Національна академія наук УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ МІКРОБІОЛОГІЇ І ВІРУСОЛОГІЇ

ім. Д.К. ЗАБОЛОТНОГО

МОРОЗ СВІТЛАНА МИКОЛАЇВНА

УДК 579.842.24

ЛІПОПОЛІСАХАРИДИ БАКТЕРІЙ

ERWINIA CAROTOVORA (Jones 1901) Bergey et al. 1923 –

ЗБУДНИКІВ М’ЯКОЇ ГНИЛІ РОСЛИН

03.00.07 мікробілогія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

КИЇВ - 2002

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана у відділі фітопатогенних бактерій Інституту мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України

Науковий керівник: | доктор біологічних наук, професор Гвоздяк Ростислав Ілліч, Інститут мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України, завідувач відділу фітопатогенних бактерій

Офіційні опоненти: | доктор біологічних наук, старший науковий співробітник Варбанець Людмила Дмитрівна, Інститут мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України, завідувач відділу біохімії мікроорганізмів

доктор біологічних наук, старший науковий співробітник Сарнацька Вереса Василівна, Інститут фізіології рослин та генетики НАН України, провідний науковий співробітник

Провідна установа: | Інститут молекулярної біології і генетики НАН України

Захист відбудеться “17” квітня 2002 р. о 10 годині на засіданні Спеціалізованої вченої ради Д 26.233.01 по захисту докторських дисертацій при Інституті мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України за адресою: 03143, м. Київ, вул. Заболотного, 154.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України за адресою: 03143, м. Київ, вул. Заболотного, 154.

Автореферат розісланий “14” березня 2002 р.

Вчений секретар

Спеціалізованої вченої ради,

кандидат біологічних наук,

старший науковий співробітник Пуріш Л.М.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Вивчення пектолітичних бактерій роду Erwinia є актуальним через високу шкідливість цих фітопатогенів для сільськогосподарських рослин і готової продукції, а також через неоднозначне таксономічне положення їх у межах роду і родини. Одним із хемотаксономічних критеріїв для встановлення філогенетичної спорідненості і шляхів еволюції бактерій є склад і структура ліпополісахаридів (ЛПС). Крім того, ліпополісахариди грамнегативних бактерій відіграють важливу роль у взаємодії бактеріальної клітини з різними чинниками навколишнього середовища, зокрема макромолекулярними бактеріоцинами. Для розробки біологічних методів боротьби з фітопатогенами E. carotovora перспективними є бактеріоцини, що потребує поглибленого вивчення їх взаємодії з клітинами бактерій.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота виконувалась у рамках НДР відділу фітопатогенних бактерій ІМВ НАН України за темами: “Вивчення гетерогенності популяцій та ролі біополімерів клітин у патогенності фітопатогенних бактерій”, 2_28.9.1 “Дослідження взаємовідносин між фітопатогенними, ендофітними та епіфітними бактеріями з метою виявлення їх ролі в стійкості рослин до хвороб”, а також програмою американського цивільного фонду UP1-333 “Розробка портативного біосенсору для швидкого серологічного визначення фітопатогенних бактерій”.

Мета і задачі дослідження. Мета роботи з’ясувати можливість використання моносахаридного і жирнокислотного складу ліпополісахаридів у хемосистематиці бактерій роду Erwinia, а також у визначенні рецепторних сайтів для макромолекулярних каротоворицинів.

Для досягнення мети необхідно було виконати такі завдання:

дослідити склад клітинних моносахаридів штамів E. carotovora та визначити можливість використання цієї ознаки для ідентифікації та диференціації пектобактерій;

вивчити залежність моносахаридного та жирнокислотного складу ліпополісахаридів від методу виділення ЛПС;

підібрати оптимальні для цілей хемосистематики і вивчення адсорбційних властивостей щодо каротоворицинів методи екстрагування ЛПС із клітин E. carotovora;

визначити моносахаридний та жирнокислотний склад ЛПС, виділених із різних штамів E. carotovora, які відрізняються складом клітинних моносахаридів, а також типових штамів чотирьох підвидів E. carotovora;

дослідити природу та адсорбційні властивості ЛПС як рецепторів для макромолекулярних каротоворицинів.

Об’єктом дослідження були фітопатогенні бактерії E. carotovora збудники м’якої гнилі рослин, таксономічне положення яких неоднозначне.

Предмет дослідження: клітинні моносахариди та мономерний склад ліпополісахаридів 11 штамів E. carotovora і типових штамів чотирьох його підвидів, а також адсорбційна здатність ЛПС щодо макромолекулярних каротоворицинів.

Методи досліджень. В дослідах використовували фітопатологічні, мікробіологічні, вірусологічні та біохімічні методи.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше проведено групування за складом клітинних моносахаридів 137 штамів E. carotovora і показано відсутність зв'язку між моносахаридним складом клітин і протопектиназною активністю, вірулентністю, джерелом та місцем виділення збудника захворювання рослин, зберіганням культури в колекції.

Показано вплив методу екстрагування ЛПС на його мономерний склад. Підібрано оптимальні методи екстрагування ЛПС із клітин E. carotovora для цілей хемосистематики, а також для вивчення їх адсорбційних властивостей щодо макромолекулярних каротоворицинів.

Вперше показано, що збудник м'якої гнилі рослин E. carotovora відрізняється від типового виду роду Erwinia E. amylovora відсутністю уронових кислот у складі ЛПС.

Вперше показано, що жирнокислотний склад ЛПС E. carotovora постійний і подібний у різних штамів E. carotovora subsp. carotovora, а також типових штамів підвидів carotovora, atroseptica, betavasculorum і odorifera. Основними жирними кислотами ЛПС є додеканова, 3-окситетрадеканова і гексадеканова. Високий (більше 50%) вміст додеканової і незначний вміст тетрадеканової серед насичених жирних кислот ЛПС E. carotovora є важливим додатковим тестом для його ідентифікації і диференціації від E. chrysanthemi, E. amylovora й інших ентеробактерій, а також підставою для виділення E. carotovora в окремий рід Pectobacterium.

Вперше встановлено, що ЛПС E. carotovora містить рецепторні сайти для макромолекулярних каротоворицинів.

Практичне значення одержаних результатів. Результати досліджень можуть використовуватись для ідентифікації та класифікації E. carotovora і розробки біологічних методів боротьби зі збудниками м’якої гнилі рослин.

Особистий внесок здобувача. Здобувачем особисто зібрано й проаналізовано літературу з даного питання, сформульовано мету роботи, сплановано й проведено експериментальні дослідження, здійснено аналіз і узагальнення отриманих результатів, їх статистичну обробку та порівняння з літературними матеріалами, написано статті. Експерименти з адсорбції макромолекулярних каротоворицинів виконано спільно з к.б.н., с.н.с. відділу вірусів мікроорганізмів Ф.І. Товкачем. Планування експериментів, методичні підходи, обговорення результатів та написання наукових статтей здійснювалося під керівництвом д.б.н., професора Р.І. Гвоздяка та к.б.н., с.н.с. О.Є. Жеребило.

Апробація результатів дисертації. Матеріали дисертації були представлені на: III Республіканській науково-теоретичній конференції молодих учених-мікробіологів (Ташкент, 1983 р.); VI з'їзді Українського мікробіологічного товариства (Донецьк, 1984р.); II Всесоюзній науковій конференції "Результати та перспективи наукових досліджень мікробних полісахаридів"(Ленінград, 1984р.); VII з'їзді Всесоюзного мікробіологічного товариства (Алма- Ата, 1985р.); конференції "Фітонциди. Бактеріальні хвороби рослин" (Ужгород, 1985р.); III Братиславському симпозіумі по сахаридах (Братислава, Чехословаччина, 1986р.); конференції молодих учених "Проблеми сучасної біології" (Москва, 1986р.); Х конгресі Угорського мікробіологічного товариства (Сегед, Угорщина, 1987р.); VIІ з'їзді Українського мікробіологічного товариства (Чернівці, 1989р.); конференції "Фітонциди. Бактеріальні хвороби рослин" (Львів, 1990р.); VIІІ Міжнародній конференції фітопатогенних бактерій (Версаль, Франція, 1992р.); ІІ Міжнародній конференції по ендотоксинах (Відень, Австрія, 1992р.); ІІ/ІХ з'їзді Українського мікробіологічного товариства (Чернігів, 2000р.); Міжнародній науково-практичній школі “Природні екосистеми Карпат в умовах посиленого антропогенного впливу” (Ужгород, 2001р.).

Публікації. За темою дисертації опубліковано 24 наукові праці, в тому числі 8 статтей у фахових виданнях.

Структура та обсяг роботи. Дисертація складається з вступу, огляду джерел літератури, основної частини (включає матеріали і методи досліджень, результати досліджень та їхнє обговорення), висновків та списку використаної літератури, який включає 190 першоджерел (з них 150 іноземних). Загальний обсяг роботи становить 143 сторінки. Робота ілюстрована 19 таблицями і 12 рисунками.

РОЗДІЛ 1. ОГЛЯД ЛІТЕРАТУРИ

Огляд літератури складається з чотирьох підрозділів, які містять сучасну інформацію про проблеми таксономії фітопатогенних бактерій роду Erwinia і, зокрема, збудників м’якої гнилі рослин. Проаналізовано хімічний склад і структуру ліпополісахаридів фітопатогенних бактерій роду Erwinia у порівнянні з іншими ентеробактеріями. Розглянуто вплив методів екстрагування ліпополісахаридів на їх хімічний склад та біологічну активність. Висвітлено механізм дії бактеріоцинів на клітини E. carotovora. На основі аналізу наукової літератури обгрунтовано необхідність проведення досліджень по темі дисертації.

РОЗДІЛ 2. МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ

Об’єктами досліджень були 137 штамів E. carotovora підвидів carotovora й atroseptica, в т.ч. 64 штами, ідентифіковані при виділенні як E. carotovora, 2 штами E. carotovora f. zeae, 48 штамів E. aroideae, 16 штамів E. atroseptica, 7 штамів E. phytophthora. Культури отримано з різних колекцій. Для порівняння використовували типові штами: Escherichia coli 8991Т (CCM 5172T =ATCC 11775T), Е. amylovora 2024Т (ATCC 15580Т=NCPPB 683Т), Е. carotovora підвидів: carotovora 1008Т (CCM 1008T=ATCC 15713T), atroseptica 549Т (NCPPB 549T=ATCC 33260T), betavasculorum 4226T (ICPB 4226T=ATCC 43762T), odorifera 1878T (CFBP 1878T=NCPPB 3839T).

Для вивчення залежності між мономерним складом ЛПС та вірулентністю використовували штам 36А Е. carotovora subsp. atroseptica та його мутанти, резистентні до налідіксової кислоти, вірулентний Nal 4 і авірулентний 544, який не виділяє целюлазу і пектатліазу, люб’язно надані нам Ю.К. Фомічовим (БДУ, Мінськ, Білорусь).

У роботі використано 19 макромолекулярних каротоворицинів, виділених і люб’язно наданих нам Ф.І. Товкачем (ІМВ НАНУ).

Бактерії вирощували на картопляному агарі при 28 С, клітини збирали у фазі логарифмічного росту культури.

Про протопектиназну активність і вірулентність судили за здатністю бактерій мацерувати скибки картоплі in vitro та зелені плоди томатів in vivo.

Моносахаридний склад клітин визначали методом розподільної висхідної хроматографії на папері (И.Я. Захарова, Л.В. Косенко, 1982).

Ліпополісахариди екстрагували з клітин наступними методами: водно-фенольним (O. Westphal, K. Jann, 1965), з використанням дистильованої води з EDTA (R.S. Roberts, 1966), фізіологічного розчину з EDTA (M.L. Leive et al., 1968) та в модифікації без EDTA. Очищення проводили різними способами: ультрацентрифугуванням, обробкою ферментами, градієнтним центрифугуванням, обробкою фенолом. Оцінку чистоти отриманих препаратів ЛПС проводили спектрофотометричним методом (180-300 нм).

Екзоцелюлярні полісахариди (ЕПС) виділяли з супернатанту (И.Я. Захарова, Л.В. Косенко, 1982).

Вміст вуглеводів визначали реакцією з фенолом та сірчаною кислотою, нуклеїнових кислот за Спіріним, білка методом Лоурі.

Для визначення кількісного вмісту моносахаридів, після гідролізу їх ацетилювали, ацетати поліолів розділяли методом газорідинної хроматографії на хроматографі "Chrom-5" (И.Я. Захарова, Л.В. Косенко, 1982). Ідентифікацію моносахаридів проводили шляхом порівняння часу утримання ацетатів поліолів досліджуваних зразків і стандартних (Serva, Німеччина).

Визначення амінокислот після гідролізу проводили на амінокислотному аналізаторі KLA-5 Hitachi (Японія). Ідентифікацію та кількісний вміст окремих амінокислот й аміносахарів визначали за співвідношенням площ піків досліджуваного розчину та розчину стандартів амінокислот й аміносахарів.

Для визначення жирнокислотного складу ЛПС їх попередньо очищали від фосфоліпідів. Після гідролізу ЛПС та метанолізу жирних кислот проводили розділення їх метилових ефірів на газорідинному хроматографі "Chrom-5" (О.Е. Жеребило, Н.М. Вишталюк, 1991). Ідентифікували метилові ефіри жирних кислот за часом утримання досліджуваних зразків у порівнянні зі стандартними (Serva, Німеччина). Для виявлення ненасичених та циклопропанових жирних кислот проводили гідрування та бромування метилових ефірів.

Кількісний вміст моносахаридів і жирних кислот виражали в процентах від загальної площі хроматографічних піків. Повторність визначення не менше 3-х разів. Статистичну обробку здійснювали за М.С. Видергауз, 1978.

Бактеріоциночутливість штамів E. carotovora subsp. carotovora й активність лізуючих макромолекулярних каротоворицинів визначали методом негативних плям. Концентрацію активних бактеріоцинів визначали методом критичних розведень або за відсотком клітин, що виживають при обробці їх макромолекулярними бактеріоцинами. В останньому випадку були використані одиниці летальної дози LD37, що відповідає е1 (A. Mаеda, M. Nomura, 1966). При дослідженні процесу адсорбції макромолекулярного бактеріоцину Еса13А на ЛПС і нативних клітинах відзначали зменшення летальної дози LD37 у залежності від часу, що адекватно відбиває падіння концентрації незв'язаних часток.

РОЗДІЛ 3. РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

1. Характеристика фітопатогенних властивостей штамів бактерій

E. carotovora

Штами E. carotovora гетерогенні за патогенністю. Більшість із них (91%) здатні викликати захворювання рослин. Вірулентні штами, на відміну від авірулентних, мають високу протопектиназну активність, яка не залежать від терміну зберігання їх у колекції. Спостерігається пряма залежність між здатністю бактерій мацерувати скибки картоплі in vitro та викликати м'яку гниль зелених плодів томатів in vivo.

2. Моносахаридний склад клітин E. carotovora

За складом клітинних моносахаридів E. carotovora subsp. carotovora більш гетерогенний (виявлено 13 груп), ніж E. carotovora subsp. atroseptica (2 групи). До складу клітин усіх 137 штамів входять глюкоза, галактоза і рибоза. Групи відрізняються за наявністю: арабінози - у 86% штамів, рамнози - 69%, манози - 52%, фукози - 40%, ксилози - 21%, неідентифікованих моносахаридів з Rf більшим, ніж у рамнози, - у 12%.

Не виявлено чіткої залежності між складом клітинних моносахаридів E. carotovora і протопектиназною активністю та вірулентністю, рослиною-хазяїном та географічним місцем виділення збудника, тривалістю зберігання культури в колекції. Однак ксилоза та неідентифіковані ліпофільні моносахариди не зустрічаються в авірулентних штамів, а ксилоза і фукоза відсутні у штамів Е. carotovora subsp. atroseptica. У 78 % штамів E. carotovora, виділених із квіткових культур, поряд із іншими моносахаридами у складі клітин виявлено фукозу, тоді як вона зустрічається у складі клітин лише 17 % штамів E. carotovora, вилучених із овочевих культур. У більшості (80 %) “овочевих” штамів E. carotovora виявлено рамнозу, тоді як вона зустрічається тільки у 54 % “квіткових” штамів, до того ж здебільшого разом із фукозою. Неідентифіковані ліпофільні моносахариди, як і фукоза, входять частіше до складу клітин “квіткових” штамів (36 %), аніж “овочевих” (15 %).

Склад клітинних моносахаридів є однією із додаткових характеристик збудників м'якої гнилі рослин, проте як тест для швидкої ідентифікації цієї групи бактерій він не може бути використаний через велику неоднорідність якісного складу моносахаридів.

3. Характеристика ліпополісахаридів E. carotovora subsp. carotovora 258 (8883), екстрагованих різними методами

Встановлено, що на вихід ЛПС впливає метод екстрагування. При виділенні ЛПС водним фенолом вихід препарату нижчий, ніж при використанні фізіологічного розчину чи дистильованої води з додаванням ЕДТА. Найвищий вміст вуглеводів та найнижчий вміст білка відзначенo в препараті, екстрагованому водно-фенольним методом (36,7 і 3,6%, відповідно).

ЛПС E. carotovora subsp. carotovora 258, виділені різними методами, мають однаковий спектр моносахаридів, проте відрізняються їх співвідношенням (табл. 1). У препаратах, виділених водним фенолом та дистильованою водою з EDTA, 62% всіх моносахаридів складають рамноза, фукоза та галактоза у майже однакових пропорціях. ЛПС, екстрагований фізіологічним розчином з EDTA, містить удвічі більше галактози, ніж рамнози чи фукози. Арабіноза, ксилоза, маноза у всіх препаратах присутні у мінорній кількості. Аміноцукри у всіх ЛПС представлені глюкозаміном.

Таблиця 1

Моносахаридний склад ЛПС, екстрагованих різними методами з клітин

E. carotovora subsp. carotovora 258 (% від загальної площі піків, Mm)

Моносахарид | Метод екстрагування ЛПС

45%-м водним фенолом (70 С) | фізіологічним розчином + EDTA (60 С) | дистильованою водою + EDTA (60 С)

гептоза | 7,8 0,3 | 2,7 0,2 | 6,5 0,5

глюкоза | 8,7 0,2 | 4,9 0,1 | 9,6 0,4

галактоза | 17,7 0,4 | 38,9 0,6 | 19,6 0,5

маноза | 1,5 0,1 | 1,8 0,1 | 1,4 0,2

ксилоза | 1,9 0,1 | 1,2 0,2 | 1,5 0,1

арабіноза | 2,0 0,1 | 2,5 0,2 | 4,7 0,4

фукоза | 20,0 0,8 | 15,2 0,4 | 18,3 0,8

рамноза | 24,4 1,2 | 15,3 0,5 | 23,9 0,6

Х1 | 7,8 0,1 | 9,0 0,2 | 7,5 0,2

Х2 | 8,2 0,3 | 8,5 0,1 | 7,0 0,2

Примітки: Х1, Х2 неідентифіковані моносахариди, з часом утримання меншим ніж у рамнози; тут і у всіх наступних таблицях: M середня величина, m середня квадратична похибка.

Препарати ЛПС E. carotovora subsp. carotovora 258, екстраговані різними методами, подібні за спектром жирних кислот, однак відрізняються їх співвідношенням (табл. 2). У всіх препаратах оксикислоти представлені тільки 3-окситетрадекановою кислотою. В ЛПС, екстрагованому водним фенолом, основними є додеканова, 3-окситетрадеканова та гексадеканова кислоти, сумарний вміст яких становить 84% від усіх жирних кислот. Біополімери, екстраговані фізіологічним розчином та дистильованою водою з додаванням EDTA, поряд із цими кислотами у великій кількості містять гексадеценову і тетрадеканову кислоти. Суттєве зменшення вмісту жирних кислот із 16 та 18 атомами вуглецю в процесі очищення препаратів від фосфоліпідів вказує на те, що вони не входять до складу ліпіду А, однак неповне їх відділення від ЛПС ще потребує свого пояснення.

У білковому компоненті ЛПС, незалежно від кількості білка у препараті і методу екстрагування ЛПС, майже половину всіх амінокислот становлять аспарагінова і глутамінова кислоти, а також гліцин і аланін.

Таким чином, при екстрагуванні ЛПС E. carotovora subsp. carotovora 258 вихід біополімерів, а також їхні хімічні характеристики залежать від застосовуваного методу виділення. Для хемосистематики E. carotovora subsp. carotovora найбільш придатним є ЛПС, виділений водно-фенольним методом.

Таблиця 2

Склад жирних кислот* ЛПС, екстрагованих різними методами з E. carotovora subsp. carotovora 258, i загальних клітинних ліпідів

(% від загальної площі піків, Mm)

Жирні кислоти | Метод екстрагування ЛПС |

Загальні клітинні ліпіди

45%-м водним фенолом

(70 С) | фізіологічним розчином + ЕDТА (60 С) | дистильованою водою + EDTA (60 С)

очистка від ФЛ

2-разова | 3-разова

С 12 : 0 | 45,2 1,4 | 26,5 0,8 | 18,1 0,5 | 21,2 0,7 | 5,8 0,1

С 13 : 0 | 1,6 0,2 | 0,6 0,2 | 0,3 0,1 | 0,8 0,1 | 0,1 0,1

С 14 : 0 | 6,2 0,4 | 9,5 0,5 | 3,3 0,3 | 11,1 0,4 | 3,1 0,2

С 15 : 0 | 4,1 0,2

3-ОН

С 14 : 0 | 27,9 1,3 | 21,6 0,9 | 6,4 0,8 | 28,0 1,1 | 5,6 0,1

С 16 : 1 | 5,7 0,1 | 8,4 0,3 | 19,4 0,4 | 10,2 0,6 | 33,7 0,6

С 16 : 0 | 11,3 0,6 | 29,9 1,2 | 35,8 0,7 | 25,0 0,4 | 31,8 0,7

С 17 : 1 | 0,6 0,1

С 17 : 0 | 0,8 0,2

С 18 : 1 | 2,1 0,1 | 3,5 0,2 | 16,7 0,4 | 3,7 0,3 | 13,3 0,6

С 18 : 0 | 1,2 0,3

Примітки: * перша цифра число атомів вуглецю, друга число подвійних зв’язків; “” відсутність кислоти; ФЛ фосфоліпіди.

4. Характеристика ліпополісахаридів Е. carotovora subsp. atroseptica 549Т, екстрагованих різними методами

Спорідненість E. carotovora subsp. carotovora і Е. carotovora subsp. atroseptica вивчали за складом мономерів їх ЛПС. Встановлено, що обробка клітин EDTA майже вдвічі збільшує вихід екстрагованого водним фенолом ЛПС. Фізіологічним розчином з EDTA із клітин Е. carotovora subsp. atroseptica 549Т екстрагується більше препарату, ніж водним фенолом, однак ЛПС у ньому знаходиться в комплексі з ліпідами та білками.

ЛПС, отримані різними методами із клітин Е. carotovora subsp. atroseptica 549Т, мають однаковий спектр моносахаридів: гептоза, глюкоза, галактоза, маноза, арабіноза і рамноза; однак відрізняються кількісним їх співвідношенням. Так, ЛПС, екстрагований фізіологічним розчином з EDTA, містить більше галактози і менше глюкози (32 і 17%, відповідно), ніж ЛПС, отриманий фенольним методом (14 і 30%, відповідно). До складу всіх препаратів ЛПС входить глюкозамін.

Основною жирною кислотою у складі ЛПС Е. carotovora subsp. atroseptica 549Т, незалежно від методу отримання препарату, є 3-окситетрадеканова кислота (табл. 3). Серед насичених жирних кислот ЛПС переважають додеканова і гексадеканова кислоти. При виділенні ЛПС фізіологічним розчином, додавання до нього EDTA змінює співвідношення між жирними кислотами біополімерів у бік збільшення рівня гексадеканової кислоти та появи октадеканової і октадеценової кислот внаслідок екстрагування інших мембранних ліпідів.

Таблиця 3

Склад жирних кислот* ЛПС, екстрагованих різними методами з Е. carotovora subsp. atroseptica 549, та загальних клітинних ліпідів

(% від загальної площі піків, Mm)

Жирні кислоти | Метод екстрагування ЛПС |

Загальні клітинні ліпіди

45%-м водним фенолом

(70 С) | 45%-м водним фенолом + ЕDТА (70 С) | фізіологіч-ним розчином (60 С) | фізіологічним розчином + ЕDТА

(60 С)

С 12 : 0 | 17,7 0,4 | 17,8 0,5 | 19,9 0,4 | 10,3 0,3 | 5,8 0,1

С 13 : 0 | 2,5 0,1 | 2,8 0,1 | Сліди

С 14 : 0 | 6,2 0,1 | 6,1 0,2 | 7,1 0,1 | 3,1 0,2

С 15 : 0 | 2,4 0,1 | 2,7 0,1 | 2,5 0,1 | 4,1 0,2

3-ОН

С 14 : 0 | 54,9 0,5 | 54,7 0,4 | 51,0 0,6 | 42,1 0,3 | 5,6 0,1

С 16 : 1 | 5,3 0,3 | 4,1 0,1 | 5,8 0,2 | 4,6 0,1 | 33,7 0,6

С 16 : 0 | 11,0 0,2 | 14,6 0,3 | 10,9 0,2 | 28,4 0,3 | 31,8 0,7

С 17 : 1 | 0,6 0,1

С 17 : 0 | 0,8 0,2

С 18 : 1 | 9,2 0,1 | 13,3 0,6

С 18 : 0 | 5,4 0,1 | 1,2 0,3

Примітки: * перша цифра число атомів вуглецю, друга число подвійних зв’язків;“” відсутність кислоти.

У білковому компоненті ЛПС Е. carotovora subsp. atroseptica 549Т переважають аспарагінова та глутамінова кислоти, а також аланін і гліцин.

Таким чином, при виділенні ЛПС із бактерій Е. carotovora subsp. atroseptica 549Т вихід біополімерів, а також їхні хімічні характеристики залежать від методу екстрагування. Попередня обробка клітин EDTA збільшує вихід екстрагованого гарячим водним фенолом ЛПС майже вдвічі. Для хемосистематики Е. carotovora subsp. atroseptica найбільш придатним є ЛПС, виділений водно-фенольним методом. За характеристикою ліпідного компоненту ЛПС Е. carotovora subsp. atroseptica й E. carotovora subsp. carotovora подібні. Основними жирними кислотами ЛПС обидвох фітопатогенів є 3-окситетрадеканова, додеканова і гексадеканова кислоти, хоча спостерігаються деякі відмінності у співвідношеннях між цими жирними кислотами.

5. Порівняльне вивчення мономерного складу ліпополісахаридів штамів E. carotovora subsp. carotovora, які належать до різних груп за складом клітинних моносахаридів

Низький вихід ЛПС (1,4 2,3 % від сухої маси клітин) при використанні водно-фенольного методу може вказувати на те, що більшість штамів Е. carotovora subsp. carotovora містить ЛПС із вкороченими бічними ланцюгами.

Штами Е. carotovora subsp. carotovora, які відрізняються між собою складом клітинних моносахаридів, різняться моносахаридним складом їхніх ЛПС, а саме, наявністю і вмістом рамнози, фукози, ксилози та неідентифікованих ліпофільних моносахаридів (табл. 4). У складі ЛПС усіх штамів виявлено гептозу, галактозу, глюкозу, арабінозу і манозу у різних співвідношеннях. Вміст глюкозаміну в ЛПС усіх штамів становить в середньому 29,4 мкг/мг.

Таблиця 4

Моносахаридний склад ЛПС штамів Е. carotovora subsp. carotovora

(% від загальної площі піків)

Моносахарид | Штам

1008T | 258 | 53П | 48П | 216 | 133

гептоза | 14,5 | 7,8 | 8,8 | 16,7 | 23,4 | 15,2

глюкоза | 28,7 | 8,7 | 10,3 | 22,7 | 28,7 | 30,0

галактоза | 20,1 | 17,7 | 2,9 | 14,6 | 16,5 | 26,9

маноза | 9,9 | 1,5 | 14,3 | 13,3 | 3,2 | 10,7

ксилоза | 1,9 | 1,4 | 1,0

арабіноза | 3,6 | 2,0 | 4,4 | 7,1 | 7,0 | 3,7

фукоза | 20,0 | 37,8 | 24,6

рамноза | 15,5 | 24,4 | 21,2 | 13,4

Х1 | 7,8 | 5,6

Х2 | 8,2 | 14.5

Х3 | 7,7

Примітки: "" відсутність моносахариду; Х1, Х2, Х3 неідентифіковані ліпофільні моносахариди з часом утримання меншим від рамнози

У складі ЛПС E. carotovora subsp. carotovora не виявлено уронових кислот, які входять до складу кору ЛПС E. amylovora, що вказує на істотну відмінність пектобактерій і справжніх ервіній.

На відміну від моносахаридного складу ліпополісахаридів E. carotovora subsp. carotovora, склад жирних кислот ліпідного компоненту біополімерів досліджуваних штамів є більш однорідним (табл. 5). Близько 80% усіх жирних кислот ЛПС шести штамів E. carotovora subsp. carotovora складають додеканова, 3-окситетрадеканова та гексадеканова кислоти. В жирнокислотному спектрі виявлено також тетрадеканову, гексадеценову, а в окремих штамів октадеканову й октадеценову кислоти, вміст яких значно зменшувався по мірі очищення ЛПС сумішшю хлороформ-метанол. Наявність цих жирних кислот, імовірніше, є наслідком недостатнього очищення ЛПС від інших мембранних ліпідів.

При збільшенні часу гідролізу ЛПС до 4 годин та метилюванні жирних кислот із використанням метанолу з 5% хлористого ацетилу відносна кількість 3-окситетрадеканової кислоти у спектрі ліпідного компоненту збільшується у два рази; вміст інших кислот змінюється незначним чином.

Таблиця 5

Склад* жирних кислот ЛПС штамів Е. carotovora subsp. carotovora

(% від загальної площі піків)

Жирні кислоти** | Штам

1008T | 258 | 53П | 48П | 216 | 133

С 12:0 | 43,0 | 45,2 | 32,1 | 34,1 | 46,6 | 47,0

С 13:0 | 1,6 | 1,6 | 2,0 | 0,5 | 0,3 | 0,2

С 14:0 | 6,4 | 6,2 | 7,5 | 7,8 | 5,5 | 5,8

С 3-ОН 14:0 | 23,4 | 27,9 | 29,9 | 25,9 | 28,2 | 27,7

С 16:1 | 10,7 | 5,7 | 6,8 | 7,3 | 4,3 | 7,5

С 16:0 | 14,9 | 11,3 | 17,4 | 18,8 | 15,1 | 11,8

С 18:1 | 2,1 | 2,7 | 5,6

С 18:0 | 1,6

Примітки: ; "" відсутність кислоти.* гідроліз 1 год в метанолі з 1,5% H2SO4. ** перша цифра число атомів вуглецю, друга число подвійних зв’язків.

Високий вміст додеканової (більше 50%) і гексадеканової та незначний вміст тетрадеканової (біля 10%) серед насичених жирних кислот ЛПС досліджуваних штамів Е. carotovora subsp. carotovora істотно відрізняє збудника м'якої гнилі рослин як від E. chrysanthemi й E. amylovora, так і від інших ентеробактерій (рис. 1, 2).

Рис.1. Вміст насичених жирних кислот в ЛПС штамів E.caratovora subsp. carotovora

При вирощуванні на твердих поживних середовищах, Е. carotovora синтезує високомолекулярний міжклітинний матрикс вуглеводневої природи (78-86% вуглеводів) із незначним домішком білка та ліпіду. Основним мономером полісахаридного компоненту його є галактоза (82-89%), у незначній кількості присутні й інші моносахариди.

Таким чином, на відміну від моносахаридного, жирнокислотний склад ЛПС E. carotovora subsp. carotovora більш однорідний і може служити додатковим тестом для характеристики цього підвиду. Одержані дані вказують на відокремлене положення типових пектобактерій всередині роду Erwinia і підтверджують правомірність виділення Е. carotovora в окремий рід Pectobacterium.

Рис.2. Вміст насичених жирних кислот у складі ліпіду А представників родини Enterobacteriaceae

6. Порівняльна характеристика ЛПС E. carotovora f. sp. zeae 1065 (8447) та E. aroideae 566 (8667)

Характеризуючись подібним складом клітинних моносахаридів, штами E. carotovora f.sp. zeae 1065 та E. aroideae 566 не відрізняються також якісним моносахаридним складом екстрагованих із них ЛПС, хоча спостерігаються деякі відмінності в кількісному співвідношенні моносахаридів (табл. 6). В ЛПС обидвох штамів переважають рамноза, глюкоза та галактоза. Гептоза, глюкоза та галактоза, як відомо, входять до складу кору ЛПС E. carotovora, а рамноза входить до складу О-антигену ЛПС і є імунодомінантним моносахаридом. Можна припустити, що ЛПС E. aroideae 566 має довші О-антигенні ланцюги, ніж E. carotovora f.sp. zeae 1065, оскільки вміст рамнози в ньому набагато перевищує вміст гептози. У складі ЛПС E. carotovora f.sp. zeae 1065 і E. aroideae 566 аміноцукри представлені глюкозаміном.

В ЛПС E. carotovora f.sp. zeae 1065, так само як E. aroideae 566, основними жирними кислотами є 3-окситетрадеканова, додеканова і гексадеканова, з переважанням додеканової над гексадекановою, що характерно для Е. carotovora, тоді як у ліпіді А E. chrysanthemi переважає тетрадеканова кислота, а додеканова не виявлена.

Таким чином, E. carotovora f. sp. zeae 1065 за жирнокислотним складом як клітин, так і ЛПС, є більш близьким до Е. carotovora, ніж до E. chrysanthemi. Хоча за моносахаридним складом ЕПС, до складу якого входить в основному арабіноза, E. carotovora f.sp. zeae 1065 відрізняється від Е. carotovora, основним мономером ЕПС якого є галактоза. E. aroideae 566 за характеристикою ліпідного компонента ЛПС подібний до Е. carotovora subsp. carotovora, що погоджується з його розміщенням у даному підвиді.

Таблиця 6

Моносахаридний склад ЛПС і ЕПС E. carotovora f.sp. zeae 1065 і E. aroideae 566

(% від загальної площі піків)

Моносахарид | Штам

1065 | 566

ЛПС | ЕПС | ЛПС | ЕПС

гептоза | 16,2 | 8,5

глюкоза | 26,3 | 12,7 | 17,5 | 6,8

галактоза | 21,7 | 13,3 | 82,2

арабіноза | 3,7 | 87,3 | 1,9 | 0,8

рамноза | 32,1 | 58,8 | 10,2

Примітка. “” – відсутність моносахариду

7. Порівняльне вивчення жирнокислотного складу ліпополісахаридів типових штамів підвидів E. carotovora

Порівняльне вивчення жирнокислотного складу ЛПС типових штамів чотирьох підвидів Е. carotovora показало подібність їх за цією ознакою (табл. 7). Основними жирними кислотами їх ЛПС є 3-окситетрадеканова, додеканова і гексадеканова.

Таблиця 7

Склад жирних кислот ЛПС типових штамів підвидів Е. carotovora

(% від загальної площі піків)

Жирні кислоти* | Е. carotovora subsp.

carotovora 1008Т | atroseptica 549Т | betavasculorum 4226Т | odorifera 1878Т

С 12 : 0 | 43,0 | 17,7 | 26,9 | 31,6

С 13 : 0 | 1,6 | 2,5 | 1,8 | 1,0

С 14 : 0 | 6,4 | 6,2 | 5,3 | 4,7

С 15 : 0 | 2,4 | 1,3

С 3-ОН 14 : 0 | 23,4 | 54,9 | 45,4 | 43,8

С 16 : 1 | 10,7 | 5,3 | 4,7 | 2,7

С 16 : 0 | 14,9 | 11,0 | 14,6 | 16,2

Примітки: * перша цифра число атомів вуглецю, друга число подвійних зв’язків;“” відсутність кислоти.

3-окситетрадеканова кислота є єдиною оксикислотою у складі ЛПС типових штамів чотирьох підвидів Е. carotovora. Відомо, що вона ацилює гідрофільну основу ліпіду А ентеробактерій. Серед жирних кислот, які в свою чергу ацилюють 3-окситетрадеканову кислоту, у досліджуваних штамів переважають додеканова і гексадеканова кислоти. Цим Е. carotovora відрізняється як від типового виду роду Erwinia E. amylovora, так і від типового представника родини Enterobacteriaceae E. coli, у спектрі жирних кислот ліпіду А яких однакове співвідношення додеканової і тетрадеканової кислот. За цією ознакою Е. carotovora відрізняється і від інших ентеробактерій, в ліпіді А яких переважає тетрадеканова кислота і є гексадеканова, яка нестехіометрично приєднується до 3-окситетрадеканової кислоти у положенні 2 GlcpN(3N)I. Високий вміст (більше 50%) додеканової кислоти серед насичених жирних кислот ЛПС Е. carotovora може слугувати також як тест для диференціації його від E. chrysanthemi, в ЛПС якого додеканову кислоту не виявлено.

8. Ліпополісахариди E. carotovora subsp. atroseptica 36А та його мутантів

Для визначення взаємозв’язку між вірулентністю, як функцією секреції пектолітичних ферментів, і хімічним складом ЛПС, було вивчено та співставлено моносахаридний і жирнокислотний склад ЛПС, екстрагованих із клітин вірулентного штаму 36А E. carotovora subsp. atroseptica та його мутантів, резистентних до налідіксової кислоти: вірулентного Nal 4 та авірулентного 544, який не виділяє целюлазу і пектатліазу.

Не виявлено відмінностей у якісному моносахаридному складі ЛПС досліджуваних штамів. ЛПС дикого штаму 36А E. сarotovora subsp. atroseptica та його мутантів, як вірулентного Nal 4, так і авірулентного 544, незначним чином відрізняються кількісним співвідношенням окремих моносахаридів. Так, у авірулентного мутанта 544, порівняно з вірулентними штамами, спостерігається нижчий вміст рамнози, що може свідчити про вкорочену довжину О-ланцюга, оскільки рамноза входить до складу О-ланцюга ЛПС E. сarotovora і є імунодомінантним моносахаридом. Основними моносахаридами у складі ЛПС досліджуваних штамів є глюкоза, гептоза, галактоза і рамноза. В мінорних кількостях виявлено манозу й арабінозу. Штам 36А, як і типовий 549Т E. сarotovora subsp. atroseptica, належить до ІІ-ї групи за складом клітинних моносахаридів. ЛПС обидвох штамів мають також однаковий набір моносахаридів. Однак на відміну від типового 549Т, штам 36А містить менше рамнози і гептози.

З аміноцукрів до складу ЛПС дикого штаму E. сarotovora subsp. atroseptica 36А та його мутантів Nal 4 та 544 входить D-глюкозамін (30,4; 26,3 та 24,7 мкг/мг ЛПС, відповідно), два -1,6-зв’язані залишки якого, як відомо, утворюють гідрофільну основу ліпіду А ентеробактерій.

За спектром жирних кислот ліпополісахариди дикого штаму E. сarotovora subsp. atroseptica 36А та його мутантів Nal 4 та 544 також не відрізняються. Спостерігаються незначні відмінності у кількісному співвідношенні деяких жирних кислот. Більше половини всіх жирних кислот у складі ЛПС як дикого штаму 36А E. сarotovora subsp. atroseptica, так і його мутантів, складає 3-окситетрадеканова кислота. Разом з тим, у складі ЛПС усіх досліджуваних штамів виявлено високий вміст додеканової кислоти, причому дещо вищий у вірулентного й авірулентного мутантів, порівняно з диким штамом. За спектром жирних кислот штам 36А виявився подібним до типового штаму 549Т E. сarotovora subsp. atroseptica.

Таким чином, втрата вірулентності у мутанта 544 в результаті порушення секреції пектолітичних ензимів, а також поява резистентності до налідіксової кислоти у мутантів Nal 4 та 544, не впливають на якісний моносахаридний і жирнокислотний склад їх ЛПС, проте спостерігаються незначні відмінності у кількісному співвідношенні окремих моносахаридів та жирних кислот у їх спектрі.

9. Вивчення ЛПС як адсорбційних рецепторів для макромолекулярних бактеріоцинів E. carotovora subsp. carotovora

Досліджувані штами E. carotovora subsp. carotovora істотно відрізняються між собою за бактеріоциночутливістю (табл. 8). Найчутливішими з них є три штами: 62А, 66А (використані як стандартні індикатори) і 53П. Один із штамів (216) не виявляє чутливості до жодного з використаних макромолекулярних бактеріоцинів. У наступних експериментах як модель обрано систему, що включає штам 48П, середній за бактеріоциночутливістю, і два бактеріоцини Еса13А та Еса42А з широким та середнім спектром літичної дії, відповідно.

Таблиця 8

Бактеріоциночутливість штамів E. carotovora subsp. carotovora

Бактеріоцин | Штам

62А | 66А | 53П | 258 | 48П | 133 | 8982Т | 216

Eca13A | + | + | + | + | +

Eca55A | + | + | + | + | +

Eca31A | + | + | + | + | +

Eca53A | + | + | + | +

Eca15A, Eca59A | + | + | +

EspZM-1 | + | + | +

Eca42A | + | + | +

Eca66A* | + | +

Ear24A, Eca7A | + | +

Eca48A | + | +

Eca J2 | +

Примітки: “+” лізис клітин, “” відсутність лізису. * аналогічна чутливість до бактеріоцинів Eca j13, Eca43A, Eca50A, Eca54A, Eca69A, Eca216.

З клітин штаму 48П E. carotovora subsp. carotovora нами було отримано ЛПС трьома способами: водно-фенольним методом, обробкою Na2EDTA з наступною очисткою ферментами і градієнтним центрифугуванням у CsCl, третій спосіб полягав у заміні градієнтного центрифугування обробкою фенолом. Спектрофотометричний аналіз ліпополісахаридів, отриманих трьома методами, показав відсутність істотних відмінностей між ними. У конкурентних експериментах з адсорбції активність проявляв тільки ЛПС, отриманий третім способом. Очевидно, методи екстрагування впливають на конформацію молекул ЛПС, що призводять до втрати їх дії на біологічні об’єкти.

Для доказу адсорбції макромолекулярних бактеріоцинів на ЛПС, в конкурентних дослідженнях вивчали зміну натурального логарифма виживання бактерій залежно від концентрації бактеріоцину в інкубаційній суміші з ЛПС-бактеріоцином. Натуральний логарифм виживання, залежно від концентрації бактеріоцину, істотно змінюється за наявності ЛПС в інкубаційних розчинах. LD37 за наявності ЛПС становить 14 од., тоді як без ЛПС її значення дорівнює 33 од. Таке істотне зменшення летальної дози свідчить про те, що ЛПС конкурує з нативними рецепторними структурами бактеріальної клітини за зв’язування макромолекулярних бактеріоцинів. Це однозначно вказує на те, що ЛПС є справжнім рецептором каротоворицинів.

Додаткове підтвердження властивості ЛПС як рецептора було отримано при вивченні швидкості адсорбції бактеріоцинів на нативних клітинах і ЛПС, при цьому оцінювали наявність незв'язаного бактеріоцину. Результати дослідження залежності LD37 від тривалості інкубації для вільних часток бактеріоцинів переконливо свідчать про те, що адсорбція на нативних клітинах є дуже швидкоплинним процесом. Вже за перші дві хвилини адсорбується основна кількість бактеріоцину, після чого (від 2 до 60 хв) спостерігається повільне насичення адсорбції.

Порівняння констант швидкостей адсорбції часток бактеріоцину на клітинах і на ЛПС показало, що швидкість адсорбції каротоворицину Еса 13А на клітинах E. carotovora subsp. carotovora 48П перевищує таку на ЛПС більш ніж у 200 разів. Отже, очищені молекули ЛПС є менш ефективними рецепторами макромолекулярних каротоворицинів, порівняно з молекулами ЛПС у складі клітинної оболонки. Ймовірно, у зовнішній клітинній мембрані молекули ЛПС знаходяться в особливій структурній конформації, яка залежить від найближчого оточення іншими компонентами.

Висока штамоспецифічність багатьох макромолекулярних бактеріоцинів E. carotovora subsp. carotovora опосередковано вказує на те, що в процесах рецепції може бути задіяним О-ланцюг ЛПС. Для виявлення моносахаридів, які входять у рецепторні сайти каротоворицинів, було проаналізовано залежність бактеріоциночутливості (% кількості бактеріоцинів, які лізують даний штам) шести штамів E. carotovora subsp. carotovora від якісного і кількісного вмісту моносахаридів ЛПС.

Як видно з табл. 9, п'ять моносахаридів (фукоза, маноза, ксилоза та два ліпофільних моносахариди Х1 і Х2),