Львівський державний медичний університет

імені Данила Галицького

Савицький Ярослав Михайлович

УДК 612.323-612.327/.337].018.2

Вплив меланіну на секреторну функцію шлунка, процеси цитопротекції та моторику проксимального відділу травної системи

14.03.03 – нормальна фізіологія

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата медичних наук

Львів – 2002

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана у Львівському державному медичному університеті імені Данила Галицького МОЗ України.

Науковий керівник:

доктор медичних наук, професор

Кімакович Віктор Йосипович,

Львівський державний медичний університет імені Данила Галицького,

завідувач кафедри ендоскопії

Офіційні опоненти:

доктор медичних наук, професор

Шевчук Віктор Григорович,

Національний медичний університет

імені О.О.Богомольця МОЗ України,

завідувач кафедри нормальної фізіології

Доктор медичних наук, професор

Ємельяненко Ірина Всеволодівна,

Івано-Франківська державна медична академія МОЗ України,

завідувач кафедри нормальної фізіології

Провідна установа:

Дніпропетровська державна медична академія МОЗ України

Захист відбудеться 30.09.2002 року о 12 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради д 35.600.03 при Львівському державному медичному університеті імені Данила Галицького МОЗ України(79010, м.Львів, вул. Пекарська, 69)

З дисертацією можна ознайомитися у науковій бібліотеці Львівського державного медичного університету імені Данила Галицького (79010, м. Львів, вул. Січових стрільців, 6)

Автореферат розісланий 27.08.2002 р.

Вчений секретар

Спеціалізованої вченої ради Федорів Я.М.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Вивчення механізмів регуляції шлункової секреції, процесів цитопротекції слизової оболонки шлунка та дванадцятипалої кишки, моторики верхніх відділів травної системи посідає одне з провідних місць у сучасних фізіологічних дослідженнях. Це пов'язано з тим, що відкриття нових нейрональних механізмів виділення медіаторів, ідентифікація численних мембранних рецепторів секреторних та гладеньком'язових клітин і пов'язаних з ними внутрішньоклітинних каскадних механізмів зумовило якісно новий рівень уявлення про координацію секреції та моторики, підтримання відповідного рівня метаболізму та цитопротекції. Меланін належить до біологічних речовин, вплив яких на функції органів травної системи не з'ясовано, водночас проведені раніше дослідження засвідчили цитопротекторну дію меланіну, отриманого з чорнильних сумок морських тварин Ommastrephes batrami Lesuel (Mimura T. et al., 1985), березового гриба чаги (Рыжова Г.Л. и соавт., 1997) та з винограду (Жеребин Ю.Л. и соавт., 1984). Попередні дослідження виявили участь меланінових пігментів у процесах радіо- і фотопротекції (Кострова Л.Н. и соавт., 1993, Mosse I. B., Lyakh I. P., 1994; Krol, Liebler, 1998; Mosse I.B. et al., 2000), імуномодуляції (Подымова Н.Г. и соавт. 1988), протипухлинного захисту (Kobayashi N. et al., 1993; Li W., Hill H. Z., 1997; Matsuda H. et al., 1996), їх антиоксидантну (Жеребин Ю.Л. и соавт., 1982) і антирадикальну дію (Сакина Н.А. и соавт., 1980; Postaire E. et al., 1997), нейролептичний (Jellinger К.А., 1999), гепато- і стреспротекторний (Жеребин Ю.Л. и соавт., 1982; Stokes A.H. et al., 1996), антитоксичний (Schmitz S. et al., 1995), ефекти.

Більшість природних меланінів існує в нерозчинній формі, що є однією з головних причин обмеженої інформації про їх властивості. Створення синтетичних розчинних меланінів та дослідження їх фізіологічних та хімічних властивостей засвідчило їх ефективний вплив на ключові процеси клітинного метаболізму, широту спектра біологічної активності, що роблять ці речовини привабливими для використання як діючі субстанції фармацевтичних препаратів (Corsaro C. et al., 1995; Zhang X. et al., 2000; Sulzer D., et al., 2000; Taieb A., 2000; Yanase H. et al., 2001). Це дає змогу вирішити проблему цілеспрямованої дії меланіну (або його комплексу з іншими речовинами) на певні обмінні процеси клітини (Борщевская М.И., Васильева С.М., 1999). Таким чином, слід сподіватися швидкого прогресу в ділянці фармакологічного застосування меланінових пігментів.

На основі меланіну, отриманого з чаги (Inonotus oblique), було створено лікарський препарат "Бефунгін" для лікування хвороб травного каналу (Патент РФ 1805968, 1993). Вивчаються антивиразкові властивості пігменту меланіну, отриманого з Ommastrephes batrami Lesuel (Mimura T. et al., 1985). У дослідженнях біологічної активності еномеланіну, отриманого з винограду Vitis viniera L., встановлено його виражену антивиразкову дію (Жеребин Ю.Л. и соавт., 1984).

Дослідження впливу меланіну на функції органів шлунково-кишкового каналу має не лише фундаментальне, але і практичне значення. Це пов'язано з участю меланіну у патогенезі виразкової хвороби та його протекторними властивостями (Sharp J.R. et al. 1980). Обмеженість даних про вплив меланіну на органи травного каналу не дають змоги однозначно пояснити механізм дії пігменту, через що виникла потреба у проведенні комплексних досліджень впливу меланіну на функції органів травного каналу з метою можливості використання його для створення різних лікарських форм, у тому числі з антивиразковою дією.

Таким чином, відсутність цілісного уявлення про вплив меланіну, отриманого з чорних дріжджів Nadsoniella nigra var. hesuelica, на секреторну функцію шлунка та моторно-евакуаторну функцію проксимального відділу травного каналу послужили основою для проведення досліджень. З іншого боку було необхідно оцінити його цитопротективні властивості порівняно з "Бефунгіном", активною субстанцією якого є меланін, отриманий з березового гриба Inonotus oblique, та з меланіном синтетичного походження (фірми "Sigma").

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Тема кандидатської дисертації затверджена на засіданні Вченої ради факультету післядипломної освіти Львівського державного медичного університету імені Данила Галицького МОЗ України 28 січня 1999 року, протокол №1. Дисертаційна робота є фрагментом комплексної теми кафедри нормальної фізіології Львівського державного медичного університету імені Данила Галицького № державної реєстрації 0100U002258 "Дослідження особливостей функціонально-метаболічних резервів секреторних органів травного каналу та встановлення критеріїв їх оцінки за умов впливу екзо- та ендоекологічних факторів".

Метою роботи було дослідити вплив меланіну, отриманого з чорних дріжджів Nadsoniella nigra var. hesuelica, на секреторну та моторно-евакуаторну функції шлунка та дванадцятипалої кишки (ДПК) у собак та цитопротекторні процеси в слизовій оболонці шлунка (СОШ) у щурів.

Задачі досліджень:

1. Вивчити ефект та механізм дії меланіну на періодичну та харчову моторну активність шлунка та тонкої кишки у собак.

2. Провести порівняльні дослідження впливу меланіну та прокінетика еритроміцину на моторну активність проксимального відділу травного каналу.

3. Дослідити вплив меланіну на тривалість евакуації зі шлунка їжі вуглеводного складу, на швидкість пропульсії по тонкій кишці та рН дуодентального хімусу.

4. Вивчити вплив меланіну на базальну та стимульовану шлункову секрецію у собак та щурів.

5. Вивчити вплив меланіну на цитопротекторні процеси у СОШ у щурів на фоні нейродистрофічних ушкоджень, викликаних методами "соціального стресу" та введенням серотоніну, етанолу та норадреналіну.

6. Вивчити вплив меланіну на перекисне окислення ліпідів та активність ферментів антиоксидантної системи в СОШ у щурів.

7. Провести порівняльні дослідження цитопротективних властивостей меланіну, отриманого з чорних дріжджів Nadsoniella nigra var. hesuelica, з меланіном синтетичного походження, а також з впливом інших препаратів цитопротективної дії.

Об'єкт досліджень: механізми регуляції функцій органів травної системи.

Предмет досліджень: оцінка дії меланіну, отриманого з чорних дріжджів, на шлункову секрецію, процеси цитопротекції в СОШ, моторну функцію проксимального відділу травної системи.

Методи дослідження. За умов хронічного експерименту на собаках з фістулами шлунка та ДПК за Басовим і Павловим вивчали вплив меланіну, отриманого з чорних дріжджів N. nigra var. hesuelica, на стимульовану шлункову секрецію, періодичну та харчову моторику шлунка та ДПК балонографічним методом, швидкість евакуації зі шлунка їжі вуглеводного складу методом багаторазового дренування фістули ДПК та швидкість пропульсії по тонкій кишці. Для оцінки шлункової секреції визначали інтенсивність соковиділення, кислотність шлункового соку та вміст в ньому пепсину. Ступінь виразкоутворення оцінювали за кількістю виразок, ерозій, масивних крововиливів, що виникали в СОШ за впливу "соціального стресу", серотоніну, етанолу та норадреналіну. Процеси цитопротекції, а власне перекисне окислення ліпідів (ПОЛ) і антиоксидантний захист оцінювали на основі визначення малонового діальдегіду (МДА), дієнових кон'югатів (ДК), Шиффових основ та активності ферментів антиоксидантної системи (АОС) — супероксиддисмутази (СОД) та каталази у слизовій оболонці шлунка.

Наукова новизна отриманих результатів. У роботі вперше проведено комплексний аналіз впливу меланіну на функції проксимального відділу травного каналу та стан його слизової оболонки. Уперше було з'ясовано, що меланін, отриманий з чорних дріжджів N. nigra var. hesuelica, стимулює моторно-евакуаторну функцію шлунка та моторику ДПК і на відміну від інших прокінетиків при повторному введенні не викликає тахіфілаксії. При цьому встановлено, що стимулюючий вплив меланіну на моторну активність шлунка та ДПК має холінергічну природу. Уперше доведено, що меланін прискорює евакуацію зі шлунка їжі вуглеводного складу, збільшує швидкість пропульсії по дванадцятипалій кишці та підвищує pН дуоденального хімусу. Вперше показано, що у щурів меланін гальмує секрецію соляної кислоти, стимульовану гістаміном та пентагастрином, не впливаючи на її базальну секрецію. У собак меланін пригнічує шлункову кислотопродукцію, стимульовану гістаміном, не впливаючи на виділення пепсину. Засвідчено цитопротективні властивості меланіну щодо слизової шлунка. Він суттєво зменшує структурно-геморагічні ураження в СОШ у щурів, викликані методами "соціального стресу", введенням серотоніну, етанолу і норадреналіну. При цьому у слизовій оболонці шлунка пригнічуються процеси ПОЛ і водночас зростає активність ферментів АОС. Меланін, отриманий з чорних дріжджів N. nigra var. hesuelica, має вираженіші цитопротективні властивості, ніж меланін, отриманий з березового гриба чаги (Inonotus oblique), що є активною субстанцією лікарського препарату "Бефунгін". Виявлені ефекти дії меланіну на функції органів травної системи та стан слизової оболонки шлунка послужили основою для створення концепції антивиразкової дії меланіну.

Практичне значення отриманих результатів. Результати експериментальних досліджень впливу меланіну на моторну активність шлунково-кишкового каналу, швидкість евакуації зі шлунка їжі вуглеводного складу та пропульсії по дванадцятипалій кишці роблять його перспективним для клінічного вивчення як прокінетика при різних патологічних станах: для профілактики та лікування рефлюксної хвороби, післяопераційних парезів і хронічних закрепів різної етіології. Виявлені антисекреторні і гастропротективні властивості меланіну є передумовою для розробки і клінічних випробувань нових препаратів на основі меланіну для лікування кислотоасоційованих захворювань верхніх відділів травного каналу.

Матеріали дисертації впроваджено у навчальний процес кафедри фізіології людини і тварин біологічного факультету Київського національного університету імені Тараса Шевченка, і кафедр нормальної фізіології Львівського державного медичного університету імені Данила Галицького, Полтавської державної медичної стоматологічної академії.

Особистий внесок здобувача. Здобувач визначив напрямок, обсяг, мету досліджень, сформулював завдання, обґрунтував та вибрав методи досліджень, виконав експериментальну частину роботи, провів статистичну обробку матеріалу, підготував наукові праці до друку. Разом з науковим керівником було проведено обговорення та узагальнення результатів. Дослідження моторно-евакуаторної функції травного каналу у собак проведені спільно з к. б. н., старшим науковим співробітником М. М. Харченко у відділі фармако-фізіології НДІ фізіології біологічного факультету Київського національного університету імені Тараса Шевченка та проконсультовані зав. відділу фармако-фізіології, д. б. н., старшим науковим співробітником Т. В. Береговою.

Апробація результатів дисертації. Основні положення дисертаційної роботи доповідались і обговорювались на другому Європейському конгресі фармакологів (Будапешт, 1999), п'ятому Російському гастроентерологічному тижні (Москва, 1999), VI міжнародній конференції "Інформотерапія: теоретичні аспекти і практичне застосування" (Київ, 2000), Першій Львівсько-Люблінській міжнародній конференціії з експериментальної та клінічної біохімії (Львів, 2000), засіданнях кафедри ендоскопії та малоінвазивної хірургії з представниками кафедри нормальної фізіології Львівського державного медичного університету імені Данила Галицького (2001-2002).

Публікації. За результатами досліджень опубліковано сім друкованих праць, з них три — у фахових наукових виданнях, чотири — у матеріалах і тезах наукових конференцій та з'їздів.

Об'єм і структура дисертації. Дисертація складається зі вступу, огляду літератури, матеріалів та методів досліджень, 2 розділів власних досліджень, аналізу та узагальнення отриманих результатів, висновків, списку використаних джерел, що містять 264 найменувань (з них 89 — країн СНД, 175 — інших країн), трьох додатків. Основні матеріали дисертаційної роботи викладено на 133 сторінках машинописного текcту, ілюстровані 17 таблицями та 19 рисунками.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріали та методи досліджень. Дослідження проведені у хронічних експериментах на 3 безпородних собаках вагою 16—20 кг і в гострих експериментах на 232 білих нелінійних щурах-самцях та на 12 щурах лінії Вістар вагою 180—200 г. Перед початком досліджень собакам було вживлено фістули у фундальний відділ шлунка та ДПК за Басовим-Павловим. Оперативні втручання проводились під загальним знечуленням (35 мг/кг нембуталу, внутрішньовенно).

Моторну активність шлунка та ДПК у собак реєстрували балонографічним методом за допомогою установки, яка складається з чутливого механотрона, лінійного електроманометра і пишучого двоканального реєстратора РПЧ-2 (Гройсман С.Д., 1968; Суходоля А.І., 1999).

Евакуаторну функцію шлунка досліджували за допомогою метода багаторазового дренування фістули ДПК при використанні в якості маркерів сфер з харчової гуми. Тваринам натще після промивання шлунка згодовували 100 г хліба, змоченого 50 мл молока. Для врахування кількості їжі, що покидає шлунок, у раціон додавали 600 гумових сфер. Густина сфер — 1,1 г/см3, яка є близькою до густини вмісту шлунка. Діаметр кожної сфери не перевищував 1—1,5 мм, що забезпечувало їх проходження разом з хімусом через пілоричний сфінктер (Гройсман С.Д., Бегека А.Д., 1972; Суходоля А.І., Харченко М.М., Берегова Т.В., 1999). Сумарний об'єм сфер не перевищував 1,5 см3. Таким чином, додавання їх до їжі на об'ємі не позначалося.

Паралельно з вивченням швидкості евакуації хімуса зі шлунка вимірювалася швидкість пропульсії по порожній кишці. Для цього через фістулу ДПК вводили поліуретановий болюс діаметром 0,6 см і довжиною 1,5 см. За формою болюс нагадує "сигару" і загалом відповідає формі природнього болюса з хімуса. До кінця болюса прикріплювалася 10-сантиметрова волосінь з обмежувачем на кінці. Волосінь проходила через отвір в корку, яким закривалася фістула. Визначали час, за який обмежувач досягав корка і на основі отриманих вимірів (не менше 3 за кожні 30 хв) розраховували швидкість пропульсії по порожній кишці (Суходоля А.І.,1999; Суходоля А.І., Харченко М.М., Берегова Т.В., 1999).

Моторну активність шлунка та ДПК, евакуацію зі шлунка їжі вуглеводного складу та швидкість пропульсії по кишці визначали при введенні меланіну в дозах 5—20 мг/кг, внутрішньокишково або внутрішньовенно.

Шлункову секрецію у собак досліджували в хронічних експериментах. Досліди починали натщесерце при відсутності базальної секреції та лужному вмісту шлунка. Стимулятором шлункової секреції було обрано гістамін, який вводили підшкірно в дозі 0,05 мг/кг (Скляров А.Я., 1987; 1993; Берегова Т.В., 2001). Упродовж дії гістаміну (1,5 години) в 30-ти хвилинних пробах вимірювали об'єм шлункового соку в мл, визначали електротитрометрично кислотність соку (Гройсман С.Д., Губкин В.А., Береговая Т.В., 1988) та концентрацію пепсину колориметричним методом, використовуючи як субстрат ліофізовану плазму людської крові. У кожній пробі виділеного шлункового соку розраховували дебіт кислоти в ммоль та дебіт пепсину в мг. Після чого обчислювали дебіт кислоти та дебіт пепсину, що виділився за весь дослід. Меланін у дозі 15 мг/кг вводили внутрішньокишково за 30 хв до введення гістаміну.

Вплив меланіну порівнювали з антисекреторною дією препаратів, які широко використовують в експериментальній та клінічній практиці, а саме: Н2-блокатора ранітидину (Rivopharm, Швейцарія) та М1-холінолітика гастроцепіну (Boehringer Ingelheim, Австрія). Ранітидин вводили внутрішньокишково в дозах 0,0125; 0,025 та 0,05 мг/кг за 30 хв до введення гістаміну. Гастроцепін вводили в дозі 0,08 мг/кг підшкірно (Скляров О.Я., Косий Є.Р., Скляров Є.Я., 1997).

Вивчення секреторної функції шлункових залоз у щурів проводилося в гострих дослідах методом перфузії шлунка (Бондарчук Т.І., 2002; Rother J.D. et al., 1995). Досліджували дію меланіну в дозі 20 мг/кг при внутрішньоочеревинному введенні на фоні базальної та стимульованої гістаміном (3 мг/кг, внутрішньоочеревинно) і пентагастрином (230 мкг/кг, внутрішньоочеревинно) секреції соляної кислоти.

Нейродистрофічні ураження у слизовій оболонці шлунка викликали методом 24-годинного іммобілізаційного стресу в модифікації С.Д.Гройсмана та Т.Г.Каревіної (1979), названого авторами "соціальним стресом". Моделювання уражень в СОШ також проводили, застосовуючи серотонін (Корякина Л.А., Серова Л.И., 1987), норадреналін (Белостоцкий Н.И., 1988; Комаров В.И. и соавт., 1984), етанол (Esplugues J.V. et al., 1993). Усі препарати вводили натще: серотонін-креатинин сірчанокислий — внутрішньоочеревинно у дозі 10 мг/кг, норадреналін — внутрішньоочеревинно у дозі 2 мг/кг, етанол — перорально об'ємом 1 мл в концентрації 96%. При дослідженні цитопротективних властивостей меланіну останній вводили в дозі 20 мг/кг перорально за 30 хв до дії ульцерогенного фактору. Дію меланіну порівнювали з дією антивиразкових препаратів: блокатора Н2-гістамінових рецепторів — ранітидину (20 мг/кг, per os), блокатора М1-холінорецепторів — гастроцепіну (30 мг/кг, внутрішньоочеревино) та блокатора протонної "помпи" — омепразолу (0,29 мг/кг, внутрішньоочеревино). Було порівняно дію меланіну, отриманого з чорних дріжджів N. nigra var. hesuelica, з "Бефунгіном" (0,45 мл/кг, перорально), активною субстанцією якого є меланін, отриманий з березового гриба Inonotus oblique, та з меланіном синтетичного походження ("Sigma").

За допомогою гастроскопа при трансілюмінаційному освітленні досліджували стан слизової оболонки шлунку. Диференційно підраховували кількість наступних уражень слизової оболонки шлунка: 1) виразки — у вигляді глибоких округлих уражень слизової оболонки з фібринозним нальотом на дні та запальним валиком навколо неї; 2) ерозії — у вигляді тріщин слизової; 3) масивні крововиливи — бурі або чорні плями овальної форми діаметром 2—3 мм і більше; 4) краплинні крововиливи — червоні плями діаметром менше 1 мм. Ефективність препаратів оцінювали за ступенем виразкоутворення в слизовій оболонці шлунка (середня кількість виразок на 1 тварину в групі), відсотку тварин з виразками, індексу Паулса і противиразковою активністю.

Про стан процесів ПОЛ в СОШ судили на основі визначення МДА, ДК, Шиффових основ. Вміст МДА визначали за методом Тимирбулатова Р.А. та Селезнева Е. И. (1991), ДК та Шиффові основи визначали за методом Стальної І.Д. (1977).

Антиоксидантний захист оцінювали за активністю ферментів — СОД (за методом В.А.Костюка, 1990) і каталази (за методом М.А.Королюка, 1988).

Статистичну обробку результатів досліджень проводили на PC Pentium 233 з використанням електронних таблиць Microsoft Excel 97 шляхом визначення парного і непарного критерію t (Стьюдента).

Прилади, що використовувалися для наукових досліджень, підлягали метрологічному контролю.

Результати досліджень та їх обговорення

Вплив меланіну на моторну функцію шлунка та тонкої кишки. Внутрішньокишкове введення меланіну в дозах 3 та 6 мг/кг не впливало на періодичну моторну діяльність шлунка та ДПК. Тривалість періоду роботи залишалася в межах 17—20 хв, періоду спокою — 50—70 хв, що відповідає нормі. Внутрішньовенне введення меланіну в дозі 5 мг/кг на фоні періоду спокою індуковало виникнення тривалої моторної реакції в кишці через 40 с. Між моторними індексами, що реєструвалися протягом періоду спокою в кишці в контрольних дослідах, та в дослідах з введенням меланіну статистично достовірної різниці не було.

Внутрішньовенне введення меланіну в дозі 20 мг/кг на фоні харчової моторики шлунку і ДПК спочатку викликало пригнічення моторики шлунково-кишкового каналу, яке тривало до 20 хв, у подальшому моторика шлунка і ДПК посилювалася, причому підсилення було суттєвішим у шлунку. За показниками інтегратора у шлунку підсилення моторики складало 70—100% від вихідного рівня. Тривалість реакції становила 30—45 хв (рис. 1).

Рис. 1 Вплив меланіну (20 мг/кг, внутрішньовенно) на харчову моторику

1 — крива моторики шлунка;

2 — крива моторики ДПК;

3 — відмітка введення меланіну;

швидкість запису — 1 см за 1 хв.

При введенні меланіну в кишку (20 мг/кг) на фоні харчової моторики через 40—60 хв виникало виражене підсилення моторики шлунка, яке тривало 50—60 хв (рис. 2).

Рис. 2. Харчова моторика шлунка (верхня крива) та ДПК (нижня крива) через 40 хв після внутрішньокишкового введення меланіну в дозі 20 мг/кг

Неселективний блокатор мускаринових ацетилхолінових рецепторів атропін усував, а вибірковий блокатор М1-мускаринових ацетилхолінових рецепторів гастроцепін різко послаблював стимулюючий вплив меланіну на моторну активність шлунка та ДПК, що свідчить про холінергічний механізм його прокінетичної дії.

Отримані результати щодо стимулюючого впливу меланіну на моторну активність шлунково-кишкового каналу роблять його перспективним для клінічних досліджень при лікуванні атонічних станів шлунка і кишки. Це спонукало нас провести дослідження на предмет тахіфілаксії, яка є лімітуючим фактором для повторного використання при стимуляції моторики шлунково-кишкового каналу такого відомого прокінетика, як серотонін (Черпак Б.Д. і співавт., 1996). Повторно меланін вводили в різні періоди після завершення реакції на попереднє введення. При внутрішньовенному введенні меланіну (5 мг/кг) ні через 10 хв, ні через 30—40 хв сила і тривалість моторної реакції на меланін не змінювалась, що свідчить про відсутність тахіфілаксії.

Порівняння впливу меланіну на моторну активність шлунка та ДПК з дією відомого прокінетика еритроміцину засвідчило, що еритроміцин у дозах понад 0,5 мг/кг іноді викликає скорочення так званого рідкого ритму, тобто скорочення типу А за С.В.Анічковим з частотою 1—2 рази за 1 хв. Водночас у ДПК реєструвалися хаотичні досить сильні скорочення з частотою 7—12 разів за 1 хвилину. Подібна моторика могла тривати 120—150 хв, після чого відновлювалася звичайна періодична моторна активність. Ця моторика трактується як прояв дезорганізації періодичної активності шлунка. При введенні еритроміцину на фоні харчової моторики спостерігалося чітке посилення моторики шлунка та ДПК, що проявлялося в збільшенні амплітуди скорочень, характер її залишався харчовим. Якщо доза еритроміцину була більшою ніж 2—3 мг/кг, то після збільшення амплітуди скорочень шлунка і ДПК у шлунку виникав типовий рідкий ритм, тобто реєструвалися скорочення типу А. У той самий час у кишці реєструвалися хаотичні неритмічні скорочення високої амплітуди. Така моторика зберігалася упродовж 2—3 годин. Скорочення типу А є нетиповими для харчової моторики шлунка, у наповненому їжею шлунку вони виникають тільки у ваготомованих тварин.

Таким чином, меланін посилює моторну активність шлунка та ДПК, при цьому, на відміну від еритроміцину, він не змінює періодичний характер моторики та не викликає дезорганізації у харчовій моториці.

Вплив меланіну на евакуаторну функцію шлунка. Оскільки евакуаторна функція шлунка залежить від моторної активності гладеньких м'язів шлунка та кишок, отримані дані щодо впливу меланіну на періодичну і, особливо, харчову моторику, дозволяють припустити, що він не є індиферентною субстанцією щодо евакуації зі шлунка та пропульсії по кишці.

Виявлено, що внутрішньокишкове введення меланіну в дозі 5 мг/кг зменшувало тривалість евакуації зі шлунка 100 г хліба з 289,5+16,0 хв до 223,5+21,6 хв, або на 22,8% (p < 0,05). При збільшенні дози меланіну до 10-20 мг/кг час евакуації їжі вуглеводного складу статистично вірогідно не відрізняється від контрольних експериментів.

У наступній серії досліджень було порівняно вплив меланіну на шлункову евакуацію з впливом відомого прокінетика еритроміцину. У середньому еритроміцин (0,7 мг/кг) при його введенні через 90 хв після згодовування 100 г хліба зменшував час його евакуації на 19,8%, що достовірно не відрізнялося від прискорення, викликаного 5 мг/кг меланіну.

Прискорення евакуації зі шлунка під впливом меланіну супроводжувалося підвищенням рН дуоденального хімусу. Меланін у дозі 5 мг/кг збільшував рН дуоденального хімусу з 5,1+0,2 до 6,4+0,3, або на 24,5% (р < 0,05). Натомість еритроміцин не підвищував рН дуоденального хімусу, а в момент максимального прискорення випорожнення шлунка рН хімусу навіть знижувався з 6,0+0,3 до 5,0+0,2, оскільки процес нейтралізації в дванадцятипалій кишці не встигав за швидкістю випорожнення шлунка.

Таким чином, меланін та еритроміцин, справляючи подібний вплив на швидкість евакуації ізі шлунка 100 г хліба, по-різному впливають на рН дуоденального хімусу, а меланін при цьому має незаперечні переваги перед еритроміцином.

Вплив меланіну на швидкість пропульсії по тонкій кишці. Паралельно з визначенням швидкості евакуації хімусу зі шлунка у собак визначалася швидкість пропульсії по порожній кишці. Додавання до хліба меланіну в дозі 5 мг/кг викликало прискорення швидкості руху болюса по ДПК з 2,0+0,3 см/хв до 2,8+0,2 см/хв, або 40% (p < 0,05). На фоні введення меланіну в дозі 10 мг/кг середня швидкість руху болюса по ДПК зростала на 15% (p>0,05). Подальше подвоєння дози меланіну (20 мг/кг) приводило до збільшення середньої швидкості руху болюса по ДПК на 40% (p<0,05).

Таким чином, встановлено, що меланін справляє виражений стимулюючий вплив на моторну активність шлунка та ДПК, швидкість евакуації вуглеводної їжі зі шлунка та швидкість пропульсії по тонкій кишці. При порівнянні впливу меланіну і еритроміцину на моторну активність травного каналу виявлено, що тривалість дії еритроміцину значно більша, ніж меланіну. Проте еритроміцин викликає дискоординацію моторики, а стимулюючий ефект меланіну на моторику не призводить до порушення періодичної моторної активності. Отримані результати свідчать, що на відміну від еритроміцину, меланін при повторному введенні не викликає явища тахіфілаксії, і це робить його перспективним для клінічних досліджень з метою лікування захворювань, пов'язаних з атонією гладеньких м'язів травного каналу, та прискорення виведення з організму токсичних речовин.

Вплив меланіну на секреторну функцію шлунка у собак та щурів. Роль меланіну в регуляції секреторної функції шлункових залоз потребувала визначення, що було з'ясовано у дослідах на собаках і щурах. У собак, як звичайно, базальна секреція шлунка була відсутня, тому ці дослідження проведено на фоні стимульованої шлункової секреції. Встановлено, що меланін зменшував інтенсивність гістамінової шлункової секреції за дослід з 127,28+10,60 до 76,05+14,74 мл, або на 40,24% (p<0,05). При цьому дебіт кислоти виділеного соку зменшувався з 20,06+1,76 до 11,09+2,34 ммоль, або на 44,72% (p<0,05). На виділення пепсину меланін статистично достовірного впливу не справляв.

Таким чином, меланін досить ефективно гальмував кислотопродукуючу функцію шлункових залоз при стимуляції їх гістаміном.

Враховуючи можливу видову специфічність впливу меланіну на секреторну функцію шлунка, були проведені дослідження його ефекту на секрецію соляної кислоти у щурів.

Гістамін в дозі 3 мг/кг при внутрішньоочеревинному введенні стимулював виражену секреторну реакцію упродовж 2 год. Дебіт соляної кислоти, що виділялася упродовж двох годин при дії гістаміну складав 10,24+0,79 титр. од. При одночасному введенні меланіну (20 мг/кг, внутрішньоочеревинно) з гістаміном виділення кислоти було значно меншим. Гальмування секреції починало проявлятися в третій 10-ти хвилинній пробі. Дебіт виділеної кислоти зменшувався з 1,00+0,11 до 0,55+0,03 титр.од./10 хв, або на 45,0% (p < 0,05). Дія меланіну тривала 1 годину. Максимальне пригнічення спостерігалося на 30-40-х хвилинах після його введення: дебіт виділеної кислоти зменшувався з 1,23+0,12 до 0,53+0,05 титр.од./10 хв, або на 56,9% (p < 0,05). У цілому за дослід меланін зменшував виділення кислоти з 10,24+0,79 до 6,53+0,35 ммоль/л, або на 36,2% (p < 0,05).

Меланін пригнічував також секрецію кислоти в шлунку, стимульовану пентагастрином. Схема проведення експериментів була такою ж, як і при використанні гістаміну. За умов дії пентагастрину виділялося 10,01+0,41 титр. од. кислоти за 100 хв спостереження. Меланін зменшував дебіт соляної кислоти пентагастринової секреції до 6,77+0,35 титр. од., або на 32,4% (p < 0,05). Тривалість пригнічуючої дії меланіну складала до 80 хв.

Таким чином, меланін гальмував секрецію шлункового соку при дії різних за механізмом стимуляторів секреції гістаміну та пентагастрину. Враховуючи те, що вплив гістаміну реалізовується за механізмом: H2-гістамінові рецептори—аденілатциклаза—цАМФ з подальшою активацією протеїнкіназ, а дія пентагастрину відбувається через ССК-рецептори і супроводжується входом позаклітинного Са2+ і в подальшому активацією синтезу соляної кислоти, участь меланіну у гальмуванні секреції HCl проходить за участю цих процесів. Блокування секреції парієтальних клітин може бути пов'язане з прямою дією меланіну на секреторні клітини через зміну проникності мембранних каналів або шляхом посиленого виділення місцевих гормонів — соматостатину та ПГЕ2, або зміни проникності йонних каналів.

На відміну від шлункової секреції, стимульованої гістаміном і пентагастрином, на базальну секрецію у щурів меланін не впливав. Між показниками дебіту кислоти в пробах до введення меланіну і після його введення статистично вірогідної різниці не було.

Отримані результати свідчать про те, що як і у попередніх дослідженнях на собаках, так і в дослідах на щурах меланін гальмує стимульовану шлункову секрецію.

Вплив меланіну на експериментальне виразкоутворення у щурів. Іммобілізаційний стрес ("соціальний стрес") викликає утворення в слизовій оболонці виразково-ерозивних ушкоджень та масивних крововиливів. Меланін в дозі 20 мг/кг майже повністю запобігав утворенню виразок в слизовій оболонці шлунка щурів, викликаних "соціальним стресом", виникнення ерозій зменшувалося з 2,13+0,51 до 0,80+0,42 на один шлунок, або на 62,4% (p < 0,05). Кількість масивних крововиливів зменшувалася з 6,00+1,76 до 0,60+0,34 на один шлунок, або на 90%. Частота виникнення нейродистрофічних уражень слизової оболонки шлунка, викликаних "соціальним стресом" під впливом меланіну також суттєво зменшувалась. Якщо в контролі виразки і ерозії утворювалися у 75% тварин, масивні крововиливи — у 100% щурів, то на фоні меланіну виразкові ураження були відмічені у 30% щурів, ерозії — у 40%, масивні крововиливи — у 30%, краплинні крововиливи — у 80% щурів.

Отримані нами дані щодо антивиразкової дії меланіну з N. nigra var. hesuelica, підтверджуються даними літератури про те, що меланін, отриманий з інших джерел, також має виражені антивиразкові властивості. Так, меланін, отриманий з Ommastrephes batrami Lesuel, гальмує виразкоутворення в слизовій оболонці шлунка у щурів, викликане фенілбутазоном та аспірином (Mimura T. et al., 1985), а також після перев'язування пілоричного сфінктера (Mimura Т., et al., 1982). Меланін з чаги Inonotus oblique, має виражену антивиразкову дію на норадреналінову, резерпінову і бутадіонову моделі патології шлунка у щурів і нейрогенні стресові виразки у мишей (Рыжова Г.Л. и соавт., 1997).

Порівняльні дослідження гастропротективної дії меланіну з дією відомих гастропротективних препаратів засвідчили, що блокада Н2-гістамінових рецепторів зменшувала утворення виразок у слизовій оболонці шлунка на 60%, ерозій — на 53%, масивних крововиливів — на 90%. Гастроцепін зменшував утворення виразок на 100%, ерозій — на 72%, масивних крововиливів — на 90%. Застосування блокатора Н+-К+-АТФази омепразолу зменшувало утворення виразок з 2,00+0,76 до 0,28+0,28 на один шлунок, або на 86,0%. Кількість масивних крововиливів на один шлунок було зменшено з 3,14+2,08 до 1,28+0,89, або на 59,2%. Введення омепразолу зменшувало кількість ерозій з 4,00+0,76 до 4,00+0,76 на один шлунок, викликаних "соціальним стресом", або на 21,5%. Відсоток уражених тварин з крапковими крововиливами зменшувався на 30% на тлі дії омепразолу. Таким чином, наведені дані свідчать, що між ефектами меланіну, ранітидіну, гастроцепіну та омепразолу на утворення ерозій та масивних крововиливів статистично достовірної різниці не було. Ці результати є підґрунтям для постулювання значної гастропротективної дії меланіну.

Меланін справляв виражену захисну дію на СОШ при впливі на організм щурів серотоніну. Кількість ерозій на один шлунок зменшувалася з 0,71+0,28 до 0,50+0,3, або на 29,6%, кількість масивних крововиливів — з 2,28+0,7 до 1,0+0,53, або на 56,1%. Утворенню виразок запобігалося повністю. Значно зменшувався і відсоток уражених тварин: кількість тварин з ерозіями зменшувалася на 42,2%, кількість тварин з масивними крововиливами — на 33,9%, кількість тварин з виразками — на 85,7%.

Враховуючи те, що утворення нейродистрофічних ушкоджень при дії серотоніну пов'язане з порушенням мікрогемодинаміки, можна припустити протекторну дію меланіну на мікрогемодинаміку шлунка.

Меланін також справляв захисну дію при експериментальному виразкоутворенні, викликаному етанолом. Під впливом меланіну кількість ерозій на один шлунок зменшувалася на 94%, кількість масивних крововиливів статистично вірогідно не змінювалась. Утворення виразок зменшувалося на 74% на один шлунок. Також зменшувався і відсоток уражених тварин: кількість тварин з ерозіями зменшувалася на 59%, з виразками — на 44,6%, відсоток тварин з масивними крововиливами не змінювався. Індекс Паулса в контрольній групі тварин складав 0,29, а в групі з введенням меланіну — 0,02. Антивиразкова активність дорівнювала 14,5, що свідчить про виражені антивиразкові властивості меланіну стосовно етанолових виразок.

Враховуючи, що меланін є діючою речовиною лікарського препарату "Бефунгін", зробленого на основі березового гриба чаги, було проведено порівняльні дослідження антивиразкової активності цього препарату і хромогенного поліфенолкарбонового комплексу (ХПФК), який містить 95% меланіну і продукується дріжджовими грибами N. nigra var. hesuelica.

При дії стресового фактора деструктивні зміни слизової шлунка було відзначено у 100% тварин контрольної групи. Кількість виразок на один шлунок становила 5,63+1,35. Індекс Паулса дорівнював 5,63. "Бефунгін" зменшував число деструкцій на слизовій оболонці шлунка до 1,57+0,48, тобто, кількість виразок на один шлунок в даній групі тварин зменшувалася на 72,1%. Кількість тварин з виразками в групі зменшувалася до 86%. Індекс Паулса дорівнював 1,35, а противиразкова активність — 4,17. Натомість у групі щурів, яким вводили меланін, кількість виразок зменшувалася до 0,43+0,20 на один шлунок, або на 92%. Більше ніж удвічі зменшувалася кількість тварин з виразками, вона складала 43% від загальної кількості тварин в групі. Індекс Паулса дорівнював 0,18, а противиразкова активність — 31,3.

Таким чином, противиразкову активність виявили обидва досліджувані препарати. Проте гастропротективна дія меланіну в 7,5 раза перевищувала цитопротекторну активність "Бефунгіну". Менша активність останнього, можливо, обумовлена тим, що вміст хромогенного поліфенолкарбонового комплексу, а значить, і меланіну у складі "Бефунгіну" значно менший, а саме він обумовлює антивиразкові властивості. Ці результати свідчать, що ХПФК з дуже високим вмістом меланіну, що продукується дріжджевими грибами виду N. nigra, є перспективним для подальших досліджень противиразкових властивостей та його інших впливів на функції травного каналу.

Наші дослідження засвідчили, що чистий меланін фірми "Sigma" справляє менш виражену захисну дію щодо нейродистрофічних уражень СОШ у щурів, викликаних методом "соціального стресу", ніж меланін, отриманий з чорних дріжджів N. nigra var. hesuelica.

Вплив меланіну на процеси ПОЛ в слизовій оболонці шлунка у щурів. Серед факторів які знижують резистентність слизової оболонки шлунка і дванадцятипалої кишки, велике значення надають посиленню процесів ПОЛ у слизовій оболонці гастродуоденальної зони. При дії ульцерогенних факторів процеси ПОЛ значно інтенсифікуються; відбувається виснаження антиоксидантної системи організму, насамперед за рахунок підвищенного використання СОД — основного ферменту антиоксидантної системи.

Враховуючи антиоксидантні властивості меланіну, було проведено дослідження його впливу на швидкість ПОЛ у СОШ. Порівнюючи з контрольною групою (плацебо), у щурів, які зазнали впливу "соціального стресу", в СОШ зафіксовано утворення виразок та масивних крововиливів в кількості 1,90+0,30 та 4,52+0,41, відповідно. Утворення нейродистрофічних уражень супроводжується зростанням інтенсивності ПОЛ, що проявлялося в зростанні концентрації малонового діальдегіду, дієнових кон'югатів та Шиффових основ.

Меланін в дозі 5 мг/кг справляв виражену гастропротективну дію. Під його впливом кількість виразок на один шлунок зменшувалася на 57,9%, кількість ерозій на один шлунок — на 28,2%, кількість масивних крововиливів — на 38,1%. Інтенсивність ПОЛ в слизовій шлунка зменшувалася до рівня, який реєструвався в контрольній групі.

Антиоксидантні властивості меланіну було підтверджено серією дослідів, у якій вивчали його гастропротективну дію щодо нейродистрофічних уражень слизової оболонки шлунка у щурів, викликаних норадреналіном. Як видно з табл. 1 меланін знижував активність ПОЛ та підвищував активність СОД та каталази.

Таблиця 1

Вплив меланіну на зміни швидкості ПОЛ та активності ферментів АОС в слизовій оболонці шлунка, викликані норадреналіном

Групи тварин МДА (мкмоль/г) СОД (од.акт./гґхв) Каталаза (мкмоль Н2О2/гґгод)

Контроль 211,6 ± 15,4 617,4 ± 10,1 1,02 ± 0,3

Норадреналін (НА) 282,2±16,3 386,0±6,2 2,16±0,21

Меланін + (НА) 192,2±13,2 571,8±6,3 1,52±0,4

Таким чином, використовуючи різні моделі ушкодження СОШ, виявлено, що гаспропротекторна дія меланіну пов'язана з його впливом на різні механізми: процеси ПОЛ, активність ферментів АОС (СОД і каталази), виділення кислоти шлунковими залозами, кровоплин. Такий характер впливу меланіну дає змогу прогнозувати його клінічну ефективність і рекомендувати для клінічних випробувань у гастроентерології.

ВИСНОВКИ

1. Меланін, отриманий з чорних дріжджів Nadsoniella nigra var. hesuelica, виявляє стимулюючий вплив на моторно-евакуаторну функцію проксимального відділу травної системи, гальмівний — на секреторну активність залозі шлунка і підсилює процеси цитопротекції в його слизовій.

2. Ефект меланіну на моторику шлунка та кишки у собак залежить від дози препарату та способу його введення: в малій дозі (5 мг/кг) при внутрішньокишковому введенні ефект не реєструвався, в цій же дозі при внутрішньовенному введенні на фоні періоду спокою періодичної моторної діяльності спостерігалося значне посилення моторики кишки.

3. У дозі 20 мг/кг при довенному введенні на фоні харчової моторики меланін виявляє фазність реакції: на початку спостерігалося короткочасове пригнічення, яке в подальшому змінювалося значним та тривалим посиленням моторики шлунка та кишки. У цій же дозі при внутрішньокишковому введенні на фоні харчової моторики меланін посилював моторику шлунка та кишки.

4. Евакуація з шлунку їжі вуглеводного складу під дією меланіну в малій дозі (5 мг/кг) прискорюється, під дією більших доз — не змінюється. Меланін в дозах 5 та 20 мг/кг прискорював швидкість пропульсії по тонкій кишці.

5. Стимулюючий вплив меланіну на моторику шлунка і кишки має холінергічну природу і його дія блокується м-холіноблокаторами.

6. Меланін пригнічує стимульовану гістаміном шлункову