НАЦІОНАЛЬНИЙ МЕДИЧНИЙ УНІВЕРСИТЕТ

ім. О.О.БОГОМОЛЬЦЯ

БІЛОЗОРОВ ОЛЕКСІЙ ПАВЛОВИЧ

УДК 612.017.1:617-097:616.5

ЦИРКУЛЮЮЧІ ІМУННІ КОМПЛЕКСИ І ДОСЛІДЖЕННЯ АНТИГЕННОГО ВПЛИВУ ПРИ АЛЕРГОДЕРМАТОЗАХ, ПСОРІАЗІ І ХЛАМІДІОЗАХ

14.03.08 - імунологія і алергологія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

доктора медичних наук

Київ - 2003

Дисертація є рукопис.

Робота виконана в Інституті дерматології і венерології Академії медичних наук України.

Науковий консультант: доктор мед.наук, професор Мавров Іван Іванович,

Інститут дерматології і венерології АМН України, директор інституту.

Офіційні опоненти:

доктор медичних наук, професор Бережна Нінель Михайлівна, Інститут експериментальної патології, онкології та радіобіології ім. Р.Є.Кавецького НАН України, завідуюча відділом імунології;

доктор медичних наук, професор, член-кореспондент АМН України, Чернушенко Катерина Федорівна, Інститут фтизіатрії та пульмонології ім. академіка Ф.Г. Яновського АМН України, завідуюча відділом імунології;

доктор медичних наук, професор Чумак Анатолій Андрійович, Інститут клінічної радіології Наукового центру радіаційної медицини АМН України, завідуючий лабораторієй молекулярної біології відділу клінічної імунології.

Провідна установа: : Інститут геронтології АМН України.

Захист відбудеться 20.11.2003 р. о 13-30 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.003.02 при Національному медичному університеті ім. О.О.Богомольця МОЗ України (01023, м. Київ-23, вул.Шовковична, 39/1, Центральна міська клінічна лікарня, корпус 2.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Національного медичного університету ім.О.О.Богомольця за адресою 03057, м.Київ, вул.Зоологічна, 3.

Автореферат розісланий 14.10.2003 р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради,

професор, доктор мед.наук, професор кафедри

шкірних та венеричних хвороб з курсом

проблем СНІДу НМУ ______________________Свирид С.Г.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. В патогенезі багатьох захворювань важливу роль відіграють імунні механізми, але антигени, що приймають участь в їх розвитку, в більшості випадків недостатньо охарактеризовані. У зв`язку з цим визначення антигенів, що діють на організм і беруть участь в патогенезі захворювань, можна вважати однією з ключових проблем при багатьох видах патології, без її вирішення неможливо розуміння патогенезу і розробка ефективної терапії (Bach J.F., 2000, Zinkernagel R.M., Hengartner H., 2001).

Для характеристики діючих на організм антигенів як правило використовують визначення тільки специфічних антитіл, але зміни їх рівня часто не співпадають з часом розвитку патології. Безпосереднє визначення антигенів в тканинах дозволяє отримати важливі дані, але вимагає застосування надчутливих методів, які в більшості випадків ще потребують розробки і удосконалення. Не завжди виявлений антиген бере участь в імунній реакції.

У зв`язку з цим важливим методом одержання інформації про вплив антигенів на організм може бути дослідження імунних комплексів (ІК) і, зокрема, циркулюючих імунних комплексів (ЦІК), їх імунохімічна характеристика і визначення специфічності антитіл, що входять до їх складу (Константинова Н.А., 1995, Oidinko L.V. et al.,2000). При цьому важливим є використання нових методичних підходів, підвищуючих специфічність визначення і характеристики ЦІК. Перспективним можна вважати застосування для дослідження ІК їх взаємодії з першим компонентом комплементу С1q із використанням феномену підвищеної спорідненості ІК з твердофазним С1q, механізм якого до цього часу не отримав пояснення.

Дослідження ЦІК значно ускладнюється тим, що велика частина їх пов'язана з клітинами крові, ще недостатньо охарактеризовані процеси звільнення ІК у плазму і сироватку, які мають істотний вплив на результати дослідження (Klint C. et al.,2000).

Великий інтерес і практичне значення має характеристика специфічності ІК. Діагностичне визначення специфічних антигенів або антитіл в крові при інфекційних захворюваннях може давати негативні результати, якщо вони зв'язані в ІК. Аналіз специфічності ІК дозволяє у цих випадках вирішити проблему діагностики захворювань (Nishanian P. et al., 1990, Troisi C.L. et al., 1997).

Дослідження діючих антигенів особливо важливо при таких розповсюджених важких захворюваннях, як алергодерматози, псоріаз, хламідіози, їх хронічний рецидивуючий перебіг складає значну проблему для лікування, а причини загострень в більшості випадків не з`ясовуються. В той же час дослідження імунокомплексних процесів при цих відмінних за своїм патогенезом захворюваннях алергічного, аутоімунного і інфекційного характеру дає матеріал для порівняльного аналізу ролі антигенного впливу в їх патогенезі.

Аналізуючи дію антигенів на організм важливо враховувати стан реактивності організму, спрямованість регуляторних механізмів, які впливають на запальний потенціал тканин і визначають реакцію організму на діючі антигени (Ward P.A., Lentsch A.B., 2002). При багатьох патологічних процесах підвищений рівень ЦІК може утримуватись тривалий час, що несприятливо впливає на реактивність організму (Agnello V., 1997, Дранник Н.Г., 2000). Тому до важливих задач можна віднести також розробку методів, спрямованих на зниження антигенного навантаження й прискорення виведення ІК із циркуляції.

Зв`язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дослідження в обраному напрямку проводились в рамках виконання планових тем Українського науково-дослідного інституту дерматології і венерології (УНДІДВ) і Інституту дерматології та венерології АМН України (ІДВ АМНУ): 1) Вивчити значення порушень імунологічної реактивності, енергетичного обміну і мікроциркуляції в патогенезі алергодерматозів і розробити нові методи їх терапії (1448в, номер держ. реєстрації 80002231), 2) Вивчити значення порушень імунологічної реактивності в патогенезі алергодерматозів з метою розробки нових методів їх раціональної терапії (ВН.33.00.0010.85, номер держ. реєстрації 01850009319), 3) Розробка імуноферментної тест-системи на антиген Chlamydia trachomatis (тема АМН СССР номер держ. реєстрації 194), 4) Плазмаферез в комплексному лікуванні артропатичного псоріазу і деяких дерматозів (ІН 33.00.003, номер держ. реєстрації 3300000486), 5) Дослідження властивостей урогенітальних штамів хламідій з метою удосконалення методів діагностики і терапії хламідіозів (ІН 33.00.0014.96, номер держ. реєстрації 019V017122), 6) Вивчення особливостей імунної відповіді при хламідійній інфекції залежно від виду збуднику і клінічних проявів захворювання (ОК 48.97, номер держ. реєстрації 0197V015564), 7) Розробка нових методів діагностики хламідіозів на основі генноінженерного білка зовнішньої мембрани і моноклональних антитіл (ОК 91.120+92.5.300, номер держ. реєстрації УА01000347Р), 8) Екстрагенітальна патологія у хворих на венеричні захворювання (ОК 07.00, номер держ. реєстрації 0100V001039). 9) Вивчити генетичні аспекти атопічного дерматиту з метою покращання терапії (Ф-02, номер держ. реєстрації 0102V004221). Автор був відповідальним виконавцем тем 1,2,3,5,7,9 і виконував фрагмент роботи по темах 4,8.

Мета і задачі дослідження. Дати кількісну і якісну характеристику ЦІК як показника інтенсивності і специфічності дії антигенів на організм при алергодерматозах, псоріазі і хламідіозах для визначення її ролі в патогенезі цих захворювань. Зазначена мета визначила основні задачі дослідження:

1.Вивчити механізми взаємодії ІК з фіксованим на твердій фазі С1q, з'ясувати причини більш високої спорідненості ІК із твердофазним С1q і механізми зв'язування з С1q IgA-утримуючих ІК, розробити методи виділення ІК і аналізу їхньої специфічності.

2.Вивчити in vitro процеси звільнення ІК, зв'язаних із клітинами, оцінити залежність показників концентрації ЦІК в сироватці і плазмі крові.

3. Дати кількісну і якісну характеристику ЦІК і їхнього зв'язку з антигенами кератину і золотистого стафілокока у хворих на псоріаз.

4. Вивчити зв'язок загострення екземи й атопічного дерматиту з дією на організм антигенів, дати характеристику деяких механізмів регуляції запального потенціалу тканин при цих захворюваннях.

5. Розробити імуноферментний метод визначення антитіл до антигенів хламідій, дати кількісну і якісну характеристику ЦІК у хворих на хламідіози, вивчити можливість діагностичного визначення специфічності ЦІК при хламідіозах.

6. Вивчити показники гуморальної імунної відповіді на гліадин і її роль в патогенезі псоріазу, екземи, атопічного дерматиту і урогенітального хламідіозу.

7. Розробити методи, спрямовані на елімінацію ЦІК і попередження їхнього утворення.

Об`єкт дослідження - хворі на алергодерматози, хламідіози і псоріаз, зразки крові і сироватки хворих людей і експериментальних тварин, культура хламідій.

Предмет дослідження - імунні комплекси, специфічні антитіла і інші показники дії антигенів на організм.

Методи дослідження - Імунологічні - визначення ІК і вільних імуноглобулінів, антитіл до бактерійних антигенів і аутоантигенів, гліадину, визначення титру комплементу, експресії на лімфоцитах Ia-подібних антигенів, хемотаксичної відповіді лейкоцитів. Імунохімічні - дифузія в гелі, визначення активності компонентів комплементу. Біохімічні - високоефективна, афінна, іонообмінна хроматографія, диск-електрофорез, отримання кон`югатів антитіло-фермент і білок А-лактоза. Бактеріологічні - визначення бактерійної засіяності шкіри, виявлення чутливості флори до антибіотиків. Клінічні - проведення терапії, визначення її ефективності. Експериментальні визначення впливу на рівень ІК in vivo, визначення пригнічення ліберації гістаміну з опасистих клітин. Статистичні - оцінка достовірності отриманих результатів.

Наукова новизна отриманих результатів. Вперше вивчена динаміка ІК у плазмі крові, консервованій ЕДТА, при 37о С, показано, що поряд зі звільненням зв'язаних із клітинами ІК, яке призводить до підвищення концентрації ІК у плазмі, відбуваються процеси протилежної спрямованості, які знижують через 60-90 хвилин концентрацію ІК одночасно з їх процесінгом; показано що при гострих інфекційних процесах рівень ІК у сироватці внаслідок дії на них комплементу може значно знижуватись в порівнянні з плазмою.

Вперше показано, що одним з механізмів терапевтичної дії плазмаферезу є звільнення C1q з С1 і фіксація його на рецепторах клітин крові, що сприяє більш ефективному видаленню з крові ЦІК і інших патогенних факторів.

Показано, що фіксація C1q на твердій фазі або поверхні клітин збільшує його спорідненість з ІК внаслідок кооперативної взаємодії з вільними Fc фрагментами ІК, які не можуть утворювати міцні зв'язки з розчиненим C1q, за рахунок подібної взаємодії IgA-ІК можуть безпосередньо зв'язуватися твердофазним C1q. Розроблена високоспецифічна система на основі C1q-cорбенту для визначення специфічності антитіл, що входять до складу ІК.

Вперше виявлені високі рівні антитіл до гліадину у значної частини хворих на атопічний дерматит, екзему, урогенітальний хламідіоз, показано, що при цих захворюваннях часто виявляються аутоантитіла до трансглутамінази.

Вперше показана асоціація високих титрів антигліадиновых антитіл з більш важким перебігом псоріазу, що свідчить про участь реакції на гліадин у патогенезі захворювання і існування клінічної форми неперенесення гліадину, не зв'язаної з аутоімунної реакцією.

Вперше отримана сполука лактозильований білок А, що може забезпечувати спрямовану елімінацію ЦІК у паренхіматозні клітини печінки.

Вперше показано, що вільні і навантажені C1q ліпосоми при внутрішньовенному введенні знижують рівень ЦІК за рахунок високої здібності зв`язувати ІК і транспортувати їх у клітини печінки.

Удосконалено метод визначення активності речовин, що пригнічують процеси ліберації біологічно активних сполук із опасистих клітин; розроблено тест-систему для скринінгу таких з'єднань, проведено аналіз похідних хромонів і виявлені сполуки з високою активністю.

Практичне значення отриманих результатів. На підставі отриманих у роботі результатів розроблені тест-системи для визначення ЦІК методом С1q-зв'язування. Розроблені імунофлюоресцентна і імуноферментні тест-системи для визначення антигену хламідій і антитіл до них. Розроблені імуноферментні системи для визначення антитіл до гліадину і трансглутамінази. Показано, що визначення антигенної специфічності ІК дозволяє більш точно охарактеризувати діючі на організм антигени. Розроблено метод визначення антигенної специфічності ІК з використанням С1q-сорбенту. Показано можливість використання антигену Chlamydia trachomatis для визначення антитіл до C.pneumoniae при захворюваннях серцево-судинної системи.

Впровадження результатів. Результати роботи впроваджені в наукових і практичних закладах України: Львівській обласній клінічній лікарні, Одеському обласному центру клінічної імунології, Донецькому медичному університеті, Харківському медичному університеті, Інституті дерматології та венерології АМН України. Отримано дозвіл на клінічне застосування імунофлюоресцентної тест-системи для визначення антигенів хламідій, затверджена фармакопейна стаття на неї, реалізовано дрібносерійний випуск цієї діагностичної системи і забезпечення нею установ практичної охорони здоров'я, починаючи з 1990 р.

Особистий внесок здобувача. Вся дисертаційна робота виконана автором самостійно, включаючи вибір теми, роботу з літературою, освоєння і розробку методів дослідження, набір матеріалу і виконання досліджень, опрацювання й аналіз результатів і оформлення тексту роботи. При проведенні апробації розробленої схеми лікування екземи ведення хворих проводилося співробітниками дерматологічного відділення ІДВ АМНУ.

Апробація результатів дисертації. Матеріали дисертаційної роботи доповідалися на I конференції по мікроаналізу (Москва,1983), республіканській конференції "Застосування імуноферментного аналізу в медицині" (Харків,1989), Y з'їзді дерматовенерологів України (Чернівці, 1986), Республіканській нараді "Актуальні питання діагностики і лікування хламідійних і мікоплазменних інфекцій" (Одеса, 1991), YI з'їзді дерматовенерологів України (Харків, 1993), Українській науково-практичній конференції по клінічній імунології (Львів, 1996), YII з'їзді дерматовенерологів України (Київ, 1999), Науково-практичній конференції по хламідіології (Київ, 2000), Науково-практичних конференціях по імунології (Київ, 2002, 2003). Матеріали представлені як стендові доповіді на II Конгресі патофізіологів України (Київ, 1996), I Національному конгресі України з імунології, алергології та імунореабілітації (Алушта, 1998), IY науково-практичній конференції “Актуальні питання алергології, клінічної і лабораторної імунології” (Київ, 1999). Матеріали опубліковані в тезах I з'їзду імунологів (Сочі, 1989), 5 і 6 з'їздів дерматологів України, XII з'їзду Європейських імунологічних товариств (Барселона, 1994), Міжнародної наукової конференції, присвяченої 150-річчю з дня народження І.І.Мечнікова (Харків, 1995), Всесоюзного з'їзду патофізіологів (Кишинів, 1989), YII і YIII Всесоюзного з'їзду дерматовенерологів (1979, 1985), 5 з'їзду дерматовенерологів України, I Російського конгресу патофізіологів (Москва,1996), II конгресу патофізіологів України (Київ, 1996), II Української науково-практичної конференції по клінічної імунології (Львів, 1996), I Національного конгресу України з імунології, алергології та імунореабілітації (Алушта, 1998), IY науково-практичної конференції Актуальні питання алергології, клінічної і лабораторної імунології (Київ, 1999), YII з'їзду дерматовенерологів України (Київ, 1999), науково-практичних конференцій з клінічної імунології (Київ, 2000, 2002, 2003).

Публікації. За темою дисертації опубліковано 22 cтатті у фахових наукових журналах, 10 статей у збірниках, 25 тез, отримано 2 авторські свідоцтва і 4 патенти України.

Структура і обсяг дисертації. Повний обсяг дисертації 307 сторінок. Робота містить 38 таблиць та 48 рисунків, з них 2 таблиці та 9 рисунків повністю займають площу 11 сторінок. Дисертація складається зі вступу, огляду літератури, опису матеріалів і методів дослідження, 3 розділів власних досліджень, обговорення, висновків і списку літератури, що містить 448 джерел.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріали і методи дослідження. У роботі використані матеріали, отримані при обстеженні 908 хворих, із них чоловіків 592, жінок 316, хворих екземою - 131, атопічним дерматитом - 113, псоріазом - 494, мікозами - 31, різноманітними формами хламідіозів - 129, інфарктом міокарду - 10. Середній вік хворих - 37,230,53 років. Контрольну групу складали здорові особи (донори), усього 306, чоловіків 222, жінок 84, середній вік 35,310,73 років.

Тяжкість псоріазу визначали індексом PASI (Baker H.,1994) з урахуванням наявності артропатії та еритродермії. Тяжкість екземи та атопічного дерматиту оцінювали за вираженістю шкірної патології.

Експеримент проведений на 52 щурах, 60 мишах, 25 кролях.

Для визначення ЦІК використовували: 1) твердофазний імуноферментний метод С1q-зв`язування (Білозоров О.П., 1989), 2) осаджування поліетиленгліколем (ПЕГ) із наступним визначенням IgA, IgM, IgG, а також специфічних антитіл імуноферментним методом, а IgЕ - наборами фірми Fadebas (PRIST), 3) метод Haskova V. et al.(1978) при 2,5, 3,5 і 4,5% ПЕГу.

C1q із сироватки людини і свиней виділяли осадженням при низькій іонній силі і афінною хроматографією (Білозоров О.П.,1989). Чистоту препарату C1q визначали диск-електрофорезом, дифузією в гелі з антисироваткою проти С1q фірми Beringwerke (ФРН), а також люб'язно наданою І.А.Тархановою (ІЕМ ім. Гамалеі), і сироватками проти білків сироватки і проти IgG людини, а також високоефективною рідинною хроматографією.

Кон`югати для імуноферментного дослідження готували перйодатним методом (Джонс Є.Л., Грегори Дж, 1991).

Агрегований IgG одержували нагріванням протягом 20 хвилин при 63оС. При вивченні ендогенних ІК, пов'язаних із клітинами, кров для дослідження одержували з ЕДТА, частину її одразу ж охолоджували і після центрифугування на холоду (400g, 15 хв., 4оС) використовували для визначення фракції вільних ІК. Частину, що залишилась, витримували при 37оС і через 15 - 90 хв. відбирали зразки та визначали в плазмі ІК.

Очищений IgА людини був люб'язно наданий М.Д.Луциком, вміст в ньому IgG не перевершував 1,5 %, а IgМ не виявлявся високочутливим імуноферментним методом.

Імуноглобуліни на поверхні шкіри визначали методом відбитків. На досліджувану поверхню шкіри накладали фільтрувальний папір площею 3х3 см, змочений ЗФР, на 4-5 хвилин, після чого переносили його в пробірку, що містила ЗФР із 0,1% бичачого альбуміну. Вміст імуноглобулінів визначали імуноферментним методом (Білозоров О.П. та інші,1983).

1-Pi визначали за Нартиковою В.Ф. і Пасхіною Т.С.(1979).

Титр комплементу визначали по 50% гемолізу, а С1 і С4 - за допомогою R-реагентів, для визначення С2 використовували сироватку хворої П. із повною відсутністю С2, що було виявлено за допомогою R-реагентів (Кэбот Е., Мейєр М., 1968).

Антитіла до золотистого стафілокока і гемолітичного стрептокока визначали імуноферментним методом з тейхоєвими кислотами і капсульним полісахаридом стафілокока, люб'язно наданими Н.В.Цвєтковою (МНДІВС), і антигеном гемолітичного стрептокока виробництва Казанського НДІВС.

Бактеріальну флору шкіри досліджували методом бакпечаток (Кветная А.С., Демяник И.В.,1981). Поряд із середовищами Ендо і Коростильова використовували кров'яний агар, визначали чутливість мікроорганізмів до антибіотиків.

Антихламідійні антитіла визначали імуноферментним методом. Антиген одержували культивуванням штаму L2 434, Bu у курячих ембріонах із наступним диференційним центрифугуванням з додатковою обробкою дезоксихолатом (Caldwell H.D., Judd R.C.,1982).

Диспергований у рідкому азоті полістирол був отриманий в Фізико-технічному інституті низьких температур (Харків).

Хемотаксичну активність лейкоцитів in vivo визначали за допомогою методу шкірних камер (Білозоров О.П.,1982).

Експресію Ia-подібних антигенів на Т-лімфоцитах визначали імуноферментним-методом з моноклональними антитілами Eco-1 проти ізоморфної детермінанти HLA-DR Горківського НДІВС (Кремлев С.Г. та ін.,1988).

Фракції кератину зі шкіри здорових осіб і псоріатичних лусочок виділяли за Westphal H.J. et al.(1987).

Генноінженерний білок А стафілококу виробництва НДІ Імунології (Любучани, Росія) лактозували ціанборгідридним методом (Wilson G.,1978).

Антитіла до гліадину визначали розробленим нами твордофазним ІФА-методом, з референс-сироваткою, люб`язно наданою проф. М.Стерном (Тюбінген, Німеччина), членом Робочої групи з стандартизації діагностики целіакії Европейської ради по медичних дослідженнях.

Результати досліджень та їх обговорення.

Для з`ясування механізмів взаємодії твердофазного С1q із ІК вивчали вплив зростаючих концентрацій С1q у розчині на зв'язування агрегованого IgG людини твердофазним C1q. Було виявлено, що С1q у розчині пригнічував зв'язування, але лише на 25 %. Мав місце виражений ефект насичення, підвищення концентрації С1q більше 0,1 мг/мл не супроводжувалось подальшим зменшенням зв`язування агрегованого IgG .

Для пояснення виявленої залежності була побудована модель взаємодії, враховуюча кооперативний характеру зв`язку С1q із ІК і розподіл Fc-фрагментів імуноглобулінів ІК на дві групи: 1) розташовані близько один до одного і зв`язуючі розчинений С1q, 2) віддалені Fc фрагменти, неспроможні зв`язувати розчинений С1q. Згідно з моделлю твердофазний С1q реагує переважно із Fc-фрагментами другої групи. Кооперативний ефект взаємодії забезпечується утворенням на твердій фазі поля зв'язування, що реагує з багатьма Fc-фрагментами, розташованими на великій відстані один від одного. Тому конкуренція між розчиненим і твердофазним С1q виражена досить слабко (рис.1).

У процесі використання методу С1q-зв`язування для визначення ІК було виявлено, що із С1q зв'язуються не тільки IgG і IgM-ІК, але і IgA-ІК, до складу яких не входили IgG-ІК або IgM-ІК, що свідчило про безпосередньо зв'язування твердофазним С1q IgA-ІК.

Можливість безпосереднього зв'язування твердофазним С1q IgA-ІК була перевірена за допомогою агрегованого нагріванням і обробкою ПЕГом IgА. Отримані результати свідчили про високу спроможність агрегованого IgА зв'язуватися з твердофазним С1q, що вказувало на наявність на IgA

С1q розчинений

антитіло антитіло

антиген

антитіло

C1q твердофазний

Рис.1. Схема взаємодії ІК з розчиненим і твердофазним С1q в залежності від відстані між молекулами антитіл.

сайтів, які взаємодіють з С1q. Але, незважаючи на спроможність взаємодіяти з твердофазним С1q, агрегований IgА не зв'язував розчинений C1q, що підтверджувало відмінність механізмів зв'язування ІК із розчиненим і твердофазним С1q.

Важливою особливістю взаємодії ІК із С1q, фіксованим на полістиролі, було швидке закріплення зв`язків ІК із твердою фазою. Для попередження зв`язування ІК з твердофазним С1q було достатньо підвищити концентрацію розчину хлориду натрію до 0,4 М, але після фіксації на твердій фазі ІК не удавалось перевести в розчин навіть в хлориді натрію 2 М. Виявлена залежність була використана для удосконалення визначення ІК твердофазним методом С1q-зв`язування. Вона дозволила проводити реакцію з кон`югатом антиімуноглобулінових антитіл з пероксидазою хрону у середовищі з високою іонною силою, яке блокувало безпосередню взаємодію кон`югату з С1q, це забезпечувало зниження неспецифічного фону і підвищення чутливості реакції, не зменшуючи кількості ІК, що зв`язались з С1q на попередньому етапі дослідження.

Значне підвищення ефективності зв'язування ІК після фіксації С1q на твердій фазі має аналогію in vivo при фіксації С1q на рецепторах імунокомпетентних клітин. В експериментах in vitro були отримані докази того, що цей механізм має значення при плазмаферезі. Під час обробки крові розчином, що зв`язує Са2+, значно підвищувалось насичення клітинних рецепторів вільним С1q за рахунок підвищення його концентрації в плазмі. Зв'язування С1q в дослідних зразках дорівнювало 0,71 0,08, а в контрольних - 0,45 0,09 од.екст. За даними літератури підвищене зв'язування С1q з поверхнею імунокомпетентних клітин забезпечує підвищення їхньої активності і сприяє видаленню ІК з крові (Leu R.W. et al.,1991). Даний механізм не потребує видалення компонентів крові і дозволяє пояснити достатньо високу ефективність удаваного плазмаферезу (Воробьев А.И. та інші,1984).

Висока ефективність зв'язування ІК твердофазним С1q стала підставою для розробки методу виділення ІК із сироватки і плазми на С1q-сорбенті з метою подальшого аналізу їх антигенної специфічності. Після зв'язування ІК безпосередньо на колонці проводили їхню дисоціацію в кислому середовищі з наступним визначенням специфічності звільнених антитіл імуноферментним методом. Розроблено середовище для визначення специфічності антитіл, звільнених кислотним шоком з ІК, яке зменшувало їх неспецифічні взаємодії, до його складу входили розчин хлориду натрію 1М з фосфатним буфером 0,01 М, рН 7,2, 1% кінським сироватковим альбуміном і 0,1 % твіну-20. Розроблена методика була застосована для дослідження ІК у хворих на хламідіози.

Процеси звільнення ендогенних ІК, пов'язаних із клітинами крові, були вивчені при інкубації крові, консервованій ЕДТА, (ЕДТА-крові) при 37о С. В більшості випадків відзначалося швидке підвищення рівня ІК у плазмі з максимумом через 30 - 60 хвилин із наступним зниженням (рис.2). Динаміка ІК, утворених імуноглобулінами різних класів, мала подібний характер, але у IgA- і IgM-ІК виявлявся більш високий максимум і більш швидке його досягнення. Водночас у частини хворих, як правило, із гострим запальним процесом, чітко виявлялась тенденція до зниження рівня ІК в процесі інкубації.

Кількість ІК у сироватці у більшості випадків була вище концентрації вільних ІК, яка визначалась в плазмі одразу ж після отримання крові з ЕДТА, але нижче максимальної концентрації. Взагалі ж це були величини одного порядку. Відзначалася висока кореляція між показниками вільних ІК (плазма, 4о С), загальних ІК (плазма, 37о С, 60 хв.) і рівнем ІК в сироватці, особливо для IgG і IgM.

Для донорів були характерні низькі показники концентрації ІК і незначна динаміка, що свідчило про малу кількість комплексів, пов`язаних з еритроцитами. На противагу цьому в хворих на псоріаз і мікози ця динаміка була чітко виражена. Відзначалося підвищення концентрації ІК, особливо IgG- і IgA-ІК при псоріазі (p < 0,05). Цікаво, що при значних розходженнях в абсолютній концентрації ІК, її відносна динаміка при псоріазі і мікозах була подібною.

Підвищення концентрації ІК у плазмі в процесі інкубації можна вважати наслідком звільнення пов'язаних із клітинами ІК. Несподіваними виявились процеси протилежного характеру, що призводили до зниження рівня ІК після досягнення максимуму. Одночасно з цим відбувалося зниження кількості зв`язаного з ІК С1q, що свідчило про продовження процесінгу ІК, який повністю не блокувався навіть в присутності ЕДТА. Але швидкість його була значно менша, ніж в сироватці крові при 37о С

При гострому запаленні динаміка концентрації ІК набувала тенденції до

зниження, що може свідчити про стимуляцію механізмів процесінгу. Ця тенденція була особливо помітна у хворих з гострими інфекційними процесами. У цих випадках відзначалося значне зниження рівня ІК в сироватці порівняно з плазмою, що свідчило про активацію процесінгу ІК in

Рис.2. Динаміка концентрації ІК в плазмі при інкубації ЕДТА-крові при 37оС (сумарна група, випадки із підвищенням рівня ЦІК і випадки із зниженням ЦІК).

vitro. Прикладом цього може бути динаміка ІК у хворого Н. (мікоз, ускладнений піодермією), із значним зниженням рівня у сироватці порівняно з плазмою (рис.3). Отримані результати дозволяють вважати, що концентрація ІК у сироватці в більшості

випадків відбиває сумарний вміст ІК у крові, але при гострих інфекційних процесах може відбуватись значне зниження рівня ІК у сироватці відносно показників плазми.

Рис.3. Динаміка ІК в плазмі хворого Н. (мікоз, ускладнений піодермією) при інкубації ЕДТА-крові при 37о С

Важливою характеристикою ЦІК є їхній розмір, у зв'язку з чим було розроблено метод диференційованого визначення ІК великих і середніх розмірів, заснований на висолюванні ІК розчинами з різною концентрацією ПЕГу.

У хворих на псоріаз у період загострення було виявлено підвищення рівня ІК великого і середнього розміру, після лікування нормалізувалися тільки показники ЦІК середнього розміру. Відзначалася позитивна кореляція між концентраціями різних за розмірами ЦІК в період загострення захворювання (? = + 0,682, p < 0,001). Це дозволяє вважати, що зміни обох фракцій ІК зв`язані з одними патогенетичними ланками захворювання, але в процесі лікування відбувається тільки часткова корекція патології. На відміну від псоріазу кореляція між комплексами великого і середнього розміру при інших вивчених захворюваннях і в донорів не виявлялася.

При загостренні псоріазу у високомолекулярній фракції ІК підвищувався вміст IgA (p<0,05), відзначалася тенденція до підвищення IgG і IgM, ці зміни залишалися і після лікування. В ІК середнього розміру вірогідно підвищувався вміст IgG при тенденції до підвищення з боку IgA і IgM. В протилежність великим ІК після лікування ці показники значною мірою нормалізувалися.

При екземі відзначалось значне зниження рівня ІК середнього розміру 38,469,54 % хворих до лікування і 41,1811,9 % після лікування. В ІК великого розміру достовірно підвищувався рівень IgA одночасно з тенденцією до підвищення IgG, з боку ІК середнього розміру визначалась тенденція до зниження вмісту IgG. Після лікування ці зміни значною мірою зберігалися.

При загостренні атопічного дерматиту рівень ІК великого розміру зростав у 70 14,5%, а середнього - у 50,015,8% хворих. Після лікування рівень великих ІК був підвищеним у 50 20,41% хворих, в той час як рівень середніх ІК в більшості випадків нормалізувався, а у 33,3 19,48 %хворих мав тенденцію до зниження.

Отримані результати свідчать про якісні відмінності зрушень ЦІК у хворих на екзему і псоріаз, які можна пояснити особливостями антигенного навантаження при цих захворюваннях. При псоріазі у більшості випадків антигенне навантаження значно підвищене і набуває системного характеру. Тому домінує тенденція до підвищення рівня ЦІК, знижені показники виявляються у відносно невеликої групи хворих.

При екземі антигенне навантаження у значної частини хворих має переважно локальний характер, що в умовах гіперергічної реакції на антиген призводить до зниження рівня ЦІК. Але при великій тяжкості процесу відбувається підвищення рівня ЦІК.

Показники ЦІК свідчать, що атопічний дерматит у цьому відношенні займає проміжне місце між псоріазом і екземою. Можна вважати, що антигенне навантаження при цьому захворюванні більш виражене, ніж при екземі, але компенсаторні механізми більш ефективні, ніж при псоріазі.

Отримані дані дозволяють вважати, що зміни рівнів ІК великого і середнього розміру в більшості випадків визначаються незалежними механізмами і виявляються більш чітко, ніж зміни сумарного показника концентрації ЦІК. Кореляція з клінічними показниками відзначалася при екземі, піодермітах і кропивниці - із великими ЦІК, а при псоріазі - із ЦІК середнього, меншою мірою - великого розміру. У хворих на атопічний дерматит виявлялося значне підвищення обох фракцій ІК.

Підвищення рівня IgA-ІК можна вважати свідченням патологічних процесів у слизових оболонках. Зокрема, клінічні дані свідчать про залежність проявів екземи від порушень з боку шлунково-кишкового тракту, які призводять до підвищення рівня антигенного навантаження. В розвитку псоріазу важлива роль належить стрептококовій і стафілококовій інфекції (Нестеренко Г.К. та інші.,1981,Villeda-Gabriel G. et al.,1998). Стрептококова інфекція у хворих на псоріаз може, за даними ряду авторів, запускати аутоімунний процес, що призводить до розвитку захворювання. Локалізація первинних осередків цієї інфекції на слизових оболонках дозволяє пояснити підвищення IgA-ІК у хворих на псоріаз. Важливість IgA-ІК у патогенезі псоріазу підкреслюється тим, що саме IgA-ІК часто відкладаються у вогнищі шкірного запалення при даному захворюванні (Miura Y.,1985).

Підвищення рівня ІК (або окремих їх фракцій) відзначалось у значної частини хворих обстежених груп у період загострення захворювання, але залежність між цим показником і тяжкістю патологічного процесу не в усіх випадках мала однозначний характер. Часто зустрічалась парадоксальна залежність, коли при загостренні рівень ІК знижувався, а після покращання стану хворого - зростав. Так, при загостренні псоріазу кількість хворих із рівнем ІК менше 0,020 од. екстинкції складала 8,57%, а після лікування - 4,88 %. Особливо чітко ця парадоксальна залежність між рівнем ІК і гостротою процесу виявлялась при захворюваннях, що характеризуються відносно малим ступенем антигенного навантаження. Так, у хворих на поверхневі мікози була виявлена від`ємна кореляція між рівнем IgG-ІК у плазмі і тяжкістю процесу ( = -0,94324, р < 0,01). При псоріазі, коли рівень антигенного навантаження значно підвищений кореляція між цими показниками була відсутня.

Отримані результати свідчать, що рівень ЦІК визначається динамічною рівновагою між процесами їх утворення і елімінації. У період загострення захворювання активуються як утворення, так і елімінація ІК, якщо останній процес домінує, їх рівень знижується. Не завжди даний варіант перебігу захворювання є більш сприятливим. Він свідчить про більш гостру і напружену реакцію організму на антигенне навантаження, але якщо вона не спроможна попередити або знизити дію антигенів, прогноз погіршується.

Важливу інформацію про стан реактивності організму дало зіставлення показників ЦІК із титром комплементу. У хворих на екзему і псоріаз була виявлена однакова залежність між цими показниками, характер якої визначався інтервалом значень ЦІК (рис.4). На інтервалі 0,075 - 0,115 од. була чітко виражена позитивна кореляція між ІК і СН50 ( с =+0,4858, p < 0,05), ?о можна

Рис.4. Кореляція між рівнем ІК і титром комплементу у хворих на екзему.

розглядати як прояв стимулюючого впливу на систему комплементу гострого запалення, перебіг якого супроводжується зростанням антигенного навантаження з підвищенням рівня ІК. Даний характер змін ЦІК і СН50 як двох паралельних наслідків гострого запалення можна визначити як нормергічний. На діапазоні 0,040 - 0,075 виявлялась обернена залежність, яку можна пояснити виходом на перший план солюбілізуючого ефекту комплементу на ІК (Svehag S.E. et al.,1984). Підвищення титру комплементу відповідає при цьому низьким показникам ЦІК, процеси їх елімінації, безпосередньо пов'язані з активністю системи комплементу, стимулюються. Даний взаємозв'язок можна визначити як гіперергічний, тому що захисна реакція перевершує рівень антигенного навантаження.

При рівні ЦІК вище 0,115 часто виявляється зниження титру комплементу, що свідчить про недостатність захисних механізмів і гіпоергічний характер реактивності.

Однаковий характер кореляційних відношень ЦІК - СН50 при різно-манітних захворюваннях свідчить, що вони відбивають загальні законо-мірності взаємозв'язку між системою комплементу і ЦІК.

З огляду на велике значення IgE-антитіл у патогенезі багатьох захворювань, становило інтерес вивчення IgE-вміщуючих ІК.

Найбільш виражене підвищення було виявлене з боку IgE-ІК і вільного IgЕ у хворих на атопічний дерматит. Середній рівень IgЕ у сироватці хворих даної групи майже в 15 разів перевершував показники контролю. Підвищений рівень IgE в ІК визначався у 75,012,5% хворих, відзначалась вірогідна кореляція рівня вільного IgE і IgE-ІК середнього розміру.

У 37,512,1% хворих на екзему відзначалось помірне підвищення рівня вільних IgE, водночас у 50,011,18 % підвищувався рівень великих ІК, а у 60,021,9% - рівень середніх IgE-вміщуючих ІК.

Високі показники вільного IgЕ і IgE-ІК частіше визначались у хворих із важким, тривалим перебігом дерматозу, але досить часто виявлялася тенденція до підвищення рівня IgЕ у сироватці в період поліпшення стану і припинення загострення, подібне відзначалося і з боку IgE-вміщуючих ІК. Можливо це було пов`язано з запізнюванням гуморальної IgE-відповіді відносно максимального антигенного навантаження, яке відповідало періоду загострення захворювання. Можливо, для IgE-ІК має значення також зменшення швидкості процесінгу ІК у зв`язку із затиханням запального процесу.

В складі IgE-ІК в сироватках хворих на атопічний дерматит і екзему у 38,513,5% випадків були виявлені IgG або IgM антитіла, що зв'язувались з дисками, покритими IgЕ, у 23,0 11,7% визначались IgG антитіла. Виходячи з даних експериментів про спроможність анти-IgЕ антитіл пригнічувати продукцію IgЕ (Marshall J. et al.,1987), можна припустити, що виявлені антитіла виконують регуляторну функцію. Високі титри IgЕ і особливо утворені ними ІК стимулюють вироблення анти-IgЕ антитіл, які зменшують утворення IgЕ. Але цей механізм може ефективно функціонувати тільки після зниження антигенного навантаження, що стимулює продукцію IgЕ.

Літературні дані свідчать, що одним з важливих джерел антигенів, які значною мірою обумовлюють антигенного навантаження у хворих із шкірною патологією, може бути бактеріальна флора шкіри (Parish W.E. et al.,1976). Виходячи з цього вивчали ознаки дії цих антигенів на організм хворих у вигляді антитіл до тейхоєвих кислот і капсульного полісахариду золотистого стафілококу, який досить часто виявляється на шкірі людини, особливо при її захворюваннях.

У хворих на екзему відзначалось вірогідне підвищення рівня IgG антитіл

як до капсульного полісахариду, так і до тейхоєвих кислот стафілококу. Крім того, виявлявся підвищений рівень IgМ антитіл до тейхоєвих кислот. Останнє можна вважати ознакою того, що дія антигенів стафілококу на організм відбувалась під час загострення. Це підтверджувалось також виявленням антистафілококових антитіл в ІК, виділених з сироватки осадженням ПЕГом, у частини хворих.

У хворих на псоріаз також виявлялося вірогідне підвищення IgG-антитіл до капсульного полісахариду і тейхоєвих кислот стафілококу. Аналіз індивідуальних показників виявив, що підвищене утворення IgG антитіл до капсульного полісахариду стафілокока визначалось у 59,259,45 % хворих на екзему і 43,248,14% - псоріазом порівняно з 7,146,8% донорів. В протилежність цьому у донорів в 66,712,17% випадків підвищувались антитіла класу А (порівняно з 22,27,99% і 21,626,76 % хворих на екзему і псоріаз відповідно). Отримані дані свідчать, що у хворих на екзему і псоріаз знижена IgA- і підвищена IgG-відповідь на дію антигенів стафілококу. Цьому може сприяти порушена бар'єрна функція шкіри.

Значення бактерійної флори шкіри як важливого джерела діючих на організм хворих антигенів було підтверджено результатами дослідження бактеріальної засіяності шкіри. У хворих на екзему і атопічний дерматит кількість мікроорганізмів на шкірі була значно більша, ніж у здорових осіб. В період загострення захворювання засіяність шкіри хворих перевершувала показники контролю у 8 - 60 разів. У стані клінічної ремісії бактерійна засіяність дещо зменшувалася, але залишалася значно вище контрольних показників.

Найбільш високі показники бактеріальної засіяності визначались у хворих на мікробну екзему, проте і при істинній екземі вони були різко підвищені. Таким чином, значне підвищення кількості бактерій на шкірі - характерна риса для хворих на екзему і атопічний дерматит, особливо в період загострення. Частіше за все виявлялися Staphylococcus aureus і патогенні стрептококи. Виділені мікроорганізми були чутливі до мономіцину, канаміцину, іноді до ампіциліну, оксациліну, еритроміцину. Чутливість до тетрацикліну, як правило, була дуже низькою.

Підвищена бактерійна засіяність шкіри може виступати як важливий чинник антигенного навантаження, яке підтримує запалення шкіри, призводить до локального утворення ІК у вогнищі екземи і атопічного дерматиту. Можна вважати це одним з механізмів розвитку хронічного запалення, властивого екземі, поряд із реакцією уповільненого типу. ІК можна вважати в цьому випадку також індикатором антигенного навантаження, яке запускає імунологічні механізми ушкодження тканин.

Чинником, сприяючим проникненню бактеріальних антигенів, є різке підвищення проникливості шкіри, що було доведено визначенням концентрації імуноглобулінів на її поверхні. У хворих виявлялося значне підвищення даного показника, найбільшою мірою виражене в осередку запалення в період загострення, особливо у хворих із ексудацією. Спостерігався паралелізм між виразністю патологічного процесу і ступенем підвищення концентрації імуноглобулінів. Найбільшою мірою підвищення концентрації імуноглобулінів було виражене з боку IgG, що можна пояснити його високою концентрацією в крові і порівняно низькою молекулярною масою.

Поза вогнищем ураження, у шкірі без помітних змін у період загострення захворювання також відзначалося підвищення вмісту імуноглобулінів, але в меншій мірі. Ці дані переконливо свідчать про системний характер ураження шкіри у хворих на екзему, проникливість якої для дії антигенів значно підвищується. У період клінічної ремісії концентрація імуноглобулінів на поверхні шкіри знижувалася, але найчастіше не досягала показників контролю, особливо у вогнищі запалення. Таким чином, навіть у стані клінічної ремісії у хворих зберігається підвищена проникливість епідермісу і судин шкіри. Можна вважати це проявом хронічного запалення,