К И Ї В С Ь К И Й Н А Ц І О Н А Л Ь Н И Й У Н І В Е Р С И Т Е Т

імені Т А Р А С А Ш Е В ЧЕ Н К А

МИХАЙЛИК ІРИНА ВОЛОДИМИРІВНА

УДК 599:539.1.047+577.122.5

ФУНКЦІОНУВАННЯ ІНТЕРФЕРОНОЗАЛЕЖНИХ СИСТЕМ ТРАНСДУКЦІЇ СИГНАЛУ В ЛІМФОЇДНИХ КЛІТИНАХ ЩУРІВ ЗА УМОВ ДІЇ ІОНІЗУЮЧОЇ РАДІАЦІЇ

03. 00. 04 – біохімія

А В Т О Р Е Ф Е Р А Т

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

КИЇВ – 2002

Дисертацією є рукопис

Робота виконана в лабораторії фізико-хімічної біології кафедри біохімії біологічного факультету Київського національного університету імені Тараса Шевченка.

Науковий керівник: доктор біологічних наук, професор

Остапченко Людмила Іванівна,

професор кафедри біохімії Київського

національного університету

імені Тараса Шевченка

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор

Тугай Василь Андрійович,

провідний науковий співробітник

Інституту біохімії імені О.В. Палладіна

НАН України

доктор біологічних наук, професор

Бойко Анатолій Леонідович,

завідувач кафедрою вірусології біологічного факультету Київського національного університету імені Тараса Шевченка, академік Української Академії Аграрних Наук

Провідна установа: Інститут експериментальної патології, онкології і радіобіології ім. Р.Є.Кавецького НАН України

Захист дисертації відбудеться ”18” березня 2002 р. о 14.00. год. на засіданні спеціалізованої вченої ради Д26.001.24 в Київському національному університеті імені Тараса Шевченка за адресою: м. Київ, пр-т Глушкова 2, корпус 12 (біофак), ауд.215.

Поштова адреса: 01033, Київ, вул. Володимирська, 64, спецрада Д26.001.24, біологічний факультет.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Київського національного університету імені Тараса Шевченка за адресою: м. Київ, вул. Володимирська, 58.

Автореферат розісланий 16.02. 2002 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради О.В. Брайон

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність проблеми. На сьогодні одним з найважливіших питань є вивчення регуляторних механізмів, до яких є залученими клітинні системи трансдукції сигналу. Особливу увагу звертають на себе месенджерні каскади, що індукуються інтерфероном (Goodbourn, 2000; Samuel, 1991). Відомо, що дія інтерферону опосередковується двома ферментними системами: 2’,5’-олігоаденілат-синтетази (АТР: полінуклеотид аденілілтрансферази, КФ 2.7.7.19.) та дсРНК-залежної протеїнкінази (АТР: протеїнфосфотрансферази; КФ 2.7.1.37.), які є залученими до цілого ряду процесів контролю клітинного метаболізму, зокрема антивірусного захисту, росту і диференціації клітин, онкогенної стабільності, апоптозу та ін. (Player, 1998; Stark, 1998).

Роль інтерферонозалежних сигнальних систем у механізмах відповіді клітин на дію іонізуючої радіації є на сьогодні практично невивченою. Встановлені радіозахисні властивості інтерферону та його індукторів, що обумовлює їх посилене використання в якості терапевтичних засобів при лікуванні різних захворювань (Македонов, 1997; Гаділія, 2001). У зв’язку з цим є важливим дослідження ключових компонентів інтерферон-індукованих сигнальних систем за умов опромінення в сублетальних дозах у лімфоїдних клітинах, які, як відомо, є одними з найбільш радіочутливих.

Мета та задачі дослідження. Метою даної роботи було вивчити особливості функціонування інтерферонозалежних систем 2’,5’-олігоаденілат-синтетази та дсРНК-залежної протеїнкінази лімфоїдних клітин в умовах тотального рентгенівського опромінення тварин в дозах 0,5 і 1 Гр. Для досягнення поставленої мети до завдань роботи входило:

1.

2.

3.

4.

5.

Об’єкти дослідження. Лімфоцити селезінки і тимусу щурів.

Предмет дослідження. Процеси трансдукції сигналу в інтерферонозалежних ферментних системах 2’,5’-олігоаденілат-синтетази і дсРНК-залежної протеїнкінази.

Методи дослідження. В роботі використовували біохімічні, радіоізотопні, імунологічні, спектрофотометричні методи та методи математичної статистики.

Наукова новизна роботи. Вперше проведене комплексне дослідження впливу іонізуючої радіації на інтерферонозалежні системи трансдукції сигналу. Встановлено підвищення внутрішньоклітинного вмісту 2’,5’-олігоаденілатів в лімфоцитах селезінки і тимусу щурів через 12 год. після рентгенівського опромінення в дозі 0,5 Гр. Показана пострадіаційна активація 2’,5’-олігоаденілат-синтетази на різних біологічних моделях (у лімфоїдних клітинах, виділених з селезінки і тимусу щурів, та в культурі В-клітин людини Namalwa). Виявлено, що індуктори інтерферону посилюють стимуляцію 2’,5’-олігоаденілат-синтетази в системах in vivo та in vitro за умов дії променевого фактору. Встановлено, що за умов впливу іонізуючого випромінювання на фоні введення індукторів інтерферону in vivo та in vitro відбувається зростання активності дсРНК-залежної протеїнкінази в спленоцитах і лімфоцитах щурів. Показано, що сумісна дія радіації та індукторів призводить до порушення взаємодії ферменту з основним субстратом фосфотрансферазної реакції (АТР). Отримані дані є важливими для з’ясування механізмів трансдукції сигналу інтерферону в лімфоїдних клітинах за умов дії радіації.

Практична значимість роботи. Отримані результати про функціонування інтерферонозалежних систем за умов дії радіації можуть бути корисними для розробки нових методів лікування захворювань, викликаних променевим ураженням організму. Оскільки інтерферон-індуковані ферменти є залученими до регуляції процесів антипроліферативного захисту та апоптозу, вивчення їх функціональної активності при опроміненні є важливим для моделювання наслідків пошкоджуючої дії іонізуючої радіації на клітинний метаболізм. Встановлений ефект посилення постпроменевої стимуляції ключових компонентів досліджуваних сигнальних систем при дії індукторів інтерферону може бути підставою для пошуку нових радіозахисних засобів.

Особистий внесок здобувача. Здійснення інформаційного пошуку та оцінка літературних даних, проведення експерименту, аналіз та теоретичне обгрунтування результатів дослідження виконані дисертантом особисто. Планування та розробка методичних підходів виконання комплексу лабораторних досліджень проведені з науковим керівником. Досліди по підтвердженню отриманих біохімічних закономірностей на вірусологічних моделях були проведені сумісно з д.б.н., зав. відділом експериментальних клітинних систем Інституту експериментальної патології, онкології та радіобіології ім. Р.Є. Кавецького Кудрявцем Ю.І. та к.б.н, доц. каф. вірусології біологічного факультету Київського національного університету імені Тараса Шевченка Токарчук Л.В.

Апробація результатів дисертації. Матеріали дисертації викладені на ІІІ Міжнародній конференції “Біоресурси та віруси” (Київ, 2001), International Conference “Physics of Liquid Matter: Modern Problems” (Kyiv, 2001), EURESCO Conference “Communication within the Immune System: Basic Rules and their Breakdown” (Spain, 2001), IV Съезде по радиационным исследованиям “Радиобиология, Радиоэкология и Радиационная безопасность” (Москва, 2001).

Публікації. За темою дисертації опубліковано 3 статті в наукових журналах та 3 тези у матеріалах і тезах вітчизняних та міжнародних конференцій та з’їздів.

Структура й обсяг дисертації. Дисертаційна робота складається з вступу, огляду літератури, матеріалів і методів дослідження, результатів роботи та їх обговорення, заключення, висновків, списку літератури, що включає 180 джерел. Дисертація викладена на 153 стор., має в своєму складі 21 рисунок, 4 таблиці.

Зв’язок з науковою тематикою організації. Робота відповідає плану науково-дослідної роботи кафедри біохімії біологічного факультету Київського національного університету імені Тараса Шевченка та виконана згідно з тематичним планом НДР № 97083 “Біохімічні механізми розвитку променевого ураження після дії іонізуючої радіації ” в рамках комплексної наукової програми “Здоров’я людини”.

МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ

В роботі використовували білих щурів лінії Вістар обох статей масою 130-150 г. Тварин опромінювали на установці РУМ-17 в дозах 0,5 і 1 Гр за умов: потужність дози-24,5 сГр/хв, фільтри 0,5 мм Сu + 1 мм Аl, напруга на трубці 200 кВ, сила струму 5 мА, відстань до поверхні шкіри тварин - 50 см.

Дослідження проводили через 12 год. після опромінення тварин, що є терміном найбільш виражених порушень основних ланок метаболізму лімфоїдних клітин після опромінення в дозах 0,5 і 1 Гр (Кучеренко, 1996; Остапченко, 1998).

Лімфоцити селезінки отримували центрифугуванням клітинної суспензії на градієнті Ficoll-Paque (густина 1,077) за методом (Boyum, 1968) Тимоцити із суспензії клітин тимусу виділяли за методом (Морозов, 1985).

Індукцію інтерферону в лімфоцитах селезінки і тимусу та в культурі клітин Namalwa проводили з використанням препаратів циклоферона, тілорона, полі(І)полі(Ц) і мітогенних лектинів конканаваліна А та ФГА, згідно з рекомендаціями (Коваленко, 2000; Chacko, 2000).

Вміст 2’,5’-олігоаденілатів в лімфоцитах щурів оцінювали радіоімунологічним методом з використанням мічених (А2’р)2А-(32Р)Ср та відповідної антисироватки (Hersh, 1984).

Активність 2’,5’-олігоаденілат-синтетази в лімфоїдних клітинах визначали спектрофотометричним методом (Justensen, 1992). Ферментативну активність виражали в наномолях неорганічного пірофосфату за 1 хв на 1 мг білка.

Активність дсРНК-залежної протеїнкінази в лімфоцитах щурів визначали за включенням 32Р з (-32Р/-АТФ) до білкових субстратів фосфотрансферазної реакції (Суетина, 1990). Питому активність фермента виражали в пмоль 32Рн за 1 хв на 1 мг білка.

Концентрацію білка визначали за методом Лоурі та ін. (Lowry, 1951).

Статистичну обробку результатів та побудову графіків проводили на IBM PC ET з використанням стандартних пакетів прикладних програм.

РЕЗУЛЬТАТИ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

Сигнальні системи, які індукуються інтерфероном, приймають участь у великій кількості регуляторних процесів, які охоплюють захист клітин від вірусної інфекції та необмеженої проліферації, ріст та диференціацію, апоптичну відповідь та ін. (Stark, 1998; Goodbourn, 2000). Месенджерний каскад 2’,5’-олігоаденілату, ключовим ферментом якого є 2’,5’-олігоаденілат-синтетаза, опосередковує відповідь клітини на різні стресові фактори (Player, 1998). 2,5А-синтетаза, активована дсРНК, синтезує з АТР 2’,5’-олігоаденілати, які в свою чергу активують 2,5А-залежну ендорибонуклеазу (РНКазу L). Результатом цього є селективне розщеплення одноланцюгової RNA та інгібування біосинтезу вірусного або клітинного білка.

У даній роботі вивчалася система 2’,5’-олігоаденілат-синтетази в лімфоїдних клітинах тварин за умов впливу рентгенівського випромінювання в дозах 0,5 і 1 Гр. Нами був оцінений рівень вторинних посередників цієї системи - 2’,5’-олігоаденілатів у лімфоцитах селезінки і тимусу опромінених щурів. Дослідження дії радіації проводили паралельно з застосуванням різних індукторів інтерферону (ФГА, конканаваліна А, полі(І)полі(С) та циклоферона) на двох експериментальних моделях: in vitro (ізольовані лімфоцити преінкубувалися з індукторами протягом 17 год.) та in vivo (препарати були введені піддослідним тваринам шляхом внутрішньом’язевої ін’єкції). В ході досліджень було встановлено підвищення внутрішньоклітинного вмісту ди- та тримерів 2’,5’-олігоаденілатів (А2’р5’А, (А2’р)2А) в 7 разів у спленоцитах і в 2,5–5 разів у тимоцитах після опромінення в дозі 0,5 Гр (рис. 1). Преінкубація клітин з індукторами інтерферону (циклофероном, ФГА та полі(І)полі(С)) викликала збільшення вмісту досліджуваних олігомерів приблизно у 2 рази порівняно з системами без індукторів, причому максимальним ефект був при опроміненні в дозі 0,5 Гр. Слід зазначити, що дія індукторів була набагато ефективнішою в системі in vitro за умов преінкубації лімфоцитів з цими речовинами, ніж in vivo при ін’єкції препарату щурам. Цікаво, що крім 2’,5’-олігоаденілатів в обох типах клітин були знайдені 3’,5’-олігомери (А3’р)2А, підвищення вмісту яких також стимулювалося під впливом іонізуючого випромінювання та індукторів. Серед досліджених олігонуклеотидів вміст димеру А2’р5’А переважав над тримером (А2’р)2А, вміст (А3’р)2А був найменшим.

Рис. 1. Вміст 2’,5’-олігоаденілатів A2’p5’A (а) та (A2’p)3A (б) в лімфоцитах тимусу щурів при опроміненні в дозах 0,5 і 1 Гр на фоні введення різних індукторів інтерферону (in vitro): 1 – без індукторів; 2 - преінкубація клітин з циклофероном; 3 - преінкубація клітин з ФГА; 4 - преінкубація клітин з полі(І)полі(С).

*- р < 0,05 по відношенню до групи без індуктора, ** - р < 0,05 по відношенню до групи без опромінення, *** - р < 0,05 по відношенню до групи без опромінення та до групи без індуктора.

Можна припустити, що дія рентгенівського випромінювання викликає посилення синтезу 2’,5’-олігоаденілатів у лімфоїдних клітинах щурів, що може бути наслідком активації 2’,5’-олігоаденілат-синтетази при опроміненні. Це дає підстави передбачити можливість стимуляції каскаду 2’,5’-олігоаденілату за умов впливу іонізуючої радіації. Ймовірно, що виявлений ефект є проявом включення компенсаторних реакцій клітини, спрямованих на ліквідацію пострадіаційних пошкоджень. Слід зауважити, що зростання вмісту олігоаденілатів в лімфоцитах було більш інтенсивним при опроміненні в дозі 0,5 Гр, а в дозі 1 Гр спостерігалося затухання ефекту. Можливо, що із зростанням дози опромінення в клітинах виникають більш глибокі постпроменеві порушення, що виявляється у пригніченні синтезу 2,5А-олігонуклеотидів. Оскільки індуктори інтерферону (циклоферон, ФГА та полі(І)полі(С)) зумовлювали посилення накопичення всіх досліджуваних олігоаденілатів у лімфоцитах опромінених щурів, є невиключеним залучення інтерферону до процесів радіоіндукованої стимуляції каскаду 2,5А.

Відомо, що 2’,5’-олігоаденілат являє собою продукт дії 2’,5’-олігоаденілат-синтетази. Тому викликає інтерес вивчення цього ферменту в лімфоцитах щурів за умов радіаційного впливу. Із застосуванням різних біологічних моделей нами була визначена активність 2,5А-синтетази на фоні введення різних індукторів інтерферону. Показано, що активність ферменту в лімфоцитах селезінки і тимусу щурів збільшується в 1,8 рази через 12 год. після рентгенівського опромінення в дозі 0,5 Гр. При опроміненні в дозі 1 Гр подібного явища не спостерігалося (рис. 2).

Рис. 2. Вплив різних індукторів інтерферону на активність 2’,5’-олігоаденілат-синтетази в лімфоцитах селезінки (а) і тимусу (б) щурів при опроміненні в дозах 0,5 і 1 Гр.

*- р < 0,05 по відношенню до групи без індуктора, ** - р < 0,05 по відношенню до групи без опромінення, *** - р < 0,05 по відношенню до групи без опромінення та до групи без індуктора.

За умов преінкубації лімфоцитів з індукторами інтерферону in vitro відбувалося посилення стимуляції 2,5А-синтетази, яка була зумовлена опроміненням. Максимальну зміну ферментативної активності викликав ФГА, при введенні якого вона збільшувалась в 1,7 рази при опроміненні в дозі 0,5 Гр та 1,5 рази в дозі 1 Гр в спленоцитах і в 1,7 рази в дозі 0,5 Гр та в 1,6 рази в дозі 1 Гр в тимоцитах. Отримані дані дають підстави розглядати підвищення активності 2,5А-синтетази як результат активації цього ферменту в лімфоцитах за умов впливу променевого фактору, що може бути наслідком пострадіаційної стимуляції процесів трансдукції сигналу в системі 2’,5’-олігоаденілату.

Оскільки різні індуктори інтерферону посилювали активність досліджуваного ферменту в лімфоїдних клітинах опромінених щурів, є ймовірним, що їх дія викликає інтенсифікацію синтезу ендогенного інтерферону за умов радіаційного впливу. Це узгоджується з літературними даними про здатність іонізуючого випромінювання посилювати продукцію інтерферону радіочутливими клітинами-мішенями (Дубинин, 1977). Є невиключеним, що виявлений ефект пов’язаний з радіозахисними властивостями індукторів інтерферону, які описані в багатьох роботах (Tazulakhova, 2001; Lvovsky, 1985). Цікаво, що активність 2,5А-синтетази, як і пострадіаційне накопичення олігоаденілатів, набувала максимуму при опроміненні в дозі 0,5 Гр, а при опроміненні в дозі 1 Гр спостерігалося зменшення цього ефекту. Це може бути пов’язано з виникненням в клітинах більш глибоких порушень при збільшенні дози опромінення.

Для з’ясування механізму впливу індукторів інтерферону на 2,5А-синтетазу ми визначили активність ферменту в лімфоцитах селезінки і тимусу опромінених щурів, яким препарат циклоферону був введений in vivo шляхом внутрішньом’язевої ін’єкції, а також в умовах преінкубації ізольованих лімфоцитів з циклофероном in vitro. Введення циклоферону зумовлювало підвищення ферментативної активності відносно її значень в системах без індуктору в 1,5 рази в спленоцитах і тимоцитах після опромінення в дозах 0,5 і 1 Гр (рис.3). Слід зазначити, що дія при опроміненні була більш ефективною за умов преінкубації лімфоцитів з цим індуктором in vitro, ніж при ін’єкції препарату тваринам in vivo. Ці дані узгоджувалися з тим, що рівень 2’,5’-олігоаденілатів у лімфоцитах щурів при введенні циклоферону in vivo був значно нижчим порівняно з in vitro.

Оскільки потужним індуктором інтерферону є полі(І)полі(С), для з’ясування механізму дії індукторів нами був використаний розширений діапазон концентрацій цього полінуклеотиду. Встановлено, що в присутності полі(І)полі(С) в системі in vitro активність ферменту в лімфоцитах зростає по мірі збільшення концентрації ліганду, причому цей ефект був найбільш вираженим при опроміненні в дозі 0,5 Гр (рис. 4).

Рис. 3. Вплив циклоферона на активність 2’,5’-олігоаденілат-синтетази в лімфоцитах селезінки (а) і тимусу (б) щурів при опроміненні в дозах 0,5 і 1 Гр.

*- р < 0,05 по відношенню до групи без індуктора, ** - р < 0,05 по відношенню до групи без опромінення, *** - р < 0,05 по відношенню до групи без опромінення та до групи без індуктора.

Рис. 4. Вплив різних концентрацій полі(І)полі(C) на активність 2’,5’-олігоаденілат-синтетази в лімфоцитах селезінки (а) і тимусу (б) щурів при опроміненні в дозах 0,5 і 1 Гр.

*- р < 0,05 по відношенню до групи без індуктора, ** - р < 0,05 по відношенню до групи без опромінення, *** - р < 0,05 по відношенню до групи без опромінення та до групи без індуктора.

Отже, на моделі in vitro ми показали, що в лімфоїдних клітинах щурів, опромінених в дозі 0,5 Гр, відбувається збільшення активності 2’,5’-олігоаденілат-синтетази, що посилюється в присутності індукторів інтерферону. Отримані дані цілком корелюють з тим, що вміст 2’,5’-олігоаденілатів у лімфоцитах щурів зростає при опроміненні, набуваючи максимуму при дії радіації в дозі 0,5 Гр. Це підтверджує припущення про те, що зростання рівню цих олігонуклеотидів за умов радіаційного впливу є наслідком стимуляції 2,5А-синтетази. Отримані експериментальні дані дозволяють зробити висновок про активацію 2’,5’-олігоаденілат-синтетази в лімфоцитах щурів за умов впливу променевого фактору. Посилення активності ферменту в присутності індукторів інтерферону дає змогу передбачити, що в лімфоцитах під впливом рентгенівських променів має місце інтенсифікація його синтезу.

Для порівняння механізмів пострадіаційної стимуляції 2’,5’-олігоаденілат-синтетази в організмі та на моделі культури клітин цей фермент був вивчений у В-клітинах лімфобластоїдної лінії людини Namalwa. Активність 2,5А-синтетази визначали через 12 год. після рентгенівського опромінення в дозах 0,5 і 1 Гр на фоні введення індукторів інтерферону (циклоферону, тілорону та полі(І)полі(С)). Встановлено підвищення активності досліджуваного ферменту в два рази при опроміненні в дозі 0,5 Гр та її зниження до контрольного рівня при опроміненні в дозі 1 Гр (рис. 5).

Рис. 5. Вплив різних індукторів інтерферону на активність 2’,5’-олігоаденілат-синтетази в культурі клітин Namalwa при опроміненні в дозах 0,5 і 1 Гр: а – без індуктора; б - преінкубація клітин з циклофероном (100 мкг на 1 млн клітин / мл); в - преінкубація клітин з тілороном (100 мкг на 1 млн клітин / мл); г - преінкубація клітин з полі(І)полі(С) (100 мкг на 1 млн клітин / мл); д - преінкубація клітин з інтерфероном (1000 М.О. / мл).

*- р < 0,05 по відношенню до групи без індуктора, ** - р < 0,05 по відношенню до групи без опромінення, *** - р < 0,05 по відношенню до групи без опромінення та до групи без індуктора.

Преінкубація клітин з індукторами інтерферону зумовлювала зростання ферментативної активності у 2-4 рази порівняно з системами без індукторів, причому цей ефект був найбільш вираженим після дії радіації в дозі 0,5 Гр. Серед усіх використаних індукторів максимальну зміну досліджуваного показника викликала полі(І)полі(С). Можна припустити, що рентгенівське випромінювання в сублетальних дозах спричинює активацію 2’,5’-олігоаденілат-синтетази в культурі клітин Namalwa, а індуктори інтерферону посилюють постпроменеву стимуляцію активності ферменту. Отримані дані повністю корелюють із змінами активності 2’,5’-олігоаденілат-синтетази в лімфоїдних клітинах опромінених щурів.

Отже, можна стверджувати про участь 2’,5’-олігоаденілат-синтетази у процесах радіоіндукованої сигнальної трансдукції в лімфоїдних клітинах. Є підстави розцінити постпроменеву стимуляцію ферменту як результат прояву адаптаційних реакцій клітин у відповідь на дію опромінення, що може бути пов’язаним з індукцією інтерферону.

Можна зробити висновок, що за умов дії рентгенівського випромінювання в лімфоїдних клітинах селезінки і тимусу щурів відбувається активація процесів трансдукції сигналу в каскаді 2’,5’-олігоаденілату, що виявляється у стимуляції його ключового ферменту 2’,5’-олігоаденілат-синтетази і в зростанні рівню вторинного посередника. Виявлена стимуляція може бути результатом включення адаптаційних механізмів в імунокомпетентних клітинах у відповідь на пошкоджуючу дію іонізуючої радіації.

Відомо, що другою складовою сигнальної системи, яка індукується інтерфероном, є ферментна система дсРНК-залежної протеїнкінази (протеїнкінази R або PKR) (Abraham, 1999; Meurs, 1993). Основною функцією PKR є фосфорилювання фактору ініціації трансляції eIF2, що призводить до його інгібування і, як наслідок, до припинення синтезу вірусного або клітинного білка (Chong, 1992). Відомо, що протеїнкіназа R є залученою до великої кількості регуляторних процесів, індукція цього ферменту спостерігається при вірусній інфекції, пухлинних процесах, введенні дсРНК, гіпертермії та ін. (Der, 1997; Barber, 1995).

Нами була вивчена активність PKR через 12 год. після рентгенівського опромінення в дозах 0,5 і 1 Гр у клітинах лімфоїдних органів щурів з застосуванням двох вищезгаданих модельних систем (in vivo та in vitro). Виявлено, що в лімфоцитах щурів, опромінених в дозі 0,5 Гр, відбувається підвищення активності протеїнкінази R, в той час як при дії радіації в дозі 1 Гр її рівень знижувався до значень контролю (рис. 6). Преінкубація лімфоцитів in vitro з індукторами інтерферону (ФГА, полі(І)полі(С) та конканаваліном А in vitro викликала зростання рівню активності PKR відносно систем без індукторів. Максимально дія індукторів проявлялася при дозі 0,5 Гр: активність досліджуваної протеїнкінази збільшувалась в спленоцитах та в тимоцитах майже в 1,9 рази при обробці клітин ФГА і більше, ніж у 2 рази при обробці конканаваліном А та полі(І)полі(С). У тимоцитах описані вище ефекти були більш вираженими, що може бути наслідком високої чутливості цих клітин до дії радіації та інших зовнішніх впливів.

Рис. 6. Вплив різних індукторів інтерферону на активність дсРНК-залежної протеїнкінази в лімфоцитах селезінки (а) і тимусу (б) щурів при опроміненні в дозах 0,5 і 1 Гр.

*- р < 0,05 по відношенню до групи без індуктора, ** - р < 0,05 по відношенню до групи без опромінення, *** - р < 0,05 по відношенню до групи без опромінення та до групи без індуктора.

Дослідження впливу різних концентрацій полі(І)полі(С) на протеїнкіназу R in vitro показало, що активність ферменту в лімфоцитах і тимоцитах опромінених щурів зростає із збільшенням концентрації індуктору, досягаючи максимуму при концентрації 100 мкг на 1 млн клітин / мл. Ефект полі(І)полі(С) на PKR набував максимуму при опроміненні в дозі 0,5 Гр (рис. 7).

На підставі отриманих даних можна стверджувати, що індуктори інтерферону посилююють активність протеїнкінази R за умов опромінення. Стимулююча дія індукторів може бути результатом прояву їх радіозахисних властивостей, пов’язаних з індукцією інтерферону в клітинах-мішенях. До того ж, активація PKR при сумісній дії радіації та індукторів, ймовірно, є результатом прояву адаптивної реакції клітин.

Рис. 7. Вплив різних концентрацій полі(І)полі(С) на активність дсРНК-залежної протеїнкінази в лімфоцитах селезінки (а) і тимусу (б) щурів при опроміненні в дозах 0,5 і 1 Гр.

*- р < 0,05 по відношенню до групи без індуктора, ** - р < 0,05 по відношенню до групи без опромінення, *** - р < 0,05 по відношенню до групи без опромінення та до групи без індуктора.

Для з’ясування механізмів впливу радіації та індукторів інтерферону на функціонування протеїнкінази ми визначили її активність при різних концентраціях субстрату фосфотрансферазної реакції (АТР) - від 5 до 150 мкмоль / л. Нами був застосований препарат “Циклоферон”, дію якого вивчали in vivo (препарат вводили піддослідним тваринам шляхом внутрішньом’язевої ін’єкції) та in vitro (клітини преінкубували з індукторами на протязі 17 год.). Показано, що за умов опромінення в дозах 0,5 і 1 Гр у відсутності індуктору не спостерігається статистично достовірних змін активності протеїнкінази R відносно контролю у вибраному концентраційному діапазоні АТР. При введенні циклоферона як in vivo, так in vitro активність ферменту збільшувалася відносно систем без індуктора, причому цей ефект набував максимуму при опроміненні в обох досліджуваних дозах. Можна припустити, що циклоферон при використанні в комбінації з рентгенівським випромінюванням посилює стимуляцію протеїнкінази R в лімфоцитах щурів.

Отже, ми показали, що при впливі іонізуючого випромінювання в дозах 0,5 і 1 Гр в лімфоцитах щурів активації дсРНК-залежної протеїнкінази не відбувається. Можливо, це є наслідком виникнення пострадіаційних порушень сигнальної трансдукції від інтерферону до протеїнкінази R. З іншого боку, є ймовірним, що за умов впливу вищевказаних доз іонізуючого випромінювання в лімфоцитах має місце індукція інтерферону, проте його рівень є недостатнім для стимуляції цієї протеїнкінази. Сумісна дія радіації з індукторами інтерферону зумовлює підвищення активності дсРНК-залежної протеїнкінази, що може бути пов’язаним із посиленням синтезу в клітинах цього цитокіну. Виявлений ефект може бути наслідком активізації процесів трансдукції сигналу в лімфоїдних клітинах під дією цих факторів, оскільки даний фермент є невід’ємною ланкою інтерферонозалежного месенджерного каскаду. Є підстави припустити, що стимулюючий вплив індукторів на протеїнкіназу в лімфоцитах опромінених щурів являється проявом радіозахисних властивостей цих препаратів, які сприяють формуванню компенсаторної реакції клітин на дію радіаційного фактору.

Таким чином, можна стверджувати, що інтерферонозалежні сигнальні системи 2’,5’-олігоаденілат-синтетази та дсРНК-залежної протеїнкінази є залученими до шляхів радіаційно-індукованої відповіді імунокомпетентних клітин селезінки і тимусу щурів на дію радіації в дозі 0,5 Гр. Вивчення цих процесів є важливим для з’ясування загальних механізмів впливу іонізуючої радіації на клітинний метаболізм, а також для розробки нових радіозахисних препаратів на базі індукторів інтерферону.

ВИСНОВКИ

1.

2.

3.

4.

5.

6.

7.

8.

СПИСОК ПРАЦЬ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1.

2.

3.

4.

5.

6.

АНОТАЦІЇ

Михайлик І.В. Функціонування інтерферонозалежних систем трансдукції сигналу в лімфоїдних клітинах щурів за умов дії іонізуючої радіації. – Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.04. – біохімія. - Київський національний університет імені Тараса Шевченка, Київ, 2002.

Досліджені особливості функціонування інтерферон-індукованих сигнальних систем 2’,5’-олігоаденілат-синтетази та дсРНК-залежної протеїнкінази в лімфоцитах селезінки і тимусу щурів за умов радіаційного впливу. Встановлено підвищення внутрішньоклітинного вмісту різних 2’,5’-олігоаденілатів через 12 год. після рентгенівського опромінення в дозі 0,5 Гр. Виявлено, що радіоіндуковане накопичення цих олігонуклеотидів в лімфоїдних клітинах значно зростає при застосуванні різних індукторів інтерферону in vivo та in vitro. На різних біологічних моделях (в лімфоцитах тварин та культурі клітин Namalwa) показана пострадіаційна активація 2’,5’-олігоаденілат-синтетази, виявлено посилення активності ферменту в присутності індукторів інтерферону за умов впливу променевого фактору. Зроблено припущення про стимуляцію каскаду 2’,5’-олігоаденілату в лімфоїдних клітинах щурів при дії іонізуючої радіації. Вивчена сумісна дія іонізуючого випромінювання та індукторів інтерферону на дсРНК-залежну протеїнкіназу, яка виявляється у зростанні її функціональної активності, проведений порівняльний аналіз дії індукторів на фермент в системах in vivo та in vitro. Показано, що за умов впливу радіації та індукторів відбувається порушення взаємодії дсРНК-залежної протеїнкінази з основним субстратом фосфотрансферазної реакції (АТР). Таким чином, установлено, що інтерферонозалежні системи трансдукції сигналу є залученими до механізмів радіоіндукованої відповіді імунокомпетентних клітин.

Ключові слова: інтерферон, індуктори інтерферону, 2’,5’-олігоаденілат-синтетаза, дсРНК-залежна протеїнкіназа, лімфоцити, рентгенівське випромінювання.

Михайлик И.В. Функционирование интерферонозависимых систем трансдукции сигнала в лимфоидных клетках крыс в условиях действия ионизирующей радиации. – Рукопись.

Диссертация на соискание научной степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.04. – биохимия. – Киевский национальный университет имени Тараса Шевченко, Киев, 2002.

Работа посвящена изучению особенностей функционирования интерферон индуцированных сигнальных систем 2’,5’-олигоаденилат-синтетазы и дсРНК-зависимой протеинкиназы в лимфоцитах селезенки и тимуса крыс в условиях действия ионизирующего излучения. Исследование влияния радиации на эти каскады проводили параллельно с использованием разных индукторов интерферона (ФГА, конканавалина А, поли(І)поли(С) и циклоферона) на двух экспериментальных моделях: in vitro (лимфоциты преинкубировались с индукторами в течение 17 часов) и in vivo (препараты индукторов были введены подопытным животным путем внутримышечной инъекции). С помощью радиоимунных методов был определен внутриклеточный уровень 2’,5’-олигоаденилатов через 12 часов после рентгеновского облучения в сублетальных дозах 0,5 и 1 Гр. Установлено повышение содержания димеров и тримеров 2’,5’-олигоаденилатов в 7 раз в спленоцитах и в 5 раз в тимоцитах при облучении в дозе 0,5 Гр, в то время как в дозе 1 Гр подобного эффекта не наблюдалось, что может быть связано с возникновением в клетке более глубоких пострадиационных нарушений. Показано, что радиоиндуцированное накопление 2’,5’-олигонуклеотидов в лимфоидных клетках крыс значительно возрастает на фоне введения разных индукторов интерферона (ФГА, циклоферона и поли(І)поли(С)). Действие индукторов на исследуемый параметр было более эффективным в системе in vitro по сравнению с in vivo.

На разных биологических моделях была исследована активность 2’,5’-олигоаденилат-синтетазы в контроле и при действии радиации. Обнаружено увеличение активности фермента в лимфоцитах селезенки и тимуса крыс приблизительно в 2 раза при облучении в дозе 0,5 Гр, при облучении в дозе 1 Гр значение активности фермента приближалось к контрольному уровню. Преинкубация лимфоцитов с индукторами интерферона in vitro вызывала повышение активности фермента относительно систем без индукторов, причем эффект был наиболее выраженым при облучении в дозе 0,5 Гр. На фоне введения индукторов интерферона in vivo пострадиационная стимуляция усиливалась. На модели культуры клеток Namalwa показано возрастание активности 2’,5’-олигоаденилат-синтетазы в 2 раза через 12 часов после рентгеновского облучения в дозе 0,5 Гр и усиление этого еффекта в присутствии индукторов интерферона (циклоферона, тилорона и поли(І)поли(С)).

Полученные результаты показывают, что в лимфоидных клетках крыс под влиянием ионизирующей радиации происходит активация процессов трансдукции сигнала в каскаде 2’,5’-олигоаденилата, которая проявляется в стимуляции активности еого ключевого фермента 2’,5’-олигоаденилат-синтетазы и в увеличении внутриклеточного содержания вторичного посредника. Подобная активация может быть результатом запуска адаптационных механизмов в иммунокомпетентных клетках в ответ облучение.

Исследовано совместное действие облучения и индукторов интерферона на активность дсРНК-зависимой протеинкиназы в лимфоидных клетках селезенки и тимуса животных. Показано увеличение активности фермента приблизительно в 2 раза в лимфоцитах облученных крыс в присутствии ФГА, циклоферона и поли(І)поли(С) in vitro. На примере циклоферона проведен сравнительный анализ действия индукторов на активность дсРНК-зависимой протеинкиназы в исследуемых системах. Обнаружено, что индукторы интерферона совместно с рентгеновским облучением усиливают стимуляцию фермента в лимфоидных клетках крыс.

Таким образом, можно утверждать, что интерферонозависимые сигнальные системы 2’,5’-олигоаденилат-синтетазы и дсРНК-зависимой протеинкиназы вовлечены в механизмы радиоиндуцированного ответа иммунокомпетентных клеток.

Ключевые слова: интерферон, индукторы интерферона, 2’,5’-олигоаденилат-синтетаза, дсРНК-зависимая протеинкиназа, лимфоциты, рентгеновское излучение.

Mihailik I.V. The functioning of interferon-dependent signal transduction systems in rat lymphoid cells under the influence of X-ray irradiation.

Dissertation for the obtaining of the scientific degree of the specialized in 03.00.04. – Biochemistry. – Taras Shevchenko Kyiv National University, Kyiv, 2002.

The functioning of interferon inducible 2’,5’-oligoadenylate-synthetase and dsRNA-dependent protein kinase signal transduction systems was investigated under the influence of ionizing irradiation. The subjects of inquiry were rat spleen and thymus lymphocytes. An intracellular 2’,5’-oligoadenylate level was shown to increase in 12 h. after animal X-irradiation at 0.5 Gy dose. Different interferon inducers intensified the post-radiation accumulation of oligoadenylate. The stimulation of 2’,5’-oligoadenylate cascade in rat lymphocytes under the radiation influence was suggested. The combined action of X-irradiation and interferon inducers on dsRNA-dependent protein kinase has been studied. The functional activity of this enzyme increased upon the effects of these factors. A comparative analysis of the action of interferon inducers in vitro and in vivo has been carried out.

Thus, interferon-inducible signal transduction pathways are involved in mechanisms of immunocompetent cell response to ionizing irradiation.

Key words: interferon, interferon inducers, 2’,5’-oligoadenylate synthetase, dsRNA-dependent protein kinase, X-irradiation.