НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

Інститут клітинної біології та генетичної інженерії

Кравчук Жанна Миколаївна

УДК 632. 938 : 577.15 : 576.32/.36

РОЛЬ АКТИВНИХ ФОРМ КИСНЮ В ІНДУКЦІЇ

ЗАХИСНИХ РЕАКЦІЙ В КУЛЬТУРІ КЛІТИН Allium cepa L.

03.00.11 – цитологія, клітинна біологія, гістологія

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Київ-2003

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана у лабораторії імунітету рослин Інституту клітинної біології та генетичної інженерії НАН України.

Науковий керівник: доктор біологічних наук, професор

Дмитрієв Олександр Петрович,

завідувач лабораторії імунітету рослин Інституту клітинної біології та генетичної інженерії НАН України

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук

Кучук Микола Вікторович,

заст. завідувача відділу генетичної інженерії Інституту клітинної біології та генетичної інженерії НАН України;

доктор біологічних наук

Сарнацька Вереса Василівна,

провідний науковий співробітник відділу

фізіології росту та розвитку рослин

Інституту фізіології рослин та генетики НАН України

Провідна установа: Національний ботанічний сад ім. М.М. Гришка НАН України

Захист відбудеться " 24 " квітня 2003 р. о " 12 " годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д.26.202.01 при Інституті клітинної біології та генетичної інженерії НАН України за адресою: 03143, Київ-143, вул. акад. Заболотного, 148, актовий зал.

З дисертацією можна ознайомитись в бібліотеці Інституту клітинної біології та генетичної інженерії НАН України за адресою: м. Київ, вул. акад. Заболотного, 148.

Автореферат розісланий " 21 " березня 2003 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради, к.б.н. О.А.Кравець

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Широке використання пестицидів, котрі є токсичними і для організмів-не-мішеней, забруднює навколишнє середовище. Їх ефективність нерідко зменшується внаслідок виникнення нових вірулентних рас паразитів (Дмитрієв и др., 2002). Тому в багатьох лабораторіях світу ведуться інтенсивні пошуки альтернативних, екологічно безпечних засобів захисту рослин, що базуються на індукуванні хворобостійкості за рахунок активізації механізмів фітоімунітету. Ці пошуки набули зараз особливої актуальності, оскільки хімічний та інфекційний прес на рослини часто перевищують поріг можливостей їх адаптації до несприятливих екологічних умов (Озерецковская, 2002). Успіх таких пошуків багато в чому залежить від з’ясування молекулярних механізмів, які лежать в основі фітоімунітету.

Рослини здатні відповідати на інфікування індукцією ряду захисних реакцій (Boller, 1994), включаючи синтез низькомолекулярних антибіотичних речовин – фітоалексинів (ФА) (Hammerschmidt, 1999; Дмитриев, 1999), синтез патогензалежних або b-білків, (Hammond-Kosack, Jones, 1996), механічне зміцнення клітинної стінки за рахунок відкладання лігніну та калози (Bolwell, 2000) та ін. Розпізнавання патогена починається зі специфічного зв’язування біогенних еліситорів (метаболітів патогена, які індукують захисні реакції) з рецепторами рослинних клітин, розташованими в плазмалемі (Nurnberger, 1999). Проте яким чином розпізнавання еліситора трансдукується у внутрішньоклітинний сигнал і як цей сигнал вмикає каскад захисних реакцій у рослини практично невідомо.

Останнім часом з’явилися свідчення щодо участі активних форм кисню (АФК) (зокрема супероксидного аніон-радикалу (О2-.) та пероксиду водню (Н2О2)) в індукції окремих захисних реакцій у рослин (Lamb, Dixon, 1997; McDowell, Dangl, 2000). Перевірка гіпотези про роль АФК при розпізнаванні патогена рослиною потребує дослідження шляхів утворення АФК в рослинах, динаміки їх накопичення та сигнальної ролі у запуску захисних реакцій.

Корисною модельною системою для проведення таких експериментів є суспензійна культура клітин цибулі (Allium cepa). Цибуля ріпчаста як об’єкт досліджень викликає інтерес щонайменше з двох причин. По-перше, вона належить до числа однодольних рослин, механізми стійкості яких вивчені значно менше, ніж дводольних. По-друге, відсутність у цибулі сортової моногенної стійкості дозволяє розглядати її як перспективний об’єкт для аналізу механізмів фітоімунітету, пов’язаних з полігенною стійкістю.

В лабораторії імунітету рослин ІКБГІ НАН України було встановлено, що в тканинах A. cepa у відповідь на інфікування синтезуються два ФА – цибуліни 1Д та 2Д (Dmitriev et al., 1990) та відбувається механічне зміцнення клітинної стінки за рахунок відкладання 1,3--глюкана - калози (Дячок, 1995). Використовуючи ці дві різні захисні реакції як маркери індукованої стійкості ми вирішили дослідити роль АФК в трансдукції еліситорного сигналу в клітинах A. cepa.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Наукова робота виконувалася у рамках проекту Державного фонду фундаментальних досліжень України № 5.04/0436 "Молекулярні механізми специфічності розпізнавання сигналів в системі патоген-рослина", згідно цільової програми НАН України "Генетична і клітинна інженерія як основа нової "зеленої революції" в рослинництві" (реєстраційний номер 0102U00263) та пошукової теми ІКБГІ НАН України "Наукове обгрунтування та розробка біотехнологічних підходів для вирішення проблем збільшення продуктивності та адаптаційної здатності рослин” (реєстраційний номер 0101U004109).

Мета і задачі дослідження. Робота присвячена вивченню механізмів утворення АФК в клітинах A. cepa у відповідь на обробку біогенними еліситорами, а також з’ясуванню сигнальної ролі АФК в індукції двох захисних реакції – синтезу ФА та накопичування калози.

Згідно з поставленою метою до задач роботи входило:

1. Отримати культуру клітин A. cepa та з’ясувати умови індукції в ній синтезу ФА та калози.

2. Провести пошук біогенних еліситорів захисних реакцій серед метаболітів фітопатогенного гриба Botrytis cinerea та виділити найбільш активні.

3. Дослідити вплив еліситорів з B. cinerea на динаміку утворення АФК у клітинах A. cepa.

4. З’ясувати можливі джерела та регуляторні механізми утворення АФК при розпізнаванні еліситора клітинами цибулі.

5. Вивчити дію різних речовин - модуляторів “окиснювального вибуху” на індукцію двох захисних реакцій в культурі клітин цибулі.

Об'єкт дослідження – механізми індукції захисних реакцій у клітинах A. cepa.

Предмет дослідження – захисні реакції A. cepa у відповідь на індукування біогенними еліситорами.

Методи дослідження – культури клітин in vitro; цитологічні; біохімічні; біофізичні.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше ідентифіковано індуктори синтезу ФА серед метаболітів фітопатогенного гриба B. cinerea. Виявлені та частково очищені три групи індукторів, які відрізняються за складом, молекулярною масою та біологічною активністю. Встановлена стимуляція утворення АФК (О2-. та Н2О2) у клітинах цибулі, оброблених біогенними еліситорами з B. cinerea. Показано, що при розпізнаванні еліситора джерелом утворення О2-. у клітинах A. cepa є оксидаза з флавопротеїновою субодиницею, а Н2О2 формується внаслідок реакції дисмутації за участю супероксиддисмутази (СОД). Доведена сигнальна роль АФК в трансдукції еліситорного сигналу при активації двох захисних реакцій (синтезу ФА та накопичування калози) в клітинах A. cepa.

Практичне значення одержаних результатів. Одержані препарати біогенних еліситорів, виділених з B. cinerea, можуть бути використані для підвищення хворобостійкості рослин A. cepa. Суспензійна культура клітин цибулі, оброблена біогенними еліситорами, дозволяє отримувати цінні антимікробні речовини – цибуліни 1Д та 2Д, що є перспективним шляхом їх одержання. Результати досліджень сигнальної ролі АФК в індукції захисних реакцій можуть бути використані для розробки альтернативних, екологічно безпечних методів захисту рослин.

Результати роботи і висновки використовуються при читанні курсу лекцій “Молекулярна фітопатологія” на кафедрі фізіології та екології рослин, спеціалізація “клітинна біологія та генетична інженерія” Київського національного університету ім. Тараса Шевченка.

Особистий внесок здобувача. Автором особисто проведені всі основні експерименти і досліди, їх обробка та інтерпретація, аналіз літератури, написання наукових статей. Спільно з науковим керівником проведено вибір об’єкту і напрямку досліджень, обговорення результатів наукової роботи та розробка структури дисертаційної роботи. Викладені у дисертації ідеї, наукові висновки та положення сформульовані автором самостійно.

Апробація результатів дисертації. Результати наукової роботи доповідались на міжнародному симпозіумі "Intracellular Signaling in Plant and Animal Systems" (Київ, 2001), міжнародному симпозіумі "Plants under stress" (Москва, 2001), міжнародному симпозіумі “Signaling systems of plant cells” (Москва, 2001), 21 щорічному зібранні европейської спілки ESNA (Греція, 2001), на щорічному зібранні спілки експериментальних біологів SEB (Великобританія, 2001), міжнародній конференції молодих вчених "Биотехнология – возрождению сельского хозяйства России в ХХІ веке" (Санкт-Петербург, 2001), Міжнародному симпозіумі “Biotechnology approaches for exploitation and preservation of plant resources” (Україна, 2002), 8-му Українському біохімічному з'їзді (Чернівці, 2002), а також на наукових семінарах відділу біофізики та радіобіології ІКБГІ НАН України.

Публікації. Наукові результати опубліковані в 12 друкованих роботах, що включають 8 матеріалів конференцій та 4 статті, виданих у фахових реферованих журналах.

Структура дисертації. Дисертація включає в себе вступ, шість розділів (огляд літератури, матеріали та методи досліджень, результати досліджень та їх обговорення і заключну частину), висновки та список використаних джерел, що містить 304 бібліографічних посилання. Робота викладена на 159 сторінках, містить 2 таблиці і 33 рисунки.

МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ

Отримання калюсної та суспензійної культури A. cepa проводили за стандартними методиками (Калинин, Сарнацкая, 1978).

Еліситори одержували з фітопатогенного гриба B. cinerea (штам №2307), отриманого з Інституту мікробіології та вірусології НАН України. З культурального фільтрату двотижневої культури одержували білкову фракцію шляхом осадження білків сульфатом амонію (10-80%) з наступним очищенням. Цитоплазматичний вміст міцелію гриба виділяли за методом Чалової (1977) у модифікації Перковської (1995). Препарат з клітинних стінок гриба одержували за методом Чалової та ін. (1976). Вміст білка у препаратах еліситорів визначали методом Лоурі (Скоупс, 1992), а вуглеводів - за реакцією з фенол-сірчаною кислотою (Dubois,1975).

В дослідах по індукції захисних реакцій клітини суспензійної культури A. cepa осаджували центрифугуванням (100 g, 5 хв), відмивали і ресуспендували у розчині, який містив 1 мМ СaCl2 (за винятком дослідів з участю ЕГТА, коли Са2+ в середовищі був відсутній), 0,1 мМ KCl, 0,1 мМ MgCl2, 30 г/л сахарози, 1 мМ МЕS, рН 5,6.

Кількість О2-. у клітинах реєстрували хемілюмінесцентним методом (Corbisier et al., 1987) з використанням люцигеніна. Вимірювання інтенсивності люцигенін-залежного хемілюмінесцентного сигналу (ЛЗХЛ) проводили на хемілюменометрі ХЛМ1Ц – 01 (Україна).

Визначення кількості виділеного Н2О2 проводили двома методами: 1) спектрофлуориметричним методом з використанням піраніна (Apostol et al., 1989). Флуоресценцію піраніна в суспензії клітин вимірювали на спектрофлуориметрі СДЛ-2 (Ломо, Росія); довжина хвилі збудження - 405 нм, довжина хвилі вимірів – 512 нм, спектральна ширина щілини 5 нм. 2) спектрофотометричним методом згідно методики Ван Гестелена та ін. (van Gestelen, 1998).

Синтез ФА в суспензії клітин індукували додаванням біогенних еліситорів. Сумарний вміст ФА 1Д та 2Д визначали методом високоефективної рідинної хроматографії (ВЕРХ) на приладі НРС (Чехословаччина) з прямофазною аналітичною колонкою Sepharon SGX в системі гексан-діетиловий ефір (3:1) (Dmitriev et al., 1990). Сумарну кількість ФА 1Д та 2Д розраховували у відносних одиницях на одиницю ваги сирої маси клітин.

Синтез калози індукували додаванням хітозану. Вміст калози в екстракті клітин визначали за флуоресценцією анілінового блакитного (Kohle et al., 1987) і позначали як мкг-екв. пахіману/мг білка.

Вітальність клітин у суспензії визначали мікроскопічно з використанням барвника Еванса блакитного, а також оцінювали кількісно спектрофотометричним методом (Levine et al., 1994).

Статистичну обробку результатів проводили за допомогою комп'ютерної програми "Origin".

РЕЗУЛЬТАТИ ТА ОБГОВОРЕННЯ

1. Отримання культури клітин цибулі in vitro. Для отримання калюсної культури цибулі тестували різні модифікації чотирьох середовищ: Мурасіге і Скуга (MS), Дунстана і Шота (BDS), Гамборга (B5) та N6 (Chu, 1978). Оптимальним для ініціації та росту калюса виявилося середовище BDS з додаванням 3 мг/л 2,4-Д, 0,1 мг/л БАП, 0,5 мг/л НОК, вітамінної суміші згідно Адамсу та ін. (Adams et al., 1989) та 300 мг/л гідролізату казеїну. Калюс являв собою дуже пухку тканину жовтуватого кольору з м'якою консистенцією.

Оскільки дослідження проводили з використанням суспензійної культури клітин, отриманий калюс культивували протягом чотирьох тижнів у рідкому поживному середовищі BDS з додаванням 3 мг/л 2,4-Д та 0,6 мг/л кінетину.

2. Індукція та визначення фітоалексинів у суспензійній культурі клітин A. cepa. Виявилося, що в суспензійній культурі клітин цибулі конститутивно відбувається синтез ФА 1Д та 2Д. Кількість ФА становила 5,2 2,8 відн. од./г. Обробка суспензії клітин біогенними еліситорами стимулювала синтез ФА. Результати дослідження динаміки індукованого синтезу ФА показали, що протягом 14 год після обробки еліситором їх накопичування в культурі клітин не відбувалося. Максимальне формування ФА в суспензії клітин A. cepa, яке становило 46,4 2,5 відн. од./г у випадку використання культурального фільтрату B. сinerea у якості еліситора, спостерігали через 48 год після його додавання. Тому в подальшому кількість синтезованих ФА оцінювали через 48 год після індукції.

Для дослідження механізмів регуляції фітоімунної відповіді важливо аналізувати індукцію різних захисних реакцій. Синтез ФА є одним із компонентів комплексної імунної відповіді у A. cepa. Іншою важливою захисною реакцією на інфікування патогенами є механічне зміцнення клітинних стінок цибулі за рахунок відкладання калози.

3. Індукція та визначення вмісту калози в клітинах суспензійної культури цибулі. В наших експериментах найбільш активним індуктором накопичування калози виявився компонент клітинних стінок грибів і екзоскелету комах – хітозан. Перші вкраплення калози спостерігали вже через 30 хв після додавання еліситора. З часом вміст калози в оброблених еліситором клітинах збільшувався і досягав максимуму через 7 год. Кількість калози, що утворювалась в клітинах A. cepa була прямо пропорційна концентрації хітозану в діапазоні 0,5 – 2 мг/г сирої маси клітин.

4. Аналіз ФА-індукуючої активності метаболітів гриба B. cinerea. В останні роки знайдені метаболіти фітопатогенних грибів, які розпізнаються рослиною-хазяїном і слугують індукторами захисних реакцій, в тому числі ФА (Nurnberger et al., 1999). Ми провели пошук індукторів серед метаболітів фітопатогенного гриба Botrytis cinerea, який є збудником “сірої гнилі” у широкого кола економічно важливих видів рослин. Досліджували культуральний фільтрат (КФ), клітинні стінки та цитоплазматичний вміст міцелію (ЦП) цього гриба.

Результати експериментів показали наявність у КФ та ЦП B. cinerea речовин, які викликають накопичування ФА в суспензії клітин цибулі (табл. 1). Але з'ясування біохімічних механізмів, з допомогою яких зовнішній сигнал (еліситор) регулює експресію захисних генів потребує, перш за все, з’ясування хімічної природи самого еліситору. Тому було проведене виділення еліситорів з КФ та ЦП гриба B. cinerea.

Препарат білкової фракції культурального фільтрату (БФКФ) ефективно індукував синтез ФА в суспензії клітин A. cepa. Індукуюча активність його залежала від концентрації. При обробці клітин цибулі БФКФ еліситором (50 мкг-екв. білка/мл) синтез ФА збільшувався у 10,5 разів порівняно з контролем (див. табл. 1). Проте, при порівнянні цього очищеного препарату з препаратом КФ за умови попереднього вирівнювання їх за концентрацією білка, виявляється, що останній активніший щодо стимуляції синтезу ФА. Імовірно, ФА-індукуюча здатність КФ обумовлена не тільки білковими молекулами, але і його вуглеводною складовою.

При проведенні гель-хроматографії спиртового екстракту ЦП B. cinerea найбільш чітке розділення фракцій досягалось на колонках з сефадексом G-75. На ФА-індукуючу активність перевіряли препарат об’єднаних фракцій вуглеводів (ВФЦП). Як видно з табл. 1 ВФЦП еліситор ефективно стимулював синтез ФА в клітинах A. cepa. Обробка суспензії клітин ВФЦП (10 мкг-екв. глюкози/мл) призводила до збільшення кількості ФА в 4,5 рази. Цей еліситор виявився активнішим щодо індукування синтезу цибулінів 1Д та 2Д порівняно з неочищеним ЦП еліситором.

Таблиця 1

ФА-індукуюча активність різних метаболітів гриба B. cinerea

Еліситор |

Концентрація |

Кількість ФА, відн.од./г

----- |

----- |

5,27 2,81

Культуральний фільтрат (КС)

Білкова фракція культурального фільтрату (БФКФ) | 25 мкг-екв. білка/мл

25 мкг-екв. білка/мл

50 мкг-екв. білка/мл |

46,39 2,51

34,53 2,58

55,56 5,04

Продукти лужного гідролізу частково очищених клітинних стінок (ВФКС) |

50 мкг-екв. глюкози/мл | 58,24 1,27

Цитоплазматичний вміст міцелію (ЦП)

Вуглеводна фракція спиртового екстракту цитоплазми (ВФЦП) |

50 мкг-екв. глюкози/мл

50 мкг-екв. глюкози/мл | 31,36 2,59

47,39 1,57

Лужний екстракт частково очищених клітинних стінок, який містив вуглеводи, (ВФКС) викликав значне накопичування ФА у суспензії клітин цибулі (див. табл. 1). ФА-індукуюча активність його залежала від концентрації.

Одержані дані показують, що серед метаболітів B. cinerea є, принаймі, три групи речовин, які відрізняються за хімічною будовою, але здатні індукувати майже однакову кількість ФА у клітинах A. cepa. Виявилося, що ФА-індукуюча активність вища у ВФКС порівняно з ВФЦП (див. табл. 1). На нашу думку, така різниця пов'язана з системою сприйняття вуглеводів клітинами A. cepa.

Використовуючи еліситори з B. cinerea далі було досліджено індукцію АФК у клітинах A. cepa.

5. Індукція та визначення АФК в клітинах суспензійної культури A. cepa. Результати експериментальної роботи свідчать, що клітини суспензійної культури цибулі реагують на обробку еліситорами з B. cinerea значним збільшенням кількості АФК – О2-. та Н2О2.

Динаміки продукування О2-. та виділення Н2О2 при індукції біогенними еліситорами виявилися подібними. Концентрація АФК починала підвищуватись у перші хвилини після додавання еліситора, виходила на плато через 15-30 хв, досягала другого максимуму до 4 год, а потім зменшувалась (рис. 1, рис. 2). Динаміка утворення АФК була подібною при індукції різними еліситорами з B. cinerea. Вже через 5 хв після додавання БФКФ (50 мкг-екв. білка/мл) та ВФКС (50 мкг-екв. глюкози/мл) еліситорів до суспензії клітин A. cepa, попередньо обробленої інгібітором СОД (діетилдитіокарбаматом натрію (ДДК)), кількість О2-. в клітинах збільшувалась відповідно в 5,6 та 2,3 рази порівняно з контролем (див. рис. 1).

Виділення АФК найбільш інтенсивно індукував БФКФ еліситор. Так, через 4 год після обробки цим препаратом ми фіксували виділення 57,5 3,1 мкМ пероксиду водню/г сирої маси клітин (див. рис. 2). Що стосується біогенних еліситорів з вуглеводним компонентом, то їх активність щодо індукування двох форм активного кисню - супероксидного аніон-радикалу і пероксиду водню, виявилася значно меншою. Для індукції майже однакової кількості виділеного Н2О2 була необхідна більша у 2 рази концентрація ВФКС еліситора порівняно з ВФЦП еліситором (див. рис. 2). Така різниця у АФК-індукуючій активності виділених з B. cinerea еліситорів може бути пов’язана з системами їх розпізнавання клітинами A. cepa, оскільки досліджувані еліситори суттєво різняться за хімічною природою. Отже, результати досліджень показали, що так званий “окиснювальний вибух” у клітинах A. cepa, індукований еліситорами з B. cinereа, складається з двох фаз: перша – швидка, невеликої інтенсивності, яка досягає максимуму через 15 хв, друга – довготривала фаза, що характеризується значною генерацією О2-. та Н2О2. Інтенсивність виділення АФК залежить від природи еліситора та його концентрації.

Виникає питання, яка система відповідає за індуковане продукування АФК. Тому в наступній серії експериментів ми з’ясовували можливі джерела генерації АФК та механізми їх запуску.

6. Трансдукція сигналу для включення механізмів індукованого біогенними еліситорами “окиснювального вибуху” в клітинах A. cepa. Перевіряли дію ряду інгібіторів різноманітних АФК-генеруючих систем на індуковане біогенними еліситорами продукування АФК.

Виявилося, що дифеніленйодоній (ДФО), інгібітор НАДФН-оксидази клітин ссавців, який безпосередньо зв’язує флавопротеїновий компонент цього ферментного комплексу (Cross, Jones, 1986), інгібує індукований сигнал ЛЗХЛ у клітинах A. cepa. Інгібуючий ефект ДФО залежав від концентрації (рис. 3). Аналіз динаміки інгібування НАДФН-оксидази показав, що утворення O2-. зменшувалось, коли ДФО додавали перед обробкою еліситором. Додавання ДФО через 10 хв після обробки еліситором практично не впливало на інтенсивність ЛЗХЛ. Інгібітор оксидазного комплексу пероксидаз - азид натрію (NaN3) у діапазоні його активних концентрацій не змінював інтенсивності генерації О2-. та Н2О2 при обробці БФКФ еліситором клітин цибулі.

Проте результати інгібіторного аналізу слід інтерпретувати із застереженням. ДФО, який ми використали в експериментах для інгібування НАДФН-оксидази, може інгібувати пероксидазу (Frahry, Schopfer, 1998) і NO-синтазу (Bolwell, 1999). У літературі існують відомості про інгібування ним процесу утворення сечової кислоти ксантиноксидазою (Able et al., 2000). Приймаючи до уваги аргументи “за” і “проти” інгібіторного аналізу, ми вважаємо, що ймовірним джерелом утворення супероксидного аніон-радикалу у клітинах A.cepa є оксидаза з флавопротеїновою субодиницею (супероксидсинтаза), яка інгібується ДФО.

Обробка клітин цибулі ДДК, який зв’язує Сu /Zn ізоформи СОД, за 10 хв до додавання еліситора суттєво інгібувала виділення Н2О2 (рис. 4). Інгібітор оксидазного комплексу пероксидази – азид натрію (NaN3) у діапазоні його активних концентрацій не змінював інтенсивності генерації Н2О2 при обробці препаратом БФКФ. Отримані дані про інгібуючий ефект ДДК на індукцію виділення Н2О2 суспензійною культурою клітин цибулі свідчать, що пероксид водню при індукції біотичними еліситорами утворюється шляхом ферментативної дисмутації супероксидних аніон-радикалів за участю СОД.

Для з’ясування регуляторних механізмів продукування АФК було досліджено роль Са2+ в індукції АФК у клітинах A. cepa. Аналізували ефекти від різних сполук, які здатні модулювати концентрацію зовнішньо- і внутрішньоклітинних іонів Ca2+. Зв’язування вільного Ca2+ у середовищі з допомогою ЕГТА призводило до суттєвого зниження продукції O2-. в оброблених еліситором клітинах цибулі (рис. 5). Блокатор потенціал-залежних Ca2+-каналів – верапаміл – також значно інгібував індуковане еліситором утворення O2-.. Додавання верапамілу за 20 хв до обробки еліситором викликало інгібування формування O2-.. Отримані нами дані свідчать, що активність супероксид-генеруючої системи при індукції еліситором залежить від наявності іонів Са2+ у зовнішньоклітинному середовищі і провідності Са2+-каналів.

Оскільки іони Ca2+ впливають на активність специфічних білків у клітині, включаючи кальмодулін (Reddy, 2001), перевіряли роль останнього у запуску

ферментних систем, які продукують АФК. Виявилося, що антагоністи кальмодуліну – трифторпіразин (ТФП) і N-(6-аміногексил)-5-хлор-1-нафтилсульфоаміду гідрохлорид (W-7) - повністю інгібували індуковане еліситором виділення О2-. в клітинах цибулі (див. рис. 5). Таким чином, активність кальмодуліну є необхідним фактором при активації АФК-генеруючої системи в клітинах A. cepa.

Наступним етапом роботи було з’ясування участі важливого вторинного посередника у тваринних клітинах - цАМФ при "включенні" АФК-генеруючої системи. Для цього ми використали дибутирил-цАМФ (ДцАМФ), який, як відомо, є проникним через плазмалему і стійким до дії окиснювачів аналогом цАМФ (Assmann, 1995) та форсколін - активатор аденілатциклази, яка утворює цАМФ (Ichikawa et al., 1997).

Додавання як ДцАМФ, так і форсколіна до суспензії клітин цибулі стимулювало продукування О2-. за відсутності еліситора (рис. 6). ДцАМФ (0,2 мМ) індукував утворення О2-., яке складало 67% від індукованого еліситором, в той час як форсколін (0,1 мМ) – до 73%.

Результати наших експериментів показали, що збільшення внутрішньоклітинної концентрації цАМФ призводить до формування АФК у клітинах A. cepa. Імовірно, цАМФ являється важливим елементом ланцюгу трансдукції сигналу при індукованому утворенні АФК у клітинах цибулі.

Для з’ясування ролі фосфорилування білків при “включенні” супероксид-генеруючої системи у клітинах A. cepa ми досліджували вплив інгібіторів протеїнкіназ і протеїнфосфатаз на процес утворення О2-.. Інгібітор протеїнкіназ, К-252А (Felix et al., 1993), у дослідженому діапазоні концентрацій частково блокував індукований“окиснювальний вибух” у клітинах A. cepa. Специфічний інгібітор протеїнфосфатази 1А - калікулін А (Li et al., 1994) індукував утворення О2-. навіть за відсутності еліситора. У концентрації 2 мМ він підвищував інтенсивність продукування О2-. майже так, як і біогенний еліситор. Таким чином, результати роботи свідчать про важливу роль фосфорилування і дефосфорилування білків при ініціації “окиснювального вибуху” у клітинах цибулі. Отримані дані узгоджуються з гіпотезою, що сигнальні білки постійно фосфорилуються і дефосфорилуються навіть за відсутності стимулів (Felix et al., 1991). У нашому випадку інгібування активності протеїнфосфатази калікуліном А могло бути достатнім, щоб викликати гіперфосфорилування окремих фосфопротеїнів і індукувати утворення АФК.

Отже, функціонування АФК-генеруючої системи у клітинах A. cepa регулюється вторинними посередниками таких сигнальних систем як аденілатциклазна і кальцієва, а також каскадом протеїнкіназ/протеїнфосфатаз.

7. Роль АФК в індукції синтезу ФА та накопичування калози в клітинах суспензійної культури A. cepa. З’ясування ролі АФК при включенні механізмів імунного захисту було розпочато з аналізу ефектів від екзогенних АФК на індукцію синтезу ФА та накопичування калози в клітинах A. cepa.

призводила до стимуляції синтезу ФА та накопичування калози відповідно у 3,7 та 1,2 рази відносно контролю. У поєднанні з ДДК він був здатний підвищувати утворення ФА і калози до рівня 58% і 83% відповідно відносно варіанта з обробкою лише еліситором (див. рис. 7).

Індукція маркерних реакцій КО2 у поєднанні з ДДК залежала від часу додавання останнього. Ефект стимуляції накопичування калози та синтезу ФА спостерігався лише у випадку додавання ДДК за 5 хв до обробки КО2. У досліджених діапазонах концентрацій КО2 і ДДК окремо або ж у комбінації не впливали на вітальність клітин у суспензії.

в клітинах цибулі при обробці 10 мМ Н2О2 дещо перевищувала (в 1,05 рази) таку після обробки клітин оптимальною концентрацією еліситора (див. рис. 8). У концентрації 1 мМ Н2О2 викликав утворення максимальної кількості ФА, яку спостерігали при застосуванні Н2О2 у якості індуктора - 58% від такої після обробки клітин еліситором. Н2О2 у концентрації вище 10 мМ не стимулював синтезу ФА у суспензійній культурі клітин A. cepa.

Отже, результати досліджень показали здатність екзогенних АФК індукувати захисні реакції в клітинах A. cepa.

Далі ми вивчали як впливають на синтез ФА та відкладання калози речовини-модулятори “окиснювального вибуху”. ДДК (1мМ) індукував утворення ФА у клітинах A. cepa, кількість яких становила 41% від такої після обробки еліситором.

Імовірно, лише незначної зміни активності СОД було достатньо для запуску механізмів синтезу цибулінів 1Д та 2Д. Проте ми не виявили впливу ДДК на кількість калози у не обробленому еліситором варіанті (див. рис. 7).

ДДК у поєднанні з еліситором дещо інгібував формування калози та ФА у суспензії клітин цибулі за умови його додавання до обробки еліситором (кількість ФА і калози становила відповідно 68% та 84% від такої при обробці лише еліситором) (табл. 2).

Інгібування “окиснювального вибуху” у клітинах A. cepa інгібітором НАДФН-оксидази клітин ссавців (ДФО) блокувало утворення ФА та калози, не впливаючи на життєдіяльність клітин. У концентрації 50 мкМ ДФO повністю інгібував індукований еліситором синтез ФА та накопичування калози (див. табл. 2).

Було проаналізовано динаміку інгібування ДФО захисних реакцій у клітинах A. cepa. Виявилося, що пригнічення формування калози і ФА відбувається лише в тому випадку, коли ДФО додавали до клітин перед обробкою еліситором. Додавання ж ДФО через 30 хв після обробки суттєво не впливало на індукцію захисних реакцій. Отже, результати експериментальних досліджень підтверджують участь супероксидсинтазної системи у сигнальних механізмах запуску імунних реакцій у клітинах A. cepa. Однак не можна виключати і важливої ролі NO-сигнальної системи в індукції захисних реакцій у клітинах цибулі, оскільки ДФО може інгібувати NO-синтазу (Bolwell, 1999), ключовий фермент цієї сигнальної системи.

Водночас індукція захисних реакцій виявилася не чутливою до відомих інгібіторів пероксидаз – NaN3, що інгібує оксидазну активність та ціаніду калію (КСN), що інгібує пероксидазну активність ферменту (Андреева, 1986). Ці речовини пригнічували індукований синтез ФА у середньому лише на 7 % і 26 % відповідно (див. табл. 2). Отже, механізм індукції досліджуваних захисних реакцій не потребує активності пероксидази.

Фермент детоксикації Н2О2 – каталаза - не проявляв значного ефекту на стимуляцію ситезу ФА біогенними еліситорами з B. cinerea у клітинах суспензійної культури цибулі (див. табл. 2). Проте при активації синтезу калози ситуація була іншою: у концентрації 100 од./мл каталаза інгібувала на 89% відкладання калози на плазмалемі.

Таблиця 2

Вплив обробки модуляторами “окиснювального вибуху” суспензії клітин A. cepa на індукований еліситорами синтез ФА та відкладання калози

Реагент | Фітоалексини | Калоза | - Еліситор | + Еліситор | - Еліситор | + Еліситор | Контроль

ДДК (1mM)

ДФО (50 мкМ)

NaN3 (1мкM)

KCN (5 мкМ)

Каталаза (100 од./мл) | 11,14

41,0

17,76

8,43

12,42

22,61 | 100

53,65

17,59

91,7

86,31

93,45 | 54,57

58,63

61,23

68,57

50,2

59,7 | 100

84,16

59,41

83,33

65,98

78,17 | Примітка.* Результати представлені як відсоток кількості відповідних речовин, які накопичуються в контролі, обробленому лише еліситором.

** Вище зазначені реагенти додавали до суспензії клітин перед обробкою еліситором.

Отже, модуляція різними хімічними сполуками "окиснювального вибуху" у клітинах цибулі призводить до змін у індукованому накопичуванні калози та синтезі ФА. Це свідчить про зв’язок між “окиснювальним вибухом” і індукцією більш пізніх захисних реакцій у клітинах A. cepa. Імовірно, АФК представляють один із елеметів сигнального каскаду. На нашу думку, в трансдукції сигналу патогена в клітинах A. cepa приймає участь супероксидсинтазна сигнальна система.

Результати наших досліджень дали змогу запропонувати схему механізму індукції захисних реакцій, що представлена на рис. 9. Зв’язування еліситора з

гіпотетичним рецептором на плазмалемі призводить до активації в клітині аденілатциклазної і кальцієвої сигнальних систем. Внаслідок наявності іонів Са2+ та подальшої активації протеїнкіназ відбувається збирання комплексу НАДФН-оксидази плазмалеми. Цей комплекс генерує супероксидні аніон-радикали, які за участю СОД дисмутують до Н2О2. Пероксид водню може впливати на функціонування окремих сигнальних систем, зокрема кальцієвої, підсилюючи Са2+-струми всередину клітини і таким чином активуючи калозосинтазу. Внаслідок дифузії Н2О2 проникає у клітину і безпосередньо або опосередковано активує фактори регуляції траскрипції, які включають експресію захисних генів, зокрема генів синтезу ФА.

ВИСНОВКИ

1.

2.

3.

4.

5.

6.

СПИСОК ПРАЦЬ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1.

2.

3.

4.

5.

6.

7.

8.

9.

10.

11.

12.

АНОТАЦІЇ

Кравчук Ж.М. Роль активних форм кисню в індукції захисних реакцій в культурі клітин Allium cepa L. – Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.11 – цитологія та гістологія. – Інститут клітинної біології та генетичної інженерії НАН України, Київ, 2003.

Дисертацію присвячено дослідженню ролі активних форм кисню в індукції двох захисних реакцій в клітинах A. cepa - синтезу фітоалексинів (ФА) та накопичування калози.

У рамках проведення роботи серед метаболітів фітопатогенного гриба Botrytis cinerea знайдені та частково очищені три групи речовин різної молекулярної маси та хімічного складу, які ефективно індукують захисні реакції в клітинах цибулі.

Показано, що в оброблених біогенними еліситорами з B. cinerea клітинах A. cepa відбувається пролонговане збільшення концентрації супероксидного аніон-радикалу (О2-.) та пероксиду водню (Н2О2) за рахунок їх ферментативного продукування. Оксидаза з флавопротеїновою субодиницею (супероксидсинтаза) слугує джерелом генерації О2-. в оброблених еліситором клітинах цибулі, який шляхом ферментативної дисмутації за участю супероксиддисмутази перетворюється в Н2О2. Встановлено, що регуляція супероксидсинтази в клітинах A. cepa здійснюється за участі аденілатциклазної та кальцієвої сигнальних систем.

Доведено, що в індукції синтезу ФА та накопичування калози приймає участь супероксидсинтазна сигнальна система. Запропоновано гіпотетичну схему трансдукції еліситорного сигналу при індукції захисних реакцій у клітинах A. cepa.

Ключові слова: захисні реакції, активні форми кисню, біогенні еліситори, трансдукція сигналу, Allium cepa.

Кравчук Ж.Н. Роль активных форм кислорода в индуцировании защитных реакций в культуре клеток Allium cepa L. – Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.11 – цитология и гистология. – Институт клеточной биологии и генетической инженерии НАН Украины, Киев, 2003.

Диссертация посвящена исследованию роли активных форм кислорода в индукции двух защитных реакций в клетках A. cepa - синтеза фитоалексинов (ФА) и накопления каллозы.

В ходе проведения работы среди метаболитов фитопатогенного гриба Botrytis cinerea найдены и частично очищены три группы веществ разной молекулярной массы и химического состава, которые эффективно индуцируют защитные реакции в клетках лука.

Результаты исследований показали, что в обработанных биогенными элиситорами из B. cinerea клетках A. cepa происходит увеличение концентрации супероксидного анион-радикала (О2-.) и пероксида водорода (Н2О2) - так называемый "окислительный взрыв". Он состоял из двух фаз: первая - быстрая, небольшой интенсивности, которая достигала максимума через 15 мин после добавления элиситора, и вторая - продолжительная фаза, которая характеризовалась значительным формированием О2-. и Н2О2. Интенсивность выделения АФК зависела от природы элиситора и его концентрации. Использование ингибиторов НАДФН-оксидазы (дифенилениодония), пероксидазы (азида натрия и цианида калия) и супероксиддисмутазы (СОД) (диэтилдитиокарбамата натрия) позволило установить, что источником генерирования О2-. является оксидаза с флавопротеиновой субъединицей (супероксидсинтаза), а Н2О2 образуется путем дисмутации О2-. с участием СОД. Регуляция супероксидсинтазы осуществляется при участии кальциевой и аденилатциклазной сигнальной системы.

Доказана сигнальная роль супероксидсинтазной системы в механизме индукции реакций синтеза ФА и накопления каллозы. Так, показана возможность экзогенных источников О2-. (супероксида калия (КО2)) и Н2О2 (раствора пероксида водорода) индуцировать исследуемые защитные реакции в клетках A. cepa. Вещества, которые модулируют концентрацию АФК как за счет ингибирования ферментативных источников образования, так и детоксикации, изменяют интенсивность синтеза ФА и накопления каллозы.

Результаты экспериментальных исследований позволили предложить гипотетическую схему трансдукции элиситорного сигнала при индукции защитных реакций в клетках A. cepa. Связывание элиситора с гипотетическим рецептором на плазмалемме приводит к активации в клетке аденилатциклазной и кальциевой сигнальных систем. Вследствие наличия ионов Са2+ и последующей активации протеинкиназ происходит сборка комплекса НАДФН-оксидазы плазмалеммы. Этот комплекс генерирует супероксидные анион-радикалы, которые дисмутируют до Н2О2. Пероксид водорода может влиять на функционирование определенных сигнальных систем, в частности кальциевой, усиливая приток ионов кальция в клетку и таким образом активируя каллозосинтазу. Вследствие диффузии Н2О2 проникает в клетку и прямо или опосредовано активирует факторы регуляции транскрипции, которые включают експрессию защитных генов.

Ключевые слова: защитные реакции, активные формы кислорода, биогенные элиситоры, трансдукция сигнала, Allium cepa.

Kravchuk Z.N. The role of reactive oxygen species in induction the defense responses in cultured cells of Allium cepa L. – Manuscript.

Thesis for a PhD by speciality 03.00.11 – cytology and histology. – The Institute of Cell Biology and