Інститут рослинництва ім. В.Я. Юр’єва УААН

Івченко Тетяна Володимирівна

УДК 635.25:631.527+631.53.02:631.147+581.1

БІОТЕХНОЛОГІЧНІ ТА ФІЗІОЛОГІЧНІ МЕТОДИ

В СЕЛЕКЦІЇ ЦИБУЛI РІПЧАСТОЇ

(ALLIUM CEPA L.)

06.01.05 – селекція рослин

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата сільськогосподарських наук

Харків – 2003

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Інституті овочівництва і баштанництва Української академії аграрних наук.

Науковий керівник: доктор сільськогосподарських наук, старший науковий

співробітник ЛЄДОВСЬКИЙ Станіслав Якович,

Інститут овочівництва і баштанництва УААН, головний науковий співробітник лабораторії біотехнології

Офіційні опоненти: доктор сільськогосподарських наук старший науковий співробітник КОЗАЧЕНКО Михайло Романович,

Інститут рослинництва ім. В.Я. Юрьєва

УААН, завідувач відділу селекції,

генетики і біотехнології ячменю

кандидат сільськогосподарських наук,

старший науковий співробітник

КОЛІСНИК Ірина Віталіївна, Полтавська

державна сільськогосподарська дослідна

станція ім. М.І. Вавілова, завідувач науково-

технічним відділом селекції, первинного та

елітного насінництва

Провідна установа: Уманська державна аграрна академія

Міністерства аграрної політики України, м. Умань у

УУУУУ

Захист відбудеться 08.07. 2003 року о 10 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 64.366.01 в Інституті рослинництва ім. В.Я. Юр’єва УААН 61060, м. Харків, проспект Московський, 142,

тел.: 92-23-78

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту рослинництва ім. В.Я.Юр’єва УААН, м. Харків, проспект Московський, 142.

Автореферат розісланий 04.06. 2003 р.

Вчений секретар спеціалізованої

вченої ради В.П. Петренкова

загальна характеристика роботи

Актуальність теми. Успіхи сучасної біологічної науки впевнено довели важливу роль біотехнологічних методів у селекції сільськогосподарських рослин. Їх застосування дозволяє значно прискорити селекційний процес, отримувати міжвидові, міжродові і навіть міжродинні гібриди, передавати культурним формам від диких і напівдиких видів підвищену стійкість проти хвороб, шкідників, несприятливих умов зовнішнього середовища (Глєба Ю.Ю., Ситник К.М., 1984; Сассон А., 1987; Сидоров В.А., 1990 та ін.). Крім того, мікроклонуванням in vitro можна у тисячі разів збільшити коефіцієнт розмноження селекційно-цінних форм, що має надзвичайно велике значення для селекції і насінництва (Катаєва Н.В., Бутенко Р.Г., 1983). Окрім біотехнологічних, важливим є і використання фізіологічних методів, зокрема хімічної кастрації квіток за допомогою гаметоцидів і підвищення зав’язуваності насіння шляхом застосування фізіологічно активних речовин (Нікелл Л.Дж., 1984; Федін М.О., 1984).

Використання біотехнологічних і фізіологічних методів добре вивчено на зернових, технічних та деяких інших культурах. Проте на одній з основних овочевих культур, якою є цибуля ріпчаста, ці питання досліджено недостатньо. До того ж, технології застосування зазначених методів на ній не розроблено.

Необхідність вирішення цих питань і визначило актуальність проведених нами досліджень.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дана робота є складовою частиною наукових досліджень лабораторії біотехнології Інституту овочівництва і баштанництва УААН за темами: “Розробити на основі біотехнологічних методів способи одержання вихідних форм для прискореного створення нового покоління високопродуктивних сортів та гібридів овочевих культур” (номер державної реєстрації UA 01001695 Р (1991-1995) і “Розробити теоретичні основи селекції овочевих культур з використанням нових методів прикладної генетики, біотехнології, імунітету (номер держреєстрації № 0101 U001168 (2001-2005 рр.).

Мета і задачі дослідження. Мета даної роботи полягала в удосконаленні існуючих біотехнологічних і фізіологічних способів створення вихідних форм для прискореної селекції цибулі ріпчастої. Для її здійснення в завдання досліджень входило:

-

-

-

-

-

-

-

Об’єкт дослідження – гетерозисна селекція цибулі ріпчастої.

Предмет дослідження - удосконалення біотехнологічних методик з використанням культури in vitro та фізіологічно активних речовин для створення на їх основі цінного і унікального за властивостями селекційного матеріалу цибулі ріпчастої для прискореної гетерозисної селекції.

Методи дослідження: а) біотехнологічні - для одержання гаплоїдів та мікророзмноження in vitro селекційно-цінного матеріалу; б) фізіологічні – для регулювання процесів проходження зав’язування і цвітіння у цибулі ріпчастої з допомогою фізіологічно активних речовин; в) математико-статистичні - для оцінки достовірності одержаних результатів досліджень.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше в Україні на культурі цибулі ріпчастої вивчено ефективність одержання гаплоїдних рослин методами андрогенезу і гіногенезу, експериментально обґрунтовано добір експланта, який забезпечує максимальний коефіцієнт регенерації. Встановлено оптимальні живильні середовища і умови культивування експлантів, вивчено реакцію різних генотипів вітчизняної селекції на використану процедуру індукування гаплоїдів. На основі одержаних матеріалів розроблено "Методику індукування інбредних ліній цибулі ріпчастої методом гіногенезу in vitro”. На основі біотехнологічних розробок запропоновано прискорену схему селекційного процесу для створення гетерозисниих гібридів цибулі ріпчастої.

Виявлено оптимальні умови для розмноження нових селекційних форм шляхом калусогенезу, з цією метою розроблено умови для індукування морфогенезу in vitro у рослин цибулі української селекції. Удосконалено технологію їх мікроклонального розмноження. Вперше для одержання гетерозисних гібридів запропоновано спосіб індукування стерильності на рослинах цибулі ріпчастої за допомогою хімічної кастрації. Виявлено 8 нових гаметоцидів, 3 препарати адаптаційної дії і один - замінник агару (за результатами роботи одержано 1 патент, зареєстровано 2 заявки на винахід, 1 методика).

Практичне значення одержаних результатів. Розроблені дисертантом досконалі технології лабораторного розмноження рослин цибулі шляхом використання мікроклонування та калусогенезу можуть бути застосовані при одержанні селекційно-цінних форм. Вже існують придатні для впровадження в селекційних програмах стерильні форми трьох генотипів цибулі ріпчастої. В результаті одержання сомаклональних варіацій і мікроклонального розмноження їх з цибулі шалот Ліра виведено новий сорт, переданий до Держсортовипробування.

Удосконалена автором технологія одержання гіногенних ліній цибулі ріпчастої при використанні в селекції гетерозисних гібридів сприяє створенню гомозиготних батьківських форм. За результатами досліджень одержано цінні форми цибулі ріпчастої, які впроваджені в селекційний процес в Інституті ово-

чівництва і баштанництва УААН.

Виявлені дисертантом нові ефективні гаметоциди при використанні у промисловому виробництві насіння гетерозисних гібридів цибулі ріпчастої заміняють трудомістку ручну кастрацію квіток хімічною стерилізацією.

Особистий внесок здобувача. Дисертантом самостійно розроблено схеми дослідів на основі аналітичного огляду літератури, запропоновано нові більш ефективні методичні підходи. Автором особисто проведено дослідження за темою дисертаційної роботи, самостійно зроблено теоретичні узагальнення і практичні висновки. Особистий внесок в опублікованих у співавторстві працях складає 80%, авторство у сорті Ліра - 10%.

Апробація результатів дисертації. Основні результати досліджень обговорювались на засіданнях вченої ради (1993-1994, 1996-1997, 2000 рр.) і представлено на розширеному засіданні методичної комісії ІОБ УААН (2002 р.); міжнародному симпозіумі “Биотехнология растений и генная инженерия” (Київ, 1994); міжнародній конференції “Биология клеток растений in vitro, биотехнология, сохранение генофонда” (Москва, 1997); науковій конференції, присвяченій 50-річчю Інституту овочівництва і баштанництва УААН (Харків, 1997); II Міжнародному симпозіумі “Биотехнология растений” (Київ, 4-8 жовтня 1998); міжнародній конференції “Оптимізація селекційного процесу на основі генетичних методів” (Харків, 1999); міжнародній конференції “Адаптивная селекция овощных культур” (Мерефа, 2001); конференції молодих вчених “Современные проблемы генетики, биотехнологии и селекции растений” (Мерефа, 2001); конференції молодих вчених “Досягнення і перспективи розвитку агробіотехнології в Україні” (Київ, 2002).

Публікації. Основні теоретичні дослідження та практичні рекомендації викладено в 15 наукових роботах, з яких 4 статі у наукових збірниках, 1 патент, 2 патентні заявки, 1 методика, 7 тез доповідей, .

Структура і обсяг дисертації. Матеріали дисертації викладено на 210 сторінках машинописного тексту. Робота складається зі вступу, семи розділів, висновків, практичних рекомендацій, списку використаних джерел, містить 32 таблиці, 24 рисунки та 6 додатків. Список використаної літератури налічує 234 праці, у тому числі 102 зарубіжних авторів.

зміст роботи

Огляд літератури. Представлено аналіз публікацій щодо основних напрямків селекції гетерозисних гібридів цибулі ріпчастої, проаналізовано біотехнологічні та фізіологічні методи створення матеріалу для прискореної селекції, аналізується стан вивченості проблем гаплоіндукції, мікророзмноження in vitro, використання хімічних стерилянтів, обґрунтовується вибір мети та задач дослідження.

Умови і методика проведення досліджень. Дослідження проведено в лабораторії біотехнології Інституту овочівництва і баштанництва УААН (ІОБ УААН) у 1991–2001 рр. В роботі застосовували загальноприйняті біотехнологічні методи (Бутенко Р.Г., 1964; Калінін Ф.Л., Сарнацька В.В. та ін., 1980). Вихідним матеріалом для дослідження були сорти і гібриди цибулі ріпчастої селекції інституту та деякі колекційні зразки. Регенеранти після дорощування і адаптації до умов культури in vivo вирощували в скляних теплицях або відкритому грунті.

Ефективність одержання гаплоїдів вивчали, порівнюючи два методи - андро - і гіногенез. При індукції андрогенезу для досліджень відбирали бутони з одноядерною стадією розвитку. В дослідах з отримання гаплоїдів шляхом гіногенезу вивчали можливість використання трьох донорських органів: незапліднених насінних зачатків, незапліднених зав’язей і бутонів у двохетапній системі регенерації (бутон-зав’язь).

Цитологічні та ДНК - аналізи одержаних рослин-регенерантів виконано у три календарних строки науковим співробітником ІОБ УААН Н.А. Баштан під методичним керівництвом наукового співробітника Інституту рослинництва ім. В.Я. Юр’єва, кандидитом біологічних наук Є.В. Белінської. У роботі використано методику, описану в книзі З.П.Паушевої (1974 ). ДНК - аналіз проводили за Ю.М.Сиволапом (1998 ).

У дослідах з гаплоїдії вивчено 24 сорти і гібриди цибулі ріпчастої. Досліджуваний матеріал висаджували на живильні середовища у 117 варіантах .

В роботі по удосконаленню існуючих і розробці нових методик одержання рослин цибулі ріпчастої шляхом калусогенезу, проводили з використанням таких донорських органів: листків, бутонів, соковитих лусок сорту Ткаченківська. З рослин використовували 4 наймолодших листки, враховуючи розташування експлантів на листковій пластині.

Дослідження з удосконалення технології мікроклонального розмноження проводили на рослинах цибулі ріпчастої сортів Харківська 82 і Веселка. При приготуванні живильних середовищ загущувачем використовували агар і новий препарат ДККмод, синтезований в Інституті органічної хімії і нафтохімії НАНУ. Пагони ініціювали з меристемних зон денця цибулі і суцвіття з закритими обгортками. Процедура розмноження потребувaла 3-6 пасажів.

З метою підвищення приживлення рослинного матеріалу з пробірок після висаджування його в грунт регенеранти у деяких варіантах обробляли розчинами нових препаратів адаптаційної дії (Д-3, Д-8, Д-2А), синтезовані в Інституті біоорганічної хімії і нафтохімії НАНУ.

Дослідження з виявлення ефективних гаметоцидів і стимуляторів зав’язування насіння здійснювали в умовах невеликих ділянок на сортах цибулі ріпчастої Стригунівська носівська і Веселка, користуючись у роботі методикою М.А. Федіна та ін., 1992. При цьому підраховували середню кількість насінин, які утворились у кожному суцвітті в умовах ізоляції (марлеві ізолятори) і без неї. Повторність досліду семиразова, площа облікової ділянки 1-2 м2. Вивчено понад 20 хімічних сполук, відомих раніше і нових, синтезованих співробітником Інституту біоорганічної хімії і нафтохімії НАНУ, кандидатом хімічних наук П.Г. Дульнєвим.

Експериментальні дані піддані математичній обробці методами варіаційної статистики дисперсійного аналізу (Доспєхов Б.А., 1985; Лакін Г.Ф., 1990).

Удосконалення способів одержання гаплоїдних рослин цибулі ріпчастої. Дослідженнями 1991-1995 рр. порівняно ефективність одержання гаплоїди у цибулі ріпчастої одержано методами андрогенезу і гіногенезу in vitro. Результати переконливо свідчать про переваги застосування гіногенезу in vitro (з незапліднених зав’язей) порівняно з використанням андрогенезу із пиляків.

Використання різних вихідних експлантів для індукування гіногенезу показало, що найбільш перспективним способом досягнення поставленої мети є застосування культури незапліднених зав’язів in vitro (табл. 1).

Таблиця 1

Частота ембріогенезу з різних тканин цибулі ріпчастої сорту Алмадон

(1993-1994 рр.)

Середовище | Первинні експланти | Кількість

шт. | %

П3

(1/2МС+2мг/л 2,4-Д) |

Пиляки | висаджені | 1012 | 100

ембріогенні | 1 | 0,1

сформували рослини-регенеранти | 0 | 0

А1( МС +НОК 1мг/л, БАП-2 мг/л) | Насінні зачатки | висаджені | 819 | 100

ембріогенні | 0 | 0,0

А2 (БДС+ БАП 1,5 мг/л)

А5(БДС+

ТДZ 1мг/л | Двохетапна система

бутон > зав’язь | висаджені | 696 | 100

сформували ембріоїди | 45 | 6,5

сформували рослини-регенеранти (нормальні) через 6 місяців культивування | 0 | 0

А3 ( БДС +БАП 2мг/л, ИОК+2,1мг/л) | Незапліднені зав’язі | висаджені | 799 | 100

сформували ембріоїдні пагони | 4 | 0,5

рослин-регенеранти (нормальні) через 6 місяців культивування | 1 | 0,1

НІР0,05 0,08

Вивчення впливу складу живильних середовищ і генотипу (21 зразок) на частоту регенерації з незапліднених зав’язів дозволило встановити, що високий рівень регенерації гіногенетичних рослин забезпечили сорти цибулі ріпчастої Золотиста, Алмадон, Халцедон, середній – сорти Харківська 82, Сонячна, Ткаченківська, Донецька золотиста і низький рівень регенерації – сорти Веселка і De ringa.

В дослідах з вдосконалення вмісту живильних середовищ для індукції гіногенезу ефективними виявились нові живильні середовища А8 і А9, котрі за своєю ефективністю у культурі гіногенезу перевищували показники середовища А3, рекомендованого зарубіжними дослідниками (Campion, 1992) ) (табл. 2).

Максимальні результати забезпечило використання живильного середовища БДС (Dunstan, Short , 1977), яке містить 2 мг/л 2,4-Д, 1,25 мг/л БАП і 100 мг/л L-проліну.

Для підвищення ефективності гаплоіндукції досліджено вплив стадій розвитку донорського органу і умов його вирощування на вихід рослин - регенерантів. При цьому враховували тісний кореляційний зв’язок між розвитком пилку і зародкового мішка в бутонах цибулі. Максимальний вихід гаплоїдних рослин (2,3 %) забезпечив донорський матеріал, який добирали з бутонів першого ярусу суцвіть (з плівкової теплиці) у двоядерній стадії пилкових зерен.

Таблиця 2

Вплив складу живильних середовищ і генотипу на частоту регенерації з незаплідненої зав’язі in vitro(1992-1994, 1996 рр.)

Живильне середовище (фактор А) | Основні компоненти живильного середовища, мг/л | Генотип (фактор В)

Золоти-

ста | Соняч-

на | Харків-ська 82 | Алмадон | середнє

А3

(контроль) | БДС + БАП(2) + ІОК (2,01) + пролін (200) | 1,39 | 0 | 0 | 0,45 | 0,46

А6 | БДС + БАП (2) + 2,4-Д (2) +пролін (100) | 0,95 | 0,44 | 0,47 | 0,96 | 0,71

А7 | Б (5) + БАП (1) + 2,4-Д (2)+ пролін (100) | 1,03 | 0,95 | 0 | 0,43 | 0,62

А8 | БДС + БАП (1) + 2,4-Д (2) | 1,93 | 0,94 | 0,95 | 1,50 | 1,33

А9 | БДС + БАП (1) + 2,4-Д (2) + пролін (100) | 1,94 | 1,35 | 0,96 | 1,96 | 1,55

Середнє | 1,22 | 0,61 | 0,40 | 0,88 | -

НІР 0,05А 0,08

НІР 0,05В 0,05

Зважаючи на те, що метою процедури з індукції гіногенетичних рослин є одержання гаплоїдів, котрі потім можна перевести на диплоїдний рівень, регенеранти, одержані в дослідах, на різних етапах їх розвитку проходили цитологічні і ДНК-аналізи.

Результат першого цитологічного аналізу показав, що 70 % рослин - регенерантів були гаплоїдними. Наступні аналізи засвідчили, що в процесі подальшого культивування гаплоїдних рослин була спонтанна диплоїдизація матеріалу, що узгоджувалось із висновками інших дослідників (Campion L., Alloni,1993; Muren, 1994). Це дозволило запобігти додатковому колхіцинуванню і спростило одержання дигаплоїдних рослин.

Проведений ПЛР- аналіз підтвердив існування кореляційного зв`язку між філогенетичним походженням ліній цибулі ріпчастої і розподілом генетичних дистанцій між проаналізованими зразками. Таким чином проведений ДНК- аналіз показав значну спорідненість донорних ліній (сорту Халцедон) і суттєву віддаленість гіногенних ліній.

На основі отриманих даних складено методику індукції гаплоїдних рослин для прискореного створення інбредних ліній цибулі ріпчастої.

Виявлення оптимальних умов для використання калусогенезу з метою прискорення селекційного процесу у Allium cepa l. Проведеними дослідами виявлено оптимальні умови для успішного проходження двох процесів, які є основними складовими частинами калусогенезу - ініціації калусогенезу та індукції морфогенезу в калусній культурі. Основні завдання роботи полягали в уточненні складу живильних середовищ і доборі донорських органів. За донорські органи брали листки (сегменти чотирьох наймолодших листків з рослини) і бутони. Максимальну інтенсивність утворення калусної тканини спостерігали при культивуванні експлантів з бутонів на середовищі К68 (70,3 %) і з четвертого листка на середовищі К63 (70,1 %) (табл. 3).

Таблиця 3

Вплив складу живильних середовищ та донорських органів на калусогенез

цибулі ріпчастої in vitro (1993-1994 рр.)

Донорський орган

(фактор А) | Живильне середовище (фактор В)

К60

(конроль) | К61 | К63 | К67 | К68 | К69 | серед-

нє за фактором А

Листок № 1 | 0 | 8,3 | 25,1 | 1,7 | 4,2 | 9,2 | 7,0

Листок № 2 | 0 | 11,4 | 28,8 | 9,8 | 6,0 | 10,6 | 10,9

Листок № 3 | 0 | 27,3 | 54,1 | 18,7 | 24,3 | 23,6 | 23,4

Листок № 4 | 0 | 29,4 | 70,1 | 27,8 | 14,4 | 33,1 | 28,4

Середнє | 0 | 19,1 | 44,5 | 14,5 | 12,2 | 19,1 | 17,4

Бутон | 0 | 12,6 | 27,3 | 26,6 | 70,3 | 41,6 | 26,0

Середнє за фактором

В | 0 | 15,8 | 35,9 | 20,6 | 41,3 | 30,6 | 21,7

НІР 0,05 для фактора А - 3,71; В - 4,0

При вивченні другого етапу калусогенезу, тобто індукції морфогенезу, встановлено, що основним джерелом одержання регенерантів з калусу виявився органогенез. У кращому варіанті досліду інтенсивність органогенезу склала 20,0 %, а процент ембріогенезу – 12,4 (табл. 4). Порівнюючи ефективність використання різних донорських органів, встановлено, що експланти з бутонів забезпечують більш високу частоту органогенезу (8,5 %), ніж з листків (3,4 %). Найбільш ефективним середовищем для індукції морфогенезу калусної тканини було тверде середовище ? MS (Murashige , Skoog, 1962 ), доповнене 0,5 мг/л ІОК і 2 мг/л кінетину (вар. К64).

Заключними етапами розмноження рослин цибулі ріпчастої з використанням калусогенезу є: регенерація пагонів з морфогенних зон калусу; укорінення одержаних регенерантів; адаптація рослин до умов вирощування у відкритому грунті. Встановлено, що для регенерації пагонів органогенні калуси слід культивувати на безгормональному живильному середовищі МС при освітленні 5000 люксів.

Одержані в калусній культурі рослини – регенеранти пересаджували на середовище для індукції різогенезу (середовище МС, доповнене 0,5 мг/л ІОК).

Таблиця 4

Вплив складу живильних середовищ на органогенез та ембріогенез з листя та бутонів цибулі ріпчастої (1993-1994 рр.)

Середовище

для калусо-генезу

(фактор А) | Середовища для ініціації (фактор В)

К62К64К64К64

Калус індукований з листків (%) | Калус індукованій з бутонів (%)

органо-

генний | ембріо-

генний

органо-

генний | ембріо-

генний

органо-

генний | ембріо-

генний

органо-

генний | ембріо-

генний

К61 | 3,85 | 0 | 6,15 | 0,93 | 8,0 | 0 | 0,0 | 0,0

К63 | 5,40 | 0 | 1,73 | 5,10 | 6,4 | 0 | 6,1 | 0,0

К67 | 7,15 | 0 | 1,05 | 2,60 | 10,5 | 0 | 0,0 | 6,3

К68 | 0,00 | 0 | 0,00 | 0,00 | 20,0 | 0 | 0,0 | 12,4

К69 | 4,20 | 0 | 0,00 | 0,00 | 6,3 | 0 | 0,0 | 0,0

К70 | 0,00 | 0 | 0,00 | 0,00 | 0,0 | 0 | 0,0 | 0,0

Середнє | 3,40 | 0 | 1,49 | 1,44 | 8,5 | 0 | 1,0 | 3,1

Обробка даних з органогенезу

Сила впливу факторів

НІР 0,05 = 3,13

Обробка даних з ембріогенезу

Сила впливу факторів

НІР 0,05 = 0,92 |

Обробка даних з органогенезу

Сила впливу факторів

НІР 0,05 = 1,57

Обробка даних з ембріогенезу

Сила впливу факторів

НІР 0,05 = 2,13

Таким чином, для стабільного індукування калусогенезу з цибулі ріпчастої кращим донорським органом слід вважати бутони, середовище для його розвитку К68 (1/2 МС + кинетин 1мг/л + ІОК-0,5мг/л).

Джерелом одержання регенерантів з калусу є органогенез. Зазначені умови забезпечують успішне розмноження селекційно-цінних генотипів при селекції гетерозисних гібридів цибулі ріпчастої.

Оптимізація умов мікроклонального розмноження селекційно –

цінних форм цибулі. Вивчено вплив складу живильних середовищ, донорських органів (суцвіть і денець) та сортових особливостей рослин цибулі на ініціацію та підрощування мікроклонально розмножених з меристемних тканин пробіркових рослин.

Встановлено, що утворенню найбільшої кількості регенерантів, з тканин денця і суцвіть досліджуваних сортів Харківська 82, Ткаченківська і Веселка сприяло використання середовищ БДС та МС із вмістом 4 мг/л БАП, 2 мг/л НОК і 150 г/л нового препарату ДККмод замість агару. З одного денця утворювалось в середньому 32,3 шт. первинних пагонів, а з одного суцвіття - 43,4 шт. (табл. 5).

Таблиця 5

Вплив вмісту живильних середовищ на регенераційний потенціал стерильних форм сортів цибулі ріпчастої з тканин денця та суцвіть in vitro

(2000-2001 р.)

Живильне середвище, мг/л

(фактор А) | Середня кількість новоутворених первинних пагонів з

меристемних зон, шт. (фактор В)

денця | суцвіття

Харьків-

ська 82 | Ткачен-ківська | Веселка | середнє | Харьків-ська 82 | Ткачен-

ківська | Веселка | середнє

МС+БАП(4) + НОК (2) + агар | 17,9 | 18,4 | 21,3 | 19,2 | 15,5 | 16,1 | 17,4 | 16,3

МС+БАП(4) + НОК (2) + ДККмод | 23,7 | 24,2 | 27,2 | 25,0 | 41,6 | 41,0 | 43,7 | 42,1

БДС+БАП(4) + НОК (4) + агар | 15,5 | 17,9 | 19,9 | 17,8 | 31,5 | 34,6 | 41,4 | 36,3

БДС+БАП(3) + агар | 19,9 | 20,4 | 22,2 | 17,8 | 18,6 | 19,9 | 24,0 | 20,7

БДС + АП(4) + НОК (2) + агар | 24,0 | 25,6 | 28,5 | 26,0 | 24,3 | 25,2 | 30,8 | 26,8

БДС + БАП (4) + НОК (2) + ДККмод | 30 | 29,9 | 36,9 | 32,3 | 38,5 | 42,9 | 49,0 | 43,4

Середнє | 21,8 | 22,7 | 26,0 | - | 28,3 | 30,0 | 34,4 |

-

НІР 0,05 1,52 шт. - 2,21 шт.

Нами вперше встановлено, що введення до складу живильного середовища нового препарату ДККмод суттєво зменшувало негативний вплив вітрифікації, нормалізувало водний обмін адвентивних пагонів, виключало утворення аномальних пагонів, підтримувало заданий рівень рН живильного середовища і врешті забезпечувало нормальний ріст новоутворених конгломератів пагонів. На препарат ДККмод оформлено патент (№ 2002010237).

Виявлено, що на регенераційну здатність меристемних зон впливає розмір цибулини і суцвіть. Оптимальний діаметр суцвіть, які добирають для клонування повинен становити 15-20, донорських цибулин – 35-50 мм.

Результативність мікророзмноження істотно залежала і від строків введення матеріалу до культури in vitro. Починати мікроклонування з тканин

цибулин найдоцільніше у першій декаді грудня. При більш пізніх строках введення матеріалу до культури відзначалось суттєве зниження (на 31 %) утворення пагонів. Використання тканин квітколожа у якості донорських органів забезпечувало більш високий коефіцієнт розмноження, ніж тканини денця. Однак останні мали у деяких випадках переваги, оскільки термін використання їх більш тривалий, більше 6 місяців.

Завершальним етапом технології лабораторного мікроклонального розмноження рослин цибулі ріпчастої є підрощування одержаних регенерантів і адаптація пробіркових рослин до вирощування у ґрунтовому субстраті. Встановлено, що для інтенсивного утворювання і росту листків пробіркові рослини цибулі протягом 1-2 пасажів слід вирощувати при короткому, 10-годинному, дні. В наступних пасажах рослини вирощують при довгому, 16-годинному дні, для утворення біля основи регенерантів цибулинок.

З метою розробки способу адаптації рослин-регенерантів до умов in vivo (табл. 6) було вивчено вплив обробки їх розчинами трьох нових препаратів з групи піридинів (Д-2А, Д-3 та Д-8).

Таблиця 6

Вплив препаратів адаптаційної дії на приживлення пробіркових рослин цибулі ріпчастої сорту Харківський 82 ( середнє за 2000-2001 рр.)

№

вар. | Препарат | Концентрація

розчину (мг/л) або розбавлення | Кількість рослин,

що прижилися | Максимальна

довжина

листка, мм

шт. | % до контролю

1 | Вода

(контроль) | - | 8,0 | 100 | 10,3 ± 1,4

2 | Д-2А | 1 | 15,5 | 194 | 9,8 ± 0,9

3 | Д-2А | 5 | 17,0 | 213 | 10,6 ± 1,1

4 | Д-2А | 10 | 12,0 | 150 | 10,1 ± 0,8

5 | Д-3 | 1 | 14,0 | 175 | 12,2 ± 1,8

6 | Д-3 | 5 | 20,0 | 250 | 15,1 ± 2,3

7 | Д-3 | 10 | 13,5 | 169 | 10,1 ± 2,0

8 | Д-8 | 1: 500 | 12,0 | 150 | 8,3 ± 2,6

9 | Д-8 | 1 : 200 | 16,5 | 206 | 10,5 ± 0,9

10 | Д-8 | 1 : 100 | 10,0 | 125 | 9,4 ± 1,7

НІР 0,05 1,8

Через 2 тижні після висаджування регенерантів у грунт підраховано кількість рослин, які прижилися, та проведено обмір довжини листків.

Дані свідчать, що кращі з досліджених нами сполук забезпечували достовірне (на 25-150 %) збільшення кількості рослин, що прижилися, порівняно з контролем. При цьому найбільш ефективним був препарат Д-3, у концентрації 5мг/л, який окрім усього, призводив до інтенсивнішого росту листків.

На вище вказані препарати зареєстровано заявку на винахід (№2002021336). Після підрощування в ґрунті одержано маточні цибулини діаметром 45-60 мм, які передано для використання в селекції гетерозисних гібридів.

Використання регуляторів росту для регулювання процесів цвітіння, зав’язування і достигання насіння у рослин в селекції цибулі ріпчастої.

Ефективність використання гаметоцидів при створенні гібридів детально вивчено на зернових культурах і соняшнику [Федін М.А., 1977; Кириченко В.В., Федоренко Т.С. (цит. По Федіну М.А. і ін., 1987)]. Застосування хімічної кастрації в селекційній практиці дозволяє замінити трудомістку ручну кастрацію. На культурі цибулі ріпчастої такі розробки відсутні. З метою виявлення ефективних гаметоцидів, протягом 1997-2000 рр. вивчено понад 20 препаратів, у тому числі 4 відомих (ХЕФК, ГМК, НОЦК, 2,4-Д) та 16 вперше синтезованих.

В результаті 10 гаметоцидів визнано перспективними для застосування на цибулі ріпчастій. У їх числі 8 нових - ДГ-67а, ДГ-07В, Д-2а, ДГ-075а, ДНОПКВ, ДГ-45а, ДГ-77, ДГ-82. Виявлені нами нові гаметоциди сприяли достовірному підвищенню стерильності пилку (до 72-96 %). Процент зав’язування насіння при вільному запиленні залишався на досить високому рівні -80-90 %. На кращі препарати подано заявку на винахід. З уже відомих речовин сильну гаметоцидну дію чинили ХЕФК (стерильність 92,4-96,2 %), ГМК (76,8 %), ДГ-67а ( 95,8 %), ДГ-07В ( 81,4 %). На суцвіттях цибулі, оброблених високими концентраціями ХЕФК, відзначено стабільне утворення повітряних цибулинок.

У дослідах 1997-2001 рр. на сортах цибулі Стригунівська носівська і Веселка встановлено можливість підвищення зав’язуваності насіння шляхом застосування препарату НОЦК у стимулюючих концентраціях. НОЦК у концентрації 0,04 % підвищував зав’язуваність насіння на 27-37 %.

Фенологічні спостереження за обробленими рослинами засвідчили у деяких варіантах значне прискорення (на 7-10 днів) цвітіння насінників. Цей факт має велике значення для вирішення питання синхронізації цвітіння селекційного матеріалу.

Використання культури in vitro та фізіологічно активних речовин у вирішенні проблем гетерозисної селекції цибулі ріпчастої. Найбільш ефективним способом одержання гетерозисного насіння цибулі у світовій селекційній практиці визнано спосіб, заснований на використанні ЦЧС. Практично кожен сорт цибулі ріпчастої має стерильність 0,1-3,0 %. Але підтримувати її для селекції та створити на її основі стерильну лінію звичайними методами є тривалим і складним процесом.

Вирішити проблему збереження і розмноження стерильного матеріалу допоможуть розроблені нами (описані вище) удосконалені елементи мікроклонування шляхом індукції пагонів із меристематичних тканин суцвіть. Застосування технології лабораторного розмноження in vitro дозволяє за 6 місяців культивування одержувати до 40 стерильних рослин-регенерантів з одного суцвіття. Саме за цією технологією створено дві стерильні лінії цибулі, які передано селекціонерам для наступної роботи, ще дві готові для передачі.

Нами розроблено і запропоновано для використання в селекційній практиці новий спосіб розмноження стерильних форм цибулі ріпчастої на основі використання фізіологічно активних речовин. Так, дворазова обробка насінників у фазу стрілкування і утворення суцвіть розчином ХЕФК у концентрації 2,5 % сприяла утворенню 8-12 штук міні цибулинок на 1 суцвіття. Цим способом можна користуватися для розмноження селекційного матеріалу без культури in vitro. Мікроклонування широко застосовується нами для розмноження селекційно цінних форм цибулі ріпчастої. Вирівняність цибулин, одержаних таким способом, становить 95-98%. Передано в селекцію розмножені таким чином дві форми, з однієї – новий сорт цибулі Ліра.

При вирішенні питань практичної селекції нами проведено роботу по створенню інбредного лінійного матеріалу цибулі ріпчастої методом гіногенезу in vitro, результат якої – передача двох інбредних ліній для прискореної гетерозисної селекції. Узагальнивши теоретичні розробки і практичні досягнення, нами розроблено і запропоновано селекційним установам нову схему створення лінійного матеріалу для прискореної (в 2-3 рази) гетерозисної селекції на основі ЦЧС (рис.1).

Рік | Методи

загальноприйнятий | з використанням гіногенезу in vitro

1 | Розсадник вихідного матеріалу.

Індивідуальний добір

2 | I0Одержання гіногенних рослин, їх мікророзмноження

3 | Добір маточниківОдержання маточників (цибулин), їх добір

4 | I1Розсадник гібридизації

SMSMS Х I4

5 | Добір маточниківОцінка F1 на ОКС и СКС

6 | I2Конкурсне випробовування

7 | Добір маточників

8 | I3

9 | Добір маточників

10 | Розсадник гібридизації

SMSMS Х I4

11 | Оцінка F1 на ОКС и СКС

12 | Конкурсне випробовування

Рис. 1. Загальноприйнята і нова схеми створення інбредних ліній цибулі

ріпчастої на гетерозис.

В селекції фертильних ліній традиційним способом є багатократний інбридінг кращих сортових популяцій з одночасним добором форм за продуктивністю та комбінаційною здатністю. При цьому рослини переносять інбредну депресію, яка досягає рівня летальності і спричиняє низьку зав’язуваність насіння. Ми пропонуємо два способи вирішення проблеми. По перше, інбридинг від самого початку необхідно проводити в родинах з відносно великою кількістю рослин за рахунок мікроклонування, що дозволить підвищити життєздатність потомства. По друге, для підвищення насінної продуктивності рослин цибулі (у фазу стрілкування суцвіть) обробити 0,04% розчином Нок. Обробка цим же препаратом ліній – запилювачів сприяє синхронізації цвітіння зі стерильною лінією.

При відпрацюванні простих та дешевих способів вирощування гетерозисного насіння міжсортових і міжлінійних гібридів цибулі ріпчастої нами розроблено методику хімічної кастрації квіток для прискореного індукування чоловічої стерильності у материнських ліній. Рекомендовано відомі та нові препарати, їх дози та строки застосування. На новий спосіб одержання гетерозисних гібридів цибулі ріпчастої одержано заявку на патент (№2002010589).

висновки

В дисертації на основі 11-річних досліджень за 1991-2001 рр. наведено теоретичне узагальнення і нове вирішення наукового завдання, яке полягає в розробці біотехнологічних та фізіологічних методів в селекції цибулі ріпчастої шляхом розробки наукових основ одержання гаплоїдів, клонального мікророзмноження, використання калусогенезу, застосування фізіологічно активних речовин для регулювання процесів цвітіння, зав`язування та дозрівання насіння у рослин цибулі ріпчастої, що є суттєвим внеском в селекційну науку і практику. На основі одержаних експериментальних даних можна сформулювати наступні основні наукові результати роботи.

1. Удосконаленими складовими технології лабораторного одержання гаплоїдних рослин цибулі ріпчастої було використання гіногенезу іn vitro, оптимізовано живильне середовище [БДС+БАП (1)+2,4-Д (2) +пролін (100)] для індукції гіногенезу, визначені оптимальні умови культивування матеріалу.

2. Виявлені генотипи з високим рівнем регенерації гіногенних рослин-регенерантів (Золотистий, Алмадон, Халцедон).

3. Для цибулі ріпчастої максимальна регенерація гаплоїдних рослин цибулі (5,6 %) одержана при використанні вирощеного в теплиці матеріалу з бутонів першого ярусу. Встановлено, що доцільно використовувати донори у яких співвідношення між довжиною пиляка і бутона дорівнює 67, що відповідає двохядерній стадії розвитку мікроспор.

4. На основі цитологічних і ДНК-аналізів одержаного гіногенетичного матеріалу, доведено гаплоїдний статус рослин-регенерантів, одержаних з незапліднених зав’язей, і проходження у цих рослин при подальшому культивуванні спонтанної диплодизації. Встановлено найбільш придатні праймери для проведення аналізів ДНК у рослин цибулі ріпчастої.

5. З метою одержання нових селекційно-цінних форм цибулі виявлено оптимальні умови для розмноження методом калусогенезу. Для стабільного індукування кращим донорським органом слід вважати бутон, середовищем для розвитку калусу-К68 (МС+кінетин 1мг/л+ ІОК 0,5).

6. Встановлено, що основним джерелом одержання рослин-регенерантів при використанні калусогенезу є органогенез.

7. Розроблено ефективну лабораторну технологію мікроклонального розмноження вихідного матеріалу для селекції, яка полягає у доборі донорних органів, живильних середовищ та умов культивування матеріалу. Для успішного розмноження селекційно-цінних сортів цибулі ріпчастої Харківська 82, Ткаченківська і Веселка кращим живильним середовищем є БДС з вмістом БАП 4 мг/л, НОЦК-2 мг/л і нового препарату ДККмод-150г/л. Не виявлено істотного впливу генотипу на коефіцієнт регенерації.

8. Визначено, що для мікроклонування мають бути придатні тканини суцвіття цибулі ріпчастої і денця, оскільки ефективність їх використання близька. При цьому оптимальний розмір суцвіть 15-20 мм, цибулини 35-50мм.

9. Визначено, що культивування пробіркового матеріалу цибулі при короткому (10-годинному) дні сприяло інтенсивному формуванню листків, при довгому (16 – годинному) – утворенню цибулинок.

10. Встановлено, що обробка рослин – регенерантів розчинами нових препаратів з групи піридинів – Д-2А, Д-3 і Д-8 сприяє кращій адаптації матеріалу до умов in vivo.

11. За допомогою розробленої технології мікроклонування in vitro розмножено і передано для включення до селекційних програм цінний вихідний матеріал, у тому числі стерильні форми. Підготовлено для передачі до державного сортовипробування новий сорт цибулі Ліра.

12. Для використання у насінництві гетерозисних гібридів F1 цибулі виявлено 10 перспективних гаметоцидів. Встановлено, що перспективними гаметоцидами на цибулі ріпчастій зарекомендували нові препарати ДГ-67а, ДГ-07В, Д-2а, які індукували стерильність на рівні 72-96 %, в той же час серед відомих препаратів найвищу фізіологічну активність показав ГМК, невисока концентрація якого забезпечила стерильність на рівні 69,0-76,7 %. Сполука ХЕФК також була ефективною (стерильність 92,4-96,2 %), але застосування її у високих концентраціях (понад 2,5 %) негативно впливало на зав`язуваність насіння.

13. Встановлено стимулюючу дію на зав`язування насіння цибулі ріпчастої препарату НОЦК у концентрації 0,004 %. До того ж оброблені ним рослини цвіли на 7-10 днів раніше.

14. Для прискореного створення гетерозисних гібридів цибулі ріпчастої запропоновано нові схеми проведення селекційних досліджень, які дозволяють більш ніж у 2 рази скоротити строки одержання інбредних ліній культури.

практичні рекомендації

1. Для прискореного (за 4-6 років) отримання інбредних ліній цибулі ріпчастої пропонується нова селекційна схема на основі гіногенетичного матеріалу, одержаного in vitro.

2. Як генотипи – донори високих показників коефіцієнта гаплоіндукції необхідно використовувати сорти цибулі ріпчастої Золотиста, Халцедон, Алмадон.

3. Вихідний матеріал для індукування гіногенезу доцільно висаджувати в теплицях в декілька строків.

4. З метою одержання стерильних ліній цибулі ріпчастої добір рослин розпочинають за 7-10 днів до початку цвітіння.

5. При розмноженні стерильних форм доцільно використовувати мікроклональне розмноження з меристемних зон суцвіть. При цьому способі розмноження з одного суцвіття можна одержати в середньому до 50 рослин –регенерантів. Донорським органом служить суцвіття з закритою обгорткою діаметром 15-20 мм. Метод мікроклонування in vitro гарантує одержання матеріалу з високою генетичною і морфологічною (95-99 %) вирівняністю, що повністю відповідає сучасним вимогам до оригінального насіння.

6. При розмноженні стерильних форм цибулі ріпчастої і індукування вівапарії пропонується застосування (в фазу стрілкування і в фазу утворення суцвіть) двох обробок фізіологічно активною речовиною ХЕФК (2,5 %).

7. З метою синхронізації цвітіння батьківських рослин-запилювачів і стерильних жіночих ліній рекомендується одноразова обробка перших у фазу стрілкування препаратом НОЦК у концентрації 0,04 %. Для підвищення зав'язування насіння у інцухтовані зразки насінників у фазі стрілкування слід обробити фізіологічно активною речовиною (НОЦК-0,04 % ).

9. При створенні міжсортових і міжлінійних гібридів цибулі ріпчастої, з метою зменшення трудових затрат необхідно замінити ручну кастрацію обробкою новими хімічними стерилянтами – ГМК, ХЕФК, ДГ-07В, ДГ- 67а.

список опублікованих робіт за темою дисертації

1. Лєдовский С.Я, Патрикей Т.В. Використання мікроклонального розмноження в селекції цибулі ріпчастої //Овочівництво і баштанництво. Респуб. міжвід. темат. науковий збірник – К.: Урожай. - 1993. - Вип.38. - С.34-36 (80% авторства, особисто досліджено і узагальнено результати).

2. Патрикей Т.В. Оцінка можливості отримання ембріогенезу в культурі in vitro із зав’язів та пиляків цибулі ріпчастої //Овочівництво і баштанництво. Респуб. міжвід. темат. науковий збірник. – К.: Урожай. - 1995. - Вип.40.-С.33-36.

3. Ледовский С.Я., Ивченко Т.В., Дульнєв П.Г. Подбор эффективних гамето- цидов для применения на луке репчатом //Овочівництво і баштанництво / ІОБ УААН. - Харків, 2001. - Вип.45. - С.30-35 (50% авторства, особисто досліджено і узагальнено результати).

4. Ивченко Т.В. Особенности стабильного размножения in vitro стерильных линий лука репчатого //Овочівництво і баштанництво. - Харків., 2002. - Вип.47. - С.441-445.

5. МПК 7 С08В31/02, А01N57/00, А01N59/00, А01С1/06. Спосіб отримання полімерних матеріалів /Дульнев П.Г., Кондратенко С.І., Чернишенко Т.В., МірошніченкоВ.П., Івченко Т.В., Гончарова С.А. – №2002010237; заявл.09.01.2002 (20% авторства, особисто досліджено і узагальнено результати).

6. Спосіб отримання гетерозисних гібридів цибулі ріпчастої: Заявка на