ІНСТИТУТ ГЕРОНТОЛОГІЇ

АКАДЕМІЇ МЕДИЧНИХ НАУК УКРАЇНИ

БЛАГОДАРЕНКО Євген Анатолійович

УДК:612.46:616.61-007.21+313.61+007.61

РОЛЬ ОПІОІДІВ І ВНУТРІШНЬОНИРКОВИХ ГОРМОНАЛЬНИХ СИСТЕМ

У ТРИГЕРНИХ МЕХАНІЗМАХ АПОПТОЗУ ЗА ГІПЕРТРОФІЇ ОДНІЄЇ НИРКИ

03.00.04 - біохімія

Автореферат дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата медичних наук

Київ - 2003

Дисертацією є рукопис

Робота виконана в Луганському державному медичному університеті

Міністерства охорони здоров’я України

Науковий керівник- | доктор медичних наук, професор Комарєвцева Ірина Олександрівна, Луганський державний медичний університет, завідувачка кафедри біохімії.

Офіційні опоненти: | доктор медичних наук, професор Кульчицький Олег Костянтинович, Інститут геронтології АМН України, завідувач лабораторії регуляції метаболізму;

доктор біологічних наук, професор Дмитренко Микола Петрович, Інститут екогігієни і токсикології ім.. Л. І. Медведя МОЗ України, завідувач лабораторії біохімії.

Провідна установа: | Інститут біохімії ім. О. В. Палладіна НАН України, відділ біохімії ліпідів, м. Київ.

Захист відбудеться 15.05.2003 року о 14 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.551.01 в Інституті геронтології АМН України: 04114, вул. Вишгородська, 67, Київ – 114.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту геронтології АМН України (вул. Вишгородська, 67, м. Київ).

Автореферат розісланий 14.04.2003 року.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради

к. мед. н. Р. І. Потапенко

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Вивчення апоптогенеза є основою цілісного розуміння великої низки як фізіологічних так і патологічних процесів (Новиков В.С. 1996; Thompson C.B. 1995). Існування різних механізмів (поза- і внутрішньоклітинних), що забезпечують біологічний феномен апоптоза, дозволяє сподіватися на здійснення можливості виборчої регуляції клітинної смерті, що безсумнівно має величезне загальномедичне значення. Участь ряду сигнальних систем внутрішньоклітинних посередників у регуляції апоптоза стало вивчатися порівняно недавно. Так оксид азоту (NO) раніше розглядався в основному як сигнальна молекула в серцево-судинній системі (Palmer R.M.J. 1987; Paulus W.J. 1994). В останні роки стала активно вивчатися його участь у механізмах регуляції апоптозу (Малкоч А.В. 2000; Shougang Zhuang 1999). При цьому темою для обговорення продовжує залишатися питання, які ефекти викликає NO, цитотоксичний чи цитопротекторний. Також залишаються суперечливими дані про ефект сфінгозину – метаболіту сфінгомієлінового сигнального шляху – на процеси проліферації, диференціювання та апоптозу (James A. 1996; Dressler K.A. 1992).

Актуальним питанням залишається гормональна регуляція апоптозу. Участь ендогенних опіоідів у цьому процесі є найменш вивченою, а наявні дані найбільш суперечливі (Maneckjee R. 1994; Polakiewicz R.D. 1998). Але останні дослідження вказують на безсумнівну роль опіоідів у регуляції апоптозу, що має значення не тільки для цілісного розуміння регуляції цього процесу, але і для поглиблення уявлень про патогенез ряду захворювань (приміром, нефропатій у наркоманів) (Singhal P.C. 1998). Так само становить інтерес участь простаноідів у регуляції функцій нирок і процесів апоптозу в ній (Raymond C. 2001).

На цей час безсумнівною є роль апоптоза в патогенезі цілого ряду захворювань нирок. Активізацією апоптоза супроводжуються гломерулосклероз, інтерстіціальний нефрит, полікістозна хвороба нирок, гостра ниркова недостатність. Апоптоз інгибується при гломерулонефриті, IgA-нефропатії, абсцесі нирки, пухлинних захворюваннях (Цаликова Ф.Д. 1999). Але які механізми регуляції апоптозу задіяні в нирці, залишається предметом подальшого дослідження. Таким чином, вивчення нами механізмів регуляції апоптозу при гіпертрофії єдиної нирки після однобічної нефректомії і вплив на них опіоідів вносить вклад у поглиблення розуміння згаданих вище актуальних проблем сучасної біохімії.

Мета і задачі дослідження. Метою даної роботи було встановити зміни вмісту у нирковій тканині метаболітів низки сигнальних шляхів, які регулюють активність апоптозу – NO-синтазного, сфінгомієлінового, гліцероліпідного, та зміни клітинного об’єму за умов гіпертрофії однієї нирки, та встановити вплив опіоідів на ці показники.

Для досягнення поставленої мети були вирішені наступні задачі:

1.

2.

3.

4.

5.

6.

Об'єкт дослідження – механізми регуляції активності апоптозу в тканинах.

Предмет дослідження – роль опіоідів і внутрішньониркової простагландинової системи у регуляції частоти апоптозу за гіпертрофії однієї нирки.

Наукова новизна отриманих результатів. Вперше за умов гіпертрофії однієї нирки після однобічної нефректомії проведено комплексне дослідження біохімічних показників, пов’язаних зі зміною частоти апоптозу у нирковій тканині. Вивчено вміст сфінгозину, стабільних метаболітів оксиду азоту, кальцію, як метаболітів сигнальних шляхів, що регулюють розвиток апоптозу за цієї експериментальної моделі, дослідження проведено у динаміці в післяопераційний період. Також вивчений взаємозв'язок частоти апоптозу зі зміною об’єму клітин за даними ЯМР-релаксометрії протонів тканинної води в умовах гіпертрофії однієї нирки.

Вперше вивчені ендогенний біосинтез простаноідів Е2 і F2б у корі та медулі нирок щурів різного віку і їх екскреція із сечею в зв'язку з адаптаційно-компенсаторними механізмами при гіпертрофії однієї нирки і з активністю апоптозу в ній.

Вперше проведене комплексне дослідження впливу даларгіну на частоту апоптозу в нирковій тканині у щурів у нормальному фізіологічному стані і за гіпертрофії однієї нирки на 3, 7, 14 добу після однобічної нефректомії. Виявлено біохімічни зміни у нирковій тканині, що супроводжують ефект опіоідів (зокрема, даларгіну) на активність апоптозу.

Практична значимість роботи. Визначені показники рівня фрагментації ДНК, вмісту вільного сфінгозину, стабільних метаболітів оксиду азоту, показники ЯМР-релаксометрії протонів тканинної води нирок, показники біосинтезу простаноідів з ендогенних попередників у нирковій тканині в зв'язку зі станом водно-електролітного балансу у інтактних щурів можуть бути використані в якості нормативних показників для подальших досліджень при різних експериментальних моделях патології нирки у щурів.

Дані щодо встановлених біохімічних змін, що супроводжують збільшення частоти апоптозу за гіпертрофії однієї нирки є базою для експериментального обґрунтування рекомендацій з модуляції адаптаційно-компенсаторних процесів в організмі в умовах гіперфункції однієї нирки, що має місце в клініці урологічних захворювань. Також ці дані дають підставу для розробки патогенетичної терапії при гіперпроліферативних процесах з урахуванням механізмів активації апоптозу в цих умовах.

Дані про вплив уведення даларгіну (синтетичного лей-енкефаліну) на частоту апоптозу в нирковій тканині щурів дозволяють рекомендувати проведення досліджень щодо впливу названого препарату на активність апоптозу в тканинах організму людини для наступного застосування при терапії захворювань, у патогенезі яких має місце зміна інтенсивності апоптозу.

Результати дослідження шляхів регуляції активності апоптозу в нирковій тканині, взаємозв'язку зміни вмісту простагландинів з регуляцією електролітного балансу в нормі й в експериментальних умовах включені в навчальну програму кафедри медичної хімії Луганського Державного медичного університету з тем: “Водно-сольовий обмін і його регуляція” і “Гормони, гормоноподібі речовини і їхні внутрішньоклітинні посередники”.

Особистий внесок здобувача. У процесі виконання дисертації автор особисто відібрав і критично проаналізував усі сучасні літературні дані щодо теми проведеного наукового дослідження і запропонував його мету. Дисертантом модифікована прийнята експериментальна методика визначення вмісту вільного сфінгозину в тканинах. Експериментальні дослідження проводилися самостійно. Опис отриманих результатів, висновки, пропозиції з практичного застосування результатів дослідження належать автору роботи.

Апробація результатів дисертації. Матеріали результатів дисертації були повідомлені й апробовані на V міжнародному конгресі молодих вчених і студентів - медиків (Польща, м. Катовице, 2000 р.); на ХVІ з'їзді Українського фізіологічного товариства (м. Вінниця, 2002 р.); на ІХ Конгресі СФУЛТ (м. Луганськ, 2002 р.); на VIII з'їзді Українського біохімічного товариства (м. Чернівці, 2002 р.); на міжкафедральному засіданні працівників кафедри медичної хімії і науково-дослідницького центру Луганського державного медичного університету.

Публікації. За результатами дисертаційної роботи опубліковано 10 наукових праць. З них 6 статей - у фахових виданнях, (2 – без співавторів), і 4 тез - у матеріалах чотирьох наукових конференцій.

Структура й обсяг дисертації. Дисертація викладена на 158 сторінках машинописного тексту і складається з вступу, огляду літератури, опису матеріалів і методів дослідження, 3 глав власних досліджень, заключного обговорення результатів, висновків і додатка. Список використаних джерел включає 295 найменування, з них 29 – українською та російською мовами і 266 іншими мовами. Робота ілюстрована 22 таблицями, 26 діаграмами та 6 фотографіями.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Об'єкти і методи дослідження. Дослідження виконані на 560 щурах-самцях 4-, 5-, 6- і 16-тижневого віку. Тварини були розділені на дві експериментальні серії з підгрупами різних термінів дослідження після операції (3, 7 і 14 доби), контрольну групу інтактних тварин і групу контролю з уведенням даларгіну. Лівосторонню нефректомію робили під гексеналовим наркозом за загальноприйнятим методом в стерильних умовах. В другій серії експерименту статевозрілим тваринам вводили даларгін (синтетичний лей-енкефалін) внутрішньочеревно в дозі 100 мкг/кг маси тіла в добу протягом післяопераційного періоду, а в групі без нефректомії даларгін уводився протягом 7 діб.

У кожній групі методом фотометрії вивчалися відсоток фрагментації ДНК у тканині нирки для оцінки активності апоптозу (Messmer U.K. 1996), а також вміст вільного сфінгозину в нирковій тканині (Прохорова М.И. 1982), вміст оксиду азоту в тканині нирки по його стабільних метаболітах ( NO2- + NO3- ) (Орлова Е.А. 2001) і вміст іонів кальцію в нирковій тканині. Розвиток апоптоза у тканині нирок підтверджували морфологічним дослідженням методом люмінесцентної мікроскопії (Hoechst33258). Для оцінки водного балансу ниркової тканини, а також зміни об’єму клітин проводилася ЯМР-релаксометрія ниркової тканини in vitro. Біосинтез простагландинів Е2 і F2? з ендогенних попередників у нирковій тканині (корі і медулі) і екскреція ПГЕ2 і ПГF2? с сечею у тварин різного віку визначали по (Olive 1980). Кількісне визначення простагландинів проводилося радіоімуним методом за допомогою наборів реактивів фірми "Advanced Magnetics Inc." (Великобританія) і "Institute of isotopes" (Угорщина). Підрахунок радіоактивності вироблявся на рідинних сцінтиляціоних лічильниках “Бета-1” і “Гама-1”. Біосинтез простаноїдів у нирковій тканині перераховували на 1 мг білка, обрахованого по (Лоури 1951). Крім того, для оцінки функціонального стану нирок визначалися електролітний склад плазми і сечі, діурез, осмолярність плазми і сечі, вміст ендогеного креатиніну в плазмі і сечі загальноприйнятими методами.

Первинний цифровий матеріал експериментальних досліджень був оброблений традиційними методами варіаційної статистики (Стентон Гланц 1999). Для оцінки імовірності отриманих результатів був використаний критерій Стьюдента. Результати розцінювалися як достовірні при р<0,05.

Результати дослідження і їх обговорення. Одним з найбільш характерних біохімічних критеріїв оцінки активності процесів апоптозу в тканині є показник фрагментації виділеної ДНК (Новиков В.С. 1996; Walker P.R. 1994). Проведені нами дослідження показали, що в тканині інтактних нирок щурів (контрольна група) рівень фрагментації ДНК складає 5,20,4% (мал. 1). Цей показник близький до даних, наведених у (Цаликова Ф.Д. 1999) про те, що в здорових нирках людини апоптозу піддається близько 3% гломерулярних клітин. В усі терміни досліджуваного післяопераційного періоду виявлене статистично значиме підвищення рівня фрагментованої ДНК у тканині однієї нирки, що гіпертрофується (рис. 1). Мікроскопічне дослідження показало збільшення кількості клітин з характерними апоптотичними змінами в усі терміни післяопераційного періоду.

Після однобічної нефректомії в тканині нирки, що залишилася, спостерігалося підвищення вмісту вільного сфінгозину, але в різному ступені на різні терміни після операції(рис. 2). За даними (Spiegel S. 1993) додавання до культур клітин Swiss і A7r5 сфінгозину в концентраціях від 1 до 10 мкМ стимулювало синтез ДНК і проліферацію. А в концентрації 15 мкм сфінгозин робив різко цитотоксичний ефект, активізуючи апоптоз. Звідси можно припустити що, підвищення вмісту сфінгозину на 3-ю добу після ОНЕ скоріше спрямовано на стимуляцію мітотичної активності, а його значне підвищення на 7-у добу активізує апоптоз у тканині нирки. На 14-у добу вже йде зниження вільного сфінгозину в нирковій тканині, але його концентрація ще залишається підвищеною у кількості близької до токсичної .

З рис. 3 видно, що вміст оксиду азоту в тканині однієї нирки значно підвищується (більш ніж у два) рази на 3 і 7 добу. На 14 добу його рівень знижується, але залишається підвищеним у порівнянні з контролем (рис. 3). При цьому спостерігається значиме зменшення частки NO2 у загальній кількості NO2 і NO3 в усі терміни післяопераційного періоду з піком зниження на 7 добу. Можливо це пов’язано з активацію продукції супероксиданіону в клітинах, що сприяє переходу більшої частки NO у пероксинитрит (Beckman 1994) (з наступним перетворенням у NO3). Утворення пероксинітриту має цитотоксичний, проапоптотичний вплив на клітину. Слід зазначити, що на 14 добу частка NO2 стає пільше, але не доходить ще до контрольного значення, також як і значення сумарного оксиду азоту ще не повертається до норми.

За даними ЯМР-релаксометрії при гіпертрофії однієї нирки після однобічної нефректомії відбувалося збільшення часу подовжньої (Т1) і поперечної (Т2) релаксації тканинної води. Це вказує на збільшення фракції вільної води і зменшення зв'язаної в тканині. Пік цього підвищення спостерігався на 7-у добу після операції. Відбувалося також збільшення частки внутрішньоклітинної води (рис. 4) в усі терміни післяопераційного періоду. Але на 14-у

Рис. 1. Рівень фрагментації ДНК в тканині нирок за гіпертрофії однієї нирки щурів після однобічної нефректомії, а також при введені даларгіну.

Рис. 2. Вміст сфінгозину в тканині нирок за гіпертрофії однієї нирки щурів після однобічної нефректомії, а також при введені даларгіну.

Рис. 3. Вміст суми NO2 i NO3 в тканині нирок за гіпертрофії однієї нирки щурів після однобічної нефректомії, а також при введені даларгіну.

добу спостерігалося наближення цього показника до контрольного значення. Підвищення частки внутрішньоклітинної води вказує на збільшення об’єму клітин. Це є необхідною умовою протікання проліферації клітин у нирці, що гіпертрофується. Але за даними (Florian Lang 1998) збільшення об’єму клітин також створює передумови для активації апоптозу, шляхом стимуляції продукції активних форм кисню (АФК).

Рис. 4. Вплив даларгіну на частку внутрішньоклітинної води (Ра) в тканині нирок за гіпертрофії однієї нирки щурів після однобічної нефректомії за даними ЯМР-релаксометрії.

Результати показали, що кореляційний зв'язок зі зміною рівня фрагментації ДНК для зміни вмісту сумарного NO вище (+0,81), ніж для вмісту сфінгозину (+0,74). Самий тісний кореляційний зв'язок виявився між рівнем фрагментації ДНК і зміною процентної частки NO2, що була негативною (-0,98). Це вказує на те, що сигнальний шлях оксиду азоту більш значно впливає на активацію апоптозу в тканині нирки, що гіпертрофується. Позитивний кореляційний зв'язок сфінгозину з рівнем фрагментації ДНК, хоча менше, ніж для оксиду азоту, але теж є істотним. Розрахунок кореляційних зв'язків між зміною об’єму клітин тканини нирок і показниками частоти апоптозу в нирковій тканині при гіпертрофії однієї нирки дав наступні результати. Висока тіснота позитивного зв'язку з рівнем фрагментації ДНК і особливо з вмістом оксиду азоту (+0,68 і +0,97 відповідно). Слабкий позитивний зв'язок зі вмістом сфінгозину (+0,38). Тісний негативний зв'язок зі зміною частки NO2 у загальному вмісті оксиду азоту ( -0,81). Ці дані дозволяють зробити висновок, що зміна об’єму клітин значно впливає на показники активності NO-залежного сигнального механізму в клітинах тканини нирок, і як наслідок на рівень фрагментації ДНК, тобто активності апоптозу.

Слід зазначити підвищення вмісту іонів Са2+ у тканині нирок при гіпертрофії. Кальцій підвищується при активації проліферації (F. Lang 1998), але він також є важливим стимулятором апоптозу, будучи активатором ендонуклеаз (Meireles J. 1993) і сNО-синтази (Alderton W.K. 2001).

Переходячи до характеристики функцій нирки після однобічної нефректомії, насамперед, слід зазначити, що ця нирка бере на себе додаткове навантаження по виведенню продуктів обміну з організму.

Основні показники функціонального стану нирок у молодих нефректомованих щурів були наступними. Швидкість клубочкової фільтрації, що не відрізняється від контрольних величин, на 3-ю добу після операції, значно збільшувалася в наступний термін (7-у і 14-у добу) і, що особливо важливо, була вище, ніж у інтактних тварин. Зміни абсолютної реабсорбції води і натрію у нефректомованих щурів були двуфазними: зменшувалися на 3-у добу і значно підвищувалися на 7-й і 14-й день після операції в порівнянні з інтактними тваринами. Осмолярність сечі, а також фактори, що її обумовлюють (концентраційний показник і кліренс осмотично активних речовин), що мають тенденцію до збільшення на 3-у добу, вірогідно підвищувалися до 7-го дня, повертаючи до вихідного рівня на 14-у добу. Кліренс осмотично вільної води у експериментальних тварин збільшувався як на 7-у, так і на 14-у добу, у той час як збільшення кліренсу води, осмотично вільної від натрію, мало місце лише на 7-у добу після нефректомії. Однобічна нефректомія приводила до збільшення екскреції натрію і його кліренсу в ранньому післяопераційному періоді (3-я і 7-а доба), що нормалізувалися к 14-му дню. Фракція натрію, що екскретується, підвищена на 3-ю добу, значно зменшувалася на 14-й день.

Аналіз отриманих даних, що характеризують процеси осмотичного концентрування і розведення сечі, дозволив укласти, що у молодих щурів після однобічної нефректомії нирка, що залишилася, у ранньому післяопераційному періоді працювала в режимі “осмотичного” діурезу. Останній зникав до 14-ї доби після операції: діурез, осмолярність сечі, виділення натрію із сечею й ін. поверталися до вихідного рівня, тобто нирка цілком компенсувала екскреторну функцію, здійснювану двома нирками (у інтактних щурів).

Реакція нирки, що залишилася в організмі, на однобічну нефректомію у дорослих щурів відрізнялася від такої у молодих тварин. Рівень клубочкової фільтрації, залишаючись незмінним на 3-у добу після нефректомії, значно знижувався в наступний термін (7-а і 14-а доба), тобто на відміну від молодих тварин, у дорослих щурів термін у 14 діб виявився недостатнім для встановлення клубочкової фільтрації на рівні, характерному для двох нирок. Абсолютна реабсорбція води в канальцах і кількість реабсорбованого натрію поступово знижувалася і на 14-й день після операції були вірогідно нижче вихідного рівня, що вказувало на зменшення процесів реабсорбції при незмінній чи зниженій клубочковій фільтрації. Осмо- і волюморегулююча функція нирки, що залишилася, у дорослих щурів також була іншою, чим у молодих тварин. Осмолярність сечі і концентраційний показник осмотично активних речовин виявилися зниженими як на 3-ю, так і на 7-у і 14-у добу. Однак, незважаючи на те, що кліренс осмотично вільної води практично не відрізнявся від вихідного рівня, CNaH2O вірогідно підвищувався у нефректомованих тварин. Екскреція натрію із сечею й інші показники обміну натрію у дорослих щурів (екскретуєма фракція натрію, кліренс натрію і його концентраційний показник) знижувалися на 3-ю добу після нефректомії і досягали контрольних величин на 14-й день. Таким чином, стає ясним, що нефректомія у дорослих тварин приводить до розвитку водяного діурезу вже в ранньому післяопераційному періоді, про що свідчать зниження осмолярности сечі, концентраційного показника осмотично активних речовин, екскреція натрію із сечею на фоні збільшеного діурезу і кліренсу води, осмотично вільної від натрію.

Підсумовуючи отримані дані, що характеризують фільтраційно-реабсорбційну здатність нирки, що залишилася після однобічної нефректомії, слід зазначити, що у молодих і дорослих тварин мають місце різні типи реакції на нефректомію: зменшення реабсорбції при незміненій чи зниженій клубочковій фільтрації в дорослих щурів і двухетапна реакція в молодих – зниження канальцевої реабсорбції при незмінному рівні клубочковой фільтрації на ранніх термінах після операції (3-я доба) зі значним підвищенням цих функцій у міру збільшення післяопераційного періоду (до 14-ї доби). Формування різних типів реакції нирки, що залишилася в організмі, і вказує на те, що в молодих щурів швидше розвивається адекватний навантаженню рівень фільтраційно-реабсорбційних процесів, за рахунок роботи нирки в режимі “осмотичного діурезу”. Компенсація ж порушених функцій (здійснюваних у нормі двома нирками) у дорослих щурів у досліджуваний нами термін не настає, про що свідчить “водяний” діурез, який має в них місце, що зберігається ще на 14-у добу після операції.

Стан простагландінової системи нирки, що залишилася після нефректомії оцінювали, як і в інтактних тварин, за рівнем біосинтезу ПГЕ2 і ПГF2? з ендогенних попередників тканиною кори і медули нирки і екскреції їх із сечею.

Підсумовуючи отримані нами результати, слід зазначити, що у молодих і дорослих тварин мала місце істотно різна реакція простагландінової системи нирки, що залишилася після нефректомії. У молодих щурів виявлена двоетапна зміна біосинтезу ПГЕ2 й у корі, і в медулі: зниження на 3-у і підвищення на 7-14 добу. Утворення ПГF2? зменшувалося, починаючи з раннього післяопераційного періоду. У той же час у дорослих щурів (таблиця) біосинтез ПГЕ в медулярному шарі нирки після нефректомії знижувався, а утворення ПГF2?, навпаки, збільшувалося. Корковий біосинтез обох простагландінів у тварин після операції підвищувався. Поряд з наявними розходженнями в біосинтезі простагландінів у молодих і дорослих щурів установлена різноспрямованість змін екскреції останніх із сечею, що виявляється зниженням виділення простагландинів у молодих і підвищенням їх екскреції у дорослих тварин.

Аналіз представлених даних і стану внутрішньосистемних зв'язків між ними показав, що ниркова простагландінова система бере участь у становленні і розвитку гіперфункції нирки, що залишилася після нефректомії у тварин різного віку. При цьому, спираючись на літературні дані, можна припустити, що підвищення біосинтезу ПГЕ2 у тканині нирок дорослих щурів робить цитопротекторний, проліферативний ефект (Ottonello L. 1998). Підвищений же рівень ПГF2? здатний стимулювати апоптоз (Fraser H.M. 1999; Young F.M. 1997), що і спостерігається в нашому експерименті.

Таблиця. Рівень ендогенного біосинтеза ПГЕ2 и ПГF2? в тканині нирок дорослих щурів.

Серії експерименту | ПГЕ2, пг/мг білка | ПГF2?, пг/мг білка

Медула | Кора | Медула | Кора

Без даларгіну | Контроль | 54384,6

9974,1 | 62,95

5,96 | 5083,4

1040,3 | 75,3

13,66

3 доба | 48615,3

5374,2 | 147,6

3,12 | 13388,9

1125,2 | 57,3

5,1

7 доба | 29846,1

2134,5 | 198,7

9,43 | 16166,8

1389,5 | 286,6

21,38

14 доба | 34615,4

2357,2 | 349,3

20,5 | 12500

986,3 | 131,8

11,86

+

даларгін | Контроль | 55165,3

4485,6 | 64,2

5,32 | 8324,7

905,7 | 86,4

5,91

3 доба | 53789,5

4182,4 | 153,9

2,01 | 14211,3

1327,4 | 64,7

3,84

7 доба | 39678,2

4102,3 | 220,5

5,32 | 16547,9

1411,6 | 234,5

24,21

14 доба | 40125,7

3657,1 | 350,2

15,6 | 12327,8

1080,4 | 129,8

10,69

Введення інтактним щурам даларгіну в дозі 100 мкг/кг у добу протягом 7 днів показало наступну картину змін показників, що вивчалися. Нами було виявлено значне підвищення рівня фрагментації ДНК у тканині нирок щурів (рис. 1), що вказує на активацію апоптозу в нирковій тканині під впливом даларгіну. Під дією даларгіну статистично значимої зміни вмісту сфінгозину в тканині нирок нами не виявлено (рис. 2). Тобто в даних умовах не відбувалася активація сфінгомієлінового сигнального шляху. Але було виявлено значне зниження вмісту оксиду азоту в тканині нирок щурів (рис. 3). При цьому значно падала частка NO2 у загальній кількості метаболітів оксиду азоту.

В ефекті даларгіну на ниркову тканину ми спостерігаємо такий же зв'язок, як при активації апоптоза за гіпертрофії. Саме зниження частки NO2 у загальній кількості оксиду азоту супроводжує підвищення рівня фрагментації ДНК. Відбувалося також статистично значиме збільшення спин-решеточного (Т1) і спиного-спінового (Т2) часів релаксації протонів тканинної води тканин нирки. Це вказує на збільшення фракції вільної води в нирковій тканині. Також підвищилося значення частки внутрішньоклітинної води (Ра) (рис. 4), що говорить про збільшення об’єму клітин у нирковій тканині. Це у свою чергу може стимулювати продукцію АФК, що активізують програму апоптоза в клітинах.

Ефект даларгіну за гіпертрофії однієї нирки після однобічної нефректомії виявився цілком протилежним. Введення даларгіну в післяопераційний період викликало зниження рівня фрагментації ДНК у порівнянні з підвищеним рівнем в аналогічні періоди після операції без введення даларгіну (рис. 1). При цьому на 14-у добу після нефректомії рівень фрагментації наближався до контрольного значення (як у інтактних щурів). Відбувалося також зниження вмісту сфінгозину в тканині нирки, що гіпертрофується, наближаючи до контрольного значення (рис. 2). Тобто при впливі даларгину падала активність сфінгомієлінового сигнального шляху в тканині нирки, що гіпертрофується.

Нами також виявлене зниження вмісту метаболітів оксиду азоту в тканині нирки, що гіпертрофується, у серії з введенням даларгіну, у порівнянні із серією без введення даларгіну (рис. 3). При цьому зберігалася динаміка зміни цього показника. Таким чином, при введенні даларгіну вміст оксиду азоту в тканині нирок знижувався як у щурів з нефректомієй так і без неї. Тобто даларгін викликав зниження активності ферменту NO-синтази.

Під дією даларгіну в тканині нирки, що гіпертрофується, відбувалося підвищення частки NO2 у загальній кількості оксиду азоту в порівнянні з аналогічними термінами після операції в серії без введення даларгіну. Ці значення наближалися до контрольного. Отут ми спостерігаємо протилежний ефект даларгіну в порівнянні із серією інтактних щурів із введенням даларгіну. Тобто у тварин у нормальному фізіологічному стані даларгин знижував частку NO2 і підвищував рівень фрагментації ДНК, а в стані підвищеного навантаження і гіпертрофії однієї нирки даларгін сприяв підвищенню частки NO2 і зниженню рівня фрагментації ДНК у тканині нирки.

При введенні даларгіну в післяопераційний період нашими дослідженнями не виявлено статистично значимих змін ЯМР-показателей стосовно показників у відповідний термін після операції без введення даларгіну.

Щодо вмісту іонів Са2+ нами виявлено, що даларгін викликав зниження концентрації кальцію в нирковій тканині (як у інтактних так і нефректомованих щурів). Зниження тканинного кальцію є одним з основних ефектів опіоідів у цілому (Слепушкин В.Д. 1988). Саме з цим і може бути зв'язаний протилежний ефект даларгіну. Зниження рівня кальцію в інтактних щурів нижче нормального рівня знижує продукцію базового цитопротекторного оксиду азоту, що підвищує продукцію АФК (Myeong Kim 1999). А за гіпертрофії даларгін наближає рівень кальцію від підвищених значень до контрольних, що і призводить до нормалізації показників активності апоптоза в нирковій тканині.

Дія даларгіну на функцію нирки була наступною. Під дією опіоіду відбувалося збільшення клубочкової фільтрації і добового діурезу, як у інтактних щурів так і у тварин у післяопераційний період. Відбувалося також збільшення екскреції натрію із сечею. Це зв'язано з натрійуретичною дією ПГЕ2 (Brater D.C. 2002). Даларгін викликав посилення біосинтезу цього простаноїда (таблиця) у корковому і медулярном шарах нирок. На рівень продукції ПГF2 даларгін у нефректомованих тварин ефекту не робив. У такий спосіб зниження фрагментації ДНК у тканині нирки, що гіпертрофується, під дією лей-енкефаліну може також бути пов'язане з цитопротекторним впливом ПГЕ2.

ВИСНОВКИ

1. Гіпертрофія однієї нирки щурів після однобічної нефректомії супроводжується активацією апоптозу в тканині нирки, що виражається в збільшенні ДНК-фрагментації в нирковій тканині однієї нирки у експериментальних тварин. Пік цієї активації спостерігався на 7 добу після нефректомії.

2. Вміст вільного сфінгозину в тканині однієї нирки підвищується відповідно з ростом ДНК-фрагментації, досягаючи максимальної концентрації на 7-у добу, що відбиває індуктивну роль сфінгозина в стимуляції апоптозу за умов гіпертрофії.

3. Рівень оксиду азоту в тканині однієї нирки значно підвищувався, більш ніж у два рази на 3-у і 7-у добу. На 14-у добу - знижувався, але залишався підвищеним у порівнянні з контролем. При цьому спостерігалося значиме зменшення частки NO2 у загальній кількості оксиду азоту (сума NO2 і NO3) в усі терміни післяопераційного періоду з піком зниження на 7-у добу.

4. Встановлено зниження біосинтезу і екскреції ниркових простаноідів в молодих і підвищення у дорослих тварин у післяопераційний термін. Зміна біосинтезу ниркових простаноїдів впливає на функціональну адаптацію однієї нирки. Наявність позитивного кореляційного зв'язку між зміною рівня біосинтезу ПГF2б і рівнем фрагментації ДНК підтверджує участь цього простаноіда в активації апоптозу в тканині нирки в процесі гіпертрофії.

5. Ефект даларгіну (синтетичного лей-енкефаліну) на частоту апоптозу в нирковій тканині залежить від фізіологічного стану тварини. У інтактних тварин внутрішньочеревинне введення даларгіну в дозі 100 мкг/кг у добу протягом 7 днів викликало збільшення ДНК-фрагментації в нирковій тканині в 2,5 рази. А в умовах гіпертрофії однієї нирки даларгін пригнічував активність апоптозу на всі терміни після операції, наближаючи до контрольних значень.

6. В обох варіантах ефекту даларгіну на апоптозу, відбувається зміна вмісту стабільних метаболітів NO в тканині нирки, об’єму клітин, а також рівня біосинтезу ПГЕ2 як у медуллі, так і в корі нирки. Також даларгин, активуючи апоптозу в тканині нирки, зменшував частку NO2- у загальному вмісті метаболітів NO, а за пригнічення апоптозу, підвищував частку NO2-.

7. Різний ефект даларгіну на частоту апоптозу пов'язаний зі зниженням рівня кальцію і оксиду азоту у тканині нирці. В інтактній тканині даларгін знижував рівень кальцію і концентрацію оксиду азоту, а в умовах гіпертрофії однієї нирки наближав ці значення до рівня контрольної групи.

8. Введення даларгіну інтактним щурам на протязі 7 діб призводило до збільшення спин-решеточного (Т1), спин-спінового (Т2) часів релаксації протонів тканинної води і частки внутрішньоклітинної води (Ра) нирки, що вказує на збільшення об’єму клітин за рахунок фракції вільної води. Збільшення об’єму клітин збігається з посиленням фрагментації ДНК. В умовах гіпертрофії однієї нирки під дією даларгіну спостерігалася динаміка до зменшення зазначених показників на фоні зниження ДНК-фрагментації.

Список робіт опублікованих за темою дисертації

1. Благодаренко Е.А., Комаревцев В.Н., Фильчуков А.А., Комаревцева Е.В., Жовнер В.А., Попова Е.И. Влияние односторонней нефрэктомии на показатели 1Н-ЯМР-релаксации протонов тканевой воды крови в онтогенезе // Український медичний альманах.-1999.-Т.2 -№3.-С.24-25

2. Благодаренко Е.А., Комаревцев В.Н. Влияние опиоидов на 1Н-протонные механизмы регуляции клеточного объема при гипертрофии единственной почки // Український медичний альманах.-2000.-Т.3 -№4.-С.26-28

3. Благодаренко Е.А. Онтогенетические особенности показателей водно-электролитного обмена у крыс после односторонней нефрэктомии // Актуальні проблеми акушерства і гінекології, клінічної імунології та медичної генетики.-2001.-№6.-С.227-231

4. Орлова Е.А., Благодаренко Е.А., Фильчуков Д.А., Методика определения сфингомиелина в почечной ткани // Український медичний альманах.-2001.-Т.4 -№6.-С.120-123

5. Благодаренко Е.А. Влияние даларгина на NO-зависимый механизм активации апоптоза // Український медичний альманах.-2002.-Т.5 -№3.-С.13-15

6. Комарєвцева І.О., Орлова О.А., Благодаренко Є.А. Вміст оксиду азоту в тканинах нирок при активації апоптозу // Український біохімічний журнал.-2002.-Т.74.-№4-С.104-107

7. Blagodarenko E., Filchukov A., Komarevtsev V.N., Savenko D.V. Influence of dalargin on the mechanisms of regulation of apoptosis // 5th International Medical Students congress: April 12-14, 2000 Katowice, Poland, Congress book.-P.65

8. Комарєвцева І.О., Орлова О.А., Комарєвцев В.М., Благодаренко Є.А. Вивчення ролі сфінгомієлінового сигнального шляху активації в тканині нирок // Фізіологічний журнал.-2002.-Т.48.-№2.-С.7

9. Благодаренко Є.А., Белкіна Г.А., Соловйова І.В., Корявий Н.В., Фурсіна Ю.О. Вплив даларгіну на триггерні механізми апоптозу при гіпертрофії єдиної нирки після односторонної нефректомії // ІХ Конгресс Світової Федерації Українських Лікарських Товариств Серпень 19-23, 2002 Луганськ. Тези доповідей.-С.215

10. Комаревцева И.А., Орлова Е.А., Благодаренко Е.А. Бифункциональный характер действия оксида азота в ткани почек крыс при активации апоптоза // Український біохімічний журнал.-2002.-Т.74.-№4а (додаток 1)-С.47

Благодаренко Е.А. Роль опіоідів і внутрішньониркових гормональних систем у тригерних механізмах апоптозу за гіпертрофії однієї нирки. – Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата медичних наук за спеціальністю 03.00.04 – біохімія. – Інститут геронтології Академії Медичних Наук України, Київ, 2003 р.

Дисертація присвячена вивченню ролі опіоідів (на прикладі синтетичного лей-енкефаліну даларгіну) і системи простаноідів у регуляції активності сигнальних шляхів апоптозу (сфінгомієлінового, NO-залежного, кальцій-залежного і механізмів регуляції об’єму клітин) за гіпертрофії однієї нирки. Виявлено підвищення рівня фрагментації ДНК у тканині нирки, що гіпертрофується. Це вказує на активацію апоптозу в умовах посиленої проліферації. При цьому відбувалося підвищення вмісту сфінгозина і метаболітів оксиду азоту в тканині нирки й іонів кальцію, тобто ці сигнальні шляхи були задіяні в активації апоптозу в умовах гіпертрофії однієї нирки. В загальній сумі метаболітів оксиду азоту значно падала частка нітритів, що вказує на посилення продукції АФК. Також спостерігається збільшення об’єму клітин ниркової тканини. Це сприяє активації продукції АФК у клітках. Змінюється активность системи простаноідів у нирковій тканині: підвищується продукція ПГЕ2 у корі нирки і збільшення продукції ПГF2 (у медулі і корі). Це вказує на участь простаноідів в адаптаційно-компенсаторних процесах у однієй нирці й участь їх у регуляції активності проліферації й апоптозу. Виявлене модулюючий вплив даларгіну (синтетичного лей-енкефаліна) на розвиток апоптозу: активація фрагментації ДНК у інтактних щурів, і зниження підвищеного рівня, наближення його до норми в умовах гіпертрофії і гіперфункції. Даларгін знижував вміст оксиду азоту і кальцію в тканині нирок.

Ключові слова: нирка, гіпертрофія, апоптоз, фрагментація ДНК, оксид азоту, простагландіни, опіоіди, регуляція.

Blagodarenko E.A. A role of opioids and intrarenal hormone systems in trigger mechanisms of apoptosis at a hypertrophy of a sole kidney. - Manuscript.

The dissertation on competition of a scientific degree of the candidate of medical sciences at a speciality 03.00.04 - biological chemistry. - Institute of gerontology of Academy of Medical Sciences, Ukraine, Kiev, 2003 y.

The dissertation is devoted to studying of a role of opioids (on an example of synthetic leu - encephalin dalarginum) and prostaglandin system in a regulation of activity of signal pathways of apoptosis (sphingomyelin-, NO-dependent, calcium - dependent and mechanisms of a regulation of volume of cells) at a hypertrophy of a sole kidney. Rising in a level of DNA fragmentation in a tissue of a hypertrophied kidney that specifies an activation of apoptosis in conditions of the amplified proliferation was revealed. Thus there was a rising in the contents of sphingosine and metabolites of nitric oxide in a tissue of a kidney and ions of calcium, that is these signal pathways were involved in an activation of apoptosis in conditions of a hypertrophy of a sole kidney. Thus in a total sum of nitric oxide metabolites the lobe of nitrites considerably fell that specifies intensifying of AOF production. The augmentation of cell volume of a renal tissue also is observed. It also promotes an activation of AOF production in cells. Change of activity of prostanoid system in a renal tissue was observed: rising of production PGE2 in a cortex of a kidney and augmentation of PGF2б production in medulla and a cortex. It specifies participation of prostanoids in adaptive-compensatory processes in a sole kidney and their participation in a regulation of activity of a proliferation and apoptosis. Twofold, modulating influence of dalarginum (synthetic leu - encephalin) on development of apoptosis is revealed: an activation of DNA fragmentation at intact rats, and depressing of the raised level, approaching it to norm in conditions of a hypertrophy and a hyperfunction.

Key words: kidney, hypertrophy, apoptosis, DNA fragmentation, nitric oxide, prostaglandins, opioids, regulation.

Благодаренко Е.А. Роль опиоидов и внутрипочечных гормональных систем в триггерных механизмах апоптоза при гипертрофии единственной почки. – Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук по специальности 03.00.04- биохимия.- Институт геронтологии Академии медицинских Наук, Украина, Киев, 2003 г.

Диссертация посвящена изучению роли опиоидов (на примере синтетического лей-энкефалина даларгина) и системы простаноидов в регуляции активности сигнальных путей апоптоза (сфингомиелинового, NO-зависимого, кальций-зависимого и механизмов регуляции объема клеток) при гипертрофии единственной почки. В работе проводился анализ фрагментации ДНК в почечной ткани в качестве показателя активности апоптоза в ткани. Проводилось микроскопическое исследование с целью выявления морфологических признаков апоптоза клеток в ткани. Эксперимент проводился на 560 лабораторных крысах-самцах 4-, 5-,