в тироцитах центральної зони, пошкодження тиреоїдного епітелію з десквамацією загиблих клітин в порожнину фолікулів та надходженням тиреоглобуліну до сполучної тканини, активація проліферації паренхими залози, картини фолікулогенезів та утворення папілярних структур. Такі пошкодження щитовидної залози внаслідок вагітності та пологів можуть спричинити розвиток автоімунних та проліферативних процесів у самок в подальшому.

Щитовидна залоза новонароджених щурів в нормі мала незрілу будову, принципово відмінну від дорослих тварин: мікрофолікулярна та трабекулярна будова залози в центральній зоні, висока проліферативна активність, високий вміст фібронектину в стромі, незрілість системи тканинних базофілів та С-клітин.

Органометрія новонароджених щурів. Введення радіонукліду в обраній нами дозі не викликає змін в здатності щурів до запліднення. Проте вплив 131I на 10 добу вагітності спричинив зниження числа задовільно народивших самок (43% - в ІІІ групі; 72% - в контролі) та числа щурят в поносі (4,6 - в ІІІ групі;, 6,8 - в контролі). Комбінована дія 131I та викликаного ним стану материнського гіпотиреозу призводить до вірогідного, при порівнянні з контролем, зниження ваги тіла новонароджених щурів в II (на 12,6%), III (на 12,0%) та IV (на 6,4%) групах, ваги головного мозку в II (на 6,9%) та IV (на 6,3%) групах, ваги щитовидної залози в IV групі (на 21,5%).

Вплив 131І на гормональний стан самок та новонароджених щурів. Ми встановили, що введення 5,5 МБк 131I до запліднення та в різні строки вагітності призводить до вірогідного зниження рівня тироксину та підвищення ТСГ в сироватці крові самок усіх експериментальних груп на 1 добу після пологів (рис. 1).

Разом з цим, встановлено підвищення рівня Т4 в сироватці крові в ІV групі новонароджених щурів, а зниження рівня ТСГ в сироватці крові в усіх експериментальних групах (рис. 1). Таким чином, в нашому експерименті доведена наявність материнського гіпотиреозу на 1 добу після пологів в усіх експериментальних групах.

Морфологічні зміни в щитовидній залозі самок щура підданих впливу 131І. У самок ІV групи виявлені ознаки спустошення тиреоглобуліну в порожнинах фолікулів. Пошкодження тиреоїдного епітелію з виходом тиреоглобуліну до строми органу та надходженням плазматичного фібронектину до колоїду свідчить про порушення бар’єрної функції тиреоїдного епітелію. Наявність в стромі тиреоглобулін-позитивних гранул і забарвлення базальної частини тироцитів дозволяє припустити, що дія радіації викликає порушення полярності тироцитів та секрецію тиреоглобуліну в сполучну тканину. Ми встановили, що з часом у самок відбувається відновлення морфології залози, що проявляється в зменшенні числа фібронектин-позитивних фолікулів, тиреоглобулін-позитивних загиблих тироцитів, відсутності тиреоглобуліну в стромі та судинах щитовидної залози.

Морфологічні зміни в щитовидній залозі новонароджених щурів під впливом материнського гіпотиреозу зумовленого дією 131I до настання вагітності. У новонароджених щурів І групи виявлені ознаки підвищення функції щитовидної залози. Вірогідне зменшення частки колоїду в центральній зоні щитовидної залози та тенденція до зменшення цього параметру в периферійній зоні (рис. 2) свідчить про перевагу процесів захвату тиреоглобуліну та його розщеплення над процесами синтезу та секреції тиреоглобуліну у порожнину фолікулів.

Ми встановили зниження на 16,4% числа клітин тиреоїдного епітелію на одиницю площі зрізу, при одночасному збереженні числа клітин строми при порівнянні з контролем. Тобто материнський гіпотиреоз впливає передусім на залозистий компартмент щитовидної залози ембріонів. Високий рівень ТСГ матері (див. рис. 1) зумовлює раннє дозрівання і початок функціонування тироцитів. Пов’язана з цим затримка проліферації у внутріутробний період призводить до зменшення кількості клітин. Розвивається гіпоплазія тиреоїдного епітелію з компенсаторною гіпертрофією тироцитів.

Ми встановили у новонароджених І групи при порівнянні з контролем вищий відсоток ЯАКП-позитивних ядер тироцитів в центральній та периферійній (на зонах залози (на 40,2% та 77,6%, відповідно.

При дослідженні компонентів строми на препаратах забарвлених за допомогою імпрегнації сріблом ми не встановили видимих відмінностей організації мережі волокон між в щитовидними залозами контрольних і експериментальних тварин. Однак в щитовидних залозах новонароджених щурів І групи ми встановили відсутність гетерогенності в забарвлення плазматичного фібронектину в центральній та периферійній зонах залози. Мережа фібронектин-позитивних волокон була рівномірно розповсюджена на зрізі і досягала капсули, виявлена тенденція до зниження частки зрізу, що займає фібронектин (на 44,8% в центральній зоні та на 33,2% на периферії залози). В цій експериментальній групі частка строми також була нижче при порівнянні з контролем (на 13,2% в центральній зоні та на 15,3% на периферії залози).

При дослідженні С-клітин ми встановили тенденцію до підвищення частки площі зрізу, що займають ці клітини (на 36,0% при порівнянні з контролем), аномальну локалізацію С-клітин на периферії та під капсулою органу. Це може бути свідченням порушення співвідношення похідних двох зародків щитовидної залози - перевага похідних латеральних зародків і відставання в розвитку похідних медіального зародку.

Встановлено збільшення числа тканинних базофілів на одиницю площі зрізу залози (контроль – 21+3,3, І група – 70+13,7). Тканинні базофіли тісно контактують з тиреоїдним епітелієм, більшість з них має високу ступінь дегрануляції. Можливе біологічне значення таких змін полягає в забезпечені тканинними базофілами функціональної активності щитовидної залози, розвиток якої відбувається при високому рівні материнського тироїдстимулюючого гормону (Bianco et al., 1983; Wynford-Thomas et al., 1982).

Таким чином, материнський гіпотиреоз, що мав місце на протязі всього внутріутробного періоду розвитку ембріонів призводить на момент народження щурят до підвищення функціональної активності щитовидної залози, гіпоплазії тиреоїдного епітелію з компенсаторною гіпертрофією клітин, компенсаторним підвищенням пролiферативної активності клітин тиреоїдного епітелію на периферії органу. Ми маємо підстави припустити, що материнський гіпотиреоз призводить до дискоординації морфогенезу щитовидної залози. При цьому щитовидна залоза не набуває на момент народження щурів необхідної кількості клітин тиреоїдного епітелію, які в той же час вимушені надмірно виробляти тиреоїдні гормони. Забезпечення підвищеної функціональної активності супроводжується гіперплазією тканинних базофілів щитовидної залози новонароджених щурів.

Морфологічні зміни в щитовидній залозі новонароджених щурів зумовлені дією 131I на 5 добу ембріонального розвитку. В ІІ групі новонароджених щурів встановлено підвищений рівень тироксину та знижений рівень ТСГ в сироватці крові (див. рис. 1). Беручи до уваги також і зниження відносної частки колоїду на зрізах щитовидної залози (див. рис. 2), можна припустити, що розщеплення тиреоглобуліну з утворенням тиреоїдних гормонів переважає над синтезом та секрецією тиреоглобуліну в порожнину фолікулів. Такі зміни можуть носити тимчасовий характер тому, що не було знайдено змін в морфологічній структурі та проліферативній активності клітин тиреоїдного епітелію щитовидної залози. Однак в центральній зоні залози ми встановили вірогідне зменшення відсотку ЯАКП-позитивних ядер клітин строми на та чутливу тенденцію до зменшення цього параметру клітин тиреоїдного епітелію майже на третину . Виявлені мієлін-подібні структури в тироцитах щитовидних залоз новонароджених щурів на електронно-мікроскопічному рівні. Це може бути ознакою порушення енергетичного балансу щитовидної залози.

Зміни забарвлення фібронектину в ІІ групі схожі на такі в І групі. Проте у новонароджених щурів ІІ групи зниження частки щитовидної залози, що займає фібронектин-позитивне забарвлення та інтегрованої оптичної щільності продукту імуногістохімічної реакції, набувають вірогідного значення в центральній зоні залози. Необхідно брати до уваги, що в центральній зоні також знижена проліферативна активність клітин строми . Тобто, не можна виключати впливу радіаційного опромінення на характеристики строми та вмісту фібронектину в щитовидній залозі новонароджених ІІ групи.

Ми не встановили вірогідних відмінностей в забарвленні кальцитоніну у новонароджених ІІ експериментальної групи. Параметри тканинних базофілів також відповідали контрольним значенням.

Таким чином, нами виявлені мінімальні морфофункціональні зміни в щитовидній залозі новонароджених щурів зумовлені дією 131I на 5 добу ембріонального розвитку.

Морфологічні зміни в щитовидній залозі новонароджених щурів зумовлені дією 131I на 10 добу ембріонального розвитку. Морфологія щитовидної залози новонароджених щурів ІІІ групи була такою ж як і в контролі, за винятком зниження частки колоїду в центральній зоні залози на 22,9% (див. рис. 2). Однак нами встановлено тотальне підвищення вмісту ЯАКП в епітеліальних клітинах центральної (на 118,4%) та периферійної зони залози (на 192,2%) , а також стромальних клітинах периферійної зони (на 78,8%) . При цьому число клітин на 1 мм2 площі зрізу мало лише тенденцію до підвищення. З літератури відомо, що радіаційне опромінення викликає пошкодження геному і, як наслідок, в клітинах активується репаративний синтез ДНК. В той же час, число опромінених клітин, що підлягають задовільному поділу обмежено. Пояснюють таку ситуацію подовженням S-фази клітинного циклу та порушенням нормального механізму поділу клітини (Malone, 1975). ЯАКП функціонує як кофактор ? ДНК-полімерази в S-фазі клітинного циклу і при репаративному синтезі ДНК (Waseem et al.,1990; Lee et al, 1990; Shivji et al, 1992; Hall et al, 1993). Таким чином, підвищення вмісту ЯАКП в щитовидних залозах новонароджених ІІІ групи може свідчити про ефект радіаційного пошкодження геному. Це узгоджується з даними про високий рівень хромосомних аберацій у дітей підданих впливу радіаційного опромінення у внутріутробний період (Einhorn et al, 1972; Goh, 1981). Такі дані важливі з точки зору подальшого розвитку у опромінених щурів проліферативних та пухлинних процесів щитовидної залози.

Зменшення забарвлення плазматичного фібронектину в ІІІ групі набуває найвищого значення серед усіх експериментальних груп. Зміни відсотку площі зрізу, що займає фібронектин-позитивна реакція та інтегрованої оптичної щільності продукту імуногістохімічної реакції знайдені як в центральній зоні залози, так і на периферії органу. Тобто носять також тотальний характер. Зменшення забарвлення фібронектину не відповідає підвищенню частки ЯАКП-позитивних ядер в щитовидній залозі новонароджених цієї групи. За даними літератури відомо, що проліферації передує підвищення синтезу та експресії фібронектину в сполучній тканині (Horiba et al, 1994). Ми спостерігали високий вміст фібронектину лише в судинах та фібробластах щитовидної залози. Низький рівень забарвлення фібронектину може бути свідченням порушення спроможності сполучної тканини зв`язувати плазматичний фібронектин, який надходить з судин та виробляється власними фібробластами, внаслідок дефектів організації самої сполучної тканини. Можна припустити, що при масивному пошкодженні геному тиреоїдного епітелію під впливом радіаційного опромінення порушується синтез та секреція компонентів міжклітинного матріксу. Це впливає на якісний стан базальних мембран, колагенових волокон та інших структурних компонентів сполучної тканини.

Ми встановили вірогідне підвищення при порівнянні з контролем числа С-клітин на 1 мм2 площі зони, де вони локалізовані (на 71,4%), а також вірогідне підвищення С-клітин у складі груп (на 203,0%) та С-клітин з відростками (на 127,4%). Тобто гіперплазія С-клітин в цій групі набуває вірогідного значення і ми припускаємо компенсаторний механізм появи таких змін. Беручи до уваги наявність радіаційного опромінення щитовидної залози в ІІІ групі що мав місце в цій групі принаймні з 16-17 доби вагітності, ми відносимо зміни С-клітин до ефектів прямого радіаційного впливу за умов материнського гіпотиреозу.

Морфологічні зміни в щитовидній залозі новонароджених щурів зумовлені дією 131I на 16 добу ембріонального розвитку. Найбільше радіаційне опромінення отримала щитовидна залоза новонароджених IV експериментальної групи. Вплив материнського гіпотиреозу на щитовидну залозу в цій групі був практично відсутній. Ембріони розвивалися за умов материнського дисгормонального стану наприкінці вагітності. Тому легко пояснити відсутність ознак компенсаторної гіперфункції і практично відсутність морфологічних змін в щитовидній залозі новонароджених на світловому рівні. При електронно-мікроскопічному дослідженні ми виявили ознаки пошкодження тироцитів - розширення ендоплазматичного ретикулуму та деформацію ядер.

Також ми встановили значне вірогідне зниження відсотку ЯАКП-позитивних ядер тиреоїдного епітелію в обох зонах залози ( на 64,3% в центральній зоні, на 46,1% на периферії залози) і лише тенденцію до зниження вмісту цього антигену в ядрах клітин строми в центральній зоні. Тобто опромінення щитовидної залози ембріонів IV групи здатне викликати пригнічення проліферації клітин тиреоїдного епітелію. Зважаючи на те, що число клітин тиреоїдного епітелію не відрізняється від норми, пригнічення пролiферативної активності могло відбутися в останні дні перед народженням, в безпосередній близькості до терміну нашого дослідження. Саме в цей період за даними літератури (Sztanyik et al., 1988; Morreale de Escobar et al., 1985) відбувається найбільш активний захват і органіфікація йоду щитовидною залозою ембріонів. Рентгенівське опромінення щитовидної залози 12-20 Гр здатне призвести до пригнічення проліферації (Malone, 1975). Таким чином, ми можемо порівняти вплив радіаційного опромінення, що зазнали новонароджені ІV групи в наших експериментах з ефектом вищезазначеної дози рентгенівського опромінення.

Вміст фібронектину та параметри тканинних базофілів в IV групі не відрізнялися від контролю. Це підтверджує припущення про нормальний розвиток щитовидної залози ембріонів практично до моменту народження і гостре пошкодження залози під впливом радіаційного опромінення. Відсутність реакції тканинних базофілів на гостре радіаційне пошкодження виглядає дивним, якщо брати до уваги високу чутливість цих клітин до дії різноманітних шкідливих факторів зовнішнього середовища (Гербильский, 1985; Banovac et al., 1992; Katayama et al., 1992). Однак ми виявили незрілість системи тканинних базофілів в нашому дослідженні і тому можна припустити, що незрілі тканинні базофіли не здатні реагувати на мінімальні радіаційні пошкодження.

При дослідженні препаратів щитовидних залоз новонароджених IV групи ми виявили кальцитонін в сполучній тканині, велике число С-клітин з ознаками дегенерації. В нормі кальцитонін в стромі щитовидної залози не виявляється. Ці знахідки дозволили нам припустити, що радіаційне опромінення призводить до руйнування частини С-клітин і виходу кальцитоніну до міжклітинного матріксу. Ми не знайшли зниження числа С-клітин внаслідок їх загибелі, що можна було б очікувати. Напроти, число С-клітин в центральній зоні залози було навіть більше, ніж в контролі, також вищим було число С-клітин з відростками та була виявлена тенденція до підвищення числа С-клітин у складі груп. Пояснити це явище можливо з позицій того, що материнський дисгормональний стан, та руйнування і дисфункція С-клітин в материнській щитовидній залозі призводить до активації розвитку системи власної регуляції кальцієвого гомеостазу ембріонів. Тому морфологічні особливості С-клітин у новонароджених ІV групи також є доказом пошкодження щитовидної залози перед самим моментом народження щурів.

ВИСНОВКИ

1.

2.

3.

4.

5.

СПИСОК РОБІТ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Usenko V.S., Lepekhin E.A., Kornilovska I.N., Lyzogubov V.V., Apostolov E.O., Ralets I.S., Witt M. An immunohistochemical study of fibronectin and thyroglobulin in the thyroid gland of female rats after exposure to radioactive iodine. // The Anatomical Record. - 1998. - V. 252, № 4. - P. 600-607.

2. Usenko V., Lepekhin E., Lyzogubov V., Kornilovska I., Ushakova G., Witt M. The influence of low doses 131I - induced maternal hypothyroidism on the development of rat embryos // Experimental and Toxicological Pathology. - 1999. - V. 51, № 3. - P. 223-227.

3. Усенко В.С., Корніловська І.М., Апостолов Є.О., Ралець І.С., Розенфельд Є.Г., Лизогубов В.В. Ядерний антиген клітинної проліферації щитовидної залози щурів в пре- та постнатальний період // Український біохімічний журнал. - 1999. - Т.7, №1. - С. 61-66.

4. Usenko V.S., Lepekhin E.A., Lyzogubov V.V., Kornilovska I.N., Apostolov E.O., Tytarenko R.G., Witt M. The influence of maternal hypothyroidism and radioactive iodine on rat embryonal development: thyroid C-cells // The Anatomical Record. - 1999. - V. 256, № 1. - P. 7-13.

5. Usenko V.S., Lepekhin E.A., Kornilovska I.M., Lyzogubov V.V., Apostolov E.O., Witt M. The influence of maternal hypothyroidism and a small dose of radioactive iodine on the embryonic development of rats: fibronectin expression in the thyroid gland // Вісник Дніпропетровського університету. Біологія. Екологія. - 2000. - Т.2, Вип. 8. - С.15-22.

6. Усенко В.С., Лизогубов В.В., Корниловская И.Н., Голуб Р.Г., Апостолов Е.О., Ралец И.С., Долженко М.И., Витт М. Изменения в системе регуляции внутреннего гомеостаза щитовидной железы эмбрионов крыс под воздействием материнского гипотиреоза и малой дозы радиоактивного иода // Регуляция в биологических системах. - 1998. - C. 131-136.

7. Lyzogubov V.V., Kornilovska I.N., Usenko V.S., Lepekhin E.A. Mathernal hypothyroidism and the effect of small doses of I131 on the development of the rat fetus // 24th Annual Meeting of the European Thyroid Association. - Munich. - 1997. - P.214.

8. Усенко В.С., Лизогубов В.В., Корниловская И.Н., Апостолов Е.О., Ралец И.С., Голуб Р.Г., Долженко М.И., Лепехин Е.А., Витт М. Морфологические аспекты влияния материнского гипотиреоза и малых доз радиоактивного иода на щитовидную железу плодов крыс // Тезисы докл. Третий съезд по радиационным исследованиям. - М: Пущино. - 1997. - Т. 1. - С.265-266.

9. Usenko V.S., Lepekhin E.A., Lyzogubov V.V., Kornilovska I.N., Witt M. The effect of small dose of 131I on the development of the C-cells of the rat fetus thyroid gland // IV European congress of endocrinology. - 1998. - P. 132.

10. Усенко В.С., Корниловская И.Н., Лизогубов В.В., Апостолов Е.О., Ралец И.С., Голуб Р.Г., Долженко М.И., Витт М. Влияние материнского гипотиреоза индуцированного 131I на тканевые базофилы щитовидной железы новорожденных крыс // Матерiали V Мiжнародної конференцiї Францiя та Украiна. - Днiпропетровськ. - 1998. - Т. 2, Ч. 3. - С. 85-86.

11. Усенко В.С., Корниловская И.Н., Лизогубов В.В., Апостолов Е.О., Ралец И.С., Витт М. Влияние 131I на морфологию и функцию щитовидной железы новорожденных крыс// Матерiали V Мiжнародної конференцii Францiя та Украiна. - Днiпропетровськ. - 1998. - Т. 2, Ч. 3. - С. 84-85.

12. Usenko G.V., Kornilovska I.N., Dolzhenko M.I., Apostolov E.O., Lyzogubov V.V., Usenko V.S. Expression of cell's fibronectin in the rat's thyroid gland during radioiodin-induced hypothyroidism // 2nd international medical conference for students and young doctors and 9th EMSA International Scientific Symposium. - Lublin. - 2000. - P. 18.

АНОТАЦІЇ

Лизогубов В.В. Морфофункціональні зміни в щитовидній залозі новонароджених щурів за умов материнського гіпотиреозу, спричиненого 131І. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.11 – цитологія, гістологія. Київський національний університет імені Тараса Шевченка, Київ, 2002.

В роботі дана характеристика морфофункціональних змін в щитовидній залозі новонароджених щурів, що розвивалися за умов материнського гіпотиреозу спричиненого введенням 5,5 МБк 131I в різні строки вагітності.. Введення 131І до запліднення призводить до підвищення функціональної активності щитовидної залози новонароджених щурів зі зміною морфології органу. Вплив 131I на 5 добу вагітності викликає лише ознаки гіперфункції щитовидної залози новонароджених щурів. При введенні 131I на 10 добу вагітності встановлено двократне підвищення відсотку ЯАКП-позитивних ядер епітелію та строми без ознак гіперплазії та підвищення вмісту фібронектину у стромі залози. Це свідчить про радіаційне пошкодження геному та активацію репаративного синтезу ДНК. Такі зміни можуть бути причиною гіперпластичних та пухлинних процесів в постнатальному онтогенезі. Вплив 131I на 16 добу вагітності характеризується гострими процесами пошкодження нормально сформованих структур щитовидної залози та двократним зменшенням проліферативної активності, що є фактором ризику для розвитку гіпоплазії щитовидної залози та гіпотиреозу у постнатальному періоді.

Отримані дані свідчать про принципові відмінності морфофункціональних змін щитовидної залози новонароджених щурів при надходженні 131I в різні строки внутріутробного розвитку.

Ключові слова:. материнський гіпотиреоз, щитовидна залоза, ембріональний розвиток, 131І, імуногістохімія, морфологія

Лизогубов В.В. Морфофункциональные изменения в щитовидной железе новорожденных крыс в условиях материнского гипотиреоза, вызванного 131І. - Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.11 – цитология, гистология. . - Киевский национальный университет имени Тараса Шевченко, Киев, 2002.

В работе дана характеристика морфофункциональных изменений в щитовидной железе новорожденных крыс, которые развивались в условиях материнского гипотиреоза вызванного введением 5,5 МБк 131І в различные сроки беременности. Проведено количественное морфометрическое исследование общей морфологии, пролиферативной активности, морфологии С-клеток и тканевых базофилов с использованием иммуногистохимии и электронной микроскопии. Применен дифференцированный подход к оценке изменений в гистогенетически различных центральной и периферической зоне железы.

Установлено, что введение 131І самкам до оплодотворения приводит к увеличению железистого компартмента щитовидной железы новорожденных крыс на 4,8%. Это