ЛЬВІВСЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ

ІМЕНІ ІВАНА ФРАНКА

ІВАШКІВ ЛАРИСА ЯРОСЛАВІВНА

УДК: 577.352.5

ЧАСОВА ОРГАНІЗАЦІЯ

БІОЕЛЕКТРИЧНИХ І МЕТАБОЛІЧНИХ ПРОЦЕСІВ

У РАННЬОМУ ЕМБРІОГЕНЕЗІ В’ЮНА ТА ШПОРЦЕВОЇ ЖАБИ

03.00.02 – біофізика

Автореферат дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Львів – 2003

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана у Львівському національному університеті імені Івана Франка Міністерства освіти і науки України.

Науковий керівник: кандидат біологічних наук, доцент

Санагурський Дмитро Іванович,

Львівський національний університет імені Івана Франка,

завідувач кафедри біофізики та математичних методів

у біології

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор

Стойка Ростислав Степанович,

Інститут біології клітини НАН України,

завідувач відділу регуляції проліферації клітин;

кандидат біологічних наук, доцент

Гаташ Сергій Васильович,

Харківський національний університет імені В.Н. Каразіна,

доцент кафедри біологічної і медичної фізики.

Провідна установа

Київський національний університет імені Тараса Шевченка, кафедра біофізики.

Захист відбудеться “ 3 ” липня 2003 року о 1400 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради К35.051.14 у Львівському національному університеті імені Івана Франка за адресою: 79005, м. Львів, вул. Грушевського, 4, ауд. № 333.

З дисертацією можна ознайомитись у науковій бібліотеці Львівського національного університету імені Івана Франка за адресою: 79005, м. Львів, вул. Драгоманова, 17.

Автореферат розісланий 2 червня 2003 р.

В.о. вченого секретаря

спеціалізованої вченої ради________________Градюк М.Б.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Розкриття механізмів регуляції клітинного поділу – важливий напрямок досліджень сучасної біології розвитку (Ed. Stein et al., 1999; Фильченков и соавт., 1994; Стойка и соавт., 1993; Busenberg, Tang, 1994). Вважають, що процеси саморегуляції біосистем, їх виживання та розвиток в значній мірі зумовлюються коливними змінами морфофізіологічних параметрів, зокрема, просторово-часова організація морфогенезу базується на періодичних явищах, які є проявом діяльності внутрішньоклітинних осциляторів (Гудвин, 1966; Ашофф и соавт., 1984; Голиченков, Романов, 1998). Питання про механізми виникнення коливань з періодом близько однієї години досі залишається відкритим (Бродский, 1998, 2000, 2002).

На даний час нагромаджено велику кількість експериментальних даних щодо закономірностей динаміки біоелектричних та метаболічних показників у ранньому ембріогенезі тварин. Особливу увагу звернено на ритмічний характер змін, а саме – на періодичні зміни, які узгоджуються з тривалістю клітинних циклів у період дроблення зародкових клітин (Ротт, 1987, 1989, 1984). Хоча відомо, що зміни процесів у ранньому розвитку зародків мають подібну часову залежність як і поділ клітин (Edmunds et al., 1981; Романов, 1995; Lloyd et al., 1982, 1992), все ж проблема часових співвідношень загальної динаміки процесів (Cанагурський, 1980, 1996) та ритмічних явищ в онтогенезі остаточно не вивчена (Ротт, 1987, 1989).

Залишаються не з’ясованими такі важливі питання:–

як узгоджені між собою в часі окремі фізико-хімічні та метаболічні процеси й якими є закономірності їх коливної динаміки у ранньому ембріогенезі тварин;–

якою є роль та значимість часової організації процесів у ранньому ембріогенезі тварин; –

якими є причинно-наслідкові залежності морфофункціональних процесів у період раннього ембріогенезу ?

Тому з’ясування закономірностей часової організації фізико-хімічних та метаболічних процесів, що супроводжують клітинні цикли дроблення зародків різних тварин, є актуальною проблемою.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційну роботу виконано відповідно до тематики наукових досліджень кафедри біофізики та математичних методів у біології Львівського національного університету імені Івана Франка як складову частину таких науково-дослідних держбюджетних тем: “Частотний аналіз та моделювання коливань мембранозв’язаних процесів у ранньому ембріогенезі тварин при різних екологічних ситуаціях”, № ДР 0194U029962 та “Дослідження динаміки біоелектричних параметрів мембран зародків тварин за різних умов інкубації з використанням комп’ютерного моделювання”, № ДР 0196U023018.

Мета і задачі дослідження. Метою роботи було з’ясування закономірностей часової організації біоелектричних та метаболічних процесів на початковій стадії ембріогенезу (дроблення) в представників риб (в’юн Misgurnus fossilis L.) та амфібій (шпорцева жаба Xenopus laevis D.) з використанням системного підходу та математичного аналізу динаміки процесів.

Для досягнення зазначеної мети у дисертаційній роботі розв’язували такі завдання:

1. Проаналізувати часові закономірності перебігу біоелектричних і метаболічних процесів у ранньому ембріогенезі в’юна з метою з’ясування послідовності їх часових змін у цей період та виявлення можливих часових причинно-наслідкових залежностей між змінами їх загального рівня.

2. Дослідити особливості коливної динаміки біоелектричних і метаболічних процесів та часові співвідношення між їх коливаннями з метою з’ясування закономірностей часової організації цих процесів у період дроблення зародків в’юна за нормальних умов розвитку.

3. Проаналізувати часові співвідношення динаміки біоелектричних і метаболічних характеристик у період дроблення зародків шпорцевої жаби.

4. Дослідити зміни у часі біоелектричних та метаболічних процесів у ранньому ембріогенезі зародків риб та амфібій. Дати порівняльну оцінку особливостей коливної динаміки цих процесів.

5. Співставити динаміку досліджуваних показників раннього ембріогенезу в’юна за нормальних та екстремальних умов розвитку з метою з’ясування ролі часової організації процесів у ранньому ембріогенезі тварин.

Об’єктом дослідження була динаміка біоелектричних і метаболічних процесів на клітинному рівні, що супроводжують розвиток костистої риби в’юна Misgurnus fossilis L. і шпорцевої жаби Xenopus laevis D. протягом періоду дроблення зародків.

Предметом дослідження були зміни в часі показників ембріональних клітин, які характеризують вказані процеси, а саме – електрофізіологічні параметри, йонні концентрації, активності ферментів і показники енергетичного метаболізму.

Методи дослідження. Для виконання поставлених у роботі завдань використовували біометричний аналіз експериментальних даних. Для цього застосовували обчислювальні методи аналізу часових рядів, за допомогою яких можна кількісно оцінити параметри динаміки, а саме – автокореляційний, крос-кореляційний та спектральний аналіз.

Наукова новизна одержаних результатів. Отримано нові дані про принципи часової організації клітинних процесів у період дроблення зародків холоднокровних тварин. Вперше у порівняльному плані проаналізовано часові залежності між змінами біоелектричних і метаболічних процесів на стадії дроблення зародків в’юна та шпорцевої жаби. Встановлено подібність часових залежностей названих процесів у ранньому ембріогенезі тварин різних систематичних груп та її незалежність від типу дроблення та будови зародків цих тварин.

Виявлено достовірні часові причинно-наслідкові зв’язки між динамікою біоелектричних характеристик та інтенсивністю енергетичного метаболізму, зокрема – їх зв’язок із динамікою вмісту серотоніну в зародках в’юна у період дроблення.

Вперше з’ясовано особливості часових залежностей між біоелектричними і метаболічними процесами при дії екстремальних чинників на ранній ембріогенез в’юна та запропоновано критерії оцінки динаміки біоелектричних і метаболічних показників за нормальних умов розвитку та при дії негативних чинників.

Практичне значення одержаних результатів. Дисертаційна робота спрямована на поглиблення фундаментальних досліджень з використанням системного підходу та математичних методів аналізу динаміки для встановлення закономірностей часової організації фізико-хімічних процесів, які малодоступні для експериментального дослідження протягом перших стадій розвитку ембріонів тварин. Запропонований підхід та методи аналізу можуть бути використані в наукових розробках присвячених проблемі часової організації різноманітних ритмічних процесів, які відбуваються на різних рівнях біологічної організації. Апробовані в роботі методи можуть бути застосовані також для аналізу динаміки фізико-хімічних характеристик клітин та біосистем з метою діагностики і прогнозування їх функціонального стану при дії різних чинників. Одержані результати підтверджують можливість використання зазначених методів аналізу для діагностування життєздатності зародків риб.

Результати дослідження також можуть бути використані в педагогічному процесі, зокрема, при викладанні спецкурсів з біофізики, електрофізіології, біології розвитку та математичних методів у біології у вищих навчальних закладах.

Особистий внесок здобувача. Особистий внесок здобувача полягає у наступному:

у роботі [1] здобувач проаналізував та узагальнив літературні джерела, зібрав експериментальний матеріал для дослідження, підготував до друку публікацію; у статтях [2, 3, 4] автор дисертаційної роботи оволоділа необхідною методикою дослідження, провела математичний аналіз зібраних експериментальних даних (оцінила часові співвідношення загальних змін досліджуваних процесів у зародків в’юна [2] та шпорцевої жаби [4], а також, проаналізувала цілісну картину динаміки деяких показників зародків в’юна за нормальних умов розвитку [3]), оцінила достовірність отриманих результатів, узагальнила їх та підготувала матеріали до друку; у роботах [5, 6, 10] автор провела порівняльне дослідження часових співвідношень біоелектричних і метаболічних процесів у ранньому ембріогенезі зародків риб та амфібій з використанням крос-кореляційного та спектрального аналізу, обробила результати аналізу, обговорила отримані результати та підготувала матеріали до друку; у роботах [7, 8, 9] нею оцінено динаміку досліджуваних показників в’юна за нормальних та екстремальних умов розвитку, виявлено критерії цієї оцінки, узагальнено та інтерпретовано отримані результати, перевірено їх достовірність та підготовано матеріали до друку.

Спільно з науковим керівником проведено планування основних напрямків досліджень, вибрано методи та обговорено одержані результати. Підготовку до друку публікацій за матеріалами дисертації проведено за участю співавторів. Особистий внесок здобувача, в публікаціях виконаних у співавторстві, становить – 75 %.

Апробація результатів дисертації. Матеріали результатів дисертації були представлені на: виїзній нараді Президії Українського біофізичного товариства за темою "Біофізика XXI століття" (Львів, 2001); 6-ій міжнародній Пущинській школі-конференції молодих вчених “Біологія – наука XXI століття” (Пущино, 2002); ІІ-ій Всеукраїнській науковій конференції студентів та аспірантів “Біологічні дослідження молодих вчених на Україні” (Київ, 2002); 4-тій міжнародній Парнасівській конференції “Molecular mechanisms of cell activation: biological signals and their target enzymes” (Вроцлав, 2002); Міжнародній науковій конференції студентів та молодих вчених “Політ” (Київ, 2002); ІІІ-му з’їзді Українського біофізичного товариства (Львів, 2002); щорічних наукових конференціях біологічного факультету Львівського національного університету імені Івана Франка (2000-2003 рр.) та на наукових семінарах кафедри біофізики та математичних методів у біології (Львів, 1999-2003 рр.).

Публікації. Головні положення дисертаційного дослідження відображені в 10 публікаціях, серед яких 5 статей загальним обсягом 1.9 друк. арк., усі з яких у фахових наукових виданнях, що визнаються положенням ВАК України; та 5 тез доповідей у матеріалах наукових конференцій та з’їзду.

Структура дисертації. Рукопис дисертації складається із вступу, 4 розділів (огляд літератури, методика досліджень та експериментальний матеріал, результати досліджень, обговорення результатів дослідження), висновків, списку використаних джерел (286 найменувань) та 3 додатків. Робота викладена на 150 сторінках, ілюстрована 6 таблицями, 40 рисунками.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

У вступі обґрунтовано актуальність теми, сформульовано мету, завдання та методи досліджень, розкрито наукову новизну і практичне значення роботи, зазначено особистий внесок здобувача та апробацію результатів дисертації.

У першому розділі систематизовано та узагальнено результати літературних джерел, зібрано експериментальний матеріал для дослідження, проаналізовано експериментальні дані про особливості динаміки біоелектричних і метаболічних показників у ранньому ембріогенезі тварин. Другий розділ присвячений методиці дослідження динаміки процесів: тут обґрунтовано вибір напрямку досліджень, наведено методи вирішення задач та описано загальну схему аналізу динаміки біоелектричних і метаболічних процесів.

Методами автокореляційного та спектрального аналізів досліджено динаміку окремих показників. За результатами спектрального аналізу оцінювали наявність та інтенсивність періодичних складових у експериментально зареєстрованій динаміці, тобто її гармонічний або квазігармонічний характер. Уточнення та перевірку цих результатів проводили також за допомогою якісної та кількісної оцінки автокорелограм певних показників. Метод крос-кореляційного аналізу з часовими зсувами дав змогу не лише виявити можливі причинно-наслідкові співвідношення між показниками, але й якісно охарактеризувати взаємоузгодженість (фазові зсуви) між коливаннями показників у динаміці, чого неможливо виявити при звичайному візуальному спостереженні.

Матеріалом для дослідження вибрано експериментальні дані різних авторів про динаміку біоелектричних і метаболічних показників на проміжку часу розвитку зародків від 60 до 385 хв. Для в’юна: трансмембранного потенціалу (ТМП), швидкості поглинання кисню (ШПК), pHц та активності сукцинатдегідрогенази (СДГ), лактатдегідрогенази (ЛДГ), ?-кетоглутаратдегідрогенази (-КГДГ), ізоцитратдегідрогенази (ізЦДГ) (Гойда, 1993), активності Na+, K+-ATФ-ази (АП) (Бериташвили и соавт., 1974), вмісту іонів K+, Na+, співвідношення K+/Na+ у зародку (Бериташвили и соавт., 1969), активності казеїнкінази II (АК) (Земсков и соавт., 1998), швидкості гліколізу (ШГ) (Мильман, Юровицкий, 1973), коефіцієнта електричного зв’язку (КЗ) (Божкова и соавт., 1971), концентрації йонів кальцію в цитозолі ([Ca2+]в) (Медына и соавт., 1987) та вмісту серотоніну у зародку (Бузников, 1987). Для шпорцевої жаби: ТМП (Grandin, Charbonneau, 1990; Гойда із співавт., 1992), вмісту іонів K+, Na+, співвідношення K+/Na+ у зародку (Slack et al., 1973), швидкості виділення вуглекислого газу (ШВВ) (Thoman, Gerhart, 1979), [Ca2+]в (Muto et al., 1996), pHц (Grandin, Charbonneau, 1990).

Графічні дані оцифровували за допомогою програми GRAPH DIGITIZER і одержували часові ряди, які були проквантовані з однаковим часовим інтервалом між значеннями показників (t). Він становив 30 хв, 5 хв, 2 хв, 1 хв відповідно до мети дослідження і конкретно поставленого завдання. Експериментальні дані узгоджували за критеріями стадій розвитку зародків (Астауров и соавт., 1975) та групували для аналізу за спільною часовою основою, зважаючи на те, що час, протягом якого проводились вимірювання, був не завжди однаковий. Часові ряди, у динаміці яких візуально спостерігались коливання навколо певного постійного чи змінного рівня, розкладали на тренд і коливні складові, які надалі аналізували окремо. Тренд описували поліноміальною моделлю (2-3 порядку).

Дослідження проводили з використанням пакету прикладних програм STATGRAРНICS, зокрема програм з розділу TIME SERIES PROCEDURES, завдяки яким також оцінено достовірність результатів спектрального аналізу з використанням підпрограми INTEGRATED PERIODOGRAM. Перевірку достовірності результатів кореляційного аналізу проводили за таблицею граничних значень коефіцієнтів кореляції, які гарантують заданий рівень значимості (p < 0.05, p < 0.01), залежно від обсягу сукупності (Деркач із співавт., 1977).

У третьому та четвертому розділах роботи викладено результати дослідження та їх обговорення. Дослідження проводили за наступною схемою.

На першому етапі проводили оцінку динаміки метаболічних і біоелектричних процесів як цілісної системи у ранньому розвитку зародків в'юна, яка складалась із трьох серій аналізу.

У першій серії проведено крос-кореляційний аналіз між змінами загального рівня досліджуваних показників, у результаті якого одержано крос-корелограми представлені у табл. 1. Проаналізувавши часові зсуви, за якими спостерігаються достовірні крос-кореляційні зв’язки, виявлено 12 статистично значимих кореляційних залежностей, з яких у 10-ти випадках існує ймовірність причинно-наслідкових зв’язків (рис. 1). Стрілка має напрямок від параметра, який вважається причиною, до наслідкового параметра.

Таблиця 1

Крос-корелограми часових рядів

Rxy\n | -5 | -4 | -3 | -2 | -1 | 0 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5

R12 | -0.22 | -0.33 | -0.38 | -0.30 | -0.10 | 0.23 | 0.72* | 0.75* | 0.65 | 0.47 | 0.12

R13– | -0.36 | -.033 | -0.10 | -0.31 | 0.80* | 0.69 | 0.54 | 0.28 | -0.10–

R14–– | -0.31 | -.024 | 0.09 | 0.46 | 0.57 | 0.73 | 0.03––

R15– | 0.36 | 0.25 | 0.01 | 0.37 | -0.79* | -0.83* | -0.70 | -0.42 | -0.03–

R16 | -0.32 | -0.14 | -0.11 | 0.41 | 0.71* | 0.90** | 0.43 | 0.22 | 0.01 | 0.15 | -0.27

R17– | -0.36 | -0.21 | 0.09 | 0.46 | 0.86* | 0.74 | 0.56 | 0.32 | 0.03–

R23– | -0.17 | 0.16 | 0.47 | 0.70 | 0.92** | 0.45 | 0.06 | -0.22 | 0.35–

R24–– | -0.29 | 0.13 | 0.57 | 0.58 | 0.24 | 0.14 | 0.14––

R25– | 0.02 | -0.14 | -0.45 | -0.68 | -0.56 | -0.15 | 0.20 | 0.41 | 0.42–

R26 | 0.28 | 0.44 | 0.48 | 0.55 | 0.59 | -0.09 | -0.11 | -0.25 | -0.26 | -0.24 | -0.17

R27– | 0.03 | 0.28 | 0.49 | 0.71 | 0.91** | 0.47 | 0.10 | -0.16 | -0.30–

R34–– | -0.34 | -0.13 | 0.27 | 0.59 | 0.51 | 0.55 | -0.51––

R35–– | 0.26 | -0.13 | -0.55 | -0.97** | -0.66 | -0.26 | 0.10––

R36– | -0.08 | 0.18 | 0.51 | 0.78** | 0.73 | 0.22 | -0.07 | -0.28 | -0.36–

R37– | -0.25 | -0.04 | 0.27 | 0.63 | 0.99** | 0.61 | 0.26 | -0.02 | -0.25–

R45–– | 0.20 | -0.20 | -0.46 | -0.75 | -0.44 | -0.12 | 0.43––

R46–– | 0.05 | 0.69 | 0.54 | 0.41 | 0.16 | -0.18 | -0.29––

R47–– | -0.03 | 0.57 | 0.52 | 0.56 | 0.24 | -0.12 | -0.32––

R56– | -0.21 | -0.45 | -0.56 | -0.63 | -0.64 | -0.22 | 0.03 | 0.22 | 0.28–

R57– | 0.20 | -0.10 | -0.41 | -0.69 | -0.94** | -0.56 | -0.17 | 0.20 | 0.34–

R67–– | 0.01 | 0.02 | -0.31 | -0.18 | 0.81* | 0.54 | 0.25 | 0.03–

Rxy – коефіцієнт крос-кореляції, де цифри у індексах позначають досліджувані показники:

1 – трансмембранний потенціал, 2 – швидкість поглинання кисню, 3 – швидкість гліколізу,

4 – pHц, 5 – коефіцієнт електричного зв’язку, 6 – активність Na+, K+-помпи, 7 – активність казеїнкінази II;

n – зсув (кількість інтервалів квантування), рівні значимості: – p 0.05 та – p 0.01.

Важливо з’ясувати, що є причиною в усіх виявлених часових співвідношеннях. По-перше, вони виявлені за довготривалими зсувами 30-60 хв (оскільки інтервал квантування становив 30 хв), по-друге, більшість крос-кореляцій є позитивними, що свідчить про однакову направленість динаміки описуваних ними процесів. Звідси зрозуміло, що зміни досліджуваних показників відображають події, які відбуваються на рівні макроорганізму, та часові взаємозв’язки між ними. Таке припущення узгоджується з результатами експериментальних досліджень.

Показано, що починаючи зі стадії 32-х бластомерів відбувається транспорт глікоген-фосфорилазного комплексу з жовтка у бластодерму (Мильман, Юровицкий, 1973; Юровицкий, 1999), що супроводжується збільшенням швидкості гліколізу. У цей же час у зародків в’юна між бластодиском та жовтком відбувається формування синцитіального шару цитоплазми – перибласту, за рахунок якого здійснюється активне засвоєння компонентів жовтка (Furshpan et al., 1968). Крім того, зміни інтенсивності дихання у цей час можуть опосередковуватись змінами в ультраструктурі популяції мітохондрій, оскільки показано, що зі стадії 16-ти бластомерів змінюється співвідношення між паличкоподібними та кулястими мітохондріями, зокрема збільшується кількість перших (Сухомлинова и соавт., 2000).

Отже, виявлені часові співвідношення між загальними змінами біоелектричних і метаболічних показників, ймовірно, зумовлені морфофізіологічними процесами пов’язаними з розвитком зародків в’юна.

У другій серії проводили детальне дослідження аперіодичної динаміки біоелектричних, метаболічних та регуляторних показників зародків в’юна з використанням крос-кореляційного аналізу з 5-хвилинним інтервалом квантування. Результати цього аналізу вказують на можливість існування між досліджуваними показниками достовірних причинно-наслідкових зв’язків, які подано у підсумковій таблиці 2, де наведено максимальні достовірні значення коефіцієнтів крос-кореляції (Rxy) і часові зсуви (t), при яких вони спостерігаються. Індекси Rxy: x – показник першого стовпчика, y – показник першого рядка; ** – p 0.01, * – p 0.05.

Таблиця 2

Крос-кореляційні зв’язки між біоелектричними та метаболічними

показниками зародків в’юна

Показники

кореляції,

Rxy | ТМП | Ca2+ | pHц | ізЦДГ | -КГДГ | СДГ | ЛДГ | ШПК | 5-HT

ТМП– | 0.84** | 0.76**–– | -0.87**– | 0.74** | -0.55**

t, хв– | 5 | 25–– | 5– | 80 | 5

pHц– | -0.54*–––– | -0.53** | 0.66**–

t, хв– | 25–––– | 40 | 25–

ізЦДГ | -0.80** | -0.86** | -0.72**–– | 0.71**– | -0.50**–

t, хв | 5 | 5 | 45–– | 5– | 80–

-КГДГ– | -0.70** | -0.40*––––––

t, хв– | 10-30 | 55––––––

СДГ– | -0.86** | -0.60**–––– | -0.79**–

t, хв– | 5 | 25–––– | 5–

ЛДГ– | -0.50*– | 0.50*– | 0.39**– | -0.42**–

t, хв– | 30– | 25– | 10– | 10–

ШПК– | -0.58**–– | -0.74**––– | 0.80**

t, хв– | 40–– | 5––– | 20

5-HT– | -0.44* | 0.52* | 0.46* | 0.54* | 0.50* | 0.51*––

t, хв– | 5 | 5 | 10 | 5 | 5 | 5––

Як і в попередньому аналізі, виявлено достовірні крос-кореляційні зв’язки, які спостерігаються при довготривалих зсувах між змінами: pHц з усіма іншими показниками (крім зв’язку з серотоніном), [Ca2+]в з активністю ЛДГ і ШПК, а також, між активністю ізЦДГ і ШПК. Аналіз зсувів показує, що ці зв’язки найімовірніше пов’язані з процесом запліднення (Божкова, 1986).

Оскільки йони Ca2+ є найбільш універсальним вторинним посередником, тому виявлені крос-кореляційні зв’язки за 5-хвилинним зсувом між ТМП–Ca2+, Ca2+–ізЦДГ, СДГ реалізуються на рівні молекулярних механізмів. Зокрема, встановлено, що зміни цитозольної концентрації Ca2+ мають вплив на мітохондріальну фізіологію, оскільки регулюють окиснювальний метаболізм через дію на окремі матриці дегідрогеназ (Ammini, 1999), а також впливають на інтенсивність перикисного окиснення ліпідів (Мукалов и соавт., 1984), регуляцію мембранної провідності та ін. (Богач із співавт., 1984).

Виявлено крос-кореляційні зв’язки між динамікою вмісту серотоніну в зародку в’юна з іншими досліджуваними показниками, у яких зміни серотоніну відбуваються з упередженням на 5-10 хв до змін інших показників (див. табл. 2). Як відомо, донервовий 5-HT (5-гідрокситриптамін) може брати участь у сегрегації цитоплазми та клітинних поділах. Внутрішньоклітинними ефекторами в реалізації обох функцій служать елементи цитоскелету (Бузников, 1987). У роботах на диференційованих клітинах показано, що дія серотоніну реалізується через вплив на аденілатциклазну систему, змінюючи у клітинах цитозольну концентрацію Ca2+, що забезпечує клітинну відповідь через Ca2+-залежні протеїнкінази (Кометиани и соавт.,1975). Через зміни [Ca2+]в можуть також опосередковуватися зв’язки між ТМП і серотоніном. Невідомими є виявлені нами кореляційні зв’язки між змінами вмісту серотоніну та активністю ферментів циклу Кребса, ЛДГ та ШПК у період дроблення зародків різних тварин. Ці дані свідчать, що збільшення концентрації серотоніну корелює зі збільшенням активності ізЦДГ, -КГДГ, СДГ, ЛДГ та ШПК.

Отже, одержані нами результати свідчать про можливість участі серотоніну в регуляції процесів дихання зародків риб, інтенсивності біосинтетичних процесів та гіперполяризації мембрани.

У третій серії аналізували коливну динаміку цих самих показників (див. табл. 2). За результатами проведеного автокореляційного та спектрального аналізу виявлено, що періоди коливань ТМП, Ca2+, pHц та ізЦДГ (рис. 2) близькі до тривалості поділів у період дроблення зародків в’юна (31.5 хв при 21С).

Виявлено двократну стосовно до поділу періодичність активності
-КГДГ та наявність декількох періодичних складових у динаміці активності СДГ, ЛДГ та ШПК (рис. 3), одна з яких близька до тривалості клітинних поділів. Результати крос-кореляційного аналізу, представлені у дисертаційній роботі (36 крос-корелограм), вказують на існування стійкогоо звязку з періодом 30-35 хв між коливаннями таких показників: ТМП–pHц та Ca2+–ізЦДГ (у фазі) та ТМП–ізЦДГ, Ca2+pHц (у протифазі). На крос-корелограмах активності СДГ, ЛДГ і ШПК із вказаними вище показниками виявлено квазіперіодичну появу крос-кореляцій з періодом у межах 30-40 хв, достовірні максимуми яких (p<0.05) спостерігаються на нетривалих інтервалах дослідження при часових зсувах певного ряду у обох напрямках, що може свідчити про синхронність динаміки цих показників, але не на усьому інтервалі дослідження. Ці результати можна пояснити нелінійним характером змін показників, нестабільністю визначених періодів коливань і наявністю декількох періодичних складових в їх динаміці, що узгоджується з попереднім аналізом їх автокорелограм та періодограм (див. рис. 2 і 3).

Проведений крос-кореляційний аналіз між коливною динамікою ТМП та ШПК на різних інтервалах розвитку від 60, 90, 120, 150 хв до 385 хв показав, що після
150 хв спостерігаються найбільш стабільні крос-кореляційні зв’язки з періодом приблизно 30 хв між цими показниками. Ці дані узгоджуються з попередньою оцінкою їх аперіодичних змін (див. табл. 1 і 2).

Дослідження динаміки метаболічних і біоелектричних процесів дозволило з’ясувати закономірності їх часових залежностей за нормальних умов розвитку зародків в’юна.

На другому етапі роботи проводили дві серії досліджень часової динаміки біоелектричних і метаболічних процесів у ранньому ембріогенезі зародків риб та амфібій (рис. 3 і 4).

У першій серії аналізували часові співвідношення динаміки названих процесів у зародків шпорцевої жаби, а у другій (див. рис. 3 і 4) – спектральний та крос-кореляційний аналіз динаміки наступних показників в’юна та шпорцевої жаби: ТМП, вмісту катіонів K+, Na+ співвідношення K+/Na+ у зародку, [Сa2+]в, pHц, ШПК і ШВВ. Аналогічні достовірні крос-кореляції між змінами вмісту K+ і Na+, відношенням K+/Na+ у зародку та динамікою ТМП, ТМП і концентрацією цитозольного Ca2+, а також, динаміки процесів, що зумовлюють зміни поляризації зародкових мембран (перерозподіл вмісту K+, Na+, співвідношення K+/Na+ у зародку) з одного боку, та інтенсивність енергетичного метаболізму, з іншого, виявлено також і у зародків в’юна, та в зародків шпорцевої жаби (див рис. 3 і 4). Порівняння коливань ТМП та концентрації цитозольного Ca2+ (за результатами їх спектрального аналізу) підтвердило близькість періодів до тривалості клітинних циклів у обох об’єктів.

Виявлено також відмінності у часових співвідношеннях між змінами pHц та біоелектричних показників (див. рис. 5) цих об’єктів. Між цими показниками у шпорцевої жаби спостерігаються достовірні крос-кореляційні залежності із зсувом від 5-ти до 35-ти хв. На відміну від цього, у в’юна виявлено періодичність виникнення крос-кореляційних зв’язків із 30-хвилинним ритмом. Ці результати підтверджені спектральним аналізом динаміки pHц. На відміну від виявленої періодичності динаміки pHц у в’юна з періодом 31 хв (p0.05), у зародків шпорцевої жаби зміни цього показника на досліджуваному інтервалі часу є випадковими флуктуаціями.

Реалізація вказаних вище зв’язків, очевидно, також пов’язана із морфофізіологічними процесами, що супроводжують дроблення зародків, оскільки більшість з них виявлено за довготривалими часовими зсувами в обох об’єктів.

Цілісна картина одержаних результатів підтверджує універсальність часової організації динаміки метаболічних і біоелектричних процесів на ранніх стадіях ембріогенезу риб та амфібій. Крім того, це свідчить про те, що динаміка ТМП, перерозподілу вмісту K+, Na+, співвідношення K+/Na+ у зародках та інтенсивності енергетичного метаболізму, властива зародкам, не залежить від типу дроблення та будови зародків цих тварин.

На третьому етапі дослідження проводили порівняльний аналіз динаміки біоелектричних і метаболічних характеристик раннього ембріогенезу в’юна за нормальних та екстремальних умов розвитку. У двох серіях дослідів оцінювали динаміку ТМП та ШПК на протязі 5 год від 1-го поділу при 16С та 21С (нормальні умови) і 24С (екстремальні умови) та при розвитку зародків у середовищі з колхіцином в концентрації 4.510-3 М (екстремальні умови) з використанням спектрального, авто- і крос-кореляційного аналізу з 1 хв інтервалом квантування.

У результаті спектрального та автокореляційного аналізу динаміки обох показників при 16С та 21С виявлено взаємну невідповідність у періодах їх коливань: 30 і 37 хв та 36 і 33 хв (p<0.01) – для ТМП (аналіз проводили в діапазонах 60-180 і 180-360 хв), а також, 46 і 35 хв (p<0.01) для ШПК (60-360 хв). Аналіз ширини піків на спектрах та швидкості зменшення коливань коефіцієнтів кореляції на автокорелограмах вказує на значну нестабільність визначених періодів. У зв’язку з цим при часових зсувах рядів цих показників поява максимумів кореляції характеризується квазіперіодичністю з неоднаковою силою зв’язків протягом досліджуваного інтервалу часу (рис. 6), що підтверджує попередній аналіз коливної динаміки.

Іншу закономірність засвідчили результати оцінки коливань ТМП та ШПК при 24С (рис. 7). Появі аномалій розвитку зародків в’юна тут передує значне спрощення коливного режиму функціонування біоелектричних та метаболічних процесів, яке проявляється у тому, що величина періодів коливань цих показників стає майже ідентичною, а самі коливання – значною мірою синхронними на протязі усього періоду дроблення зародків (p<0.01). Це підтверджує аналіз їх крос-корелограми (рис. 7, 5), яка має форму близьку до гармонічних синусоїдальних коливань з тим самим періодом. Крім того, тут також змінені фазові співвідношення коливної динаміки досліджуваних процесів: вони відбуваються майже синфазно.

Після блокування поділів під впливом колхіцину настає збільшення інтенсивності динаміки названих параметрів (рис. 8). За цих умов параметри коливань ТМП стабілізуються, а осциляції ШПК значно сповільнюються і стають аперіодичними. Останнє може свідчити про те, що механізм формування коливань кожного з цих показників є автономним, хоч існують спільні фактори, за рахунок яких зміни обох показників стають більш узгодженими в часі, особливо після стадії 16-32 бластомерів.

Отримані результати аналізу динаміки досліджуваних характеристик за екстремальних умов розвитку узгоджуються з оцінкою коливної динаміки циркадної ритміки за умов патології, для визначення якої запропоновано використання структури ритмів (Моисеева, 1978, Комаров, Рапопорт, 2000). Зазначено, що добрий прогноз при захворюванні показує структура, в якій чітко сформований рисунок ритму: великий розмах коливань значень параметра, добрий збіг положень максимумів і мінімумів на осі часу при дослідженні протягом 3 діб. При цьому дуже сильна синхронізація коливань показників є небажаною для організму. Існують дані про те, що збільшення регулярності та періодичності в електрокардіограмах передує нападам стенокардії, інфаркту міокарда, раптовій смерті (Golgberger et al., 1987). Багаточисельні спостереження ритмічної активності серцево-судинної та нервової систем також свідчать про те, що “резерв частот” і “гнучкість функції” є загальною ознакою стану здоров’я, тоді як стабілізація періоду коливань є ознакою патологічного стану (Pool R., 1989; Elbert et al., 1993, Бродский, 1998, Игошева и соавт., 2001).

ВИСНОВКИ

У дисертації подано теоретичне узагальнення і нове розв’язання наукової проблеми, що виявляється в з’ясуванні принципів часової організації клітинних процесів у період дроблення зародків холоднокровних тварин.

1. Оцінено особливості коливної динаміки біоелектричних і метаболічних характеристик зародків в’юна та встановлено кількісні залежності між їх часовими змінами. Це дозволило виявити закономірності часової організації клітинних процесів у нормі (16-21 С) на стадії дроблення зародків тварин, а саме – нестабільність коливань (варіативність визначених періодів), особливо характеристик енергетичного метаболізму, динаміці більшості з яких властивий квазіперіодичний характер. Аналіз крос-кореляцій між динамікою ТМП і ШПК показав зростання ступеня спряженості їх аперіодичних і періодичних змін після 150 хв розвитку зародків в’юна, що може свідчити про синхронізацію в цей час коливань названих показників.

2. Порівняльний аналіз динаміки біоелектричних і метаболічних процесів у зародків в’юна та шпорцевої жаби на стадії дроблення виявив аналогії у часових співвідношеннях між перерозподілом вмісту K+ і Na+, співвідношенням K+/Na+ у зародках і динамікою ТМП, а також, між змінами характеристик енергетичного метаболізму та змінами біоелектричних характеристик. Ці дані свідчать про подібність часової організації процесів, що зумовлюють динаміку названих характеристик у ранньому ембріогенезі тварин різних систематичних груп та її незалежність від типу дроблення та будови зародків цих тварин.

3. Виявлено достовірні причинно-наслідкові залежності між аперіодичними змінами біоелектричних і метаболічними характеристиками у зародків в’юна та шпорцевої жаби. Можливо, що зміни цих характеристик опосередковуються морфофізіологічними процесами, які відбуваються під час ранніх клітинних циклів в зародках тварин.

4. Встановлено достовірну позитивну крос-кореляцію між динамікою вмісту серотоніну в зародку та ШПК, активністю ферментів циклу Кребса, лактатдегідрогенази, (p0.05), а також, достовірну негативну кореляцію між вмістом серотоніну, з одного боку, та цитозольною концентрацією катіонів Ca2+ у зародків в’юна (p0.05) й динамікою ТМП (p0.01), з іншого. На підставі цих результатів можна припустити, що серотонін є однією з проміжних ланок регуляції процесів енергетичного метаболізму на стадії дроблення в ембріогенезі тварин, зокрема, гіперполяризації мембрани.

5. Показано, що за екстремальних умов розвитку зародків в’юна (24 С), коли на наступних стадіях розвитку виникають аномалії й відбувається загибель зародків, значно спрощується коливна динаміка ТМП та ШПК. Це проявляється у ідентичності величин їх періодів, зростанні їх стабільності та порушенні фазових співвідношень їх коливань. Коливання цих показників стають синхронними на протязі усього періоду дроблення зародків, що достовірно (p<0.01) відрізняється від їх динаміки у нормі.

6. Аналіз змін ТМП та ШПК, визначених щохвилинно, за умов впливу колхіцину, який блокує клітинний поділ зародків в’юна, виявив збільшення на порядок інтенсивності коливань вказаних показників. Параметри коливань мембранного потенціалу при цьому стабілізуються. Осциляція швидкості поглинання кисню значно сповільнюється і стає аперіодичною. Механізм формування коливних процесів біоелектрогенезу не залежить від часової динаміки інтенсивності енергетичного метаболізму.

7. Апробовані у роботі методи можуть застосовуватися для аналізу ритмічних процесів, що відбуваються на різних рівнях біологічної організації, з метою діагностики та прогнозування функціонального стану біосистем при дії різних чинників. Одержані результати дозволяють використати зазначені методи аналізу для діагностування життєздатності зародків риб. Найбільш чутливими критеріями оцінки динаміки процесів за нормальних умов розвитку та при дії негативних чинників слід вважати такі критерії, як форма авто- і крос-корелограм, максимуми спектральної потужності коливань на періодограмах біоелектричних і метаболічних показників.

СПИСОК ДРУКОВАНИХ ПРАЦЬ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Івашків Л.Я., Градюк М.Б., Санагурський Д.І. Особливості часової організації мембранозв'язаних процесів у ранньому ембріогенезі тварин // Вісн. Харк. ун-ту. Сер. Біофізичний вісник. – 2001. – Т. 1(8), №525. – С.42-50.

2. Івашків Л., Градюк М., Санагурський Д. Аналіз крос-кореляцій у часових змінах фізико-хімічних показників розвитку зародків в'юна // Вісн. Львів. ун-ту. Сер. біологічна. – 2001. – №27. – С.3-11.

3. Івашків Л.Я., Гумецький Р.Я., Санагурський Д.І. Дослідження змін фізико-хімічних показників розвитку зародків в'юна методами кореляційного та спектрального аналізів // Вісн. Харк. ун-ту. Сер. Біофізичний вісник. – 2001. – №528. – Т. 2 (9). – С.51-57.

4. Івашків Л.Я., Санагурський Д.І., Рибальченко Т.В. Дослідження крос-кореляцій між змінами фізико-хімічних показників розвитку зародка X. laevis у період синхронних дроблень // Вісн. КНУ ім. Т. Шевченка. Проблеми регуляції фізіологічних функцій. – 2002. – №.8. – С.24-28.

5. Івашків Л., Гумецький Р., Санагурський Д. Часові співвідношення динаміки метаболічних та біоелектричних характеристик раннього ембріогенезу в’юна та шпорцевої жаби // Вісн. Львів. ун-ту. Сер. біол. – 2002. – №.29. – С.15-24.

6. Ивашкив Л.Я., Гумецкий Р.Я., Санагурский Д.И. Анализ зависимостей в динамике физико-химических характеристик раннего эмбриогенеза холоднокровных животных // Сборник тезисов 6-ой Пущинской школы-конференции молодых ученых “Биология – наука XXI века”. – Пущино. – 2002. – Т.1. – С.12-13.

7. Івашків Л.Я. Дослідження динаміки фізико-хімічних характеристик раннього ембріогенезу в’юна при дії різних факторів // Матеріали ІІ всеукраїнської наукової конференції студентів та аспірантів “Біологічні дослідження молодих вчених на Україні”. – Київ. – 2002. – Вип.1. – С.19-20.

8. Івашків Л.Я., Гумецький Р.Я., Санагурський Д.І. Аналіз динаміки фізико-хімічних характеристик раннього ембріогенезу в’юна при цитостатичних та температурних впливах // Збірник тез доповідей IIІ з’їзду Українського біофізичного товариства. – Львів. – 2001. – C.153.

9. Ivashkiv L., Humetskyi R., Sanagurskyi D. Analysis of the dynamics of the physical-chemical characteristics during early embryogenesis of loach under cytostatic and temperature influence // 4th Parnas Conference “Molecular mechanisms of cell activation: biological signals and their target enzymes”. – Wroclaw. – 2002. – P.63.

10. Івашків Л.Я., Гумецький Р.Я., Санагурський Д.І. Дослідження часових залежностей в динаміці фізико-хімічних характеристик раннього онтогенезу холоднокровних тварин // Наука і молодь. Матеріали міжнародної наукової конференції студентів та молодих вчених “Політ-2002”. – Київ. – С. 198.

АНОТАЦІЇ

Івашків Л.Я. Часова організація біоелектричних і метаболічних процесів у ранньому ембріогенезі в’юна та шпорцевої жаби. – Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.02 – біофізика. – Львівський національний університет імені Івана Франка, Львів, 2003.

Дисертацію присвячено проблемі часової організації біоелектричних і метаболічних процесів у ранньому ембріогенезі тварин. Дослідження динаміки проведено з застосуванням системного підходу та математичних методів автокореляційного, крос-кореляційного та спектрального аналізу. Отримано нові дані про принципи часової організації клітинних процесів за нормальних та екстремальних умов розвитку протягом періоду дроблення зародків холоднокровних тварин. Встановлено подібність цієї організації у ранньому ембріогенезі тварин різних систематичних груп (риб та амфібій) та незалежність її від типу дроблення та будови зародків цих тварин. Виявлено достовірні крос-кореляції між динамікою вмісту серотоніну в зародках в’юна з біоелектричними процесами та інтенсивністю енергетичного метаболізму. Запропоновано критерії оцінки динаміки клітинних процесів за нормальних умов розвитку та при дії екстремальних чинників.

Ключові слова: в’юн, шпорцева жаба, дроблення, біоелектричні та метаболічні показники, часова динаміка, автокорелограма, періодограма, крос-кореляція.

Ивашкив Л.Я. Временная организация биоэлектрических и метаболических процессов в раннем эмбриогенезе вьюна и шпорцевой лягушки. – Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.02 – биофизика. – Львовский национальный университет имени Ивана Франко, Львов, 2003.

Диссертация посвящена проблеме временной организации биоэлектрических и метаболических процессов в раннем эмбриогенезе холоднокровных животных. Исследование динамики процессов проводилось с использованием системного подхода и математических методов автокорреляционного, кросс-корреляционного и спектрального анализа. Получены новые данные о принципах временной организации клеточных процессов на основе оценки особенностей колебательной динамики биоэлектрических и метаболических показателей при нормальных условиях