ЛЬВІВСЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ

ІМЕНІ ІВАНА ФРАНКА

БОЙКО НАТАЛІЯ МИКОЛАЇВНА

УДК 577.352.5: 597.551.2-131 + 504.054

ВПЛИВ ІОНІВ ВАЖКИХ МЕТАЛІВ НА ЕЛЕКТРИЧНІ ПАРАМЕТРИ МЕМБРАН ЗАРОДКІВ В’ЮНА Misgurnus fossilis L.

03.00.02 – біофізика

Автореферат дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Львів – 2003

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана у Львівському національному університеті імені Івана Франка Міністерства освіти і науки України.

Наукові керівники: доктор біологічних наук, професор

Гойда Омелян Антонієвич

кандидат біологічних наук, доцент

Санагурський Дмитро Іванович,

Львівський національний університет імені Івана Франка,

завідувач кафедри біофізики та математичних методів

у біології

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор

Зима Валентин Леонідович,

Київський національний університет

імені Тараса Шевченка,

професор кафедри біофізики

доктор біологічних наук, професор

Стойка Ростислав Степанович,

Інститут біології клітини НАН України,

завідувач відділу регуляції проліферації клітин

Провідна установа: Харківський національний університет

імені В.Н. Каразіна Міністерства освіти і науки України

Захист відбудеться “18” квітня 2003 року о 13.00 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради К 35.051.14 у Львівському національному університеті імені Івана Франка за адресою: 79005, м. Львів, вул. Грушевського, 4, біологічний факультет Львівського національного університету імені Івана Франка, аудиторія № 333.

З дисертацією можна ознайомитись у науковій бібліотеці Львівського національного університету імені Івана Франка за адресою: 79005, м. Львів, вул. Драгоманова, 17.

Автореферат розісланий “15березня 2003 р.

В.о. вченого секретаря

спеціалізованої вченої ради,

кандидат біологічних наук, доцент ________________ М.Б. Градюк

Загальна характеристика роботи

Актуальність теми. Вплив таких факторів забруднення навколишнього середовища, як катіони важких металів, на іонтранспортні системи мембран клітин та на мембранний електрогенез є актуальною проблемою сучасної біології не тільки з екологічної, але і з біофізичної точки зору. Особливо важливим є дослідження таких впливів на електричні параметри мембран зародкових об’єктів, оскільки динаміка електрофізіологічних показників клітин в період раннього розвитку відображає зміни функціонального стану, зокрема ступінь життєздатності, і може бути прогностичним біофізичним показником їх подальшого виживання.

Використання методу внутрішньоклітинного відведення потенціалу за допомогою скляних мікроелектродів дозволило дослідити динаміку трансмембранного потенціалу (ТМП) бластомерів зародків в’юна в процесі розвитку заплідненої яйцеклітини від моменту запліднення до закінчення періоду дроблення бластомерів.

Було встановлено, що в цей період для динаміки ТМП є характерними коливання величини потенціалу (Божкова, 1971; Квавилашвили, Божкова, Чайлахян, 1971; Гойда, 1993). Також було показано, що період таких коливань відповідає тривалості клітинного циклу під час дроблення бластомерів, причому гіперполяризація (зростання абсолютних значень потенціалу) припадає на інтерфазу клітинного циклу, а деполяризація (зменшення абсолютних значень) – на мітоз. Середній рівень абсолютних значень потенціалу зростає протягом періоду дроблення бластомерів (Божкова, Квавилашвили и др., 1971; Гойда, Кусень, Санагурський, 1974). Встановлено, що в генерації потенціалу в цей період беруть участь системи як пасивного, так і активного мембранного транспорту (Гойда, Медина, Санагурський, 1989; Гойда, 1993). Багатьма авторами було показано, що динаміка ТМП істотно змінюється внаслідок впливу різних зовнішніх факторів, як фізичних (Гойда, 1993), так і хімічних (Гойда, Ротт, Санагурский, 1981; Санагурский, 1983; Бойко, Санагурський, 2000) а отже є досить чутливим показником.

Однак, вплив на цей показник таких поширених забрудників навколишнього середовища, як катіони важких металів, майже не досліджувався з використанням зародкових об’єктів, хоча подібні дослідження проведені на мікроорганізмах (Грузина, Балакина, Карамушка и др., 1997; Карамушка, Ульберг, Грузина, 1991).

Тому вивчення впливу іонів важких металів на динаміку трансмембранного потенціалу бластомерів зародків в’юна в період раннього ембріогенезу є актуальним для виявлення механізмів ембріотоксичності та тератогенності цих факторів забруднення, і для визначення механізмів транспорту цих іонів мембранними системами клітин та їх участі в процесах клітинного електрогенезу.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота виконана в межах науково-дослідних тем “Частотний аналіз та моделювання коливань мембранозв’язаних процесів у ранньому ембріогенезі тварин при різних екологічних ситуаціях”, № держреєстрації 0194U029962, “Дослідження динаміки біоелектричних параметрів мембран зародків тварин за різних умов інкубації з використанням комп’ютерного моделювання”, № держреєстрації 0196U023018, а також науково-дослідної теми “Вплив іонів важких металів на електрогенез клітин в ранньому ембріогенезі”, № держреєстрації 0102U003573 (здобувачем проведено дослідження впливу катіонів важких металів, а саме Ni2+, Co2+, Sn2+, Zn2+, Mn2+ та Cd2+, на динаміку трансмембранного потенціалу та на активність Na+, K+-АТФ-ази мембран зародків в’юна з використанням частотного аналізу).

Мета і завдання дослідження. Метою роботи є дослідження впливу катіонів важких металів на динаміку ТМП з тим, щоб з’ясувати механізми впливу цих іонів на електрогенез клітин зародків в’юна. Для досягнення цієї мети у роботі вирішували наступні завдання:

1. Електрофізіологічне дослідження динаміки ТМП бластомерів інтактних зародків в’юна.

2. Дослідження динаміки ТМП зародків за умов наявності в інкубаційному середовищі двовалентних катіонів нікелю, кобальту, марганцю, цинку, кадмію та олова в різних концентраціях.

3. Спектральний аналіз коливної динаміки ТМП зародків в’юна в нормі та за умов впливу катіонів важких металів.

4. Дослідження активності Na+, K+-АТФ-ази мембран зародків в’юна на різних стадіях розвитку протягом періоду дроблення бластомерів у нормі та за умов впливу іонів важких металів.

5. Електронно-мікроскопічне дослідження ультраструктури бластомерів зародків в’юна, інкубуваних у нормальному середовищі та в присутності катіонів важких металів.

6. Дослідження морфогенетичних характеристик зародків в’юна в нормі та за умов впливу катіонів важких металів.

Об’єкт дослідження: динаміка трансмембранного потенціалу бластомерів зародків в’юна.

Предмет дослідження: механізми впливу катіонів важких металів на динаміку трансмембранного потенціалу зародків в’юна.

Для досягнення мети роботи використовувались електрофізіологічні, спектрофотометричні, статистичні методи досліджень, а також метод електронної мікроскопії.

Наукова новизна одержаних результатів. За допомогою методу внутрішньоклітинного відведення ТМП встановлено, що катіони важких металів викликають зміни у динаміці ТМП бластомерів зародків в’юна. Показано, що за умов впливу катіонів важких металів відбувається залежна від концентрації важких металів деполяризація мембрани бластомерів; амплітуда коливань ТМП зменшується внаслідок впливу іонів важких металів, а період коливань – збільшується, що свідчить про сповільнення розвитку зародків. Останнє підтверджене дослідженнями морфогенезу личинок в’юна, інкубованих у присутності катіонів важких металів. Ці дослідження показали, що вплив катіонів важких металів веде до значного відставання у розвитку та появи різних аномалій у личинок в’юна.

З’ясовано, що вплив катіонів важких металів веде до зниження активності Na+, K+-АТФ-ази мембран зародків в’юна, яке проявляється суттєвіше із збільшенням концентрації катіонів металів в інкубаційному середовищі.

Показано, що вплив іонів важких металів приводить до значних ультраструктурних змін органел бластомерів зародків в’юна.

Теоретичне і практичне значення одержаних результатів. Одержані результати розширюють уявлення про механізми впливу катіонів важких металів на електричні параметри мембран зародкових клітин і на морфогенетичні процеси, зокрема на ультраструктуру бластомерів зародків. Ці результати впроваджені у навчальний процес при викладанні загального курсу біофізики та спецкурсів з біофізики мембран та фізико-хімічних методів дослідження у Львівському національному університеті імені Івана Франка. Вони використовуються для токсикологічної оцінки біологічно-активних речовин у лабораторіях фармакологічних та токсикологічних досліджень Державного науково-дослідного контрольного інституту ветпрепаратів та кормових добавок Міністерства аграрної політики України.

Особистий внесок здобувача полягає у виконанні всього обсягу експериментальної частини дисертації, статистичній обробці одержаних результатів, підборі та обробці даних літератури та у підготовці до друку публікацій за матеріалами дисертацій.

У плануванні напрямків досліджень, аналізі та інтерпретації одержаних результатів та у формуванні висновків брали участь наукові керівники та співавтори публікацій.

У проведенні електронно-мікроскопічних досліджень брав участь старший науковий співробітник, кандидат біологічних наук Кулачковський О.Р.

Апробація результатів дисертації. Результати досліджень, що внесені до дисертації, доповідались на звітних наукових конференціях Львівського національного університету імені Івана Франка (1996–2002 р.р.); на 4-ій Міжнародній студентській науковій конференції (Gdansk, Poland, 1996); на VII Українському біохімічному з’їзді (Київ, 1997); на 6-ій Пущинскій школі-конференції молодих вчених (Пущино, 2002); на ІІІ з’їзді Українського біофізичного товариства (Львів, 2002); на міжнародній конференції пам’яті І.В. Шостаковської (Львів, 2002).

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 12 друкованих праць, з них 7 – у фахових наукових виданнях, 5 – у збірниках і тезах наукових конференцій.

Структура та обсяг дисертації. Дисертаційна робота складається з вступу, огляду літератури, опису матеріалів та методів досліджень, результатів власних досліджень, обговорення результатів, висновків та списку використаної літератури з 279 джерел. Робота викладена на 142 сторінках друкованого тексту, вона містить 1 таблицю та 61 рисунок.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

У вступі обґрунтовано актуальність теми, визначено мету та завдання досліджень, розкрито наукову новизну і практичне значення роботи, означено особистий внесок здобувача, представлено перелік конференцій, на яких апробувались результати досліджень.

У першому розділі ”Огляд літератури” систематизовано і узагальнено наукові дані про електрофізіологічні показники мембран зародків тварин, проаналізовано дані про вплив іонів важких металів на електричні параметри мембран різних об’єктів, розглянуто ембріотоксичну та тератогенну дію катіонів металів.

У другому розділі “Матеріали та методи досліджень” описано об’єкт досліджень, обґрунтовано методи, використані в дослідженнях для досягнення мети роботи.

Експериментальна установка. Вимірювання та реєстрацію трансмембранного потенціалу клітин зародків в період дроблення бластомерів здійснювали на спеціально зібраній установці. При проведенні експерименту в камеру з оргскла з інкубаційним середовищем, де знаходився зародок, вносили розчини хлоридів важких металів у концентраціях від 10–6 М до 10-4 М, які виготовляли на основі фізіологічного розчину для холоднокровних – розчину Гольтфретера, і проводили реєстрацію трансмембранного потенціалу, зміненого внаслідок впливу іонів важких металів.

Реєстрацію рівня мембранного потенціалу здійснювали безперервно, протягом 6-7 год розвитку зародків. Для цього використовували підсилювачі, які були змонтовані на базі інтегральних мікросхем К544 УДІА за принциповими схемами, запропонованими в роботах (Костюк, Крышталь, 1981; Магура, 1981; Первис, 1983). Електричні сигнали, отримані на виході підсилювача, реєстрували за допомогою потенціометра КСП-4.

Визначення активності Na+, K+-активованої, Mg2+-залежної АТФ-ази в гомогенаті клітин зародків в’юна. Активність Na+, K+-активованої, Mg2+-залежної аденозинтрифосфатази в гомогенаті клітин зародків в’юна визначали за різницею активностей у відсутності оуабаїну та при його додаванні (Прохорова, 1982). Внаслідок гідролізу АТФ при дії АТФ-ази нагромаджується неорганічний фосфат (Рн). Останній перетворюється молібденовокислим амонієм у комплексну сполуку, яка відновлюється аскорбіновою кислотою до молібденової сині. Інтенсивність забарвлення є пропорційною вмісту Рн. Величину оптичної густини визначали на спектрофотометрі СФ-26 при довжині хвилі 700 нм. За калібрувальною кривою через величину екстинкції визначали вміст неорганічного фосфору в зразку. 1 мкг Рн в зразку відповідало середнє значення екстинкції, що дорівнювало 0,031. АТФ-азну активність (в мкмолях Рн/мг білка?год) розраховували за формулою: A = 6Pн/аМ, де Рн – вміст фосфору в пробі, знайдений за кривою; а – вміст білка в пробі; М – молекулярна маса фосфору.

Методика електронно-мікроскопічних досліджень клітин зародків в’юна. Зародки в’юна на стадіях 2 і 16 бластомерів та на 6-ій годині розвитку фіксували 1,5%-м розчином глютарового альдегіду в 0,2 М какодилатному буфері (рН 7,2) при to = 4оС, на протязі 1 год. Зразки промивали какодилатним буфером і додатково фіксували 2%-м розчином чотирьохокису осмію у тому ж буфері протягом 1 год (при to = 4оС). Потім препарати відмивали від фіксаторів і обезводнювали в зростаючих концентраціях етилового спирту (50%, 70%, 90% і 100%). Додатково обезводнювали 2-ма змінами окису пропілену і поміщали в епоксидну смолу епон-812 (Уикли, 1975). Зрізи готували на ультрамікротомі УМТП-6 за допомогою алмазного ножа, контрастували 2%-ним розчином уранілацетату протягом 15 хв і додатково цитратом свинцю за Рейнольдсом (Reynolds, 1963). Зрізи переглядали і фотографували за допомогою електронного трансмісійного мікроскопа ПЕМ-100.

Усі отримані результати були оброблені за допомогою методів статистичного аналізу. Крім того, для кривих динаміки трансмембранного потенціалу було проведено спектральний аналіз за допомогою пакету прикладних програм STATGRAPHICS 2.6.

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

Динаміка трансмембранного потенціалу зародків в`юна в нормі та за умов впливу катіонів важких металів

Відомо, що динаміка трансмембранного потенціалу зародків в’юна Missgurnus fossilis L. протягом періоду дроблення бластомерів має коливний характер (Санагурський, 1983; Гойда, 1993), причому гіперполяризація – збільшення абсолютних значень потенціалу – припадає на інтерфазу клітинного циклу, а деполяризація – зменшення абсолютних значень – власне на мітоз (Гойда, 1993). Період коливань ТМП в нормі є приблизно однаковим протягом усього часу дроблення і становить близько 31 хв (Детлаф, Детлаф, 1960), що співпадає з тривалістю клітинного циклу.

Як було показано в проведених дослідженнях, за умов присутності в середовищі інкубації зародків в’юна катіонів важких металів, а саме нікелю, кобальту, цинку, олова, марганцю та кадмію в концентраціях 10-6–10-4 М, відбувається загальна деполяризація мембрани, а також зменшення амплітуди та збільшення періоду коливань ТМП. Останнє співпадало зі зменшенням частоти поділу, а, отже, іони важких металів спричиняли сповільнення розвитку зародків. Ці зміни були більш виражені внаслідок збільшення концентрації металів в інкубаційному середовищі.

Зокрема, за наявності іонів нікелю в концентрації 10-5М (рис.1) виявлено значну деполяризацію мембрани – до -30-35 мВ (норма -60-70 мВ) (максимальні значення). Вплив іонів кобальту та марганцю в концентрації 10-5 М викликав деполяризацію мембрани до -40-45 мВ (рис. 2, 5).

Значна деполяризація простежувалась також внаслідок впливу іонів олова (рис. 3) – до -35-40 мВ, цинку (рис. 4) – до -40-45 мВ та кадмію – до -35-40 мВ (рис. 6) в концентраціях 10-5 М. У випадку зменшення концентрації важких металів деполяризація мембрани була менш вираженою: до -45-50 мВ при дії іонів нікелю та кадмію (рис. 1, 6), до -50-55 мВ при наявності іонів олова та цинку (рис. 3, 4) і до -55-60 мВ внаслідок впливу іонів марганцю (рис. 5).

За наявності в інкубаційному середовищі іонів нікелю, марганцю та кадмію в концентрації 10-5-10-6 М (рис. 1, 2, 6) період коливань ТМП збільшувався в 1,5 - 2 рази, а, отже, в 1,5 - 2 рази зменшувалась частота поділу бластомерів. Це збігалося з даними візуального спостереження за зародками: тварини, яких інкубували за наявності іонів важких металів у середовищі, розвивались набагато повільніше, ніж контрольні особини, і, крім того, мали деякі вади розвитку.

Амплітуда коливань ТМП також значно зменшувалась внаслідок впливу іонів важких металів: за наявності іонів нікелю та олова в концентрації 10-5 М (рис. 1, 3) в 2 - 2,5 рази, а іонів цинку, марганцю та кадмію в концентрації 10-5 М (рис. 4 - 6) – в 1,5 - 2 рази. Наявність в інкубаційному середовищі іонів важких металів у менших концентраціях приводила до менш виражених змін амплітуди та періоду коливань.

Отже, вплив катіонів важких металів веде до виражених змін у динаміці трансмембранного потенціалу (ТМП) зародків в’юна протягом періоду дроблення бластомерів, а саме – збільшення періоду синхронних коливань потенціалу, зменшення амплітуди коливань, деполяризації мембрани, тобто до зменшення абсолютних значень ТМП.

Спектральний аналіз коливань ТМП зародків в’юна

Середні значення періодів коливань ТМП зародків в’юна протягом періоду дроблення бластомерів як в нормі, так і внаслідок впливу іонів важких металів можна визначити за допомогою спектрального аналізу коливань потенціалу.

Частотні спектри (періодограми) коливань ТМП отримували за допомогою пакету прикладних програм STATGRAPHICS.

Спектральний аналіз коливань трансмембранного потенціалу зародків в`юна на ранніх етапах ембріогенезу дає можливість визначити як змінюються частота та амплітуда коливань ТМП внаслідок впливу іонів важких металів у порівнянні з контролем.

На рис. 7 (1) представлений спектр частоти коливань ТМП зародків в`юна, яких утримували в нормальних умовах (контроль). Оскільки на цьому графіку присутній тільки один досить вузький пік, то можна зробити висновок, що в динаміці коливань ТМП зародків в`юна в контролі превалюють коливання тільки одної частоти. Максимум приходиться на 0,041 періоду на інтервал квантування. Оскільки інтервал квантування в нашому випадку становив 1,25 хв, можна вирахувати період коливань, які превалюють в контролі, він становить: 1,25?1/0,04 = 30,5 хв.

На рис.7 (2-3) зображені спектри частоти коливань ТМП зародків в`юна в присутності іонів нікелю в концентрації 10-6 та 10-5 М. Спектральному максимуму при дії іонів нікелю в концентрації 10-6 М (з частотою 0,021 періоду на інтервал квантування) відповідають коливання з періодом 59,5 хв. При дії іонів нікелю в концентрації 10-5 М пік є досить широким, в діапазоні 0,02–0,035 періодів на інтервал квантування. Це означає, що період коливань у цьому випадку не є постійним і варіює від 38 до 62,5 хв.

Спектральний аналіз коливань ТМП був також проведений для значень ТМП, одержаних внаслідок впливу інших досліджуваних важких металів. Проведений аналіз дозволив вирахувати значення періодів коливань потенціалу протягом дроблення бластомерів.

При дії катіонів кобальту період коливань є однаковим, як при концентрації 10-5 М, так і при концентрації 10-4 М, і становить приблизно 39 хв.

У присутності іонів олова в концентрації 10-5 М період коливань ТМП становить приблизно 39 хв, а при дії іонів олова в концентрації 10-4 М частотний пік є широким: 0,023 – 0,033 періоду на інтервал квантування, отже період коливань ТМП є неоднаковим протягом дроблення бластомерів, а змінюється від 38 до 54 хв.

Період коливань потенціалу в присутності іонів цинку в концентрації 10-6 М становить приблизно 40 хв, таким чином період коливань ТМП в цьому випадку збільшується приблизно в 1,3 рази порівняно з контролем. При дії іонів цинку в концентрації 10-5 М період коливань ТМП змінюється від 39 до 52 хв протягом дроблення бластомерів.

Період коливань при дії іонів марганцю в концентрації 10-6 М становить 52 хв, а при дії катіонів марганцю в концентрації 10-5 М період коливань досягає 54,3 хв, що більше від періоду коливань в контролі в 1,8 рази.

У присутності катіонів кадмію в концентрації 10-6 М період коливань ТМП становить приблизно 54 хв, а при дії іонів кадмію більшої концентрації – 10-5 М період коливань є ще більшим в порівнянні з контролем і сягає 57 хв, що перевищує контроль в 1,9 рази.

Отже, спектральний аналіз дозволяє виявити частоти коливань трансмембранного потенціалу, які превалюють протягом періоду дроблення бластомерів, а також порівняти частоти коливань ТМП в нормі та за умов впливу катіонів важких металів. Він показав, що вплив катіонів досліджуваних металів в концентраціях 10-4 – 10-6 М приводить до зменшення частоти коливань трансмембранного потенціалу, а отже – до збільшення періоду коливань порівняно з контролем.

Зміни активності Na+, K+-АТФ-ази внаслідок впливу іонів важких металів

Поряд зі збільшенням періоду коливань потенціалу, в усіх випадках впливу іонів досліджуваних металів відбувається деполяризація мембрани, тобто зменшення абсолютних значень потенціалу. Подібний вплив на ТМП зародків в’юна, що полягає у значній деполяризації мембрани при збереженні коливань, спостерігався при внесенні в середовище інкубації зародків специфічного інгібітору Na+, K+-АТФ-ази – серцевого глікозиду оуабаїну (Гойда, 1993). Інші автори, такі як Грузина Т.Г., Балакина М.Н., Карамушка В.И. та співавтори (1997), показали, що зменшення абсолютних значень ТМП внаслідок впливу іонів важких металів у бактерій супроводжується зниженням АТФ-азної активності бактеріальної мембрани. Виходячи з цього можна зробити припущення, що катіони важких металів впливають на динаміку трансмембранного потенціалу шляхом інгібування Na+, K+-помпи. Тому наступним етапом нашої роботи було дослідження впливу іонів важких металів на активність Na+, K+-АТФ-ази, яка є інтегральним білком Na+, K+-помпи, що здійснює спряжений з гідролізом АТФ транспорт іонів Na+ і K+ через мембрану.

Одержані результати показують, що вплив двовалентних іонів важких металів, а саме нікелю, кобальту, олова, цинку, марганцю та кадмію у концентраціях 10-6 – 10-4 М веде до залежного від концентрації зменшення активності Na+, K+-активованої, Mg2+-залежної АТФ-ази. Таке зменшення активності спостерігалось як після першого поділу – на стадії 2 бластомерів, так і в кінці періоду дроблення бластомерів – на стадії 10-го поділу, причому на більш пізніх стадіях дроблення бластомерів зменшення активності Na+, K+-АТФ-ази під впливом іонів важких металів було виражено суттєвіше. На всіх досліджуваних стадіях активність АТФ-ази змінювалась найменше внаслідок впливу катіонів кобальту та мангану. Найсуттєвіше зниження активності спостерігалось при дії катіонів нікелю та кадмію – тобто за умов тих самих впливів, за яких відбувалось найбільш виражене зменшення абсолютних значень ТМП.

Якщо порівняти зміни в часі активності Na+, K+-АТФ-ази зародків в’юна протягом періоду дроблення бластомерів та загальну тенденцію змін ТМП – тренд – протягом того ж періоду, то видно, що характер змін цих двох показників у присутності катіонів важких металів є подібним (рис. 8 – 13).

На рис. 8 представлені зміни активності Na+, K+-АТФ-ази (а) та динаміки ТМП зародків в’юна (б) за умов впливу іонів нікелю в порівнянні з контролем. Вплив іонів нікелю в концентрації 10-6 М веде до помітного зменшення як активності Na+, K+-ATФ-ази, так і абсолютних значень ТМП, яке стає більш вираженим із збільшенням концентрації іонів металу до 10-5 М. Видно, що в той час, як в контролі на стадіях 6–10-го поділів бластомерів активність Na+, K+-АТФ-ази та значення потенціалу збільшуються, при дії іонів нікелю на цих стадіях спостерігається суттєве зменшення значень цих показників.

При дії іонів кобальту зміни є подібними, але менш вираженими (рис. 9). До значного зниження активності Na+, K+-АТФ-ази (а) та абсолютних значень ТМП зародків (б) приводив вплив іонів кобальту в концентрації 10-4 М. Вплив іонів кобальту у концентрації 10-5 М був менш помітним.

На рис. 10 представлені зміни активності Na+, K+-ATФ-ази (а) та динаміки ТМП зародків в’юна (б) за умов впливу іонів марганцю в концентрації 10-5 М та 10-6 М у порівнянні з контролем. Вплив іонів марганцю також веде до зменшення активності Na+, K+-ATФ-ази (а) і зменшення абсолютних значень потенціалу (б). Зміни є вираженими суттєвіше при дії іонів марганцю в концентрації 10-5 М.

Результати впливу катіонів олова на досліджувані показники наведені на рис. 11. Ці зміни, як і в попередніх випадках, є залежними від концентрації: при дії іонів олова в концентрації 10-5 М активність Na+, K+-ATФ-ази зародків в’юна (а) зменшувалась, як і абсолютні значення ТМП (б).

За умов впливу іонів олова в концентрації 10-4 М деполяризація мембрани була більш вираженою, як і зменшення активності АТФ-ази.

Вплив іонів цинку (рис. 12) веде до подібних змін як активності Na+, K+-ATФ-ази (а), так і значень потенціалу зародків в’юна (б). У випадку впливу іонів цинку в концентрації 10-5 М ці зміни були суттєвішими, ніж при концентрації іонів 10-6 М.

На рис. 13 представлені зміни АТФ-азної активності (а) та динаміки ТМП зародків в’юна (б) у присутності іонів кадмію. Активність Na+, K+-ATФ-ази зародків при дії цих іонів, як і при дії іонів нікелю, зменшувалась суттєвіше, ніж внаслідок впливу іонів інших металів. Як і в інших випадках, вплив іонів кадмію в концентрації 10-5 М приводив до більш значних змін обох показників, ніж вплив іонів кадмію в концентрації 10-6 М.

Узагальнюючи, можна сказати, що вплив катіонів важких металів веде до залежного від концентрації зменшення активності Na+, K+-ATФ-ази і до подібного за характером зменшення абсолютних значень трансмембранного потенціалу зародків в’юна впродовж стадії дроблення бластомерів.

Більш вираженому зниженню ензиматичної активності помпи відповідає суттєвіша деполяризація мембрани.

Якщо в контролі активність Na+, K+-АТФ-ази зростала від запліднення до стадії 64 бластомерів, то при дії іонів металів активність цього ферменту зменшувалась або зростала незначно протягом періоду дроблення, як і абсолютні значення ТМП у відповідних випадках.

Виходячи з проведеного порівняння, можна вважати, що інгібування Na+, K+-АТФ-ази іонами досліджуваних важких металів може бути одною з основних причин змін рівня ТМП зародків в’юна внаслідок впливу іонів важких металів.

Інгібування Na+, K+-АТФ-ази катіонами важких металів може здійснюватись, зокрема, шляхом зв’язування іонів металів з сірковмісними групами ферменту (Zhang Guo, Yamaguchi Masayoshi et al., 1990; Вовканич, Дубицький, 1998; Zichittella, Shi, Arguello, 2000).

Показано (Дубицький, Вовканич, 2000), що інгібування катіонами металів транспортних систем мембран залежать від їх фізико-хімічних властивостей, зокрема від радіусу іона, ентальпії гідратації, констант стійкості комплексів металів з біолігандами, у тому числі, SH-лігандами.

Згідно теорії жорстких і м’яких кислот і основ, розробленої Пірсоном (Pearson, 1968), катіони металів з великою електронною оболонкою атомів, що легко поляризуються (м’які кислоти Льюіса) високоспоріднені з м’якими основами, які мають низьку електронегативність, зокрема з групами –SH і –SR (Торчинский, 1977). За цією теорією, кадмій належить до м’яких кислот, нікель, цинк, олово, кобальт – до проміжних, марганець належить до жорстких кислот (Ершов, Плетенева, 1989). Виходячи з цього стає зрозумілим, чому іони марганцю впливають на активність Na+,K+–АТФ-ази найменше, а іони кадмію – найсильніше. Очевидно, такі результати пов’язані саме із утворенням комплексів металів з SH-групами Na+,K+–АТФ-ази. Вплив на активність ферменту металів, які належать до проміжних кислот, виражений в різній мірі, що залежить, можливо, від інших фізико-хімічних властивостей цих металів.

Одержані результати щодо інгібування Na+,K+–АТФ-ази катіонами важких металів у значній мірі підтверджуються змінами ультраструктури бластомерів зародків в’юна, які були інкубувані в присутності іонів вказаних важких металів.

Вплив іонів важких металів викликав появу ультраструктурних змін органел бластомерів зародків в’юна. Зокрема при дії іонів важких металів спостерігалось пошкодження та руйнування мітохондріальних мембран та крист. У деяких випадках мембрани та кристи мітохондрій були повністю зруйновані та утворювали суцільні ліпопротеїдні поля. У цитоплазмі спостерігалася підвищена кількість первинних лізосом, що може бути пов’язано із великою кількістю органел, зруйнованих внаслідок впливу іонів важких металів.

У випадку впливу іонів нікелю та цинку спостерігалася гіпертрофія комплексу Гольджі, що свідчить про підвищену активність видільної системи клітин зародків.

Крім того, у випадку дії іонів всіх досліджуваних металів спостерігалося пошкодження плазматичної мембрани, зокрема розпушення та переривання в окремих місцях, а також зменшення її хвилястості.

Крім того, спостерігалося зменшення хвилястості плазматичної мембрани в порівнянні з контролем, розрідження гіалоплазми, набряк органел.

Очевидно, це пов’язано з надмірним надходженням води у клітину, яке супроводжує вхід у клітину іонів Na+. Надлишок води у цитоплазмі через недостатній вихід її з клітини може бути пов’язаний із зменшенням виходу з клітини іонів натрію.

Останнє може свідчити про порушення активного транспорту натрію, який виводить надлишок Na+ з клітини, а отже – про зниження активності Na+, K+-АТФ-ази внаслідок досліджуваних впливів.

У результаті проведених досліджень виявлено збільшення періоду коливань ТМП зародків в’юна внаслідок впливу іонів досліджуваних металів у порівнянні з контролем. Використання спектрального аналізу динаміки ТМП показало, що збільшення періоду (зменшення частоти) коливань потенціалу спостерігалось у всіх випадках впливів іонів досліджуваних металів. Найсуттєвіше збільшення періоду спостерігалось внаслідок впливу іонів нікелю, олова та кадмію, найменш виражене – при дії іонів кобальту. Оскільки тривалість періоду коливань потенціалу співпадає з тривалістю клітинного циклу зародків в’юна, збільшення періоду свідчить про сповільнення розвитку зародків.

Цей висновок підтверджується візуальним спостереженням за розвитком личинок в’юна на більш пізніх стадіях розвитку за допомогою бінокулярного мікроскопу.

Личинки в’юна у віці 10 діб, які розвивались за нормальних умов, були рухливими, з подовгастою формою тіла, розвиненими плавцями та зябрами, вираженою пігментацією. Жовтковий міхур на цій стадії в нормі був відсутній.

Личинки того ж віку, які розвивались у присутності в інкубаційному середовищі катіонів досліджуваних важких металів в концентрації 10-5 М, мали аномалії розвитку. Помітним було відставання у розвитку цих личинок у порівнянні з контролем: вони мали менші розміри тіла та залишки жовткового міхура.

Крім того, у них спостерігалися суттєві вади розвитку, а саме викривлення та перекручення хребта, деформація кісток черепа та збільшення розмірів голови (можливо, гідроцефалія), значний набряк черевної порожнини, недорозвинені плавці, зябра, вусики. Личинки були малорухливими, а їх серцебиття сповільненим.

Такі аномалії розвитку личинок в’юна спостерігались приблизно в 25-30 % зародків, що співпадає з даними, які були одержані на личинках Xenopus laevis (Plowman, Peracha et al., 1991; Sunderman, Plowman, Hopfer, 1991; Plowman, Grbac-Ivankovic et al., 1994; ). Решта тварин, в яких не спостерігалися виражені аномалії розвитку, також були малорухливими, їх шкіра була слабше пігментована в порівнянні з контролем.

Отже зародки в’юна Missgurnus fossilis L. є досить чутливими до сторонніх впливів, зокрема, динаміка їх трансмембранного потенціалу суттєво змінюється внаслідок дії таких речовин, як гормони (Гойда, 1993), поліпептидні фактори росту (Гойда, Ротт, Санагурский, 1981), антибіотики (Гойда, 1993; Бойко, Санагурский, 2000), катіони важких металів (Бойко, Санагурський, 2000), а також таких фізичних чинників, як відхилення від нормальних температури та атмосферного тиску (Гойда, 1993). Виходячи з цього, можна вважати, що зародки в’юна є зручною і адекватною тест-системою для вивчення впливу різних фармакологічних, хімічних та біологічних чинників на живі об’єкти.

ВИСНОВКИ

1. Досліджено динаміку трансмембранного потенціалу зародків в’юна Misgurnus fossilis L. протягом періоду дроблення бластомерів. Встановлено, що внаслідок впливу катіонів важких металів, а саме: нікелю, кобальту, цинку, олова, марганцю та кадмію в концентраціях 10-6 –10-4 М, відбувається зменшення амплітуди та частоти коливань потенціалу, а також загальна деполяризація мембран зародкових клітин на 10-30 мВ у порівнянні з контролем.

2. Виявлено, що катіони всіх застосованих важких металів дозозалежно інгібують активність Na+, K+-АТФ-ази мембран зародків в’юна. Найсуттєвіше активність цього ферменту зменшується при дії іонів нікелю та кадмію – в 1,5-3 рази в залежності від концентрації.

3. Встановлено, що деполяризація мембран зародкових клітин в’юна за умов впливу іонів важких металів обумовлена зниженням активності Na+, K+-АТФ-ази внаслідок дії цих іонів.

4. Період коливань трансмембранного потенціалу зародків в’юна протягом синхронних дроблень бластомерів збільшується в 1,3-2 рази внаслідок впливу катіонів важких металів, що свідчить про сповільнення процесів розвитку зародків. Найсильніше період коливань потенціалу змінюється внаслідок впливу іонів нікелю та кадмію, найменше – при дії іонів кобальту.

5. Електронно-мікроскопічне дослідження ультраструктури бластомерів зародків в’юна показало суттєві структурні пошкодження органел та мембран бластомерів при дії катіонів важких металів.

6. Інкубування зародків в’юна у присутності іонів важких металів веде до появи значних аномалій, зокрема відставання у розвитку в порівнянні з контрольною групою, деформації кісток скелету зародків, набряку черевної порожнини, недорозвиненості зябер та плавців.

7. Отримані результати дають підставу вважати, що зародки в’юна Misgurnus fossilis L. на стадії дроблення бластомерів є зручною та адекватною тест-системою для вивчення токсичного впливу хімічних, фармакологічних та інших біологічно активних чинників на живі об’єкти.

Список опублікованих праць за темою дисертації

1. Гойда О.А., Бойко Н.М., Полуйко В.Ю. Мембранний електрогенез та швидкість споживання кисню в ранньому розвитку зародків риб // Вісник Київського ун-ту ім. Т. Шевченка. – 1996. – Вип. 2 – С. 27-35.

2. Бойко Н.М., Гойда О.А. Морфогенез та електричні параметри мембран зародків в’юна за умов наявності в середовищі важких металів // Актуальні проблеми мед., біол., ветер. і сільськ. госп. – 1996. – С. 85-86.

3. Бойко Н.М., Санагурський Д.І. Динаміка трансмембранного потенціалу зародків в’юна в умовах впливу іонів важких металів // Вісник Львів. ун-ту, Сер. Біол. – 2000. – Т. 25. – С. 3-7.

4. Бойко Н.М., Санагурський Д.І. Вплив іонів важких металів на динаміку трансмембранного потенціалу зародків риб // Вісник Харків. ун-ту. Сер. Біофізичн. вісник. – 2000. – Вип. 2 (7). – С. 42-46.

5. Бойко Н.М., Целевич М.В., Санагурський Д.І. Зміна активності Na+, K+-АТФ-ази мембран зародків в’юна під впливом катіонів важких металів // Проблеми екол. та мед. генетики і клітин. імунології. – 2002. – Вип. 2 (41). – С. 17-23.

6. Бойко Н., Целевич М., Санагурський Д. Вплив йонів важких металів на активність Na+, K+-АТФ-ази та динаміку трансмембранного потенціалу зародків в’юна // Вісник Львів. ун-ту, Сер. Біол. – 2002. – Вип. 29. – С. 25-31.

7. Бойко Н.М., Кулачковський О.Р., Ковалишин В.І., Целевич М.В., Санагурський Д.І. Вплив катіонів нікелю та марганцю на ультраструктуру бластомерів зародків в’юна // Вісник Харків. ун-ту. Сер. Біофізичн. вісник. – 2002. – Вип. 1 (10). – С. 62-67.

8. Boyko N., Goyda O. The heavy metal ion influence on membrane electric parameters and morphogenesis of loach embryo // Book of Abstracts of 4th International Students’ Scientific Conference. – Gdansk, Poland, 1996. – p. 37.

9. Бойко Н.М., Гойда О.А., Дика М.В. Вплив іонів важких металів на електрогенез мембран зародків в’юна // Тези доповідей VII Українського біохімічного з’їзду, ч. І. – Київ, 1997. – С. 36-37.

10. Целевич М.В., Бойко Н.Н., Санагурский Д.И. Влияние ионов тяжелых металлов на активность Na+, K+-АТФ-азы мембран зародышей вьюна // Сборник тезисов 6-ой Пущинской школы-конференции молодых ученых, т. 1. – Пущино, 2002. – С. 38-39.

11. Бойко Н.М., Санагурський Д.І. Вплив катіонів важких металів на електрофізіологічні параметри мембран зародків в’юна // Тези доповідей ІІІ з’їзду Українського біофізичного товариства. – Львів, 2002. – С. 248.

12. Бойко Н.М., Целевич М.В., Кулачковський О.Р., Ковалишин В.І., Санагурський Д.І. Ультраструктура бластомерів зародків в’юна за умов впливу катіонів важких металів // Матеріали міжнародної конференції пам’яті І.В. Шостаковської – Львів, 2002. – С.13.

Анотації

Бойко Н.М. Вплив іонів важких металів на електричні параметри мембран зародків в’юна Misgurnus fossilis L. – Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.02 – біофізика. – Львівський національний університет імені Івана Франка, Львів, 2002.

Дисертацію присвячено дослідженню динаміки трансмембранного потенціалу зародків в’юна Misgurnus fossilis L. у нормі та за умов впливу іонів важких металів.

Показано, що присутність в інкубаційному середовищі двовалентних катіонів важких металів: нікелю, кобальту, олова, цинку, марганцю та кадмію в концентраціях 10-6 – 10-4 М веде до появи змін у динаміці трансмембранного потенціалу зародків. Зокрема, внаслідок впливу катіонів вказаних металів спостерігались зниження рівня абсолютних значень потенціалу, збільшення періоду та зменшення амплітуди коливань величин потенціалу. Ці зміни проявлялись більш суттєво із збільшенням концентрації солей металів у середовищі інкубації.

Встановлено, що деполяризація мембрани зародків в’юна за умов впливу іонів важких металів зумовлена зниженням активності Na+, K+-АТФ-ази внаслідок дії цих іонів.

Показано, що вплив іонів важких металів викликає ультраструктурні зміни у зародків в’юна. Виявлено значні пошкодження органел бластомерів, зокрема, набряк мітохондрій, гіпертрофія комплексу Гольджі, розрідження гіалоплазми, розпушення та розриви мітохондріальних та плазматичної мембран.

Інкубація зародків в’юна у середовищі із вмістом іонів важких металів веде до появи морфогенетичних змін у личинок у віці 10 діб.

Описані зміни підтверджують токсичний вплив катіонів важких металів на живі організми.

Ключові слова: трансмембранний потенціал, активність Na+, K+-АТФ-ази, дроблення бластомерів, зародки в’юна, іони важких металів, ультраструктура, морфогенез.

Бойко Н.Н. Влияние ионов тяжелых металлов на электрические параметры мембран зародышей вьюна Misgurnus fossilis L. – Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.02 – биофизика. – Львовский национальный университет имени Ивана Франко, Львов, 2002.

Диссертация посвящена исследованию динамики трансмембранного потенциала зародышей вьюна Misgurnus fossilis L. в норме и под влиянием ионов тяжелых металлов.

Исследования проводились с использованием микроэлектродной техники для регистрации потенциала, спектрофотометрического метода определения активности Na+, K+-АТФ-азы, электронной микроскопии для определения ультраструктурных изменений бластомеров.

На первом этапе исследований было установлено, что присутствие в инкубационной среде двухвалентных катионов таких тяжелых металлов, как никель, кобальт, олово, цинк, марганец и кадмий в концентрациях 10-6–10-4 М приводит к появлению изменений в динамике трансмембранного потенциала зародышей. В частности, под влиянием катионов указанных металлов наблюдались снижение уровня абсолютных значений потенциала, увеличение периода и уменьшение амплитуды колебаний величин потенциала. Эти изменения проявлялись более существенно с увеличением концентрации солей металлов в среде инкубации. Наиболее существенно на динамику потенциала влияли ионы никеля и кадмия, наименее выраженным было действие ионов кобальта и марганца.

На втором этапе было показано, что катионы тяжелых металлов дозозависимо ингибируют активность Na+, K+-АТФ-азы – фермента Na+, K+-помпы. Наибольшее влияние на активность Na+, K+-АТФ-азы также оказывали катионы никеля и кадмия, наименьшее – катионы кобальта и марганца.

Установлено, что деполяризация мембраны зародышей вьюна при действии катионов тяжелых металлов обусловлена снижением активности Na+, K+-АТФ-азы вследствие действия этих ионов.

Также показано, что влияние катионов тяжелых металлов вызывает ультраструктурные изменения у зародышей вьюна. Выявлены значительные повреждения органелл бластомеров, в