АКАДЕМІЯ МЕДИЧНИХ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ ФАРМАКОЛОГІЇ ТА ТОКСИКОЛОГІЇ

МИСЛИВЕЦЬ Світлана Онисимівна

УДК 615.856; 616-089.811

СТВОРЕННЯ КОМПОЗИЦІЇ

КООРДИНАЦІЙНИХ СПОЛУК БІОМЕТАЛІВ

І ВІТАМІНІВ ГРУПИ В ТА ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНЕ

ОБГРУНТУВАННЯ ЇЇ ЗАСТОСУВАННЯ ДЛЯ

ПІДВИЩЕННЯ РЕЗИСТЕНТНОСТІ ОРГАНІЗМУ

14.03.05 – фармакологія

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Київ -2002

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Інституті фармакології та токсикології АМН України.

Наукові керівники:

доктор хімічних наук Григор'єва Ганна Савівна, Інститут фармакології та токсикології АМН України, головний науковий співробітник відділу експериментальної терапії;

доктор медичних наук, професор Мохорт Микола Антонович, Інститут фармакології та токсикології АМН України, завідувач відділу фармакології серцево-судинних засобів.

Офіційні опоненти:

доктор біологічних наук Коваленко Валентина Миколаївна, Інститут фармакології та токсикології АМН України, завідувач відділу загальної токсикології;

доктор медичних наук Купраш Ліана Петрівна, Інститут геронтології АМН України, керівник групи експериментальної фармакології.

Провідна установа

Національний медичний університет ім. О.О. Богомольця, кафедра фармакології, МОЗ України, м. Київ.

Захист відбудеться 16.10.2002 р. о 15 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.550.01 при Інституті фармакології та токсикології АМН України за адресою: 02057, м. Київ, вул. Ежена Потьє, 14.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту фармакології та токсикології АМН України за адресою: 03057, м. Київ, вул. Ежена Потьє, 14.

Автореферат розісланий 31.07.2002 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради

кандидат біологічних наук ДАНОВА І.В.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. У сучасному фармакотерапевтичному арсеналі значне місце зайняли композиційні вітамінно-мікроелементні засоби, показанням до медичного застосування яких, поруч із профілактикою сезонних або екологічних гіповітамінозів і дефіциту мінеральних сполук, є підвищення резистентності організму (М.Д. Машковський, 1997; В.О. Тутел'ян, 2001; С.О. Щербак, 2001). Ці препарати здатні не лише позитивно впливати на життєдіяльність хворої людини, але і покращувати якість життя здорової популяції за впливу несприятливих факторів (Е.Є. Олексієнко, 2000; H. Kolb, 1999).

З фізико-хімічних позицій абсолютну більшість металовміщуючих препаратів представляють виключно іонні форми металів. Для них притаманні низька біодоступність in vivo (не більше 20% введеного металу), прооксидантний вплив, висока токсичність і можливість кумуляції (Е.Е. Крисс, 1986). Саме ці негативні властивості свого часу обумовили неоднозначне сприйняття перспектив застосування сполук металів як засобів фармакотерапії.

В якості реальної альтернативи іонним сполукам запропоновані синтетичні комплекси біометалів з органічними лігандами, утворення яких призводить до оптимізації, синергізму і розширення діапазону фармакологічних ефектів обох складових. Такі комплекси характеризуються оптимальною термодинамічною стабільністю при фізіологічних значеннях рН і ліпідорозчинністю, на молекулярному рівні проявляють ферментімітуючу активність у каталазних і оксидазних реакціях, виступають як антиоксиданти у вільно-радикальних процесах (Г.С. Григор'єва, 2001). Найбільш плідних наслідків впливу на важливі ланки гомеостазу слід очікувати при застосуванні систем, які містять координаційні сполуки різних металів (О.В. Скальний, 2000).

На підтвердження цієї концепції створено оригінальну композицію вітамінів групи В (В1, В2, В3, В5, В6) і мікроелементів (Fe, Zn, Cu, Mn, Co, Cr), в якій останні знаходяться у складі комплексів із N-2,3-диметилфенілантраніловою кислотою. Природа і мольне співвідношення мікроелементів, які входять до композиції, відповідають їх складу у металовміщуючих ферментах. Ці мікроелементи необхідні для реалізації метаболізму вітамінів групи В, які беруть участь в регуляції вуглеводного, жирового, білкового та енергетичного обмінів, функцій ендокринних залоз та в обміні катехоламінів (Т.Т. Березов, 1990; О.В. Кудрін, 2000).

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційну роботу виконано в рамках планової науково-дослідної роботи відділів фармакології серцево-судинних засобів та експериментальної терапії Інституту фармакології і токсикології АМН України на тему "Дослідження ролі координаційних сполук мікроелементів з амінокарбоновими кислотами в корекції патологічних змін організму, обумовлених стресом" (№ державної реєстрації 0196U003205).

Мета роботи і завдання дослідження. Створити та дослідити фармакологічну активність оригінальної композиції вітамінів групи В і координаційних сполук мікроелементів, експериментально обгрунтувати доцільність клінічного застосування нового лікарського засобу для підвищення резистентності організму.

Відповідно до поставленої мети завданнями дослідження були:

1. Створення композиції вітамінів групи В і координаційних сполук біометалів з N-2,3-диметилфенілантраніловою кислотою та її фізико-хімічна ідентифікація.

2. Оцінка гострої токсичності композиції на безпородних собаках, білих мишах і щурах.

3. Вивчення специфічної активності композиції вітамінів групи В і комплексів мікроелементів з N-2,3-диметилфенілантраніловою кислотою при іммобілізаційному стресі.

4. Оцінка актопротекторної активності композиції вітамінів групи В і комплексів мікроелементів з N-2,3-диметилфенілантраніловою кислотою в умовах динамічних і статичних фізичних навантажень.

5. Вивчення геріатричних особливостей фармакодинаміки досліджуваної композиції.

6. Дослідження нешкідливості композиції вітамінів групи В і координаційних сполук біометалів з N-2,3-диметилфенілантраніловою кислотою при тривалому введенні.

7. Обгрунтування можливості клінічного застосування нового мікроелементно-вітамінного препарату Вітам.

Об'єкт дослідження – нова композиція координаційних сполук біометалів і вітамінів групи В, відомий мікроелементно-вітамінний препарат Юнікап – М, білі миші, щури та безпородні собаки.

Предмет дослідження – фармакологічна активність нової композиції на моделях іммобілізаційного стресу, динамічних та статичних навантажень.

Методи дослідження – хімічні, токсикологічні, фізіологічні, біохімічні, патоморфологічні та статичні методи досліджень.

Наукова новизна одержаних результатів. В результаті проведення фізико-хімічних і фармакологічних досліджень вперше обгрунтовано можливість створення композиційного засобу, який містить вітаміни групи В і шість мікроелементів у формі координаційних сполук.

Висвітлено основні фармакологічні та токсикологічні властивості мікроелементно-вітамінної композиції і встановлено переваги її активності щодо підвищення резистентності організму до посилених навантажень та стресів у порівнянні із мікроелементно-вітамінним препаратом Юнікап-М, який містить іонні форми біометалів.

Експериментально обгрунтовано перспективність застосування створеної композиції як геропротектора, здатного стимулювати метаболічні процеси і підтримувати активний спосіб життя людей похилого і старечого віку.

Практичне значення одержаних результатів. Практична цінність роботи визначається створенням нового комбінованого вітамінно-мікроелементного препарату Вітам та експериментальним обгрунтуванням його застосування у медичній практиці.

Особистий внесок здобувача. Автором особисто проведено патентно-інформаційний пошук, аналіз даних літератури за темою дисертації, опрацьовано моделі, згідно з якими особисто виконано експериментальні дослідження, здійснено статистичну обробку одержаних даних та оформлення їх у вигляді графіків і таблиць. Проаналізовано результати досліджень, сформульовано висновки роботи, опубліковано основні положення дисертації.

Створення і фізико-хімічна ідентифікація композиції здійснені при консультативній допомозі к.х.н. Н.Ф. Конахович; аналіз впливу композиції на картину морфологічного складу крові проведено при консультативній допомозі к.б.н. Т.С. Клеменцевої; дослідження впливу композиції на морфологічну структуру внутрішніх органів проведено при консультативній допомозі к.м.н. О.А. Писарева, за що дисертант їм щиро вдячний.

Апробація результатів роботи. Результати роботи були представлені і доповідались на щорічних наукових конференціях Інституту фармакології та токсикології (1996-2000), на III Національному Конгресі геронтологів і геріатрів України (Київ, 2000), III Національному Конгресі ревматологів України (Дніпропетровськ, 2001), на Всеукраїнській науково-практичній конференції “Вчені України – вітчизняній фармації” (Харків, 2000) та на 2-й науково-практичній конференції із міжнародною участю “Прискорене старіння та шляхи його профілактики” (Одеса, 2001).

Публікації. За темою дисертації опубліковано 7 робіт, з них 3 – у наукових фахових журналах, 1 – у збірнику наукових праць, рекомендованих ВАК України, 3 – в збірниках матеріалів конгресів та конференцій, в тому числі із міжнародною участю.

Обсяг та структура дисертації. Дисертація викладена на 187 сторінках машинописного тексту і складається із вступу, огляду літератури, опису матеріалів та методів дослідження, 6-х розділів власних досліджень, аналізу та узагальнення результатів дослідження, висновків, списку використаних джерел. Роботу ілюстровано 33 таблицями та 17 рисунками. Бібліографія містить 246 джерел, з яких 188 вітчизняних та 58 іноземних авторів.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріали та методи досліджень. Об'єктом експериментальних досліджень була нова мікроелементно-вітамінна композиція (КМВ), розроблена в Інституті фармакології та токсикології АМН України, яка містить комплекси шести мікроелементів (Fe, Zn, Mn, Cu, Co, Cr) з

N-2,3-диметилфенілантраніловою кислотою (HL) і вітаміни групи В (тіамін – В1, рибофлавін – В2, нікотинамід – В3, кальцію пантотенат – В5, піридоксин – В6). Другим об'єктом дослідження був препарат порівняння – відомий мікроелементно-вітамінний препарат Юнікап-М (Pharmacia & Upjohn, США).

Фізико-хімічну ідентифікацію КМВ проведено методами рідинної хроматографії (вітаміни), атомно-адсорбційної (мікроелементи) та електронної спектроскопії (ліганд).

Експерименти проводили на статевозрілих білих мишах і щурах, собаках обох статей з масою тіла відповідно 18-28 г, 150-250 г, 10-15 кг, а також на старих щурах (вік – 16-28 місяців) масою тіла 350-500 г. Тварини знаходилися на звичайному харчовому раціоні віварію із вільним доступом до води.

Гостру токсичність визначали за методом В.Б. Прозоровського та співавт. (1978). Досліджувані речовини вводили внутрішньошлунково зондом у вигляді зависі в 2% крохмальному клейстері.

Для вивчення антистресорних властивостей КМВ використана методика іммобілізаційного стресу (П.Д. Горизонтов, 1983).

При вивченні біохімічного статусу організму та визначенні стану окремих органів застосовано наступні методи дослідження: кількість моноамінів визначали методом спектрофлюометрії (S. Reitman, 1957), глікогену – за методом Монтгомері, молочної кислоти по реакції з параоксидифенілом (В.В. Меншиков, 1987), сечовини і показників обміну азоту (азот сечовини та залишковий азот) – спектрофотометрично за допомогою біотестів “Лахема” ( C.L. Crocker, 1967; P. Breinek, 1970). Оцінку киснево-лужної рівноваги крові тварин здійснено за методом Ван-Слайка (1976). Показники периферичної крові визначали стандартними методами (М.А. Базарнова та співавт., 1982), морфологічний склад підраховували в пофарбованих за Гімза–Романовським мазках крові.

Проводили патоморфологічні та мікроскопічні дослідження тканин, оцінювали зовнішній стан та гістологічну будову органів і тканин за загальновизнаними методами (фіксація матеріалу в 10% нейтральному формаліні, парафінові та заморожені зрізи, фарбування гематоксиліном-еозином, суданом чорним – на жир, за Перлсом – на залізо, а також – за Слінченком (Е.С. Кирпічников та співавт., 1962).

Детоксикуючу активність печінки визначали за гексеналовою пробою (О.Н. Єлізарова та співавт., 1974). Функцію зовнішнього дихання досліджували, визначаючи частоту дихання (І.П. Западнюк та співавт., 1983). Досліджували вплив композиції на діяльність серця та стан гемодинаміки (М.А. Мохорт та співавт., 1999).

При вивченні впливу КМВ на фізичну працездатність в умовах динамічних навантажень використовували плавальну пробу (Ю.Г. Бобков та співавт., 1984), в умовах статичних навантажень – за методикою утримування тварин на жердині (С.Я. Арбузов та співавт., 1970). Зміни працездатності при навантаженні плаванням вивчали на статевозрілих білих щурах обох статей. Препарати КМВ і Юнікап-М вводили протягом 30 діб профілактично в дозах 26 мг/кг/добу і 22,5 мг/кг/добу відповідно. Тварини підлягали 4-кратному навантаженню з 15-хвилинним відпочинком перед кожним наступним запливом. У стресованих тварин проводили однократне навантаження плаванням безпосередньо після іммобілізації.

Статистичну обробку отриманих результатів проводили з використанням ступеня вірогідності за t-критерієм Ст'юдента (О.П. Минцер і співавт., 1991).

Результати досліджень та їх обговорення. За результатами фізико-хімічної ідентифікації створено композицію, що містить суму мікроелементів (Fe, Zn, Mn, Cu, Co, Cr) у вигляді комплексів з N-2,3-диметилфенілантраніловою кислотою (MLn) із мольним співвідношенням 50:50:15:10:1:1 та вітаміни групи В (В1, В2, В3, В5, В6). Склад композиції відповідає масовому співвідношенню металів, обгрунтованому аналітичними даними щодо балансу ендогенних d-металів в організмі (О.П. Авцин і співавт., 1991; О.В. Скальний і співавт., 2000) та їхньому вмісту в композиційних лікарських засобах, активними компонентами яких є мікроелементи і вітаміни (М.Д. Машковський, 1997). Створена КМВ має відмінну особливість, а саме – знижений вміст заліза в порівнянні з чисельними металовміщуючими препаратами. Методично процес одержання композиції комплексів мікроелементів і вітамінів передбачав поєднання стадій “одномоментного” синтезу композиції комплексів мікроелементів із подальшим її об'єднанням з окремими вітамінними інгредієнтами. Доведено фізико-хімічну стабільність КМВ, яка проявляється у відсутності міжкомпонентних взаємодій і руйнуючого впливу сполук металів на нативну структуру вітамінних інгредієнтів.

Це стало підгрунтям для подальшого дослідження фармакологічних ефектів КМВ з метою підтвердження та розширення уявлень про її властивості як засобу для підвищення резистентності організму в умовах впливу різних подразнювачів і підсилених навантажень.

Для виявлення можливих антагоністичних чи синергічних наслідків дії мікроелементів у складі композиції дослідження токсичності здійснено в порівняльному аспекті із індивідуальними комплексами та деякими простими солями вибраних металів. Важливим наслідком створення композиції вітамінів із мікроелементами у формі комплексних сполук є зменшення токсичності у порівнянні із окремими інгредієнтами. При цьому підтверджено, що токсичність комплексів металів суттєво менша, ніж у іонних сполук тих же мікроелементів (табл. 1).

Цей ефект є найбільш вираженим для сполук цинку: ЛД50 для солянокислої солі цього металу складає 6,5 мг/кг, для комплексу ZnL2 – 1290 мг/кг, а для Fe при переході від солі до комплексу ЛД50 збільшується у 3 рази.

У результаті визначення токсикологічних параметрів при внутрішньошлунковому введенні за показником ЛД50 (3420 мг/кг для мишей; 3250 мг/кг для білих щурів; > 5000 мг/кг для безпородних собак) та інтенсивністю клінічних симптомів створену композицію можна кваліфікувати як фармакологічний засіб IV класу токсичності, тобто як малотоксичну речовину (К.К. Сидоров, 1973).

Результати дослідження гострої токсичності на старих щурах обох статей віком 22-28 місяців показали, що середньосмертельна доза становить 3150-3300 мг/кг, тобто не відрізняється від таких у молодих і статевозрілих тварин і не залежить від віку тварин.

Для дослідження специфічної дії створеної композиції щодо корекції наслідків стресу залучено модель іммобілізаційного стресу. Фармакологічна активність вивчалась на білих щурах у порівняльному аспекті з вітамінно-мікроелементним препаратом Юнікап-М.

Таблиця 1

Показники гострої токсичності КМВ, індивідуальних

комплексів та простих солей мікроелементів

(щури, внутрішньошлункове введення)

Об'єкт дослідження ЛД50, мг/кг

Цинк хлористий 6,50 (4,38 – 8,86)

Cu2+, Co2+, Mn2+, Cr3+ (хлориди) 10 – 260

Залізо хлористе (III) 470 (139,4 – 965,6)

Мефенамінова кислота (HLn) 520,0 (419,3 – 644,8)

Комплекс ZnL2 . H2O 1290 (840 – 1740)

Комплекс FeL3 . H2O 1410 (914 – 2094)

Комплекс CuL2 . H2O 740 (487 – 997)

Комплекс CoL2 . H2O 564 (490 – 640)

Комплекс MnL2 . H2O 1630 (1087 – 2810)

Комплекс CrL2 . H2O 1290 (842 – 1786)

КМВ 3250 (2188 – 4548)

Результати досліджень показали, що у групі іммобілізованих тварин, яким не вводили досліджувані препарати, спостерігаються суттєві наслідки стресу. Так, кількість і діаметр виразок слизової оболонки шлунка були в шість разів більшими, порівняно з групою інтактних тварин (контроль). При цьому реєструється напруження адреналової системи (маса надниркових залоз збільшується в 1,6 рази) та інволюція лімфоїдних органів – маса селезінки і тимуса знижується майже у два рази. Це свідчить про адекватність залученої моделі стресу для дослідження антистресорної дії досліджуваної композиції (рис. 1).

Рис. 1. Вплив КМВ на ерозійність слизової оболонки шлунка, стан стрес-компетентних внутрішніх органів після іммобілізації у щурів

(* – Р<0,05 по відношенню до групи тварин після іммобілізації).

Профілактичне введення досліджуваного засобу в дозі 26 мг/кг/доба (з розрахунку на добову потребу організму у мікроелементах і вітамінах) протягом 30 днів значно зменшує прояви стрес-реакції і в цьому плані суттєво переважає препарат порівняння Юнікап-М (доза

22,5 мг/кг/добу) (рис. 1). Внаслідок профілактичного введення КМВ у піддослідних тварин, в порівнянні з нелікованими, майже в 4 рази зменшується кількість ерозій слизової оболонки шлунка, в 1,4 рази знижується маса наднирників і одночасно зростає маса лімфоїдних органів. Юнікап-М за всіма показниками поступається КМВ.

Таким чином, КМВ активує механізми адаптації до надзвичайних факторів, що сприяє зниженню інтенсивності класичних наслідків стрес-реакції: ерозії слизової оболонки шлунка, напруження адреналової системи і лімфоїдних органів, що підтверджено і проведеними морфологічними дослідженнями.

Стан гострого напруження при відсутності адаптації до нього або тривале інтенсивне напруження змінюють функціональну активність печінки (А.Ф. Блюгер, 1984; В.О. Шкурупій, 1989). При цьому втрачається печінковий фонд глікогену, порушується синтез білків і метаболізм азоту, пригнічується екскреторна функція, знижується детоксикуюча активність органу. Введення КМВ на тлі іммобілізаційного стресу приводило до підвищення печінкового фонду глікогену (на 16,6%, p<0,05) і зниження рівня глікогену в крові (на 37,7%, p<0,05) (табл. 2). Це говорить про позитивний вплив КМВ на метаболізм глікогену в організмі та попередження надмірних витрат вуглеводів.

Таблиця 2

Вплив КМВ на біохімічні показники та детоксикуючу

функцію печінки тварин на фоні іммобілізації

Показники Контроль Іммобілізація Іммобілізація + КМВ Іммобілізація + Юнікап

Вміст катехоламінів в крові, мкг/мл

Норадреналін 0,12 + 0,01 0,30 + 0,01* 0,19 + 0,01 *, ** 0,20 + 0,01*, **

Адреналін 0,37 + 0,01 0,56 + 0,03 * 0,41 + 0,02 ** 0,46 + 0,02 *,**

Дофамін 0,11 + 0,01 0,24 + 0,01 * 0,17 + 0,01 *, ** 0,19 + 0,01*, **

Вміст глікогену, мг%

В крові 17,5 + 1,9 38,7 + 2,9 * 28,1 + 3,5 *, ** 27,7 + 4,1*

В печінці 2494 + 86 1747 + 57 * 2037 + 57 *, ** 1972 + 33 *, **

Азот

Сечовини в крові, мМ/л 2,15 + 0,08 4,90 + 0,40 * 3,30 + 0,57 *, ** 3,80 + 0,42*

Залишковий в крові,мг/100 мл 23,84 + 1,29 41,55 + 1,72 * 31,28 + 3,83 *, ** 31,41 + 4,02 *

Амінотрансферази, ммоль/(год ґ г) в печінці

АлАт 128,9 + 5,7 198,9 + 3,9 * 153,3 + 7,7 *, ** 159,6 + 7,1*, **

АсАт 51,2 + 1,0 84,2 + 3,2 * 66,7 + 2,9 *, ** 66,2 + 2,9 *, **

Детоксикуюча функція печінки

Тривалість гексеналового сну, хв 24,8 + 1,0 33,7 + 0,8 * 23,6 + 0,5 ** 25,6 + 0,7 **

Примітки: 1. * – P<0,05 по відношенню до контролю.

2.** – P<0,05 по відношенню до групи тварин після іммобілізації.

При іммобілізації також встановлене достовірне підвищення рівня аланінамінотрансферази і аспартатамінотрансферази, але введення КМВ вірогідно знижує ці показники в порівнянні з стресованими тваринами (на 30%) (табл. 2). Важливо відзначити, що корекція досліджуваною композицією пост-стресорних порушень рівня трансаміназ не супроводжується органічними змінами печінки. Про це свідчить відносна стабільність коефіцієнту де Рітіса в різні терміни спостереження. На фоні введення КМВ не порушується детоксикуюча функція печінки (табл. 2).

Внаслідок стресу значно змінюється білковий обмін із кінцевим порушенням вмісту азотовміщуючих метаболітів та азотистого балансу (табл. 2). КМВ справляє позитивну дію на ці процеси: концентрація сечовини в крові при введенні КМВ знижувалась на 48,5%; показники залишкового азоту – на 32, 9% порівняно із стрес-контролем.

Дія КМВ при іммобілізаційному стресі проявилася також у нормалізації морфологічного статусу периферичної крові (табл. 3). Встановлене зменшення сегментоядерної нейтрофілії більш, ніж у 2 рази, та збереження кількості паличкоядерних нейтрофілів на фізіологічному рівні попередило коливання вмісту лейкоцитів протягом всього терміну спостереження після іммобілізації. КМВ достовірно зменшує лімфопенію (до 40% підвищення при стресі, максимум – 17% на тлі введення КМВ) і запобігає дефіциту еозинофілів та моноцитів, а також змінам агрегації тромбоцитів. Ефекти КМВ щодо системи крові, як одного з найбільш чутливих об'єктів стресорних уражень (П.Д. Горизонтов та інші, 1983), відбивають її гематокомпетентну роль в процесах підвищення резистентності організму.

Таблиця 3

Вплив КМВ на показники периферичної крові на фоні

іммобілізаційного стресу (n=6)

Показники Контроль Іммобілізація Іммобілізація + КМВ Іммобілізація + Юнікап

Лейкоцити, 1.109/л 9,6 + 0,4 14,5 + 0,5 * 9,8 + 0,5 ** 13,4 + 0,01*

Паличкоядерні нейтрофіли, 1 . 109/л 0,10 + 0,001 0,15 + 0,001* 0,10 + 0,001** 0,12 + 0,001**

Сегментоядерні нейтрофіли, 1 . 109/л 2,9 + 0,1 9,9 + 0,4 * 4,0 + 0,2 ** 9,0 + 0,3 *

Еозинофіли, 1 . 109/л 0,15 + 0,002 0* 0,10 + 0,002 ** 0*

Моноцити, 1 . 109/л 0,47 + 0,02 0,23 + 0,02* 0,42 + 0,02 ** 0,23 + 0,02 *

Лімфоцити, 1 . 109/л 6,0 + 0,4 4,0 + 0,2 * 5,2 + 0,2 ** 4,0 + 0,2 *

Тромбоцити, 1 . 109/л 480,0 + 18,0 400,0 + 30,0 500,0 + 23,0 ** 420,0 + 28,0

Примітки:

1. * – P<0,05 по відношенню до контролю.

2. ** – P<0,05 по відношенню до групи тварин після іммобілізації.

Введення КМВ, на відміну від Юнікапу-М, нівелювало прояви пост-іммобілізаційної гістохімічної реакції міокарду на іони заліза, яка проявляється у вигляді контрактурних ушкоджень внаслідок детермінованого стресом адренергічного ефекту (Ф.З. Меєрсон, 1981).

Позитивний вплив композиції виявлений у підвищенні резистентності організму до фізичних навантажень (динамічні – плавання; статичні – висіння на жердині), поєднаних із стресом. Адаптогенна активність КМВ проявилася у 1,8-2,3 кратному підвищенні працездатності при повторних навантаженнях тварин плаванням і вірогідно перевищила таку для Юнікап-М в 1,8; 1,6 і 1,9 рази при 2-му,

3-му і 4-му навантаженні відповідно (рис. 2).

В умовах стресу адаптогенна активність композиції виявилася в 2,1-кратному подовженні тривалості плавання стресованих тварин, що в 1,5 рази перевищує ефект препарату порівняння (рис. 2). В умовах статичних навантажень профілактичне введення КМВ супроводжується підвищенням працездатності тварин на 60%.

Рис. 2. Вплив КМВ на працездатність тварин (щури).

Примітки: 1. 1-4 – тривалість плавання при повторних навантаженнях.

2. 5 – тривалість плавання після іммобілізації.

3. * – P<0,05 по відношенню до групи інтактних тварин.

Доцільність оцінки геріатричних особливостей КМВ обумовлена підвищеними потребами старого організму у вітамінах і мікроелементах при віковому зниженні адаптаційних можливостей і активації патологічних процесів при старінні (В.В. Фролькіс, 1995).

КМВ затримує вікову інволюцію органів (збільшення ваги головного мозку, сім'яників, печінки на – 44,4%, 40,5%, 28,1% відповідно) (рис. 3).

Рис. 3. Вплив КМВ на вікові зміни масових коефіцієнтів

внутрішніх органів щурів.

Примітка. * – P<0,05 по відношенню до групи старих щурів.

Період старіння характеризується зниженням детоксикуючої функції печінки, яке проявляється в прискоренні засинання та збільшенні тривалості гексеналового сну. При курсовому введенні КМВ спостерігається віддалення початку (в 1,3 рази) та суттєве зниження тривалості гексеналового сну (у 2,3 рази, p<0,05) порівняно з тваринами контрольної групи. Це свідчить про здатність КМВ прискорювати метаболізм гексеналу в організмі старих тварин за рахунок підвищення активності мікросомальних ферментів печінки.

Експериментально встановленим геріатричним особливостям впливу КМВ на стан органів і систем організму відповідають і результати дослідження її впливу на поступове зниження працездатності тварин у процесі старіння (рис. 4).

Проведені дослідження показали, що здатність тварин виконувати як динамічну (плавання), так і статичну (утримання на вертикальній жердині) роботу з віком різко знижується. Так, якщо тварини віком 10-13 місяців спроможні плавати з навантаженням 20% від маси тіла 570,0 ± 47,5 с (n=50), то у віці 28 місяців лише 133,0 ± 14,5 с, тобто у 4,3 рази менше. При профілактичному курсовому введенні КМВ підвищується здатність виконувати динамічну роботу: після першого курсу введення КМВ – у 1,2 рази, після другого та третього курсів введення препарату – у 1,6 рази (рис. 4).

Рис. 4. Вплив КМВ на працездатність щурів в процесі старіння.

Примітки: 1. А – тривалість плавання.

2. Б – тривалість утримання на жердині.

3. * – P<0,05 по відношенню до групи інтактних тварин.

Введення КМВ старим щурам сприяє достовірному зростанню працездатності уже після другого курсу лікування: у віці 22 місяців тривалість утримання на жердині в контрольній групі – 125,2 ± 12,9 с, а в групі тварин, які отримували КМВ – 183,7 ± 11,5 с; у віці 25 місяців – 89,2 ± 7,2 с і 129,3 ± 6,8 с відповідно; у віці 28 місяців 82,3 ± 8,07 с, і – 108,4 ± 9,3 с відповідно (рис. 4).

Одержані результати обумовлюють перспективність застосування мікроелементно-вітамінної композиції як геропротектора, здатного стимулювати метаболічні процеси в організмі і сприяти подовженню працездатності у похилому і старечому віці.

Проведені дослідження нешкідливості КМВ в хронічному експерименті протягом 6 місяців свідчать про практичну нешкідливість препарату. Введення КМВ в дозах 26 мг/кг і 130 мг/кг не зумовило змін загального стану тварин, показників периферичної крові, дихання і функцій печінки, стану серцево-судинної, центральної нервової і видільної систем, морфологічних характеристик внутрішніх органів.

Внаслідок проведеного дослідження доведено, що нова вітамінно-мікроелементна композиція виявляє позитивну фармакологічну активність щодо стану стрес-компетентних органів, динаміки біохімічних, морфологічних і гемопоетичних показників організму при іммобілізації і має переваги перед препаратом порівняння Юнікап-М, який містить іонні сполуки мікроелементів.

Узагальнення результатів фізико-хімічної ідентифікації, досліджень специфічної активності, нешкідливості і встановлений діапазон фармакологічних ефектів КМВ обгрунтували перспективність клінічного застосування даної композиції як лікарського засобу Вітам. Проведені клінічні дослідження підтвердили фармакотерапевтичні переваги Вітаму, який містить координаційні сполуки мікроелементів, порівняно з препаратом Юнікап-М. Отримано дозвіл на медичне застосування Вітаму при дефіциті вітамінів групи В і мікроелементів, підвищеній потребі організму у вітамінах та мінеральних сполуках за умов збільшення фізичних навантажень і стресів, при зниженій працездатності, у супутній терапії при комплексному лікуванні тривалих і/або з тяжким перебігом захворювань та у період реконвалесценції (реєстраційне свідоцтво Р.07.00/01968 від 12.07.00 р.).

ВИСНОВКИ

1. Запропоновано склад і створено нову вітамінно-мікроелементну композицію, яка містить комплекси шести мікроелементів (Fe, Zn, Cu, Co, Cr) з N-2,3-диметилфенілантраніловою кислотою із мольним співвідношенням 50:50:15:10:1:1 і вітаміни групи В (тіамін – В1, рибофлавін – В2, нікотинамід – В3, кальцію пантотенат – В5, піридоксин – В6). На підставі фізико-хімічних досліджень доведено індивідуальність вітамінно-мікроелементної композиції та стабільність її складу.

2. Вітамінно-мікроелементна композиція за показником ЛД50 (3250-5000 мг/кг) при введенні білим мишам, щурам, собакам внутрішньошлунково та проявами клінічних симптомів отруєння належить до IV класу токсичності, тобто до малотоксичних речовин.

3. В умовах експериментального нервово-м'язового стресу фармакологічний ефект композиції мікроелементів і вітамінів проявляється у запобіганні гіпертрофії наднирників (до 30%, p<0,05), інволюції тимуса (на 67%, p<0,05) і селезінки (на 63%, p<0,05), ульцерації слизової оболонки шлунка (у 3,9 рази), а також у нормалізації показників функції печінки, вуглеводного та азотного обміну, морфологічного статусу периферичної крові і покращенні інтегральних показників стану тварин.

4. Профілактичне введення вітамінно-мікроелементної композиції білим щурам в дозі 26 мг/кг на протязі 30 діб один раз на добу підвищує адаптивні властивості організму до багаторазових статичних та динамічних навантажень, підвищуючи працездатність тварин в 1,8-2,3 рази (p<0,05).

5. Вітамінно-мікроелементна композиція підвищує працездатність старих тварин (в 1,2-1,4 рази) в умовах статичних і динамічних навантажень, рівень детоксикуючої функції печінки (в 1,3-2,3 рази, p<0,05), гемоглобіну (на 11%) і еритроцитів (на 15,3%). Профілактичне введення вітамінно-мікроелементної композиції старим тваринам сприяє стабілізації маси тіла, попереджує гіперплазію жирової тканини, протидіє віковій інволюції органів і подовжує працездатний вік.

6. За ступенем підвищення резистентності організму до дії стресорних факторів і фізичних навантажень композиція мікроелементів і вітамінів в 1,5-1,9 рази переважає препарат порівняння Юнікап-М, який містить мікроелементи у вигляді простих солей.

7. Повторне введення вітамінно-мікроелементної композиції тваринам (собаки та щури) внутрішньошлунково у дозах 26 мг/кг та 130 мг/кг в хронічному експерименті протягом 6 місяців не спричиняє негативного впливу на загальний стан тварин, не змінює показники периферичної крові, функцій печінки, стану серцево-судинної, центральної нервової, дихальної і видільної систем, а також морфологічні характеристики внутрішніх органів.

8. Результати експериментального доклінічного дослідження композиції мікроелементів і вітамінів використано для обгрунтування її клінічного застосування, розробки аналітично-нормативної документації та Інструкції для медичного застосування на новий препарат Вітам.

ПРАКТИЧНІ РЕКОМЕНДАЦІЇ

1. Вітам рекомендується призначати при підвищеній потребі організму у вітамінах і мінеральних сполуках за умов підсилених фізичних навантажень і стресів, при зниженій працездатності, в сукупній терапії при комплексному лікуванні тривалих і/або важко протікаючих захворювань та в період реконвалесценції.

2. Рекомендується застосування Вітаму як геропротектора, здатного стимулювати метаболічні процеси і підтримувати активний спосіб життя людей похилого і старечого віку.

СПИСОК РОБІТ, ОПУБЛІКОВАНИХ

ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Григор'єва Г.С., Киричок Л.М., Конахович Н.Ф., Мисли-

вець С.О. Мохорт М.А. Комплексоутворення як спосіб підвищення нешкідливості сполук мікроелементів // Современные проблемы токсикологии. - 1998. - №1. - С. 21-23 (дисертантом виконано набір і обробку експериментального матеріалу, написання і оформлення статті).

2. Мисливець С.О., Григор'єва Г.С., Киричок Л.М., Мохорт М.А. “Юнікап” як засіб для підвищення резистентності організму при експериментальному стресі // Таврический медико-биологический вестник. -1999. - № 1-2. - С. 89-92 (дисертантом проведено патентний пошук, виконані основні експериментальні дослідження, обробка і аналіз матеріалу, узагальнення, написання тексту статті).

3. Григор'єва Г.С., Мохорт М.А., Клеменцева Т.С., Киричок Л.М., Мисливець С.О., Охріменко Т.В. Корекція токсичного впливу ембіхіну на гемопоез композицією мікроелементів і вітамінів // Современные проблемы токсикологии. - 2001. - №1. - С. 53-56 (дисертантом проведено патентний пошук, частково проведені експериментальні дослідження, статистична обробка, написання і підготовка матеріалів до друку).

4. Мисливець С.О. Геропротекторні властивості нового мікроелементно-вітамінного засобу “Вітам” // Труды Крымского государственного медицинского университета им. С.И. Георгиевского

(К 70-летию КГМУ). - 2001. - Т.137, Ч.3. - С. 125-129.

5. Мохорт М.А., Григор'єва Г.С., Киричок Л.М., Мисливець С.О., Конахович Н.Ф., Охріменко Т.В. Геріатричні особливості фармакодинаміки нового мікроелементно-вітамінного засобу "Вітам" // Матеріали III Національного Конгресу геронтологів і геріатрів України: Тези. - Київ, 2000. - С. 33-34.

6. Конахович Н.Ф., Киричок Л.М., Мохорт М.А, Мысливец С.А. Первый отечественный микроэлементно-витаминный препарат: от идеи до внедрения // Мат. Всеукраїнської наук.-практ. конференції. - Харків, 2000. - С. 66-68.

7. Мохорт М.А., Григор'єва Г.С., Киричок Л.М., Мисливець С.О., Конахович Н.Ф., Серединська Н.М., Притула Т.П Перспектива використання мікроелементно-вітамінних комплексів в ревматологічній практиці // Ревматологічний журнал. - Мат. III національного конгресу ревматологів України. - Дніпропетровськ, 2001. - С. 58.

АНОТАЦІЯ

Мисливець С.О. Створення композиції координаційних сполук біометалів і вітамінів групи В та експериментальне обгрунтування її застосування для підвищення резистентності організму. – Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 14.03.05 – фармакологія. – Інститут фармакології та токсикології АМН України, Київ, 2002.

Дисертація присвячена створенню та дослідженню нової композиції координаційних сполук біометалів і вітамінів групи В з метою обгрунтування клінічного застосування лікарського засобу для підвищення резистентності організму.

Створено оригінальну композицію, до складу якої входять мікроелементи (Fe, Zn, Cu, Mn, Co, Cr) у вигляді координаційних сполук з N-2,3-диметилфенілантраніловою кислотою, з мольним співвідношенням 50:50:15:10:1:1, і вітаміни групи В (В1, В2, В3, В5, В6) (КМВ). Експериментально доведено наявність широкого спектру фармакологічних властивостей КМВ щодо підвищення резистентності організму в моделях іммобілізаційного стресу, динамічних та статичних навантажень, а також при старінні. Геріатричні особливості КМВ проявляються у гальмуванні інволюції внутрішніх органів, активації метаболічних процесів, стимуляції гемопоетичної функції, подовженні “працездатного віку”. За рівнем фармакологічної активності КМВ в 1,5-1,9 рази переважає відомий препарат Юнікап-М, в якому мікроелементи знаходяться в іонній формі. Повторне введення КМВ тваринам протягом 6 місяців не справляло негативної дії на функціонування органів і систем організму. Результати експериментального доклінічного дослідження КМВ стали обгрунтуванням розробки і впровадження нового препарату Вітам.

Ключові слова: композиція, мікроелементи, вітаміни, координаційні сполуки, стрес, резистентність.

АННОТАЦИЯ

Мысливец С.А. Создание композиции координационных соединений биометаллов и витаминов группы В и экспериментальное обоснование ее применения для повышения резистентности организма. –

Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 14.03.05 – фармакология. –

Институт фармакологии и токсикологии АМН Украины, Киев, 2002.

Диссертация посвящена созданию и исследованию новой композиции координационных соединений биометаллов и витаминов группы В для обоснования клинического применения нового лекарственного средства с целью повышения резистентности организма.

В результате экспериментальных исследований создана оригинальная композиция, в состав которой входят витамины группы В (В1, В2, В3, В5, В6) и микроэлементы (Fe, Zn, Cu, Mn, Co, Cr) в виде координационных соединений с N-2,3-диметилфенилантраниловой кислотой с мольным соотношением 50:50:15:10:1:1. Физико-химическая идентификация микроэлементной композиции подтвердила ее ингредиентную индивидуальность при отсутствии межкомпонентного взаимодействия. Целенаправленно был сделан выбор шести микроэлементов в составе композиции, который обусловлен их влиянием на метаболизм витаминов группы В. Природа, сбалансированное соотношение и координационное окружение выбранных микроэлементов соответствует их сосуществованию в активных центрах металлосодержащих ферментов. Замена в составе композиции тривиальных простых солей биометаллов на комплексы приводит к существенному повышению их биодоступности, снижению прооксидантных проявлений, токсичности и побочных эффектов. Важным следствием создания композиции является уменьшение токсичности комплексов металлов по сравнению с ионными соединениями тех же микроэлементов.

По показателю острой токсичности ЛД50 (3250-5000 мг/кг) при внутрижелудочном введении белым мышам, крысам и беспородным собакам созданная композиция относится к классу малотоксичных веществ.

Экспериментально установлен широкий спектр фармакологического действия композиции, что проявляется в повышении резистентности организма в условиях иммобилизационного стресса: предупреждении гипертрофии надпочечников (30%), инволюции тимуса (67%) и селезенки (63%), ульцерации слизистой желудка, нормализации биохимических показателей крови, морфологического статуса периферической крови, повышении показателей работоспособности животных.

По уровню влияния на повышение резистентности организма в условиях действия стрессорных факторов и физических нагрузок композиция существенно превосходит известный препарат Юникап-М, в котором микроэлементы находятся в ионной форме.

Профилактическое введение КМВ старым животным приводит к стимулированию гемопоэтической функции красного ростка крови (увеличение гемоглобина и эритроцитов), а также увеличивает количество лейкоцитов, что свидетельствует о повышении специфической иммунной защиты организма. КМВ предупреждает возрастную инволюцию органов старых животных (головной мозг – >44,4%, семенники – >40,5%, печень – >28,1%), увеличивает детоксицирующую функцию печени в 1,3-2,3 раза. Повышается работоспособность в группах старых крыс, которым вводили КМВ (в 1,2-1,4 раза).

Результаты исследований, проведенных на старых животных, обосновывают перспективность применения композиции как геропротектора, позволяющего стимулировать метаболические процессы и поддерживать активный способ жизни людей преклонного и старого возраста.

Повторное введение КМВ животным (беспородные собаки и крысы, внутрижелудочно в дозах 26 мг/кг и 130 мг/кг в хроническом эксперименте на протяжении 6 месяцев) не оказывало отрицательного влияния на общее состояние животных, не изменяло показателей периферической крови, функций печени, состояния сердечно-сосудистой, центральной нервной, дыхательной и выделительной систем, а также морфологических характеристик внутренних органов.

Полученные результаты и данные клинических исследований, которые подтвердили высокую фармакологическую активность препарата Витам, позволяют рекомендовать его при повышенной потребности организма в витаминах и минеральных соединениях в условиях усиленных физических нагрузок и стрессов, при пониженной работоспособности, в комплексной терапии при лечении длительных и/или тяжело протекающих заболеваний, а также в период реконвалесценции.

Ключевые слова: композиция, координационные соединения, микроэлементы, витамины, стресс, резистентность, геропротектор.

SUMMARY

Mislivetz S.O. The creation of the composition of coordination compounds of biometals and B-vitamins and experimental background of it's application increase of organism resistance. – Manuscript.

Thesis for candidate's degree in biology by specialty 14.03.05 –

pharmacology. – Institute of Pharmacology and Toxicology, AMS of Ukraine, Kyiv, 2002.

The dissertation is devoted to creation and study of the composition of biometal coordination compounds and B-group vitamins for the substantiation of clinical of the new drug agent to increase of organism resistance.

The original composition is made which contains essential microelements in the form of coordination compound with N-2,3-dimetylphenylantranilic acid at mole ratio Fe Zn Mn Cu Co Cr = 50:50:15:10:1:1 and B-group vitamins (B1, B2, B3, B5, B6) (named KMV).Wide KMV pharmacological actions were determined experimentally for increasing of organism resistance in models of immobilizative stress, dynamic and static loads and also at aging. The KMV geriatric features are manifested in inhibition of internal organs, activation of metabolic processes, stimulation of hemopoietic function and prolongation of “efficient age”. The KMV pharmacological activity at 1.5-1.9 folds exceeds the same of the known Unicap-M drug, which contains ionic forms of microelements. Repeated KMV application during 6 months doesn't result in negative influence at functioning of body's organs and systems. The results of the experimental preclinical investigation KMV were used for the development and legalization of new medicine Vitam.

Key words: composition, microelements, vitamins, coordination, stress, resistance.

Підписано до друку 25.06.2002 р. Формат 60ґ84/16. Обсяг 1,25 друк. арк. Зам. 288. Наклад 100.

Друкарня НМУ, Київ – 57, проспект Перемоги, 34