НАЦІОНАЛЬНИЙ АГРАРНИЙ УНІВЕРСИТЕТ

Піотрович Віталій Анатолійович

УДК 619:576.858:576.34:576.535

РОЗРОБКА ЖИВИЛЬНИХ СЕРЕДОВИЩ ДЛЯ КУЛЬТИВУВАННЯ КУЛЬТУР КЛІТИН

16.00.03 – ветеринарна мікробіологія та вірусологія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата ветеринарних наук

Київ – 2002

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Інституті ветеринарної медицини Української академії аграрних наук.

Науковий керівник кандидат біологічних наук Кучерявенко Олексій Олександрович, Інститут ветеринарної медицини УААН, завідувач лабораторії лептоспірозу сільськогосподарських тварин із музеєм штамів мікроорганізмів, заступник директора з питань науки

Офіційні опоненти: доктор ветеринарних наук, старший науковий співробітник Прискока Віктор Андрійович, Державний науково-контрольний інститут біотехнології і штамів мікроорганізмів, завідувач відділу експертизи і стандартизації;

кандидат ветеринарних наук Павленко Микола Степанович, Центральна державна лабораторія ветеринарної медицини, директор

Провідна установа Білоцерківський державний аграрний університет, кафедра мікробіології, вірусології та зоології Міністерства аграрної політики України, м. Біла Церква

Захист відбудеться " 4 " жовтня 2002 р. о 10 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.004.03 в Національному аграрному університеті за адресою: 03041, м. Київ-41, вул. Героїв оборони, 15, навчальний корпус 3, ауд. 65.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Національного аграрного університету за адресою: 03041, Київ-41, вул. Героїв оборони, 13, навчальний корпус № 4, к. 41.

Автореферат розісланий "3 " вересня 2002 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради Міськевич С.В.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Постійно зростаючі масштаби використання культур клітин як субстрату при виготовленні біопрепаратів і біологічно активних речовин зумовлюють необхідність розробки економічних і доступних живильних середовищ для їх культивування.

За кордоном та в країнах ближнього зарубіжжя виготовляють широкий спектр живильних середовищ для культивування культур клітин, вірусів, бактерій. В Україні виробництво живильних середовищ знаходиться на низькому рівні і виникає реальна загроза припинення проведення науково-дослідних робіт з вивчення вірусних хвороб тварин, створення і виробництва діагностичних та вакцинних препаратів. Це також може призвести до втрати досить цінних перещеплюваних ліній культур клітин та вакцинних штамів вірусів, які є основою біофабричного виробництва, та до залежності від іноземних фірм і держав при проведенні протиепізоотичних заходів. Саме тому виробництво живильних середовищ із застосуванням вітчизняної сировини є актуальною проблемою дослідження культур клітин.

Великої уваги при роботі з культурами клітин заслуговують ферментативні гідролізати білків, оскільки продукти гідролізу в складі живильних середовищ забезпечують високий індекс проліферації клітин. Середовища на їх основі прості в приготуванні, дешеві (коштовний набір окремих амінокислот в них замінений набором амінокислот, отриманих в результаті ферментативного гідролізу білка) і в значній мірі забезпечують стандартні умови культивування клітин.

Після виготовлення першого середовища на основі ферментативного гідролізату лактоальбуміну багато дослідників займалися розробкою ферментативних гідролізатів із іншої білкової сировини як тваринного, так і рослинного походження (Сергєєв В. А., 1988, Матюшина Л. В., Строгов С. Е., 1989, Пригода А. С., 1990, Єфремова Л. В., Іванов І. В., 1991, Телішевська Л. Я., 1993, Наумець З. П., Бусол В. А., Стеценко В. І., Кучерявенко Л. І., Герман В. В., 1997, Мартинець Л. Д., 1998 та ін.).

Незважаючи на досягнуті успіхи вітчизняних та зарубіжних вчених у галузі створення живильних середовищ, все ще багато питань залишається невирішеними. Є дані про декілька сотень рецептів живильних середовищ для культивування клітин та вірусів, проте досить мало із отриманих гідролізатів вийшли за рамки лабораторних досліджень. Недостатньо проводиться порівняльна оцінка відомих гідролізатів з метою виявлення найбільш ефективного вітчизняного живильного середовища, яке змогло б замінити коштовні імпортні препарати.

Культивування культур клітин виконують в основному на живильних середовищах з вмістом сироватки крові великої рогатої худоби. Ембріональна сироватка стабільна за складом, має високу проліферативну активність, проте застосування її обмежене із-за дефіциту сировини та високої вартості готового препарату. В той же час нестабільність складу сироватки крові дорослих тварин не обмежує її використання для культивування культур клітин. Необхідно ставити високі вимоги до ростових властивостей та стерильності сироватки крові, а тому пошук технологічних методик виготовлення високоякісної сироватки, придатної для використання у складі живильних середовищ для культивування культур клітин, є актуальним питанням.

Проблема стерильності культур клітин, які використовуються при виготовленні вакцин та діагностичних препаратів, є також актуальною. Для виробництва багатьох біологічних препаратів необхідно використовувати більш безпечні клітинні субстрати, якими безперечно є культури клітин, приготовлені із органів тварин-гнотобіотів. Створення таких культур клітин, призначених для вірусологічних досліджень, які культивуються на простому дешевому живильному середовищі, також необхідно збільшити.

Вирішенню цих важливих питань і присвячені наші дослідження.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами

Дисертаційна робота виконана згідно Державного плану науково-дослідних робіт Інституту ветеринарної медицини УААН КП И № держреєстрації 0197U012759 інв. № 02.01. “Розробити нові конкурентноздатні живильні середовища для вірусологічних досліджень”.

Мета і завдання досліджень. Метою нашої роботи було виготовлення ефективного живильного середовища для культивування культур клітин. Для реалізації вказаної мети вирішувались такі завдання:–

визначити оптимальні умови гідролізу та спростити методику отримання ферментативного гідролізату згустків крові великої рогатої худоби;–

вивчити фізико-хімічні властивості отриманих гідролізатів;визначити здатність росту первинних та перещеплюваних клітин в середовищах, на основі отриманих гідролізатів;–

визначити придатність клітин, вирощених на середовищах з гідролізатом, забезпечувати репродукцію вірусів;–

удосконалити методику отримання сироватки крові великої рогатої худоби та провести оцінку її ростової активності у складі живильних середовищ для культивування культур клітин;–

адаптувати виведену лінію перещеплюваних клітин тестикулів поросят (ПТП) до отриманого середовища та визначити придатність культури для використання у вірусологічних дослідженнях.

Об’єкт дослідження – культури клітин, живильні середовища.

Предмет дослідження – процес культивування культур клітин та вірусів на різних середовищах з вмістом сироватки крові.

Методи досліджень: культури клітин отримували методом дрібної трипсинізації; визначення концентрації клітин проводили методом забарвлення трипановим синім та підрахунком в камері з сіткою Горяєва; життєздатність клітин підтримували методом регулярних пересівів; визначення протеолітичної активності ферментів проводили методом Лейлян-Фольгарда в модифікації; для характеристики фізико-хімічних показників маточних гідролізатів визначали: амінний азот – формольним титруванням за спрощеним методом Зеренсен-Гаврилова, концентрацію водневих іонів – потенціометрично, вміст триптофану – методом М. А. Пешкова, зовнішній вигляд, колір та запах – органолептично; визначення ступені токсичності та ростової активності середовищ та сироватки проводили методом культивування культур клітин; накопичення вірусу визначали по величині титру інфекційності методом титрування; розрахунок титру інфекційності проводили за методом Ріда і Менча.

Наукова новизна отриманих результатів:–

вперше в Україні отриманий і випробуваний з позитивними результатами ферментативний гідролізат білків крові із відходів виробництва сироватки, придатний для виготовлення живильних середовищ для культур клітин; –

удосконалена методика по отриманню ферментативного гідролізату білків із використанням нехарчової білкової сировини на принципах безвідходної технології виробництва; –

запропоновані технологічна схема отримання сироватки крові великої рогатої худоби нативної без консерванту та метод контрольної системи для визначення її ростової активності;–

вперше виведена лінія перещеплюваних клітин тестикулів поросят-гнотобіотів та обґрунтована можливість використання її для вірусологічних досліджень (отримано патент на винахід № 40865 А).

Практичне значення отриманих результатів. Матеріали досліджень використані при розробці нормативної документації (НД), яка затверджена Державним департаментом ветеринарної медицини:

1). НД по виготовленню і контролю живильного середовища гемогідролізату для культивування культур клітин № 24.4.05510830.640 від 13.11.2001р.;

2). НД по виготовленню і контролю сироватки крові великої рогатої худоби нативної без консерванту № 24.4.05510830.639 від 13.11.2001р.

Виведена культура клітин ПТП використана при виготовленні:–

вірусвакцини проти ентеровірусного гастроентериту свиней із штаму УНИВИ

(ТУ У 46. 15. 077 – 95);–

вірусвакцини проти ентеровірусного гастроентериту свиней із штаму В 386/79 ( ТУ У 46. 15. 078 – 95);–

вірусвакцини проти трансмісивного гастроентериту свиней із штаму П 1439/81 (ТУ У 46.15.308 – 98);–

набору для діагностики ентеровірусних захворювань з синдромом SMEDI (ТУ У 46. 15. 327 – 98).

Особистий внесок здобувача. Експериментальні дослідження, аналіз одержаних результатів, їхнє узагальнення і статистична обробка, а також оформлення рукопису нормативної документації виконані власне дисертантом. При виведенні лінії перещеплюваних клітин тестикулів поросят особистим внеском є субкультивування отриманої культури. Автором самостійно адаптовано лінію клітин ПТП до виготовленого живильного середовища та проведено культивування вірусу хвороби Тешена із застосуванням цієї культури.

Апробація результатів дисертації проводилась на ІІІ Українсько-австрійському симпозіумі “Сільське господарство. Наука і практика” (Чернівці, 14-16 вересня 2000 р.); Всеукраїнській науково-практичній конференції молодих вчених “Проблеми патології тварин та шляхи їх вирішення” (м. Київ, 11 жовтня 2000 р). Результати досліджень, викладені в дисертації, заслухані та обговорені на засіданнях вченої ради та методичної комісії Інституту ветеринарної медицини УААН (1998-2001 рр.).

Публікації. Основні положення дисертаційної роботи викладені в чотирьох опублікованих наукових працях, три з яких у фахових виданнях (Віснику Білоцерківського державного університету, Віснику аграрної науки). Отримано один патент на винахід.

Об’єм і структура дисертації

Дисертація викладена на 154 сторінках друкованого тексту і містить: вступ, огляд літератури, загальну методику та основні методи досліджень, результати експериментальних досліджень, аналіз і узагальнення результатів досліджень, висновки, список використаних джерел, додатки. Робота ілюстрована 11 рисунками, 12 таблицями та 11 додатками. До списку літератури входить 221 джерело, у т. ч. 59 - далекого зарубіжжя.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ

Загальна методика та основні методи досліджень

Дослідження виконано в лабораторії культур клітин Інституту ветеринарної медицини УААН в період з 1998 по 2001 рр.

У дослідах використовували первинно – трипсинізовані клітини нирки свині (СН), перещеплювані культури СНЕВ (нирка ембріона свині), КТП (тестикули поросят), ВНК – 21 (нирка новонародженого хом’яка) та ПТП. Лінію ПТП вивели дослідним шляхом із тестикулів поросят-гнотобіотів, а культури СНЕВ, КТП та ВНК–21 використовували із колекції культур клітин ІВМ УААН.

Життєздатність клітин підтримували методом регулярних пересівів на свіже ростове середовище. Для цього використовували середовище 199, ГЛА, Ігла МЕМ, 5% гемогідролізат (Білорусія) та дослідні серії гемогідролізату. До складу середовища добавляли 10% сироватки крові великої рогатої худоби.

Вихідною сировиною для приготування гідролізату були згустки крові великої рогатої худоби та підшлункові залози свиней. Для проведення гідролізу використовували також трипсин. В процесі гідролізу визначали рН (потенціометрично), вміст амінного азоту – формольним титруванням за спрощеним методом Зеренсен-Гаврилова та триптофан – методом М. А. Пешкова.

Для приготування дослідного живильного середовища за сольову основу використовували розчин Хенкса, який готували із основних концентрованих розчинів А, В, С і розчину індикатора фенолового червоного (1:1000). При виготовленні живильного середовища до сольової основи додавали основний (маточний) гемогідролізат, L – глютамін та розчин вітамінів кваліфікації “для культур клітин”. Після встановлення рН 7,20,2 проводили стерилізацію фільтруванням. Приготовлене середовище перевіряли на стерильність шляхом висіву на МПБ, МПА, середовища Кітт-Тароцци та Сабуро.

Для визначення здатності живильного середовища гемогідролізату та сироватки крові великої рогатої худоби забезпечувати ріст культур клітин використовували методи біологічного контролю. При цьому визначали ступінь токсичності та ростової активності при культивуванні первинних і перещеплюваних культур клітин.

В дослідженнях використовували РНК-вірус, що належить до родини Picornaviridae, роду Enterovirus і є збудником хвороби Тешена. Вірусутримуючу рідину отримували в лабораторії генетики та імунології ІВМ УААН з люб’язного дозволу доктора ветеринарних наук, академіка Романенка В. Ф. Накопичення вірусу визначали по величині титру інфекційності методом титрування для кожної культури окремо. Множинність інфікування вірусу складала 0,8 – 1 ТЦД50/см3 на одну клітину. Розрахунок титру інфекційності проводили за методом Ріда і Менча.

Статистичну обробку отриманих результатів проводили згідно статистичних методів у вірусологічних дослідженнях (Честяков И. И., 1966). При цьому вираховували середні арифметичні величини, середнє квадратичне відхилення, достовірність різниці між середніми величинами (критерій значення “ Р ”).

Результати експериментальних досліджень та їх аналіз

Визначення оптимальних умов гідролізу згустків крові великої рогатої худоби. Розробляючи умови гідролізу білків крові великої рогатої худоби, основну увагу звертали на вибір відповідного методу гідролізу, підбір фермент-субстратного співвідношення, визначення ступеня розбавлення субстрату, встановлення тривалості гідролізу, дотримання певного температурного режиму та рH.

Зважаючи на недоліки кислотного та лужного методу гідролізу, нами був обраний ферментативний метод.

Для контролю процесу гідролізу проводили визначення рН, вмісту амінного азоту та наявності триптофану. Гідроліз припиняли при накопиченні амінного азоту не менше 700 мг/100см3, зниженні рН на 0,2-0,4 одиниці та наявності триптофану. Якщо гідроліз проходив повільно, суміш лишали ще на 12-24 години в термостаті, а потім повторно проводили визначення. За нашими даними трьох вищезгаданих показників контролю процесу гідролізу достатньо, що є зручно і економічно вигідно.

На першому етапі дослідження встановлювали оптимальну концентрацію субстрату шляхом вибору співвідношення субстрат–розчин Хенкса (без фенолового червоного). Намагалися досягти такого ступеня розбавлення субстрату, при якому забезпечувалася б найбільш легка атака і перетравлення його ферментом. Було досліджено 4 варіанти розведення субстрату розчином Хенкса у співвідношеннях 1:1; 1:1,5; 1:2; 1:2,5. Розведення 1:2 є оптимальним. При цьому співвідношенні субстрату з розчином Хенкса забезпечується найбільш повне розщеплення білка (вміст амінного азоту становив 802±15 мг/100см3). Максимальне нагромадження амінного азоту спостерігалося при розведенні вихідної сировини і розчину Хенкса –1:1 і 1:1,5, але слід відмітити, що при цих співвідношеннях гідроліз був неповним, тому що в суміші залишалося багато нерозщепленого білка. Різниця вмісту амінного азоту при цих співвідношеннях в порівнянні з оптимальним була значною з високим ступенем достовірності (Р<0,001). Із збільшенням розведення зростає ступінь розщеплення білка, але подальше розведення субстрату небажано, оскільки це призводить до зниження концентрації продуктів гідролізу і збільшення загального об’єму (Р<0,001), що ускладнює технологію виробництва.

Для визначення оптимальної кількості ферментної маси проводили гідроліз, використовуючи різну кількість ферментного препарату, приготовленого із підшлункової залози, а також різну кількість трипсину в розрахунку на 1 дм3 кров’яної маси. Оптимальний вміст амінного азоту (не менше 700 мг/100см3) отримували у тих випадках, коли кількість ферментного препарату, приготовленого із підшлункової залози, становила 35–45 %, а при використанні трипсину – 4,0–5,0 г на 1 дм3 кров’яної маси.

Слід відмітити, що з внесенням в гідролізну суміш великих кількостей ферменту збільшується показник амінного азоту (Р<0,05). Це пояснюється тим, що фермент також є білком і в процесі гідролізу інактивована частина ферменту може гідролізуватися, підвищуючи тим самим величину азотовмісних фракцій в гідролізаті.

Згідно літературних даних (Малахов А. Г., Вишняков, С. И., 1984), відомо, що температурний оптимум для ферментів тваринного походження лежить у межах 37–50°С. До цього значення температури каталітична активність росте, причому на кожні 10°С приблизно в 2 рази підвищується швидкість перетворення субстрату. При досягненні температурного оптимуму денатурація ферментного білка різко посилюється і хоч швидкість розщеплення субстрату продовжує зростати, активність ферменту, що виражається кількістю перетравленого субстрату, знижується.

Враховуючи вищесказане, для проведення гідролізу нами була вибрана нижня межа температурного оптимуму. Одержані результати показують, що вміст амінного азоту істотно не відрізняється при зміні температури гідролізу в межах від 40 до 42°С (Р>0,2). Гідроліз можна проводити і при температурі 38°С, адже незважаючи на достовірну різницю в порівнянні з температурою 40 – 42°С (Р>0,01 і Р<0,05 при застосуванні ферментного препарату та трипсину відповідно) кількість амінного азоту є достатньою (808-860 мг/100см3) для повноцінного росту і розвитку клітин в культурі.

Для визначення тривалості гідролізу проводили дослідження вмісту амінного азоту в гідролізаті на першу, другу, третю, четверту і п’яту добу гідролізу. Результати цих досліджень показують, що процес гідролізу проходить, в основному, на 2–3-ю добу – вміст амінного азоту становив 798-854 мг/100см3. Протягом наступних двох діб величина амінного азоту мало змінювалася або залишалася сталою (Р>0,2). Збільшувати час гідролізу немає резону, оскільки створюється загроза бактеріального забруднення препарату.

Відомо, що протеолітичні ферменти трипсин і хімотрипсин, які є основою ферментного препарату, приготовленого із підшлункової залози, активні в слаболужній зоні, тому гідроліз проводили при показнику рН у межах 7,4–7,8.

Таким чином, було встановлено, що для проведення гідролізу необхідно дотримуватись таких умов: розбавлення субстрату розчином Хенкса проводити у співвідношенні 1:2; використовувати для гідролізу 35–45% ферментного препарату, приготовленого із підшлункової залози та 4,0–5,0 г трипсину на 1 дм3 кров’яної маси; проводити гідроліз 2–3 доби при температурі 38–42°C та концентрації водневих іонів 7,4–7,8.

Здатність середовищ з гемогідролізатом білків крові великої рогатої худоби забезпечувати ріст культур клітин. В процесі роботи, застосовуючи оптимальні умови гідролізу білків крові великої рогатої худоби, отримали 21 серію гідролізатів, які були вивчені за фізико – хімічними показниками (табл. 1) та випробувані в складі живильних середовищ.

З даних табл. 1 видно, що вміст амінного азоту в гідролізатах був у межах 710 – 949 мг/100см3. В середньому це склало 805±13,7 мг/100см3, що є достатнім для росту клітин. Наявність триптофану у всіх серіях гідролізатів свідчить про те, що процес гідролізу згустків крові великої рогатої худоби був завершений. Концентрація водневих іонів в процесі гідролізу знижувалася, що обумовлено накопиченням кислотних продуктів гідролізу, і становила, в середньому, 6,860,5. За фізичними показниками гідролізати були подібними.

Фізико – хімічні показники маточних гідролізатів не можуть бути використані для оцінки біологічних властивостей, тобто здатності забезпечувати ріст культур клітин. Це обумовило необхідність проведення спеціального дослідження по застосуванню гідролізату згустків крові великої рогатої худоби як основи живильних середовищ для культивування культур клітин. Зважаючи на те, що найбільш повну характеристику властивостей живильного середовища дає культивування на ньому перещеплюваних ліній клітин, свою роботу ми спрямували саме в даному напрямку.

Випробування ростових властивостей дослідних серій проводили в два етапи. Спочатку визначали переносну нетоксичну концентрацію гемогідролізату в одному пасажі культивування клітин. Було приготовлено 4 варіанти живильних середовищ на основі 2,5, 5,0, 7,5 і 10%-х рідких ферментативних гідролізатів згустків крові великої рогатої худоби на розчині Хенкса. Для контролю використовували середовище 199, гемогідролізат 5%-ний (Білорусія), ГЛА. Концентрація гідролізату 5,0 і 7,5% в середовищі є оптимальною. Серії цих середовищ забезпечували формування моношару (не пізніше 72-96 годин) світлих, без зернистості клітин ПТП та СНЕВ, які щільно прилягали одна до одної і мали типову для даних ліній морфологію без ознак пошкодження клітин. Моношар формувався на 100%-ів площі

культурального матрацу. Концентрація 2,5% гідролізату в препараті не забезпечувала формування суцільного моношару, а при застосуванні живильних

Таблиця 1 – Фізико - хімічні показники ферментативних гідролізатів згустків

крові великої рогатої худоби

№

серії | Хімічні показники | Фізичні показники

Амінний азот, мг/100см3 | Зна-

чення

рН | Трипто-фан, мг/100см3 | Колір | Запах

1 | 773 | 6,8 | 100 | солом’яно-жовтий | характерний без гнильного

2 | 823 | 6,8 | 105 | жовто-коричневий“ | Те ж”

3 | 890 | 6,7 | 125“ | Те ж”“ | ”

4 | 729 | 6,5 | 120 | солом’яно-жовтий“ | ”

5 | 752 | 7,0 | 120“ | Те ж”“ | ”

6 | 764 | 6,8 | 120“ | ”“ | ”

7 | 848 | 6,8 | 180“ | ”“ | ”

8 | 860 | 7,2 | 150“ | ”“ | ”

9 | 871 | 6,9 | 140“ | ”“ | ”

10 | 949 | 6,9 | 170“ | ”“ | ”

11 | 782 | 7,0 | 105“ | ”“ | ”

12 | 829 | 7,2 | 110 | жовто-коричневий“ | ”

13 | 796 | 7,1 | 110 | солом’яно-жовтий“ | ”

14 | 788 | 6,8 | 125“ | Те ж”“ | ”

15 | 816 | 6,8 | 105 | жовто-коричневий“ | ”

16 | 893 | 7,4 | 125“ | Те ж”“ | ”

17 | 731 | 6,4 | 95 | солом’яно-жовтий“ | ”

18 | 760 | 6,8 | 110“ | Те ж”“ | ”

19 | 800 | 6,7 | 110“ | ”“ | ”

20 | 710 | 6,6 | 100“ | ”“ | ”

21 | 740 | 6,9 | 105“ | ”“ | ”

805 | 6,86 | 120,5 | від солом’яно-жовтого до жовто-коричневого різної інтенсивності | характерний без гнильного

13,7 | 0,05 | 4,9——–––

58,75 | 137 | 24,5——–––

Р< | 0,001 | 0,001 | 0,001————

середовищ на основі 10%-ного гідролізату відмічали ознаки токсичності (округлість клітин, зернистість цитоплазми, пікноз ядер, відшарування клітин від поверхні скла).

На другому етапі ростові властивості гемогідролізату оцінювали при послідовних пасажах. Дослідженням встановлено, що культури клітин вирощені на дослідному та контрольному середовищах, мали подібну інтенсивність початкового росту, вид клітин та їх форма не мали суттєвої різниці.

Ростові властивості дослідного та контрольних середовищ представлені в табл. 2.

Таблиця 2 – Порівняльна характеристика ростових властивостей

дослідного та контрольного живильних середовищ при

культивуванні перещеплюваних культур клітин СНЕВ,

ПТП, ВНК та КТП (Мm, n5 – 7, р 0,2)

Назва культури клітин | Назва показника

Коефіцієнт пересіву | Посівна концентра-ція, тис.кл/см3 | Час формування моношару, год | Концентра-ція на 4-ту добу, тис.кл/см3 | Індекс проліферації

СНЕВ | Д Дослід – гемогідролізат (дослідний). | 1:3 – 1:4 | 702,9 | 72 – 96 | 2488,4 | 3,540,13

К Контроль – середовища 199, гемогідролізат 5% (Білорусія), ГЛА, Ігла. | 1:3 – 1:4 | 702,9 | 72 – 96 | 2506,8 | 3,580,10

ПТП | Д | 1:8 –1:12 | 25,31,3 | 70 – 90 | 26015,3 | 10,521,02

К | 1:8 –1:12 | 25,31,3 | 68 – 88 | 26114,7 | 10,581,02

ВНК | Д | 1:3 – 1:4 | 68,23,4 | 72 – 96 | 2157,1 | 3,160,09

К | 1:3 – 1:4 | 68,23,4 | 72 – 96 | 2145,8 | 3,160,08

КТП | Д | 1:4 – 1:5 | 87,43,5 | 96 – 120 | 37414,7 | 4,290,12

К | 1:4 – 1:5 | 87,43,5 | 96 – 120 | 3797,1 | 4,350,13

При однаковій посівній концентрації, приріст клітин по відношенню до контролю на 4-ту добу росту в дослідному середовищі становив: у культурі клітин СНЕВ – 99,2 %, ПТП – 99,6 %, ВНК – 100,4 %, КТП – 98,6 %, а отже і індекс проліферації не був суттєво відмінним (Р>0,2). Формування моношару на 90 – 100% культурального матрацу відбувалося за однаковий час із застосуванням як контрольного, так і дослідного середовищ.

Отже, живильне середовище гемогідролізат, виготовлене за нашою методикою, можна рекомендувати для використання з метою культивування культур клітин.

Здатність клітин, вирощених в середовищах з експериментальними гемогідролізатами, забезпечувати репродукцію вірусів. Після того, як була доведена можливість використання середовища на основі гідролізату білків крові великої рогатої худоби для культивування культур клітин, ми поставили перед собою завдання перевірити можливість використання клітин, вирощених із застосуванням експериментальних гемогідролізатів для репродукції вірусів. Для цього використовували РНК-утримуючий вірус, що належить до родини Picornaviridae, роду Enterovirus. Даний вірус є збудником хвороби Тешена. При використанні експериментального середовища з гідролізатом білків крові великої рогатої худоби не виявлено відмінностей в накопиченні вірусу ензоотичного енцефаломіеліту свиней і строках проявлення цитопатогенної дії в порівнянні з контрольними середовищами (Р>0,2). Вірус накопичувався в однакових титрах в клітинах, що вирощені як на дослідних (7,16-7,23 lg ТЦД 50/см3), так і на контрольних живильних середовищах (7,16-7,36 lg ТЦД 50/см3).

Таким чином, провівши дослідження по отриманню ферментативного гідролізату згустків крові великої рогатої худоби, вважаємо за доцільне відмітити, що даний гідролізат може бути використаний як повноцінна основа живильного середовища, призначеного для культивування різних тваринних культур клітин, а самі клітини, які виросли на цих середовищах, здатні забезпечити репродукцію вірусу хвороби Тешена.

Отримання сироватки крові великої рогатої худоби нативної без консерванту. Нами була обрана досить проста методика отримання сироватки крові великої рогатої худоби нативної без консерванту. Для контролю якості сироватки складали контрольну систему, що включала культуру клітин (перещеплювальні лінії ПТП та СНЕВ), сироватку, що досліджується, та контрольну (виробництва Конотопського м’ясокомбінату та підприємства “Біоветпрепарат”), розчин версена або трипсину для відділення клітин. У цій системі невідомим елементом є тільки си-роватка. Інші компоненти повинні бути заздалегідь перевіреними й від-повідати всім вимогам. Дослідження невідомої сироватки проводили у 5 послі-довних пересівах із використанням одних і тих же компонентів контроль-ної системи. Рістстимулюючу активність сироватки на культурі клітин оцінювали за індексом проліферації (в годинах) після посіву клітин та візуальним станом клітинного моношару. Динаміка росту культури клітин ПТП відображена в табл. 3.

Таблиця 3 – Динаміка росту культури клітин ПТП (Мm, n=5)

№ п/п | Вид сироватки | Індекс проліферації (по годинам) після посіву клітин

48 | 72 | 96 | 120

1. | Дослідна сироватка | 6,93±0,14 | 10,22±0,2 | 10,12±0,2 | 9,84±0,16

2. | Контрольна сироватка11 Сироватка Конотопського мясокомбінату. | 6,96±0,22 | 10,52±0,26 | 10,36±0,23 | 10,1±0,19

3. | Контрольна сироватка22 Сироватка державного дослідного виробничого підприємства “Біоветпрепарат” – серія 2. | 6,68±0,21 | 10,08±0,16 | 9,84±0,12 | 9,62±0,12

4. | Контрольна сироватка33 Сироватка державного дослідного виробничого підприємства “Біоветпрепарат” – серія 5. |

6,44±0,23 | 9,82±0,21 | 9,46±0,2 | 9,4±0,22

Аналіз даних табл. 3 показав, що рістстимулююча активність дослідної сироватки по індексу проліферації клітин культури ПТП подібна до контрольних сироваток № 1-2 (Р>0,2) та № 3 (Р>0,1). При посівній концентрації 20-30 тис. клітин/см3 формування моношару клітин відбувалося майже одночасно, а пік кількості клітин, які виросли, відмічали через 72 години посіву. Візуально стан клітинного моношару був однорідним як із застосуванням дослідної, так і контрольної сироваток. В полі зору мікроскопа видно епітеліоподібні клітини полігональної форми, які щільно прилягали одна до одної, мали чіткі контури з яскраво вираженим тургором. Клітини тривалий час (10–15 діб) залишалися на склі без субкультивування та зміни середовища.

При визначенні динаміки росту культури СНЕВ використовували аналогічні компоненти контрольної системи (табл.4).

Таблиця 4 – Динаміка росту культури клітин СНЕВ (Мm, n=5)

№ п/п | Вид сироватки | Індекс проліферації (по годинам) після посіву клітин

48 | 72 | 96 | 120

1. | Дослідна сироватка | 1,98±0,06 | 3,02±0,06 | 3,54±0,06 | 3,34±0,2

2. | Контрольна сироватка1 | 2,0±0,07 | 3,02±0,02 | 3,6±0,09 | 3,3±0,06

3. | Контрольна сироватка2 | 1,94±0,08 | 3,08±0,09 | 3,48±0,06 | 2,8±0,09

4. | Контрольна сироватка3 | 2,0±0,08 | 2,96±0,07 | 3,5±0,04 | 2,78±0,09

Дані табл. 4 свідчать, що рістстимулююча активність дослідної сироватки по індексу проліферації клітин культури СНЕВ практично не відрізняється від контрольних сироваток (Р>0,2). Формування моношару світлих без зернистості клітин відбувалося на 3-4 добу. Клітини щільно прилягали одна до одної і мали типову для даної лінії морфологічну характеристику. Проте слід відмітити, що клітини, вирощені із застосуванням дослідної сироватки, були більш життєздатними: падіння індексу проліферації проходило повільніше, ніж в присутності контрольних сироваток № 2 і 3 (Р<0,05).

Після зазначеного вище досліду ми продовжили проведення порівняльної оцінки дослідних серій сироваток із контрольними за станом клітинного моношару ще протягом десяти пасажей (всього 15 пасажей). Сироватка, що досліджувалася, по часу утворен-ня суцільного моношару клітин залишалася постійною одиницею на протязі п'ятнадцяти послідовних пересівів культури й становила у перещеплюваних лініях ПТП та СНЕВ не більше 2-4 доби. Візуально клітинний шар мав вигляд добре вираженого матового нальоту на поверхні посуду для культивування. Контури клітин під мікроскопом чіткі, з ін-тенсивно вираженим тургором, від чого поверхня клітинного шару вигля-дала рельєфною, цитоплазма прозора, добре переломлювала сві-тло.

Отже, при культивуванні культур клітин із застосуванням виготовлених серій сироватки крові отримано позитивні результати, тому сироватка крові великої рогатої худоби нативна без консерванту може виготовлятися серійно для культивування культур клітин.

Отримання лінії перещеплюваних клітин тестикулів поросят. У зв’язку з тим, що в інфекційній патології свиней значне місце займають вірусні захворювання, важливо розширити діапазон отримання культур клітин із тканин свинячого походження, адже останні найбільш чутливі до вірусів свиней.

Нами була отримана така культура, яку було названо ПТП – лінія перещеплюваних клітин тестикулів поросят, що культивувалась на середовищах 199 та ГЛА. В умовах біотехнологічного виробництва, де є потреба великої кількості живильних середовищ для отримання клітинної маси, ці середовища нерентабельні. Саме необхідність заміни імпортних живильних середовищ 199 та ГЛА зумовило проведення досліджень по адаптації культури ПТП до вітчизняного живильного середовища, запропонованого вище. Паралельно проводили адаптацію культур клітин СНЕВ та КТП.

Усі три клітинні лінії переводили з культивування в середовищах 199 та ГЛА до культивування з гемогідролізатом шляхом заміни середовища ГЛА уже в першому пасажі. Далі, поступовим добавленням гемогідролізату, адаптували вищезгадані культури клітин до виготовленого живильного середовища.

Із даних рис. 1 видно, що серед трьох перещеплюваних клітин свинячого походження, найшвидше процес адаптації пройшов у запропонованій нами культурі клітин ПТП.

Рис. 1. Адаптація перещеплюваних клітин ПТП, СНЕВ та КТП до середовища

з гемогідролізатом

Вже на рівні 3-4-го пасажів кількість синтетичного живильного середовища 199 була зведена до мінімуму і становила на 77,8% менше від початкового значення. А починаючи з 5-го пасажу культуру клітин ПТП вирощували із застосуванням лише гемогідролізату та 10% сироватки крові великої рогатої худоби. В той же час культури КТП та СНЕВ були адаптовані повністю до гемогідролізату лише на 8 та 9-му пасажах відповідно. Далі нами було проведено 20 пасажів клітин ПТП на гемогідролізаті в порівнянні із контрольними середовищами. При цьому клітини мали таку ж конфігурацію, межі клітин чітко виражені, без ознак цитопатології.

Нами також було проведено дослідження динаміки і характеристики росту культури клітин ПТП впродовж 15 діб без зміни середовища. При культивуванні культури клітин ПТП на живильному середовищі гемогідролізат і середовищах 199 та ГЛА спостерігали однотипний характер росту. Клітини ПТП були здатні протягом 10-15 діб залишатися на склі без субкультивування та зміни середовища.

Отже, наші дослідження показали можливість культивування культури ПТП із використанням дешевого живильного середовища взамін коштовним – 199 та ГЛА.

Використання культури клітин ПТП для вірусологічних досліджень. Після виведення культури клітин ПТП та адаптації її до простого у приготуванні, дешевого живильного середовища гемогідролізат, нами було проведено дослідження можливості використання її для культивування вірусу хвороби Тешена.

Культура клітин ПТП виявилась дуже чутливою до вакцинного штаму “Перечинський-642”, який був використаний у наших дослідженнях. Вже з першого пасажу через 15-20 годин після зараження культури проявлялася цитопатогенна дія. При цьому виникали дрібні фокуси круглих клітин, що охоплювали до 60-70% всього моношару, а ще через деякий проміжок часу вражалися всі клітини моношару, який руйнувався і відокремлювався від скла.

На рис. 2-3 представлені фотографії культури клітин ПТП, які були використані при дослідженнях. На рис. 2 зображений контрольний моношар культури, який був сформований за 55 годин росту, а на рис. 3 – ЦПД вірусу хвороби Тешена через 22 години після зараження.

Рис. 2. Контрольна культура Рис. 3. ЦПД вірусу хвороби

клітин ПТП. Збільшення х 80 Тешена через 22 години після

зараження. Збільшення х 80

Згідно проведених досліджень не виявлено відмінностей в строках проявлення цитопатогенної дії. Накопичення вірусу інфекційного енцефаломіеліту свиней було в межах 10-7,5 – 10-8,24 ТЦД 50/см3, а різниця в титрах при застосуванні різних середовищ в якості ростових та підтримуючих була незначною (Р>0,2). Цим було підтверджено результати наших досліджень, зазначених вище, згідно з якими, дослідне живильне середовище гемогідролізат, виготовлене за спрощеною методикою, може бути з успіхом використане як ростове та підтримуюче при культивуванні культур клітин та вірусів. Це дає змогу повної заміни імпортних живильних середовищ на гемогідролізат, що технологічно простіше та економніше.

ВИСНОВКИ

1. Розроблено та запропоновано для практики культуральне живильне середовище – ферментативний гідролізат білків крові (ФГБК) великої рогатої худоби. Середовище виготовлене із вітчизняних компонентів, дешеве, просте у приготуванні, призначене для культивування первинних і перещеплюваних культур клітин та вірусів різного походження.

2. Визначені оптимальні умови проведення ферментативного гідролізу білків крові великої рогатої худоби: розбавлення субстрату розчином Хенкса у співвідношенні 1:2; концентрація ферментативного препарату – 35-45%, трипсину 4-5 г/дм3 кров’яної маси; температура гідролізу 38-42?С; початкове значення рН суміші, яка гідролізується 7,4 – 7,8; тривалість гідролізу – 2-3 доби.

3. Рідкий ФГБК – прозора рідина від солом’яно-жовтого до жовто-коричневого кольору різної інтенсивності, зі вмістом амінного азоту 710-949 мг/100см3, триптофану 120,5±4,9 мг/100см3, величиною рН 6,86±0,5 та з характерним без гнильного запахом.

4. Живильні середовища на основі 5- і 7,5%-го ФГБК, при культивуванні первинних та перещеплюваних культур клітин, забезпечують накопичення біомаси життєздатних клітин і продуктивний їх ріст. За морфологічною характеристикою моношару, строками формування та індексом проліферації клітин препарат не поступається ГЛА та синтетичному живильному середовищі 199.

5. Встановлена придатність клітин, вирощених із застосуванням живильних середовищ на основі ФГБК, забезпечувати репродукцію вірусу хвороби Тешена. Титр інфекційності вірусу складає на різних культурах 10-7,0 –10-8,24 ТЦД 50/см3, що не відрізняється від цього показника при використанні клітин, вирощених на інших середовищах. Середовища на основі ФГБК, поряд із імпортними препаратами на основі чистих амінокислот і гідролізатів білків, використовуються як підтримуючі при репродукції вірусу хвороби Тешена.

6. Сироватка крові великої рогатої худоби нативна без консерванту, одержана за простою методикою, із застосуванням контрольної системи, забезпечує повноцінний ріст та розвиток клітин у культурі.

7. Отримана стабільна за морфофункціональними якостями лінія перещеплюваних клітин тестикулів поросят із високим індексом проліферації (1:8-1:12). Культура адаптована до вітчизняного живильного середовища і забезпечує високі титри інфекційності різних вірусів свинячого походження.

Пропозиції виробництву

При масовому вирощуванні клітин у культурі, в разі самостійного виготовлення живильних середовищ та розчинів, пропонуємо використовувати технологію безвідходного виробництва, яка забезпечує використання рідкої частини крові для отримання сироватки, а згустків крові – для приготування основ живильних середовищ, призначених для культивування культур клітин.

На основі результатів дослідних та виробничих випробувань партій ФГБК та сироватки крові нативної без консерванту розроблена і затверджена нормативна документація на їх виробництво і застосування.

Культуру клітин ПТП, одержану із тестикулів поросят-гнотобіотів, доцільно використовувати для вірусологічних досліджень – постановки реакції нейтралізації, титрування інфекційності вірусів по ЦПД, напрацювання біомаси вірусів з метою приготування вакцинних та діагностичних препаратів.

Список робіт, опублікованих за темою дисертації

1. Піотрович В. А. Ферментативний гідролізат білків крові великої рогатої худоби як основа живильних середовищ для культур клітин // Вісник Білоцерків. держ. аграр. ун-ту: Зб. наук. праць. – Біла Церква, 1999. – Вип.9. – С. 129-133.

2. Піотрович В. А. Біологічний контроль гемогідролізату – живильного середовища для культур клітин // Вісник Білоцерків. держ. аграр. ун-ту. – Біла Церква, 2000. – Вип. 14. – С. 225-229.

3. Піотрович В. А. Гідролізні середовища – основа успішного використання методу культур клітин // Матер. Всеукраїнської науково-практичної конференції молодих вчених: “Проблеми патології тварин та шляхи їх вирішення” – Київ, 2000.- С. 44-47.

4. Піотрович В. А. Альтернативне живильне середовище для культур тваринних клітин при вирощуванні вірусу Encephalomyelitis enzootica suum // Вісник аграрної науки. – Київ, 2001. - № 10. – С. 76-77.

5. Пат. 40865 А Україна, МПК7 С 12 N 5/00, Лінія перещеплюваних клітин тестикулів поросят для вірусологічних досліджень / А. М. Жуковський, О-й О. Кучерявенко, В. А. Піотрович; Інститут ветеринарної медицини УААН. - № 2000084920; Заявлено 18.08.00; Опубл. 15.08.01, Бюл. № 7.

Дисертантом проведено адаптацію культури ПТП до живильного середовища гемогідролізату та доведено можливість використання культури для культивування вірусу хвороби Тешена.

Піотрович В. А. Розробка живильних середовищ для культивування культур клітин. – Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата ветеринарних наук за спеціальністю 16. 00. 03 – ветеринарна мікробіологія та вірусологія. Національ-ний -аграрний університет, Київ, 2002.

Дисертація присвячена питанню культивування культур клітин. При виготовленні живильних середовищ за білкову основу запропоновано використовувати ферментативний гідролізат білків крові великої рогатої худоби із відходів виробництва сироватки. Експериментальним шляхом знайдені оптимальні умови проведення гідролізу. Отримано 21 серію гідролізатів, які характеризувалися такими хімічними показниками: вміст амінного азоту – 805±13,7 мг/100см3; вміст триптофану – 120,5±4,9 мг/100см3; концентрація водневих іонів – 6,86±0,05. Визначено переносну нетоксичну концентрацію гемогідролізату у складі живильних середовищ, яка становила 5-7,5 %. Доведена можливість використання живильного середовища гемогідролізат для культивування первинних і