НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ ЗООЛОГІЇ ІМ. І. І. ШМАЛЬГАУЗЕНА

Янчуков Олексій Валерійович

УДК 575.1:597.822

СТРУКТУРА ЗОНИ ГІБРИДИЗАЦІЇ ЧЕРВОНОЧЕРЕВОЇ (BOMBINA BOMBINA L.) І ЖОВТОЧЕРЕВОЇ (BOMBINA VARIEGATA L.) КУМОК В ПРИКАРПАТТІ УКРАЇНИ

03.00.08 - зоологія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Київ – 2002

Дисертацією є рукопис

Робота виконана у Відділі еволюційно-генетичних основ систематики Інституту зоології ім. І. І. Шмальгаузена НАН України, м. Київ.

Науковий керівник: доктор біологічних наук

Межжерін Сергій Вітальєвіч

Інститут зоології ім.. І. І. Шмальгаузена НАН України, завідуючий Відділом еволюційно-генетичних основ систематики

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук

Писанець Євген Максимович

Національний Науково-природничий музей НАН України, м. Київ, завідуючий Зоологічним музеєм

кандидат біологічних наук, доцент

Гассо Віктор Якович

Дніпропетровський національний університет,

доцент кафедри зоології та екології

Провідна установа: Ужгородський національний університет, кафедра зоології

Захист дисертації відбудеться "14" січня 2003 р. о 14 год. на засіданні спеціалізованої вченої ради Інституту зоології ім.. І.І. Шмальгаузена НАН України за адресою: 01601, Київ-30, вул. Б.Хмельницького, 15.

З дисертацією можна ознайомитись у науковій бібліотеці Інституту зоології ім. І. І. Шмальгаузена НАН України за адресою: 01601, Київ-30, вул. Б.Хмельницького, 15.

Автореферат розіслано "13" грудня 2002 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради В.В. Золотов

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Збереження біологічної різноманітності, раціональне і ощадливе природокористування, зменшення наслідків негативного антропогенного впливу на біоту є неможливими без глибокого комплексного вивчення популяцій тварин. На даний момент не існує єдиного погляду ні на зв'язок біорізноманітності на рівнях популяції, організму і генотипу, ні на значення генетичної різноманітності для існування живої речовини. Саме тому дослідження взаємодії різних видів, які зберігають можливість обміну генетичним матеріалом, є новим етапом у пізнанні процесів видоутворення і еволюції організмів.

Вивчення явища природної гібридизації у наземних хребетних є особливо цікавим з погляду на величезний накоплений досвід з біології цієї тваринної групи. Кумки роду Bombina (Anura, Discoglossidae) є класичним модельним об'єктом досліджень міжвидової гібридизації (Hewitt, 1988; Jiggins and Mallet, 2000). Недостатній вираз репродуктивних бар'єрів у цих амфібій дозволяє розглядати стан двох парапатричних видів, червоночереву (B.bombina) і жовточереву (B.variegata) кумок, як проміжний для еволюції близьких таксонів взагалі. У цьому полягає доцільність досліджень саме цього об'єкту для пізнання процесу становлення видів. Сучасні роботи з цим об'єктом в різних регіонах Європи (Szymura and Barton, 1991; Szymura, 1993; Kruuk et al., 1997; MacCallum et al., 1998; Vines et al., 2002) носять дещо однобічний характер, так як з розвитком методів молекулярного аналізу геному традиційний морфологічний аналіз отримує менше уваги. Тому на даний час виникає необхідність у порівнянні методів морфометрії і генетичного аналізу на спільному матеріалі. Оскільки біотопи існування кумок в Центральній та Західній Європі дістали незворотних змін, а стан обох видів – значно погіршився, то вивчення їх взаємодії стає дедалі складнішим. Унікальне явище, характерне для цих амфібій – вузька гібридна зона, збереглось тільки у деяких місцях Східної Європи. Тому особливий інтерес представляють природні популяції в цьому регіоні. Саме в Українському Прикарпатті зона гібридизації кумок залишається у відносно недоторканому стані на протязі століть чи навіть тисяч років. Можливість прижиттєвого обстеження тварин, висока чисельність видів і відсутність досліджень кумок на молекулярно-генетичному рівні у цьому регіоні зумовила вибір території і об'єкту даної роботи.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертація виконана у рамках планової теми №137 Інституту зоології ім. І.І.Шмальгаузена НАНУ: “Дослідження мікроеволюційних та видоутворючих процесів у модельних групах тварин”.

Мета і задачі досліджень. Метою роботи було виявлення властивостей і визначення структури гібридної зони кумок на рівні морфологічних ознак і молекулярних маркерів. При цьому були поставлені такі задачі:

1. Встановити факт гібридизації Bombina bombina і B. variegata і місцезнаходження гібридної зони.

2. Описати структуру зони гібридизації і класифікувати гібридні популяції.

3. Порівняти мінливість в гібридній зоні біохімічних генних маркерів і молекулярних маркерів ядерного геному, а також гаплотипів мітохондріальної ДНК.

4. Порівняти мінливість морфологічних ознак із генними маркерами.

5. Виявити характер розподілу морфологічних ознак і генотипів відповідно до біотопів проживання кумок.

6. Виявити географічні відмінності гібридної зони і факторів, що їх визначають, шляхом порівняння результатів із даними попередніх досліджень в інших областях Європи.

Об'єкт дослідження – популяційна структура, морфологічна та генотипна мінливість особин із зони парапатрії червоно та жовточеревої кумок в Прикарпатті України.

Предмет дослідження – дорослі особини та ікра червоночеревої, жовточеревої кумок та їх гібридів, біотопи місць їх збору.

Методи досліджень. Молекулярний рівень аналізу геному є сучасним і надійним засобом діагностики видової належності або гібридної природи особин. Тому в роботі використані методи електрофоретичного розділення в гелях білкових фракцій та амплфікованих фрагментів ДНК. Видові відмінності кумок проявляються у вигляді адаптивних до різних екологічних умов ознак. Тому такі ознаки стали предметом морфометричного аналізу. Дослідження природних популяцій неможливе без дослідження біотопів їх існування. Відповідно, був проведений детальний опис і наступний аналіз водних та наземних біотопів.

Наукова новизна одержаних результатів. Було проведене перше для вітчизняної зоології цілісне мікроеволюційне дослідження, що виконано за допомогою комплексу молекулярно-генетичних методів. Унікальною є також і та обставина, що структура популяцій гібридної зони кумок вивчалася за допомогою трьох підходів: популяційно-біологічного, генетичного та морфологічного. Вперше на молекулярно-генетичному рівні проведено картування гібридної зони кумок у Прикарпатті. Виявлено, що для гібридної зони в цьому регіоні характерна клинально-мозаїчна структура, визначена рядом факторів, головним з яких вважається розміщення наземних біотопів. Продемонстроване різноманіття типів внутрішньої структури гібридних популяцій в межах лише кількох кілометрів. Емпірично доведено, що гібридна зона залишається стабільною на протязі 70 років. Встановлено високий рівень достовірності морфологічного індексу злиття плям кумок з їх генотипом і непридатність традиційних індексів морфометрії для опису гібридних популяцій. Вперше для видів, що гібридизують, доведений високий ступінь кореляції конформаційних маркерів ДНК із алозимними, а також спільний характер мінливості частот ядерної і мітохондріальної ДНК.

Теоретичне і практичне значення одержаних результатів. Отримані фактичні дані вносять певний внесок у розробку теорії парапатричного видоутворення та концепції генетичної нестабільності. Зокрема зроблений внесок у вирішення питання про розвиток ізолюючих механізмів між видами, що гібридизують. Отримані дані можуть бути застосовані для перевірки популяційно-генетичних моделей взаємодії гетерогенних популяцій, для масштабного опису гібридних зон кумок на інших територіях, при побудові філогенетичних схем зв'язків між різними географічними популяціями видів роду Bombina, а також при розробці програм охорони червоно- та жовточеревої кумки у регіоні. Стан популяцій цих вразливих амфібій, що охороняються у європейському масштабі, може бути біоіндикатором стану навколишнього середовища, тому дані мають значення для загальної оцінки екологічної ситуації в регіоні. Результати можуть бути використані як ілюстрації при викладанні батрахології, популяційної генетики і теорії еволюції.

Особистий внесок здобувача. Польові дослідження, збір матеріалу, вивчення морфологічних ознак і молекулярний аналіз ядерної ДНК проведені особисто. Біохімічні і мітохондріальні локуси проаналізовані здобувачем на 40% під час спільних досліджень із колегами Інституту Зоології НАНУ в Києві та Інституту зоології Ягелонського університету в Кракові, Польща.

Апробація результатів і публікації. Матеріали роботи були представлені на конференції НАНУ для молодих вчених (Київ, 2002); на засіданнях Відділу еволюційних і генетичних основ систематики ІЗ НАНУ; на засіданні Лабораторії молекулярного аналізу Інституту зоології університету ім. Людвіга-Максиміліана, Німеччина; на 8-му з'їзді молодих вчених Європи, які займаються питаннями еволюційної біології. По темі дисертації опубліковано чотири наукові роботи у фахових виданнях, а також тези доповіді.

Структура і обсяг роботи. Робота складається із вступу, дев'яти розділів, висновків, а також списку літератури та додатку; вона містить 149 стор. машинописного тексту, включаючи 14 таблиць і 46 рисунків: текст дисертації – 116 стор., список літератури – 14 стор., додатки – 19 стор. Список літератури містить 140 джерел на 6-ти мовах.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Теоретична частина

Наводяться сучасні відомості про явище гібридизації близьких таксонів в природі, зокрема у випадку, коли географічно розділені в минулому популяції зустрічаються знову і рівень репродуктивної ізоляції виявляється недостатнім для запобігання схрещувань між особинами. Серед ряду теорій побудови і механізмів існування гібридних зон розглядається та, що доводить прийнятність моделі балансу між дисперсійним потоком генів та факторами, які запобігають схрещуванню і зменшують долю чужорідних генів в популяціях. В ролі останніх виступають поведінкові або екологічні бар'єри, гібридний дисгенез і невідповідність гібридних фенотипів даному середовищу.

Історія вивчення

Вперше факт гібридизації кумок в природі був доведений Mehely (1905). Дослідженнями гібридної зони займалися Michalowski, (1958), Lac, Lehovic (1962), Szymura (1976, 1986, 1991), Gollmann (1986, 1988), Sanderson et al. (1992), Nurnberger et al. (1995), Kruuk et al. (1997), MacCallum et al. (1998), Vines et al. (2002). На території України проблему вивчали Horbulewicz (1927), Стугрен, Попович (1961), Щербак, Щербань (1980), Решетило (2000). На початку історії вивчення зусилля були спрямовані на вирішення питання про гібридну природу перехідних міжвидових форм, а після застосування Я. Шимурою (Szymura, 1976) молекулярних методів аналізу – на розкриття механізмів підтримання стабільності гібридної зони і збереження цілісності генофондів двох видів. Велика кількість робот присвячена побудові та перевірці популяційно-генетичних моделей зони гібридизації, де основним фактором, що запобігає потоку генів, виступає природний добір (Barton, Gale, 1993) а також активне екологічне уподобання особин (MacCallum, 1998).

Матеріал і методи

Рід Bombina (Anura, Discoglossidae) представлений в Європі двома видами – червоно і жовточеревою кумками (Bombina bombina et B. variegata Linnaeus, 1758; Szymura, 1996). Червоночерева кумка є монотипічним видом із Центрально і Східноєвропейським поширенням, тоді як жовточерева представлена чотирма підвидами із Центральної і Західної Європи. Два види відрізняються один від одного по ряду морфологічних, фізіологічних та поведінкових ознак, мають значні генетичні відмінності (дистанція Неі = 0,27 (Szymura, 1993). Крім того, вони займають різні екологічні ніші: Bombina bombina розмножується в крупних постійних водоймах і є рівнинним видом, в той час як B. variegata нереститься в дрібних тимчасових водоймах в гірсько-лісовому поясі. Тим не менш вони вільно схрещуються і утворюють плодовите потомство всюди, де перекриваються їх ареали – вздовж передгір'їв Карпатської гірської дуги та на півночі Балканського півострова.

Матеріал роботи був зібраний на протязі 2000-2002 рр. в межах трансекти 15 х 30 км на правому березі р. Стрий, між містами Моршин і Жидачів Львівської області (рис. 5). Всього було проаналізовано 847 дорослих особин та ікра з 25 кладок кумок, зібраних із 58 місцезнаходжень (рис. 5), а також контрольних вибірок в околицях Києва та гірських Карпатах. Під час збору фіксувалися якісні і кількісні характеристики наземних та водних біотопів.

Знімалися наступні проміри за загальноприйнятими методиками: Довжина тулуба (L.), довжина голови (L.c.), ширина голови (Lt.c.), довжина гомілки (T.) та стегна (F.). В якості видоспецифічних показників морфометрії використовувались наступні індекси: L./T., L./F., L.c./Lt.c. Знімався комплексний показник злиття плям (Sp.), який являє собою результат підрахунку з'єднань між плямами на певних ділянках тіла (Hofman, Szymura, 1998) і змінюється в межах від 0 (червоночерева) до 1 (жовточерева кумка).

Електрофоретичний аналіз білків в поліакріламідному гелі проводився в двох буферних системах: неперервній (Peacock et al., 1965) і перервній (Davis, 1964). Були проаналізовані спектри 27 локусів, 2 з яких (лактатдегідрогенази Ldh-B і НАД-залежної малатдегідногенази Mdh-1) були використані для діагностики гібридної природи особин. Частина матеріалу, а також ікра, проаналізовані в крохмальному гелі по локусах Ldh-B, Mdh-1, нуклеозидфосфорилази Np і глюкофосфатізомерази Gpi. Молекулярний аналіз ядерної ДНК проводився шляхом розділення конформаційних одноланцюгових фрагментів (SSCPs) в поліакріламідному гелі (Orita et al., 1989). Використовувались два діагностичних локуси, Bb7.4 і Bv24.11 (Nurnberger et al., 2002). Аналіз видової належності мітохондріальної ДНК проводився за допомогою рестрікційних маркерів (RFLPs) в агарозному гелі з використанням рестриктаз Hae III та Bam HI (Szymura, 2000). Згадані локуси в даному видовому комплексі сегрегують незалежно (Szymura, 1989, Nurnberger et al., 2002). Гібридний індекс (HI) визначався по підрахунку кількості алелів B.variegata в кожній особині. Для аналізу генних частот були застосовані програми Analyse 1.10 (Barton, Baird, 1998) і CNDd (Basten, Asmussen, 1994). Регресія частот локусів підраховувалась за рівнянням Pi = p+2pq(a+b(p-q)), де Pi – частота алеля B.variegata в даному локусі, , p – середня частота усіх алелів B.variegata, q – середня частота алелів B.bombina, a и b - коефіцієнти регресії. Просторовий аналіз трансекти проведений за допомогою програми ArcView 3.1 (ESRI, 1996) за наступною схемою: місцезнаходження вибірок були нанесені на карту території масштабу 1:100 000 з точністю ± 100 м. Значення показників в кожній вибірці були інтерпольовані на всю територію трансекти за наступною схемою: для будь-якої точки на площині карти; , де ()n - n вибірок j, найближчих до ; Dj – відстань від до ; Z – значення діагностичного показника в даній точці. В розрахунках n приймалося рівним 12. Статистична обробка даних виконувалась за допомогою програми SPSS 9.0

Аналіз ознак

В розділі викладено основні фактичні результати роботи. Насамперед, доведений факт гібридизації червоночеревої і жовточеревої кумки в Прикарпатті України. Виявлені фіксовані генні відмінності між контрольними вибірками із околиць Києва і гірських Карпат та різноманітність змішаних генотипів в околицях Стрия. Видоспецифічність і незалежність сегрегації використаних генних маркерів відома також із літератури (Szymura, Farana, 1978; Szymura, Uzzel, Sposky, 2000; Nurnberger et al., 2002). Особини із околиць Стрия є проміжними між контрольними вибірками за ознаками морфології. Проте за генотипами в околицях Стрия представлені як чисті особини B.bombina, так і B.variegata. Частка генів кожного виду в решті особин і серед популяцій змінюється поступово (клинально), так само як індекс злиття плям. Завершеність клин генних частот в популяціях (від 0 до 1) свідчить про наявність гібридної зони, ширина якої обмежена територією досліджень. Генетична структура самих популяцій є досить різноманітною. Всі результати можна поділити на три основні групи: аналіз морфологічних ознак та їх розподіл; аналіз генотипів та генних частот локусів ядерної ДНК; аналіз розподілу гаплотипів мітохондріальної ДНК.

Виявлено, що морфометричні індекси на обробленому матеріалі змінюються в наступних межах: L./T. (2.30 – 3.75, М = 2.80, SD=0.23); L./F. (2.16 – 3.56; M = 2.80, SD=0.25); L.c./Lt.c. (0.75 – 1.125, M = 0.934, SD=0.6). Розподіл всіх трьох показників наближується до нормального (тест Колмогорова-Смірнова Z = 1.1, p < 0.01) (рис. 1а). Згідно літературних джерел (Банников, Даревский, 1977; Щербак, Щербань, 1980), отримані середні значення індексів є проміжними між нормами для червоно і жовточеревої кумок. Розподіл індексу злиття плям (Sp.) двохвершинний, з піками в значеннях 0.1 і 0.7 (рис. 2а), а мінливість його середніх значень у вибірках є клинальною. Загалом це збігається із даними інших авторів (Щербак, Щербань, 1980; Решетило, 2002) про наявність проміжних форм кумок у прикарпатських передгір'ях, проте не дає змогу довести їх гібридну природу.

Розподіл гібридного індексу (HI) по особинах чітко бімодальний з піками в значеннях 0 і 1 (рис. 2б). При цьому наявні всі можливі проміжні значення індексу, тобто матеріал представлений як генотипово “чистими” особинами, так і рекомбінантами – нащадками багатьох поколінь схрещувань між видами. Кількість вибірок, де переважає геном одного з видів, більша, ніж тих, де переважають гібриди. Це вказує на достатнє охоплення матеріалом гібридної зони на даній ділянці.

Рис. 1. Загальний розподіл морфометричних індексів (L../T., L./F., L.c./Lt.c.) по особинах із зони парапатрії кумок.

а) б)

Рис. 2. Загальний розподіл по території досліджень:

а) індексу злиття плям (Sp.)

б) гібридного індексу (HI).

Різноманітність популяційної структури проілюстрована на прикладі двох популяцій із подібними значеннями генних частот обох видів (HI ” 0.5): Розмноження кумок в околицях с. Долішнє відбувається в основному за рахунок мігрантів із суміжних “чистих” популяцій B.bombina і B.variegata. На це вказує двохвершинний розподіл ознак і генотипів, а також розподіл числа гетерозиготних локусів в особинах із високою часткою (9%) у вибірці алодиплоїдів – гетерозигот по всіх досліджених локусах (рис. 2а). Вірогідно, що принаймні деякі з них є гібридами першого покоління гібридизації. Переважна більшість проаналізованих ікринок з цієї популяції мали гомозиготні генотипи по всіх локусах, що вказує на високий рівень асортативності схрещувань. Частка генів альтернативного виду в суміжних популяціях незначна, що вказує на значну обмеженість потоку генів на даній ділянці. Даний тип популяційної структури був охарактеризований як бімодальний (Jiggins, Mallet, 2000).

В околицях с. Станків кумки утворюють більш менш стійку популяцію, де переважають рекомбінантні генотипи і частка алодиплоїдів (4%) не відрізняється від очікуваної за умов вільного схрещування (рис 2б). В ряді популяцій з цієї ділянки та в інших місцях (околиці с. Лотатники) всі проаналізовані особини мають гібридне походження (відсутні особини з HI = або 1). Частота генів іншого виду в суміжних популяціях зменшується поступово (утворює клину). Гібридизація в останньому випадку відбувається за принципом взаємної інтрогресії генів, що характерно для видів саме цього комплексу (Szymura, 1993). Гібридні популяції з околиць с. Станків та с. Лотатники належать до унімодального типу (Jiggins, Mallet, 2000).

1) 2)

А

1) 2)

Б

Рис. 3. Порівняльні характеристики унімодального і бімодального типів внутрішньої популяційної структури в гібридній зоні кумок на прикладі популяцій з околиць с. Долішнє (А) та с. Станків (Б).

1) розподіл гібридного індексу (HI)

2) розподіл числа гетерозиготних локусів.

Популяції гібридної зони не відповідають умовам вільного схрещування особин. Спостерігаються значні відхилення внутрішньо вибіркових генотипних пропорцій від рівноважних, як по генотипам в межах одного локуса (нерівновага Харді-Вайнберга), так і по двохлокусним генотипам (нерівновага по щепленню локусів). Нерівноважність генотипних пропорцій може бути наслідком асортативності схрещувань, підвищеної смертності гетерозигот і постійного притоку особин із чистими видовими генотипами в гібридну зону. На користь останнього припущення свідчить те, що згадані відхилення генотипної структури у значній мірі викликані диспропорцією гомозигот по всіх локусах одного з видів (рис. 4).

Розподіл відхилень від рівноважних пропорцій по вибірках хаотичний і практично не залежить від генних частот. У поєднанні із різноманіттям внутрішньої структури популяцій отримані факти дозволяють зробити припущення про нерівномірність потоку генів на різних ділянках трансекти. Це, в свою чергу, є наслідком особливостей просторового розміщення популяцій та дії зовнішніх факторів довкілля.

Рис. 4. Відхилення генотипних пропорцій в популяціях гібридної зони B.bombina B.variegata від рівноваги Харді-Вайнберга. P – частоти гомозигот по всіх локусах B.bombina (відкриті квадрати) Q – частота гомозигот по всіх локусах B.variegata (темні квадрати) Криві HI 8 і (1-HI) 8 відповідають популяціям, в якіх відбувається вільне схрещування особин.

Порівняння даних морфології і генотипів

Розділ присвячений порівняльному аналізу показників між собою на рівні особин і на рівні вибірок. Виявлено, що мінливість морфометричних індексів пропорцій тіла є хаотичною і не відповідає мінливості генотипів і індексу злиття плям, як для окремих особин, так і для популяцій. Це змушує відмовитись від використання пропорцій тіла для опису структури гібридної зони кумок. Що стосується різних генних маркерів, всі вони високо асоційовані між собою і відображають рівень загальної інтрогресії генів чужорідного виду в популяціях. З деякими відмінностями так само поводить себе комплексний індекс злиття плям.

Найвищій рівень кореляції ( ” 0.9, p < 0.01) мають між собою генні маркери; з ними високо асоційований індекс злиття плям (” 0.8, p < 0.01). Кореляція морфометричних індексів між собою і з рештою показників нижче рівня достовірності або відсутня. Ієрархічний кластерний аналіз, застосований до локусних генотипів та морфологічних ознак, демонструє високий рівень спорідненості ядерних локусів і гібридного індексу, дещо нижчий – гаплотипів мтДНК, ще нижчий – індексу злиття плям. Проте всі ці показники утворюють цілісну групу, значно відокремлену від групи показників морфометрії. Кластерні відстані всередині останньої у двічі – тричі більша, ніж всередині першої групи (рис.5).

0 0.2 0.4 0.6 0.8 1

+---------+---------+---------+---------+---------+

Відстань між кластерами

Mdh-1 тш

HІ тъ

Bv24.11 тфтш

Ldh-B тч щтш

Bb7.4 тттч щтш

mtDNA тттттч щтттттттттттттттттттттттттттттттттттттттттш

Sp. тттттттч у

L./T. тттттттттттттттттытттттттттттттш у

L./F. тттттттттттттттттч щтттттттттттттттттч

L.c./Lt.c. тттттттттттттттттттттттттттттттч

Рис. 5. Дендрограма відношень між застосованими морфометричними індексами і генними маркерами.

L./T., L./F., L.c./Lt.c., Sp. – морфологічні індекси

Ldh-B, Mdh-1, Bb7.4, Bv24.11 – маркерні локуси ядерної ДНК

HI – гібридний індекс

mtDNA – гаплотип мітохондріальної ДНК.

Примітка. В якості міри кластерних відстаней обрана кореляція Пірсона.

Середньо вибіркові значення індексу злиття плям, частот ядерних локусів і гаплотипів мтДНК змінюються неперервно і корельовано на протязі трансекти. Регресія частот чотирьох ядерних локусів і гаплотипів мтДНК по середній частоті генів B.variegata свідчить про дуже незначну відмінність у градієнті та ширині клини кожного локуса. Відмінності у клині індексу злиття плям у порівнянні з клинами локусів пов'язані із асиметричним характером мінливості останнього: морфологічні особливості червоночеревої кумки зберігається у особин з переважанням генів жовточеревої частіше. Варіація значень індексу також вища в популяціях жовточеревої кумки (CV=0.042, SD=0.2).

Відсутність кореляції морфометричних індексів з генними маркерами і між собою є свідченням недостатньої діагностичної цінності останніх, на що вказував Н.Н. Щербак (Щербак, Щербань 1980). Однією з причин може бути граничний рівень точності промірів на живих особинах: в аналогічному дослідженні тих же самих пропорцій тіла B. Nurnberger et al. (1995), було виявлено клинальну мінливість відносної довжини скелету кінцівок (L./T. і L./F.). Проте в останньому випадку проміри знімались з рентгенівських фотографій. Індекс злиття плям дозволяє надійно визначити переважання генів одного з видів у популяціях і може бути використаний для швидкого обстеження інших ділянок зони парапатрії. Достовірність визначення видової належності особин за цим показником, за матеріалом даної роботи, дорівнює 95%. Проте генетична система, яка визначає прояв даного комплексу ознак, не пов'язана безпосередньо із маркерними локусами. Відомості про мінливість цих ознак в регіонах розташованих далеко за межами гібридної зони (Michalowski, 1958; Стугрен, Попович, 1961), змушує обережно відноситись до використання індексу злиття плям для вивчення шляхів далеких інтрогресій генів.

Зв'язок розподілу морфологічних ознак і генотипів з біотопом

Розділ містить дані обліку водних і наземних біотопів місць вибірок та їх зв'язок із генетичним складом популяцій. Так як червоно- і жовточерева кумки мають різні екологічні уподобання, теж саме можна очікувати і для особин з незначною ступінню інтрогресії чужорідних генів. В межах території досліджень популяції, де переважають гени жовточеревої кумки, тісно пов'язані із гірсько-лісовим біотопом і дещо менше – з дрібними тимчасовими водоймами. Відповідно популяції з переважанням генів червоночеревих частіше трапляються на відкритих місцях і у великих постійних водоймах. Це пов'язане не лише із доступністю цих чи інших біотопів для кумок різних популяцій. Ці амфібії можуть переміщуватись на значні відстані, а розміщення біотопів в межах територій, де проводився аналіз, є досить мозаічним. Прив'язаність кумок до “свого” видового біотопа зменшує вірогідність схрещувань між різко гетерогенними особинами, тобто обмежує генні потоки всередині зони гібридизації.

До кількісних характеристик водойм, де проводився збір матеріалу, був застосований діскрімінантний аналіз. Виявлені ключові параметри, які відрізняють два типи водойм, характерних відповідно для червоно і жовточеревої кумок. Тільки для вибірок із середнім гібридним індексом HI ” 0.5 кореляція генотипного складу популяцій із типом водойми достовірна (r = 0.67, p < 0.01), в решті вибірок такої залежності не спостерігається.

Залежність генотипів від наземних біотопів більш виражена: жовточерева кумка всюди прив'язана до гірсько-лісових стацій (HI в лісовому біотопі = 0.69), а червоночерева – до відкритих рівнин (HI = 0.39). Спостерігається поступове зменшення гібридного індексу в ряду “ліс – екотон лісу – пасовище – с/г землі або людські поселення”. Розподіл індексу злиття плям, на відміну від гібридного, в цілому однаковий по наземних біотопах, крім гірсько-лісового, де індекс зростає (Sp. = 0.58) Популяції з рівним співвідношенням генів від різних видів (HI ” 0.5) займають біотопи, проміжні між характерними типами: тобто водойми, притаманні Bombina bombina, але розміщені в наземних біотопах, характерних для B. variegata. Висувається припущення про підвищену смертність в таких біотопах потомства кумок від пересихання водойм, які знаходяться під впливом прямої сонячної радіації. Це, в свою чергу, може створювати додаткове обмеження для генних потоків у гібридній зоні.

Просторовий аналіз

В розділі розглядається необхідність врахування просторового аспекту в дослідженнях зони парапатрії кумок. Рельєф долини р. Стрий, мозаїчне поєднання тут лісових та відкритих стацій, а також наявність потужної водної артерії роблять просторову структуру гібридної зони кумок надзвичайно складною. Спільна дія цих чинників може частково відповідати за асиметричність інтрогресії генів B.variegata в напрямку популяцій B.bombina.

Базові дані складалися із площинних координат місць вибірок і середньовибіркових значень досліджуваних параметрів. За допомогою комп'ютерної симуляції була виділена область умовного центру гібридної зони ( = 0.5) по індексу злиття плям, ядерних маркерах і гаплотипах мтДНК. Інтерполяція значень індексів морфометрії не дозволяє виявити переходу між популяціями різних типів. На відміну, решта показників вказують на плавний перехід від популяцій з домінуванням B.bombina (північно-східна частина трансекти: с. Миртюки, с. Дашава, м. Жидачів) до популяцій B.variegata (південно-західна область: с. Горішнє, м. Моршин, с. Лисовичи; рис. 6). Вибірку в околицях Жидачіва із частотою генів B.bombina 0,995 можна вважати межою інтрогресії генів жовточеревої кумки. Вибірка в околицях с. Горішнє із частотою генів B.variegata 0,966 є найбільш віддаленою в протилежний бік, але інтрогресія генів B.bombina, ймовірно, продовжується дещо далі в гірсько-лісову зону. Структура гібридної зони виглядає більш чітко в графічному представлені (рис. 7). Можна виділити дві підзони: 1) центральну вузьку область переходу між видами (1.5 - 2 км) і 2) широку область взаємних інтрогресій (6 і більше км.). Відрізняється і генотипна структура самих популяцій: тільки в межах першої підзони зустрічаються повністю гібридні популяції, де відсутні “чисті” генотипи, а також бімодально структуровані вибірки; тоді як розподіл гібридного індексу в популяціях другої підзони завжди унімодальний з переважанням генотипів одного з видів.

Рис. 6. Структура гібридної зони кумок по ядерним локусам.

Примітка. Чорним кольором в діаграмах представлена доля в популяціях генів B.variegata.

Розподіл популяцій носить більш мозаїчний характер в південно-східній частині трансекти (район м. Моршин – с. Долішнє), тоді як в північній і центральній частині показники мають виражену клинальну мінливість (район с. Станків – с. Дашава – м. Жидачів). Ця відмінність, очевидно, пов'язана із більш хаотичним розподілом лісових біотопів на півдні трансекти. В цілому форма ділянки гібридної зони в межах території досліджень повторює рельєф долини річки Стрий. Під час повені дорослі особини кумок можуть зноситись вниз по течії, що приводить до більш інтенсивної інтрогресії генів B.variegata в популяціях B.bombina із пойми ріки. Подальші дослідження наслідків гірських річкових повенів для існування гібридної зони особливо актуальні з погляду на їх катастрофічний характер в останньому десятиріччі.

Рис. 7. Мінливість середньо вибіркових значень індексу злиття плям (Sp.) і гібридного (HI) в центрі гібридної зони в залежності від відстані.

Примітки:

1. Знак “–“ відповідає віддаленню в напрямку популяцій червоночеревої, знак “+” – популяцій жовточеревої кумки

2. Тренди показників апроксимовані за допомогою методу найменших квадратів.

Обговорення результатів

Центральна проблема теорії існування вузьких гібридних зон – це питання про причини, які зупиняють взаємо направлені генні потоки і не дають генофондам двох видів змішуватись. Це в повній мірі актуально для зони гібридизації кумок. Серед основних факторів обмеження з літератури відомі гібридний дисгенез (Kruuk et al., 1992), поведінкові бар'єри (Sanderson et al., 1992) та активне біотопічне уподобання особин (MacCallum et al., 1998). Останній фактор був досліджений нами в Прикарпатті і його вплив на процес гібридизації не викликає сумнівів. Проте очевидно, що фізико-географічна композиція території обмежує генну інтрогресію на одних ділянках і підсилює генні потоки на інших. Ряд відмінностей у структурі гібридної зони, які раніше були відомі тільки для різних географічних областей Європи, спостерігаються в межах лише 5-10 км в українському Прикарпатті. Таким чином, ландшафт місцевості є головним чинником, що визначає розбіжності структури гібридної зони на різних її ділянках.

Загальна методика аналізу в даній роботі багато в чому була запозичена із попередніх досліджень ділянок гібридної зони в Центральній та Південній Європі. Тому було проведено безпосереднє порівняння отриманих результатів із минулими. Насамперед, місцезнаходження гібридної зони в Україні стосовно висоти над рівнем моря, її ширина, двохрівнева структура, унімодальний розподіл генотипів в популяціях, а також клинальна мінливість показників в області взаємних інтрогресій співпадають із спостереженнями на географічно близькій ділянці в околицях Кракова (Szymura, 1976, 1991). Інші ознаки, такі як мозаїчність розміщення гетерогенних популяцій в центрі зони, високі рівні варіації локусних частот (Fst), дефіциту гетерозигот (Fis) і нерівноваги по щепленню локусів (R) споріднюють українську трансекту із дослідженнями у колишній Югославії (MacCallum et al., 1998). Порівняння вказаних параметрів в ряді трансект в Польщі – Україні – Хорватії – Трансільванії (Vines et al., 2002), дозволяє прослідкувати перехід від вираженої клинальної (Польща) до вираженої мозаїчної структури (Румунія, табл. 1). Трансекти в Україні і Хорватії займають в цьому ряді проміжне місце, так як в них наявні обидва типи організації. Подібність організації трансект підкреслюється значними кліматичними і ландшафтними відмінностями територій, що зумовлює значно нижче розташування Хорватської ділянки над рівнем моря.

Порівняння результатів із даними першого дослідника гібридної зони кумок Л. Горбулевіча (Horbulewicz, 1927) свідчить про незмінність поширення чистих видових типів в районі Стрия - Моршина на протязі 70 років.

Таблиця 1.

Порівняння ділянки гібридної зони в околицях Стрия і трьох інших трансект: в Польщі (Szymura and Barton, 1986, 1991), Хорватії (MacCallum et al., 1998) і Румунії (Vines at al., 2002).

Характеристики Україна (Cтрий) Польща (Краков) Хорватія (Пещениця) Румунія (Апахіда)

Популяції, що гибридизують Карпатська B.variegata і північно-східна – B.bombina Карпатська B.variegata і північно-східна – B.bombina Західно-Європейска B.variegata і південна – B.bombina Карпатська B.variegata і південна –B.bombina

Висота н.р.м., м 200 – 400 200 – 300 100 – 250 100 – 280

Ландшафт Поступовий перехід від лісового до рівнинного, з деякою мозаїчністю Поступовий перехід від лісового до рівнинного Мозаїчний, суміш лісового і рівнинного Мозаїчний, практично без лісу

Кількість особин 847 3014 1764 1034

Кількість вибірок 58 57 147 116

Продовження табл.1.

1 2 3 4 5

Станд. варіація частот маркерних локусів, Fst 0.007 0.0083 0.0068 0.033

Макс. відхилення від пропорцій Харді-Вайнберга, Fis* 0.16 (0.02 – 0.3) 0.014 (-0.012 – 0.040) 0.23 (0.05 – 0.55) 0.21 (0.01 – 0.5)

Макс. різниця генних частот між водоймами двох типів 0,21 – 0,23 0,39

Примітка (*). В дужках вказаний інтервал 95% достовірності значення.

Антропогенний вплив на види, що гібридизують, і проблема їх збереження

Серед амфібій Східної Європи червоно та жовточерева кумки є одними з найбільш прив'язаними до антропогенних ландшафтів видами. Це пояснюється розмноженням обох у створених людиною водоймах. Вірогідно, що сучасне поширення гібридних популяцій є прямим наслідком локальних лісовирубок, як це трапилось в Румунії (Vines et al., 2002). Безперечно, що традиційне освоєння земель в Європі на протязі століть сприяло збільшенню чисельності видів. Проте із технічною революцією в сільському господарстві в Західній Європі стан кумок значно погіршився, і зараз обидва види охороняються Бернською конвенцією як такі, що потребують особливої охорони (ETS № 104, Додаток ІІ). С погляду на перевагу традиційного методу господарства в Прикарпатті умови існування кумок в цьому регіоні є найменш загрозливими. Про цей факт додатково свідчить збереження в регіоні гібридної зони, існування якої є зараз неможливим в Австрії (Gollmann, 1988), Польші (Szymura, 1996) та інших регіонах. Проте із розвитком транспортної мережі і курортної індустрії в Прикарпатті ці види будуть потребувати спеціальних методів охорони.

Висновки

1. У вузький зоні передгір'їв в Прикарпатті має місце інтрогресивна гібридизація червоночеревої та жовточеревої кумок.

2. Гібридна зона Bombina bombina і B. variegata ділиться на дві підзони: центральну область переходу від одного виду до іншого, шириною близько 2 км, популяції якої можуть складатись виключно з особин гібридного походження; і симетричну підзону взаємних інтрогресій (6 і більше км), де завжди переважають генотипи одного з видів.

3. Проаналізована ділянка гібридної зони поєднує клинальний і мозаїчний типи структури, які раніше відрізняли зони парапатрії кумок в Центральній та Південній Європі.

4. Для популяцій гібридної зони характерні два типи внутрішньої генотипної структури: унімодальний, де переважають рекомбінантні генотипи або генотип лише одного з видів; і бімодальний, де рекомбінанти складають меншість, проте наявні генотипи обох видів.

5. Використані генетичні маркери, тобто алозимні та молекулярні конформаційні локуси ядерної ДНК, а також гаплотип мітохондріальної ДНК є рівноцінними для опису структури гібридної зони.

6. В цілому мінливість морфологічних ознак співпадає із розподілом генотипів, при чому морфометричні індекси вказують тільки на присутність проміжних форм кумок на даній території. В той же час індекс злиття плям адекватно відображає генетичну структуру зони, за виключенням області домінування жовточеревої кумки.

7. В біотопічному розподілі популяцій різного генотипного складу провідну роль відіграють наземні біотопи, а характер водних біотопів має другорядне значення.

8. Є підстави вважати, що гібридна зона кумок залишається стабільною на протязі багатьох століть. Ділянка зони в Прикарпатті України не змінилася на протязі 70 років.

СПИСОК ОПУБЛІКОВАНИХ РОБІТ ПО ТЕМІ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Межжерин С.В., Морозов-Леонов С.Ю., Янчуков А.В. Характер генных интрогрессий в гибридной зоне Bombina bombina (L., 1761) и Bombina variegata (L., 1758) (Amphibia, Discoglossidae) Прикарпатья // Доповіді НАН України. 2001. № 5. с. 161-164.

2. Янчуков А.В., Морозов-Леонов С.Ю. Сравнительный анализ генетического состава гибридных популяций европейских жерлянок рода Bombina (Oken, 1816) из Украины и Хорватии // Цитология и генетика. 2002. Т. 36. № 3. с. 36 - 40.

3. Янчуков А.В., Межжерин С.В., Морозов-Леонов С.Ю. Анализ трансекты гибридной зоны краснобрюхой (Bombina bombina) и желтобрюхой (Bombina variegata) жерлянок в Прикарпатье // Вестник зоологии. - 2002. - № 5. - С. 41-46.

4. Янчуков А.В. Особенности сочетания генетических и морфологических маркеров в гибридной зоне краснобрюхой Bombina bombina и желтобрюхой Bombina variegata жерлянок // Доповіді НАН України. - 2002. - № 11. С. 194-198.

5. Yanchukov A. The effects of migration on the mosaic spatial structure of the hybrid zone between Bombina bombina and B. variegata toads // Program&Abstracts: 8th meeting of PhD students in evolutionary biology. 28.08. – 01.09.2002, Lohja, Finland. - P. 41.

Янчуков О.В. Структура гібридної зони між Bombina bombina і Bombina variegata (Anura, Discoglossidae) в Прикарпатті України. Дисертація на здобуття вченого ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.08 – “Зоологія”. Ін-т зоології ім. І.І. Шмальгаузена НАН України, Київ, 2002. Рукопис.

Був проведений аналіз популяцій із зони парапатрії жовточеревої і червоночеревої кумок і досліджена мінливість ряду ознак морфології, видоспеціфічних алозимних і SSCP локусів, а також гаплотипів мітохондріальної ДНК (RFLP аналіз). Виявлені фіксовані генетичні відмінності між контрольними вибірками в Центральній Украіні і Карпатах та змішані генотипи з околиць м. Стрий. Оцінений загальний розподіл показників в межах території досліджень і всередині популяцій, отриманий ряд популяційно-генетичних параметрів. Результати вказують на присутність гібридної зони з двохшаровою структурою: мозаїчною в центральній частині і клинальної в області взаємних інтрогресій. Емпіричним шляхом доведено збереження стабільності гібридної зони на протязі 70 років. Порівняльний аналіз морфологічних ознак і генотипів виявив придатність індексу злиття плям для опису генетичної структури гібридної зони, за виключенням області домінування генотипу жовточеревої кумки. Морфометричні індекси пропорцій тіла можуть бути використані тільки для виявлення присутності проміжних форм на даній території. Аналіз біотопів місць вибірок дозволив виявити залежність генотипного складу популяцій від характеру наземного біотопа,