Інститут біохімії ім О.В.Палладіна

_____________________________________________________________________________________

Архипова

Валентина Миколаївна

УДК 577.15.08 + 577.151.35

543.257.5

ОПТИМIЗАЦІЯ основних характеристик КОНДУКТОМЕТРИЧНИХ ФЕРМЕНТНИХ біосенсорів для аналізу реальних зразків

03.00.20 - біотехнологія

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Київ - 1998

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана у відділі механізмів трансляції генетичної інформації Інституту молекулярної біології та генетики НАН України.

Науковий керівник - кандидат біологічних наук, старший науковий співробітник

Солдаткін Олексій Петрович,

старший науковий співробітник Інституту молекулярної біології і генетики НАН України.

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, старший науковий співробітник

ДМИТРЕНКО Микола Петрович,

керівник лабораторії біохімії Інституту екогігієни і токсикології ім.Л.І.Медведя МОЗ України;

кандидат хімічних наук, старший науковий співробітник

НІГМАТУЛЛІН Рінат Равільович

старший науковий співробітник відділу фізико-хімії мембран Інституту колоїдної хімії та хімії води імені А.В. Думанського НАН України.

Провідна установа - Інститут мікробіології і вірусології ім. Д.К.Заболотного НАН України, відділ біохімії мікрорганізмів, м.Київ

Захист відбудеться « 7 » грудня 1998 року о 14 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.240.01 в Інституті біохімії ім.О.В.Палладіна НАН України (252601, Київ-30, вул.Леонтовича, 9).

З дисертацією можна ознайомитись в бібліотеці Інституту біохімії ім.О.В.Палладіна
НАН України.

Автореферат розісланий « 29 » жовтня 1998 року.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради

кандидат біологічних наук Кірсенко О.В.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Потреби сучасної медицини, екології та біотехнології вимагають створення нових аналітичних систем, що мають високу специфічність та чутливість і разом з тим є дешевими, простими у використанні та компактними. Розробка та впровадження таких систем дасть змогу успішно сприяти діагностиці та лікуванню захворювань, вирішувати проблеми контролю та регуляції біотехнологічних процесів, а також моніторингу навколишнього середовища. Серед таких систем велику увагу приділяють біосенсорам - приладам нового покоління, які поєднують в собі біоселективний елемент з фізичним перетворювачем. Протягом останніх років промислове виробництво біосенсорів у світі зробило величезний стрибок. Так, якщо у 1993 році ринок біосенсорів складав 150 млн. доларів, то у 1997 р. він склав більш ніж 1 млрд. [Weetal, 1996, Turner, 1998]. За прогнозами експертів до 2000 року очікується його збільшення до 2 млрд. доларів [Gibson, 1996].

Роботи, що були розпочаті в Інституті молекулярної біології і генетики НАН України у співробітництві з кафедрою фізики напівпровідників радіофізичного факультету Київського університету ім. Тараса Шевченка показали, що при створенні ферментних сенсорів доцільним є використання електрохімічних перетворювачів, оскільки за їх допомогою можна проводити аналіз забарвлених зразків, а в деяких випадках електрохімічні методи більш чутливі та прості за традиційні. Оскільки чутливість аналізу, як правило, обмежується границею визначення фізичного перетворювача, тому його вибір є надзвичайно важливим. Попередні роботи співробітників нашого Інституту показали перспективність використання перетворювачів, виготовлених за технологією мікроелектроніки, а саме рН-чутливих польових транзисторів [Солдаткин и др., 1993] і кондуктометричних планарних електродів [Дзядевич и др., 1993], але широке використання їх на практиці лімітується рядом недоліків. У деяких випадках це недостатньо висока стабільність біосенсорів на основі цих перетворювачів, але частіше за все - вузький лінійний діапазон концентрацій речовин, що визначаються. Крім того, робочі характеристики наведених біосенсорів у значній мірі залежать від умов проведення аналізу, що потребує постійного врахування цього при складанні протоколів вимірів.

Таким чином, актуальним для усунення вищевказаних недоліків та можливості практичного використання розроблених раніше лабораторних прототипів біосенсорів є проведення детального дослідження факторів, що покращують ефективність роботи як електронного перетворювача, так і самого біосенсора, оптимізуючи при цьому основні аналітичні характеристики його роботи.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота виконувалась в рамках бюджетної теми Інституту молекулярної біології та генетики № 2.2..4.22 «Розробка наукових засад створення біосенсорів на основі кондуктометричних перетворювачів», конкурсних проектів № 5.4/74 «Вивчення молекулярних аспектів рецепторних взаємодій у біоелектронних системах» Управління фундаментальних досліджень та № 02.12/01962 «Розробка біосенсорів нового покоління для аналізу та контролю біотехнологічних процесів» Департаменту науково-прикладних програм Міністерства України з питань науки та технологій та Міжнародного NATO-Linkage гранта ENVIR.LG 950913.

Мета і задачі дослідження. Головною метою роботи була оптимізація електрохімічних характеристик ферментних біосенсорів і створення на їх основі високоефективних і стабільних приладів для аналізу реальних зразків.

Виходячи з мети роботи, були поставлені такі задачі:

1.

1.

1.

1.

Наукова новизна одержаних результатів. У роботі знайшло подальший розвиток моделювання електрохімічних процесів у комірці з кондуктометричними перетворювачами за допомогою еквівалентних електричних схем, що описують ці процеси. Вперше запропонований ряд пріоритетності використання різних матеріалів для створення кондуктометричних перетворювачів. Показано, що чутливість датчика не залежить від характеристичних розмірів електродів та матеріалу непровідної підкладинки, а для створення ферментного біосенсора цілком придатні електроди з деяких неблагородних матеріалів.

Вперше розроблено лабораторний прототип ферментного сенсора для визначення пеніциліну на основі кондуктометричних планарних електродів, і проведено порівняльний аналіз його робочих характеристик з аналогічними параметрами сенсору на основі рН-чутливих польових транзисторів. Показано, що аналітичні характеристики обох датчиків подібні, але з технологічної точки зору планарні тонкоплівчасті електроди більш прості та дешеві, що робить їх перспективнішими для масового виробництва і застосування на практиці.

Розроблено глюкозний кондуктометричний біосенсор з аналітичними характеристиками, які дозволяють його використання для аналізу реальних зразків без попередньої обробки останніх. Вперше для кондуктометричних біосенсорів показано, що розширення лінійного діапазону до 20 мМ глюкози можна досягти при використанні фериціаніду калію, як альтернативного кисню окислювача. Іншим шляхом розширення динамічного діапазону роботи глюкозного біосенсора є використання додаткових напівпроникних мембран, застосування яких до того ж покращує його основні аналітичні характеристики, а саме чутливість і стабільність, а також зменшує вплив середовища на відгук сенсора.

Вперше було проведено аналіз концентрацій глюкози в реальних зразках (кров і культуральні рідини) за допомогою розробленого кондуктометричного біосенсора та показано високий ступінь кореляції з результатами, одержаними класичними методами.

Теоретичне та практичне значення одержаних результатів. Запропоновано декілька шляхів цілеспрямованої зміни аналітичних характеристик кондуктометричних ферментних біосенсорів, зокрема чутливості та динамічного діапазону вимірювань, та проведено їх детальний аналіз.

Розроблено практичні рекомендації щодо оптимального вибору матеріалів, форми та розмірів електродів при виготовлені кондуктометричних планарних перетворювачів, які використовуються як основа ферментних біосенсорів.

Створено діючі лабораторні моделі ферментних біосенсорів на основі кондуктометричних планарних електродів і рН-чутливих польових транзисторів для визначення концентрацій пеніциліну. Аналітичні характеристики розроблених сенсорів вказують на перспективність їх використання в біотехнологічних процесах для кількісного аналізу пеніциліну.

Створено аналітичні прилади на основі глюкозних кондуктометричних біосенсорів, які було застосовано для аналізу концентрацій глюкози в крові щурів з Чорнобильскої зони відчуження, та культуральних середовищах при контролі біотехнологічних процесів у лабораторній практиці (вирощування клітин Klebsiella oxitoca) і промисловості (виробництво лужної протеази та глюкоамілази). Розроблено протоколи експериментального визначення концентрацій глюкози в реальних зразках за допомогою кондуктометричних біосенсорів.

Особистий внесок здобувача. Дисертаційна робота була виконана під керівництвом к.б.н. Солдаткіна О.П. у відділі академіка НАНУ Єльської Г.В. Основні експериментальні результати були отримані здобувачем особисто. Частина матеріалу була отримана у співробітництві з к.б.н. Дзядевичем С.В., к.ф.-м.н. Шульгою О.А., з якими автор має спільні публікації. Експериментальні установки були виготовлені за допомогою Пацковського С.В.

Апробація результатів дисертації. Результати досліджень доповідались на 7 Європейському Конгресі по біотехнології (Ніца, Франція, 1995), Міжнародній конференції NATO ARW «New trends in biosensors development» (Ворзель, Україна, 1998).

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 9 робіт, у тому числі 6 статей.

Структура та обсяг роботи. Дисертаційна робота складається зі вступу, огляду літератури, опису матеріалів та методів дослідження, експериментальної частини, яка включає виклад результатів роботи та їх обговорення (у 4 главах), висновків, списку літератури, який включає 141 джерело, та 2 додатків. Робота викладена на 131 сторінці машинописного тексту і містить 58 рисунків та 8 таблиць.

МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ

У роботі використoвували реактиви: -глюкозооксидаза (ГОД) з Penicillium vitale (КФ 1.1.3.4, виробництво Косарського спиртзаводу Черкаського виробничого об'єднання спиртової промисловості, Україна) з активністю 168 од.акт./мг., каталаза з печінки бика (КФ 1.11.1.6, виробництво фірми "Sigma", Франція) з активністю 19.9 од.акт./мг., пеніциліназа з Bacillus cereus (КФ 3.5.2.6, виробництво фірми "Sigma", США) з активністю 2150 од.акт./мг; сироватковий альбумін бика (БСА) (виробництво фірми "Boehringer Mannheim", Франція), 20 % розчин глутарового альдегіду (ГА) (виробництво фірми "Merck", Німеччина), натрієва сіль бензилпеніциліну (500000 од., виробництво Київського заводу медпрепаратів), фериціанід калію K3[Fe(CN)6] (виробництво фірми "Merck", Німеччина), глюкоза (виробництво фірми "Sigma", Франція); полімери для створення додаткових мембран: полівінілбутираль (ПВБ) та політетрагідрофуран (ПТГФ) (виробництво фірми "Aldrich Chem. Co.", США), нафіон-перфторований іонообмінний полімер (5 % розчин в суміші аліфатичних спиртів що містить 10 % води), (виробництво фірми "Aldrich Chem. Co.", США, продукт № 27.470-4), співполімер
(4-вінілпіридину зі стиролом) - іонообмінний полімер (ПВКС) (виробництво фірми "Aldrich Chem. Co.", США, продукт № 19.207-4). Як буферні системи використовували КН2РО4-NaOH фірми "Merck" (Німеччина), тріс-HCl фірми "Reanal (Угорщина) та універсальний буфер [Soldatkin et al., 1994]. Інші реактиви, що використовувались в роботі, були вітчизняного та закордонного виробництва та мали кваліфікацію "ос. ч." та "х. ч.".

Кондуктометричні перетворювачі були виготовлені як на Україні: Київський радіозавод та ВО «Кристал», так і за кордоном: Інститут мікроелектроніки м. Ньюшатель (Швейцарія) та Інститут хемо- і біосенсорики м. Мюнстер (Німеччина). Їх загальна конструкція та основні характеристики описано в роботі [Дзядевич и др., 1994].

рН-Чутливі польові транзистори було виготовлено в НДІ «Мікроприлад» (м.Київ, Україна). Їх конструкція та характеристики описано в роботі [Shul’ga et al., 1996].

Методики створення ферментних біоматриць на поверхні електродів та додаткових мембран детально описано у роботах [Архипова и др., 1996, Архипова, 1998].

Схеми експериментальних установок для проведення імпедансних вимірів та досліджень з використанням біосенсорів, а також методики проведення експериментів детально описано в роботах [Дзядевич и др., 1994, Soldatkin et al, 1994, Архипова и др., 1996, Архипова, 1998].

Протоколи аналізу субстратів у реальних рідинах за допомогою біосенсорів описано в роботах [Soldatkin et al., 1998, Єльська, 1997].

РЕЗУЛЬТАТИ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

Дослідження роботи тонкоплівчастих кондуктометричних перетворювачів

У роботі в основному використовували кондуктометричні перетворювачі, зовнішній вигляд яких представлено на Рис. 1.

Рис.1. Зовнішній вигляд кондуктометричного перетворювача.

При нанесенні на його поверхню біоселективної мембрани датчик перетворюється в кондуктометричний біосенсор, який схематично представлено на Рис.2а, а фізико-хімічні процеси, що протікають в електрохімічній комірці з ним, в загальному випадку моделюються еквівалентною схемою, яку представлено на Рис. 2б.

а) б)

Рис. 2. Кондуктометричний біосенсор (а) та еквівалентна схема, що моделює фізико-хімічні процеси в комірці з ним (б).

Розглянемо цю еквівалентну схему.

Ланцюг а - Сконт - ємність контактів та дротів, що здійснюють з’єднання з вимірювальною системою. Звичайно її величина залежить від їх матеріалу та змінюється від 0,1 до 1 пФ.

Ланцюг б - Сгеом - геометрична ємність самих металевих гребінок перетворювача. Звичайно її величина залежить від матеріалу гребінок, їх геометрії та розмірів і змінюється від 0,1 до 1 пФ.

Ланцюг в - електрохімічний імпеданс, що описує область поза мембраною. Він складається з двох однакових ємностей См-р, що відповідають за межу розподілу мембрана/розчин, та опору Rрозч, що моделює провідність розчину поза мембраною.

Ланцюг г - електрохімічний імпеданс, що описує область всередині мембрани. Він складається з двох однакових поверхневих імпедансів Zпов, що відповідають за межу розподілу електрод/розчин; двох однакових ємностей Сокисл, що моделюють процес окислення матеріалу електродів; опору Rм, що моделює провідність розчину всередині мембрани.

При роботі кондуктометричного ферментного біосенсора ланцюгами а, б, і в можна знехтувати, і наша еквівалентна схема приймає більш простий вигляд [Дзядевич и др., 1994].

Було проведено математичне та експериментальне моделювання такого еквівалентного ланцюга, побудовані теоретичні імпедансні криві. Також були отримані реальні імпедансні криві перетворювачів та еквівалентної електричної схеми. На основі порівняння теоретичних та експериментальних даних було доказано правильність запропонованої моделі та вибрані найбільш оптимальні умови проведення експериментів з кондуктометричними ферментними біосенсорами [Дзядевич и др., 1994].

Наступним етапом роботи було детальне вивчення залежності характеристик перетворювачів від типу матеріалу, розмірів та геометрії електродів.

Досліджувався ряд структур із електродами, виготовленими з Au, Ni, Cr, Cu, Pt, Ti, Al. На рис.3 представлено залежності реальної частини адміттансу електрохімічної комірки від частоти струму при вимірах у бідистильованій воді та 1 мМ розчині KСl для електродів із Au, Ni, Cr та Cu з однаковими геометрією та розмірами.

Рис. 3. Залежність реальної частини адміттансу від частоти струму для електродів із різних матеріалів.

Рис. 4. Залежність відгуку сенсору від концентрації KCl для електродів, виготовлених з різних металів: 1 - Al, 2 - Ti, 3 - Cr, 4 - Ni, 5 - Au, 6 - Cu, 7 - Pt.

Із рисунка добре видно, що адміттансні криві всіх структур мають подібну форму. При збільшенні провідності середовища відбувається збільшення загального адміттансу системи та, відповідно, збільшується його реальна частина - провідність. При цьому для всіх електродів форма кривих та взаємне розташування зберігаються. Із цього ряду випадають тільки Cu-електроди, тому що на їх поверхні дуже швидко утворюється шар окислу, який призводить до появи Сокисл та зміни форми адміттансної кривої. Це також веде до зменшення чутливості датчика. Однак, на високих частотах (від 50 кГц), коли електродними процесами можна знехтувати, реальні частини адміттансу всіх зразків подібні, що ще раз підтверджує положення про вибір високих частот для проведення вимірів.

В подальших експериментах досліджувалась чутливість електродів з різних матеріалів до зміни концентрації KСl, при цьому моделювалась зміна провідності під час ферментативної реакції (рис.4). З рисунку видно, що найбільшу чутливість до зміни концентрації KCl мають електроди, виготовлені із Pt. Чутливість Au-, Cu-, Ni- електродів трохи менша, але подібна для всієї групи, тоді як Cr-, Ti-, а особливо Al- електроди показують значно меншу (на порядок) чутливість. Це робить небажаним використання їх при створенні кондуктометричних ферментних біосенсорів. Для виготовлення кондуктометричних ферментних біосенсорів необов’язково використовувати лише благородні метали (Au та Pt), а цілком придатні більш дешеві матеріали (Ni, Cu), тому що перетворювачі на основі цих металів в цілому мають аналітичні характеристики, аналогічні перетворювачам на основі благородних металів. Але у випадку використання мідних електродів необхідно враховувати фактор часу роботи датчиків, тому що відбувається дуже швидке окислення поверхні електроду, і, відповідно, зниження чутливості.

Наступним важливим моментом при розробці перетворювача є вибір матеріалу підкладинки. Тому було проведено дослідження датчиків з електродами, нанесеними на скло, ситал та оксид кремнію. Було показано, що матеріал підкладинки не впливає в значній мірі на чутливість датчика до зміни провідності середовища. Основною вимогою, яку необхідно пред’являти до матеріалу підкладинки при виготовленні перетворювача, - він повинен бути непровідним. З технологічної точки зору найбільш зручно використовувати скло, яке, з одного боку, найбільш дешевий матеріал, а з другого - найменш крихкий.

Наступною важливою задачею було проведення експериментів по дослідженню впливу розмірів пальців гребінок та відстані між ними на чутливість датчиків. Вивчались дві групи датчиків. Перша складалась з електродів з характеристичними розмірами 20, 40 та 70 мкм та активною чутливою поверхнею 2.25 мм2, друга - з 10, 5, 2 и 0.5 мкм електродів з поверхнею
1.5 мм2. Для всіх зразків спостерігались подібні адміттансні криві.

На рис. 5 представлені залежності чутливості датчиків від концентрації солі в розчині для електродів з різними характеристичними розмірами. Для обох груп електродів чітко видно тенденцію зменшення чутливості датчиків зі зменшенням розмірів «пальців» гребінок та відстані між ними, тобто, при мініатюризації сенсора не треба технологічно складного збільшення кількості пальців на електроді за рахунок зменшення їх розмірів, як це вважалось раніше. Мініатюризацію можна проводити шляхом відносного зменшення як робочої поверхні електроду, так і характеристичних розмірів гребінок. Але, з іншого боку, не можна виготовляти електроди з великими «пальцями» (хоча чутливість перетворювача може бути більшою), тому що в цьому випадку критичною для чутливості сенсора є товщина мембрани. Основним при виборі розмірів сенсора є співвідношення між товщиною мембрани, характеристичними розмірами електродів та їх активною площиною.

(а) (б)

Рис. 5. Залежність відгуку сенсору від концентрації KCl для електродів з різними характеристичними розмірами (а - перша група, б - друга група).

Розробка ферментних біосенсорів на основі кондуктометричних планарних електродів та рН-чутливих польових транзисторів для визначення пеніциліну та порівняння їх основних аналітичних характеристик

Наступна задача, що стояла перед нами, - розробити ферментні сенсори на основі кондуктометричних перетворювачів та рН-чутливих польових транзисторів для кількісного аналізу пеніциліну та провести порівняння їх основних робочих характеристик.

В процесі реакції ферментативного гідролізу пеніциліну під дією пеніцилінази в мембрані утворюються додаткові іони, які призводять до зміни як рН розчину, так і його провідності, що дозволяє використовувати для вимірів обидва типи перетворювачів [Архипова и др., 1996].

На рис. 6 представлені калібрувальні криві пеніцилінових біосенсорів на основі кондуктометричних планарних електродів (а) і рН-чутливих польових транзисторів (б), отримані у фосфатному буфері, рН 7, різної концентрації.

Можна бачити, що в обох випадках спостерігається такий ефект: з одного боку, збільшення концентрації буферу призводить до розширення динамічного діапазону роботи датчика, що є позитивним моментом, а з іншого боку, - до падіння величини відгуку, а відповідно чутливості сенсора, що є негативним моментом. При збільшенні концентрації буферу в 10 разів відбувається падіння амплітуди відгуку теж в 10 разів. Для кондуктометричного сенсора це пояснюється, головним чином, зростанням іонної сили розчину при збільшенні концентрації буферу [Архипова и др., 1996]. Відгук сенсора на основі рН-ПТ не залежить в такій мірі від іонної сили. В цьому випадку основним лімітуючим фактором є саме буферна ємність. Однак в обох випадках ми маємо можливість підбирати необхідний діапазон роботи сенсора, змінюючи буферну ємність зразку.

(а) (б)

Рис. 6. Калібрувальні криві пеніцилінових біосенсорів на основі кондуктометричних електродів (а) і рН-чутливих польових транзисторів (б), отримані у фосфатному буфері, рН 7, різної концентрації.

Таким чином було показано, що основні аналітичні характеристики обох датчиків подібні, сенсори характеризуються малим часом відгуку та високою операційною стабільністю. Але з технологічної точки зору планарні кондуктометричні електроди простіші та дешевші при виготовленні, що робить їх більш перспективними для створення біосенсорів.

Кондуктометричні біосенсори було використано для аналізу вмісту бензилпеніциліну в деяких комерційних препаратах антибіотиків різних заводів-виробників. Результати експериментів наведено в табл.1.

Таблиця 1.

№ п/п | Субстрат | Завод-виробник | Відгук, мкСм | Похибка, %

1 | Натрієва сіль бензилпеніциліну | Київський завод медпрепаратів | 51,61,6 | 3,1

2 | Калієва сіль бензилпеніциліну | Саранський завод медпрепаратів | 45,62,3 | 5,0

3 | Натрієва сіль бензилпеніциліну | Красноярський з-д медпрепаратів | 51,62,1 | 4,1

4 | Калієва сіль бензилпеніциліну | Київський завод медпрепаратів | 46,01,8 | 3,9

5 | Натрієва сіль ампіциліну | Київський завод медпрепаратів | 18,01,6 | 8,8

6 | Новоцин | Київський завод медпрепаратів | 25,22,3 | 9,1

Як видно з таблиці (зразки 1-4), відгуки сенсора на одну і ту ж лікарську форму антибіотика (калієва чи натрієва сіль) були однакові для препаратів різного походження, що свідчить про однаковий вміст антибіотика. Крім того, для оцінки селективності біосенсора були використані інші препарати антибіотиків пеніцилінового ряду (зразок 5, 6). Як можна бачити з таблиці, сенсор не характеризується абсолютною селективністю. Відгуки на ампіцилін та новоцин складали 35 % та 49 %, відповідно.

Оптимізація роботи глюкозного кондуктометричного біосенсора та дослідження факторів, що покращують його аналітичні характеристики

В основі роботи кондуктометричного біосенсора для визначення глюкози лежить реєстрація зміни концентрації протонів, яка має місце в результаті диссоціації глюконової кислоти, яка утворюється в мембрані при окисленні глюкози за допомогою ГОД за схемою:

ГОД

-D-глюкоза + О2 + Н2О ----------> D-глюконо--лактон + Н2О2

глюконова кислота

глюконат-іон + Н+

Раніше розроблений біосенсор [Shul’ga et al., 1993] мав область лінійної залежності величини відгуку сенсора від концентрації субстрату 0,1 - 1,5 мМ. Крім того, він характеризувався значною залежністю характеристик від факторів середовища: буферної ємності, іонної сили та рН, що ускладнювало проведення експериментів з реальними рідинами.

Вузький діапазон роботи глюкосенсора можна пояснити лімітуванням ферментативної реакції перетворення глюкози до глюконолактону за допомогою кисню - косубстрату цієї реакції [Soldatkin et al., 1995]. Було запропоновано такі шляхи розширення динамічного діапазону роботи глюкосенсора: 1) збільшення концентрації кисню в зразках пробулькуванням останнього; 2) коіммобілізація в ферментну мембрану додаткового ферменту каталази, яка розщеплює Н2О2 з виділенням кисню; 3) використання K3[Fe(CN)6] як альтернативного окислювача; 4) зміна дифузійних характеристик ферментної мембрани за рахунок використання додаткових мембран різної природи.

Перші два способи не принесли значних результатів. Так, в першому випадку ми отримали розширення діапазону визначення глюкози до 10 мМ, однак, в аналітичній практиці пробулькування киснем сильно ускладнює процедуру визначення глюкози. Коіммобілізація ж каталази показала незначне розширення динамічного діапазону сенсора, тому що фермент не продукує, а лише частково регенерує вже використаний раніше кисень [Дзядевич та ін., 1995].

Наступним етапом роботи було використання фериціаніду калія як альтернативного кисню окислювача. Використання фериціаніду призводить до збільшення ступеня закислення розчину всередині ферментного шару (а відповідно до значного збільшення провідності), оскільки генерується три протони на одну молекулу глюкози замість одного як у випадку використання природного косубстрату кисню.

Принцип кондуктометрії складається з вимірювань загальної провідності зразка, і чутливість датчика зменшується при збільшені фонової провідності розчину. Таким чином вже при концентрації фериціаніду 40 мМ і вище, в умовах високочастотної кондуктометрії, не спостерігалося відгуку біосенсора на внесення глюкози. Тому необхідно було провести додаткові дослідження умов, при яких міг би бути використаний фериціанід калію при визначенні глюкози за допомогою кондуктометричного біосенсора.

На рис. 7 приведено адміттансні криві для кондуктометричного глюкозного біосенсора в 5 мМ фосфатному буфері (рН 7,4), що містив 150 мМ концентрацію фериціаніду калія до та після добавлення у розчин 5 мМ глюкози. Ми можемо бачити 10-кратне збільшення адмітансу на низьких частотах та відсутність змін на високих частотах. Це можна пояснити електроактивними властивостями самого фериціаніда калію. Тому подальші експерименти за участю фериціаніда проводились на частоті струму 3 Гц.

Калібрувальні криві кондуктометричного глюкозного біосенсора у 10 мМ фосфатному буфері, рН 7,4 за різних концентрацій фериціаніду представлено на рис. 8. Можна бачити, що при використанні високих концентрацій фериціаніду калібрувальна крива досягає насичення при більш високих концентраціях глюкози. При 160 мМ концентрації фериціаніду динамічний діапазон роботи сенсора розширюється до 20 мМ. Однак подальше збільшення концентрації фериціаніду не призводить до подальшого розширення динамічного діапазону біосенсора, але дещо збільшує його чутливість.

Рис. 7. Адміттансні криві для кондуктометричного глюкозного біосенсора в 5 мМ фосфатному буфері (pH 7,4), що містив 150 мМ фериціанід калію до (1) та після (2) добавлення у розчин глюкози до концентрації 5 мМ.

Рис. 8. Калібрувальні криві для глюкозного кондуктометричного біосенсору у 10 мМ фосфатному буфері, рН 7.4, за різних концентрацій фериціаніду калію (1 - 80 мМ, 2 - 120 мМ, 3 - 140 мМ, 4 - 150 мМ, 5 - 160 мМ та 6 - 200 мМ).

Теоретичний аналіз різних фізико-хімічних факторів та їх впливу на вигляд калібрувальних кривих глюкозного кондуктометричного біосенсора у присутності фериціаніда калію можна представити таким чином (рис. 9). Можна виділити такі основні області концентрації глюкози та процеси, що відповідають за хід калібрувальних кривих в цих областях: (1) - біокаталітична реакція, головним чином, визначається окисленням FADH2 за допомогою кисню; (2) в умовах «кисневого дефіциту» реакція визначається окисленням FADH2 фериціанідом калія, що призводить до утворення додаткових протонів; (3) основний вклад в амплітуду відгуку біосенсора починає вносити зміна буферної ємності та рН всередині ферментного шару.

Рис.9. Вплив різних фізико-хімічних факторів на вигляд калібрувальних кривих глюкозного кондуктометричного біосенсора у присутності фериціаніда калію (гіпотетичне уявлення).

Таким чином, була показана можливість розширення динамічного діапазону роботи кондуктометричного глюкосенсора до 20 мМ за рахунок використання фериціаніду калію як альтернативного окислювача. Але залежність від буферної ємності залишається [Dzyadevich et al., 1998], до того ж вимірювання необхідно проводити тільки на низьких частотах, що дещо ускладнює процедуру вимірювань, але дозволяє роботу в середовищах з великою іонною силою.

У подальшій роботі основну увагу було сконцентровано на використанні додаткових мембран різної природи, які наносяться зверху ферментативної мембрани для модифікації сенсора. В цьому випадку створюється дифузійний бар’єр для проникнення в мембрану молекул глюкози, у той час як розчинений кисень має змогу вільно проходити всередину мембрани.

На рис. 10 приведені калібрувальні криві звичайного глюкозного сенсора та сенсорів модифікованих різними додатковими мембранами.

Рис. 10. Калібрувальні криві звичайного глюкозного кондуктометричного біосенсора (1) та сенсорів модифікованих різними додатковими мембранами: 2% ПВБ (2), ПТГФ (3), Nafion (4) і ПВКС (5), отримані в 5 мМ фосфатному буфері, рН 7,4.

Використання 2 % ПВБ-мембрани дозволяє розширити динамічний діапазон роботи датчика до 10 мМ з незначним зменшенням чутливості (крива 2). Модифікація сенсора більш щільною додатковою 5 % ПВБ-мембраною не призводила до подальшого розширення динамічного діапазону роботи сенсора, але його чутливість значно падала. Для сенсора з додатковою 10 % ПВБ-мембраною відгуків на додавання глюкози не спостерігалось взагалі. Подібні результати були також отримані для політетрагідрофуранових мембран. Використання 2% ПТГФ-мембрани дозволяє розширити динамічний діапазон роботи датчика до 15 мМ без погіршення чутливості (крива 3).

Використання додаткової нафіон-мембрани призводить до розширення динамічного діапазона роботи сенсора до 10 мМ, а також до значного збільшення величини відгуку сенсора (крива 4). Ефект збільшення величини відгуку сенсора можна пояснити тим, що негативний заряд полімера перешкоджає проникненню всередину ферментної мембрани вільних негативно заряджених частинок буферу і, таким чином, блокує додатковий канал «полегшеної» дифузії протонів із мембрани, що призводить до збільшення провідності в мембрані.

Аналогічний ефект спостерігається при використанні додаткової позитивно зарядженної ПВКС-мембрани (крива 5). Збільшення амплітуди відгуку в даному випадку поясняється тим, що при використанні ПВКС-мембран за рахунок позитивно заряджених функціональних груп всередині полімеру створюється дифузійний бар’єр для вільних протонів, тим самим блокуючи звичайну дифузію протонів із мембрани.

Амплітуда відгуку глюкозного біосенсора дуже залежить від умов проведення експерименту, а саме буферної ємності та іонної сили аналізованих розчинів. На рис. 11 представлено залежність амплітуди відгуку сенсора від концентрації буферного розчину для сенсорів з додатковими мембранами та без них.

Рис. 11. Залежність величини відгуку кондукто-метричного глюкозного біосенсора без (1) та з додатковыми ПВКС (2), нафіон (3), ПТГФ (4) та ПВБ (5) мембранами від концентрації буферного розчину. Вимірювання проводились в калій-фосфатному буфері, рН 7,4, концентрація глюкози - 1 мМ.

З рисунку видно, що при використанні додаткової ПВКС-мембрани (крива 2) вплив буферної ємності на величину відгуку сенсора залишається практично таким же, як і у сенсорів без додаткової мембрани. Пояснити це можна таким чином. З одного боку наносячи позитивно заряджений полімер зверху ферментної мембрани ми блокуємо канал звичайної дифузії протонів, що утворюються в мембрані. А з іншого боку позитивно заряджений полімер притягує до себе вільні аніони із розчину (в тому числі і аніони буферу), в результаті чого їх концентрація біля мембрани збільшується, тим самим збільшуючи можливість їх проникнення всередину мембрани і взаємодію з протонами, що призводить до збільшення каналу «полегшеної» дифузії. Враховуючи, що головним фактором залежності величини відгуку сенсора від буферної ємності є наявність каналу «полегшеної» дифузії, зрозуміло, що ефект впливу на відгук сенсора буферної ємності в цьому випадку залишається.

Коли використовується додаткова нафіон-мембрана, то глюкозний кондуктометричний біосенсор стає менш чутливим до зміни буферної ємності середовища (крива 3). Таке зменшення впливу буферної ємності на відгук сенсора можна пояснити властивостями нафіон-полімеру. Тобто присутність нафіон-мембрани ефективно блокує транспорт негативно-заряджених частинок буферу через мембрану, внаслідок чого блокується канал «полегшеної» дифузії протонів із мембрани. Таким чином зменшується вплив буферної ємності середовища на величину відгуку сенсора.

При використанні додаткових ПВБ-мембрани (крива 5) та ПТГФ-мембрани (крива 4), вплив буферної ємності середовища на величину відгуку глюкозного кондуктометричного біосенсора стає ще меншим. Це може бути пояснено бар’єрними властивостями гідрофобних полімерних плівок для дифузії гідрофільних частинок буферу.

Також було вивчено вплив іонної сили розчину на величину відгуку сенсора [Дзядевич та ін., 1995, Архипова, 1998]. Показано, що при використанні додаткових мембран вплив іонної сили на величину відгуку дещо зменшується.

Порівняння операційної стабільності та відтворювальності роботи сенсору (з додатковими мембранами та без) показало, що сенсори з додатковими нафіон та ПВКС мембранами демонструють кращі характеристики. Так, розкид величин відгуку на добавлення 1 мМ глюкози для звичайного сенсора складав біля 10%. У випадку сенсора з додатковими мембранами розкид зменшувався до 5 % та значно збільшувалась операційна стабільність.

Використання кондуктометричних біосенсорів для аналізу реальних зразків

Аналіз концентрацій глюкози в сироватці крові щурів

Як об’єкти дослідження брали сироватку крові щурів з Чорнобильскої зони відчуження. Контрольні визначення глюкози в крові проводили по стандартній методиці з використанням ферментного набору «Діаглюк» Львівського підприємства лікарських препаратів (м.Львів, Україна) та за допомогою аналізатора «Ексан-Г» (Латвія).

Для визначення концентрацій глюкози біосенсорним методом використовували частину калібрувальної кривої до 1,5 мМ у модельному розчині, що відповідало 60 мМ глюкози в нерозведеній сироватці (розведення в 40 разів).

Ефективність проведення аналізів глюкози в сироватці крові за допомогою біосенсора була перевірена з використанням методу стандартних додавань. На рис. 12 приведені порівняльні криві для вимірювань, отриманих за допомогою біосенсору та набору «Діаглюк». З рисунку видно, що у випадку визначення концентрації глюкози за допомогою біосенсора ми маємо майже 100% узгодження даних (фактор лінійності 1,03, похибка визначення 3%) на відміну від визначень за допомогою «Діаглюка» (фактор лінійності 0,88, похибка визначення 12%). Це свідчить про високий ступінь точності для вимірювань з використанням біосенсору. Екстраполяція ж кривої на вісь х дає значення концентрації глюкози в пробі (без штучного додавання глюкози).

На рис. 13 показано порівняльні результати аналізу глюкози в сироватці крові щурів, отримані за допомогою трьох різних методів. З рисунку чітко видно кореляцію даних. Краще співпадання відмічається для результатів, отриманих за допомогою біосенсора та «Ексану-Г», що може бути пов’язано з однаковими принципами формування відгуків. У випадку набору «Діаглюк» (фотометричний метод) може мати місце вплив забарвлення зразків на результати аналізів.

Рис. 12. Порівняльні криві визначення глюкози в сироватці крові за допомогою кондуктометричного біосенсору та ферментного набору «Діаглюк».

Рис. 13. Порівняльні результати аналізів, отримані за допомогою різних методів.

Кількісна оцінка кореляції даних, отриманих за допомогою трьох методів в 29 різних пробах сироватки крові щурів показала високе співпадання результатів, отриманих за допомогою кондуктометричного біосенсора та аналізатора «Ексан-Г» (коефіцієнт кореляції - 2,2 %).

Біосенсори демонстрували операційну стабільність протягом 48 годин роботи, що дозволяло провести 200-300 вимірів глюкози в реальних зразках на одному датчику.

Аналіз концентрацій глюкози в культуральних рідинах

Контроль і оптимізація процесів виробництва біологічно-активних препаратів вимагає швидкої та відтворюваної інформації про концентрацію субстратів та продуктів, а також про концентрацію мікроорганізмів і їх фізіологічний стан (клітинна маса, поглинання С-джерела (глюкоза), стан N-джерела (амоній та амінокислоти) тощо). Тому було проведено експерименти по застосуванню розробленого біосенсора для визначення концентрацій глюкози в культуральних рідинах.

Культуру клітин мікроорганізмів Klebsiella оxitoca вирощували в споживному середовищі LB з добавленням 40 мМ глюкози протягом доби при температурі 37С при постійному перемішуванні та періодично відбирали проби для контролю рівню глюкози в середовищі. Порівняльні результати аналізів, отримані за допомогою двох методів вимірювання (біосенсорний і класичний фотометричний), представлено на рис. 14.

Рис. 14. Порівняльні результати аналізів концентрації глюкози при вирощуванні культури клітин Klebsiella оxitoca. Культуру мікроорганізмів вирощували в споживному середовищі LB

На діаграмі видно хороше співпадання даних, отриманих різними методами, а також динаміку зменшення концентрацій глюкози при рості культури клітин. Таким чином наш біосенсор з успіхом можна використовувати для контролю вирощування культур в лабораторній практиці.

Розроблений біосенсор також було застосовано для аналізу інших культуральних рідин, у тому числі, в зразках промислового виробництва, отриманих на Ладижинському заводі «Ензим» безпосередньо з ферментерів (табл. 2).

Таблиця 2.

№ п/п | Зразок | Джерело | Концентрація, мМ | Похибка, %

1 | Лужна протеаза | «Ензим», м.Ладижин | 3,70,3 | 8,1

2 | Глюкоамілаза | «Ензим», м.Ладижин | 30,01,5 | 5,0

3 | Середовище Ігла | Відділ генетики людини ІМБІГ | 3,60,3 | 8,3

4 | Середовище LB | Відділ регуляторних механізмів клітини ІМБІГ | 18,01,0 | 5,6

Біосенсори демонстрували операційну стабільність протягом 48 годин роботи, що дозволяло провести 200-300 вимірів глюкози в реальних зразках на одному датчику.

ВИСНОВКИ

1.

1.

1.

1.

1.

1.

ПЕРЕЛІК РОБІТ, ЩО ОПУБЛІКОВАНІ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1.

S.V. Dzyadevich, A.A. Shul'ga, S.V. Patskovsky, V.N. Arkhipova, A.P. Soldatkin, V.I. Strikha. Thin-films conductometric transducer for enzyme biosensor // Russian Journal of Electrochemistry (by Interperiodica, USA).- 1994.- V. 30, No 8.- P. 887-891.

1.

1.

1.

1.