НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

Інститут мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного

Мороз Оксана Михайлівна

УДК 582.282.23:577.1.15.02.07

ОКИСЛЮВАЛЬНА КОНВЕРСІЯ ЕТАНОЛУ В АЦЕТАЛЬДЕГІД

КЛІТИНАМИ МЕТИЛОТРОФНИХ ДРІЖДЖІВ

03.00.20 – біотехнологія

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Київ - 2003

Дисертацією є рукопис

Робота виконана на кафедрі генетики та біотехнології біологічного факультету Львівського національного універcитету імені Івана Франка Міністерства освіти і науки України

Науковий керівник: доктор біологічних наук, професор Сибірний Андрій Андрійович, Інститут біології клітини НАН України, директор, завідувач відділу молекулярної генетики і біотехнології

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, с.н.с. Курдиш Іван Кирилович, Інститут мікробіології і вірусології ім. Д. К. Заболотного НАН України, завідувач відділу мікробіологічних процесів на твердих поверхнях;

кандидат біологічних наук, доцент Шинкаренко Любов Миколаївна, Національний технічний університет України “КПІ” МОН України, завідувач кафедри промислової біотехнології

Провідна установа: Інститут молекулярної біології і генетики НАН України

Захист відбудеться “19” березня 2003 р. о 1200 годині на засіданні Спеціалізованої вченої ради Д 26.233.01 по захисту докторських дисертацій при Інституті мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України за адресою: 03143, м. Київ, вул. Заболотного, 154.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного за адресою: 03143, м. Київ, вул. Заболотного, 154.

Автореферат розіслано “14” лютого 2003 року

Вчений секретар

Спеціалізованої вченої ради

кандидат біологічних наук, с.н.с. Пуріш Л.М.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Ацетальдегід (оцтовий альдегід) використовується в основному для хімічного синтезу [Hagemeyer, 1991], крім цього застосовується у харчовій промисловості. Як ароматизуючий смаковий додаток ацетальдегід надає присмаку свіжих фруктів чи горіхів багатьом продуктам: сокам, молочним, м’ясним, кондитерським виробам, алкогольним напоям. Він є компонентом ряду розчинних продуктів і приправ (прянощів). Ацетальдегід природного походження для потреб харчової промисловості має ринкову перевагу над синтезованим хімічно. Оскільки тради---ційна природна сировина, яка використовується для одержання оцтового альдегіду (дозрілі фрукти), є дорогою і наявна в обмежених кількостях, альтернативним шляхом його отримання є біотехнологічне виробництво з використанням систем ферментів або клітин мікроорганізмів [Welsh et al., 1989]. Ацетальдегід є інтермедіатом ферментації глюко---зи до етанолу, а також аеробної утилізації етанолу, що може розглядатися як біоконверсія.

В останні роки для біотехнологічного отримання ацетальдегіду запропоновано ряд підходів з використанням систем очищених ферментів. Розроблено ензиматичний процес от---римання ацетальдегіду шляхом окислення екзогенного етанолу, додано---го у апельсинову есенцію, алкогольдегідрогеназою мікробного походження в присутності каталази, НАД+, ФМН та тріс-HCl буферу, рН 8,2 [Raymond, 1984]. Описано процес окислювальної конверсії етанолу в ацетальдегід з використанням очище---них ферментів метилотрофних дріжджів Candida boidinii - алко---гольоксидази і каталази, в умовах вільного доступу повітря [Kierstan, 1982].

З метою отримання ацетальдегіду запропоновано також використання клітин мікроорганізмів. Описано продуку---вання ацетальдегіду мутантними клітинами Zymomonas mobilis з блоком алкогольдегідрогенази під час утилізації глюкози в умовах аерації [Wecker and Zall, 1987; Zall, 1990]. Розроблено процес окислення етанолу в ацетальдегід алкогольдегідрогеназою культивованих у середовищі з етанолом клітин дріжджів Candida utilis при постійному збага---ченні системи повітрям і відокремленні продукту [Armstrong et al., 1984]. Здатність алкогольоксидази окислювати етиловий спирт лежить в основі більшості розроблених процесів біоконверсії етанолу в ацетальдегід інтактними клітинами метилотроф---них дріжджів. Практично повного окислення екзогенного етанолу досягнено при використанні вирощених у середовищі з метанолом клітин Pichia pastoris дикого типу [Murray et al., 1988; Duff and Murray, 1988; Murray et al., 1989], мутанта Candida boidinii з підвищеною активністю алкогольоксида---зи [Sakai and Tani, 1987] та вирощених у середовищі з глюкозою та метанолом клітин регуляторного мутанта C. boidinii з порушеною глюкозною катаболітною репресією і під---вищеною активністю алкогольоксидази [Sakai et al., 1987; Tani and Sawai, 1988].

Незважаючи на суттєві переваги використання клітин метилотрофних дріжджів для конверсії етанолу в оцтовий альдегід, ряд проблем лімітують ефективність процесу. Найперше – це зменшення виходу ацетальдегіду у зв’язку з його подальшим окисленням альдегіддегідрогеназою та відновленням редуктазою aцетальдегіду [Мороз и соавт., 1994]. Очевидно, що найважливішим фактором у визначенні ефективності біоконверсії є активність алкогольоксидази клітин [Sakai et al., 1987; Мороз и соавт., 1994]. Хоча активність алкогольоксидази при утилізації клітинами метанолу є високою, метанол не є найкращим субстратом для отримання клітин для біоконверсії. Вихід біомаси низький, існує потреба культури у постачанні значної кількості кисню, крім того, метанол токсичний і горючий. Ми припустили, що регуляторні мутанти з конститутивною експресією алкогольоксидази у глюкозному середовищі (без індуктора) [Мороз и соавт., 1994; Стасык и соавт., 1997] будуть найзручнішим об’єктом для розробки процесу біоконверсії етанолу в ацетальдегід. При перенесенні інтактних клітин мети---лотрофних дріжджів у реакційне середовище для біотрансформації, вони потрапляють у такі ж умови, як і при перенесенні у ростове середовище з етанолом. Припускали, що створення умов для мінімізації втрати активності алкоголь---оксидази під час біоконверсії на основі розшифрування молекулярних механізмів процесу етанольної катаболітної інактивації матиме важливе значення для підвищення рівня акумуляції ацетальдегіду. Виявлено, що мутації, які приводять до дефектів індукованої етанолом автофагійної деградації алкогольоксидази, сприяють зростанню ефективності біоконверсії завдяки стабілізації активності фермента [Kulachkovsky et al., 1997]. Виходячи з цих даних, було ізольовано мутанти H. polymorpha з високою активністю алкогольоксидази після культивування клітин у середовищі з глюкозою (пошкодження репресії), а також після перенесення пермеабілізованих дигітоніном клітин у реакційну суміш з етанолом та інкубації в присутності інгібітора протеїназ - фенілметилсульфонілфториду (пошкодження інактивації) [Moroz et al., 2000]. Клітини регуляторного мутанта з підвищеною активністю алкогольоксидази виявилися придатними до майже повної (кількісно) конверсії етанолу в оцтовий альдегід в експериментах, проведених у колбах без додаткового постачання киснем.

Зв’язок з науковими програмами, планами, темами. Робота є частиною комплексних тематичних досліджень кафедри генетики і біотехнології біологічного факультету Львівського національного універси---тету імені І. Франка: Бг-436 Б “Розробка методів біотрансформації етанолу в ацетальдегід за допомогою диких і мутантних штамів дріжджів”, Бг-007 Б “Дослідження факторів, що впливають на ефективність біотрансформації спиртів до альдегідів метилотроф---ними дріжджами”, Бг-172 Б “Селекція та вивчення властивостей мутантів метилотрофних дріжджів з порушенням різних етапів ме---таболізму метанолу”, Бг-151 Д “Біохімічне, генетичне та елект---ронномікроскопічне дослідження регуляції біогенезу пероксисом і метаболізму метилового та етилового спиртів у метилотрофних дріжджів”, Бг-007 Б “Мутанти метилотрофних дріжджів з порушен---ням різних етапів метаболізму спиртів та їх біотрансформація до відповідних альдегідів”.

Мета і завдання досліджень. Метою роботи була розробка модельної системи високоефективного біотехнологічного процесу окислювальної конверсії екзогенно---го етанолу в ацетальдегід алкогольоксидазою клітин сконструйованих мутантних штамів H. polymorpha.

Завданням роботи було:

- оцінити роль різних ферментів метаболізму ацетальдегіду для забезпечення ефективної біотрансформації етанолу в оцтовий альдегід клітинами відповідних мутантних штамів H. polymorpha;

- дослідити вплив пошкодження глюкозної катаболітної репресії та підвищення активності алкогольоксидази на нагромадження ацетальдегіду під час біоконверсії;

- розробити новий метод селекції мутантів H. polymorpha – надпродуцентів алкогольоксидази;

- оптимізувати умови проведення процесу окислювальної конверсії етанолу у ацетальдегід;

- вивчити вплив мутацій, які приводять до пошкодження механізму генетичного контролю індукованої етанолом автофагійної деградативної інактивації алкогольоксидази, на ефективність біотрансформації етанолу в оцтовий альдегід клітинами штамів P. methanolica;

- селекціонувати мутанти дріжджів H. polymorpha з блоком етанольної інактивації алкогольоксидази і дослідити ефективність біоконверсії етанолу в ацетальдегід клітинами цих мутантів, а також розробити схему біоконверсії етанолу в оцтовий альдегід клітинами мутанта H. polymorpha з порушеною глюкозною репресією та підвищеною активністю алкогольоксидази, у яких стабілізація активності фермента забезпечувалася б дією хімічних реагентів.

Об’єкт дослідження – алкогольоксидаза дріжджів H. polymorpha, катаболітна регуляція синтезу фермента, деградативна інактивація в процесі пексофагії.

Предмет дослідження – біотрансформація етанолу в оцтовий альдегід клітинами метилотрофних дріжджів.

Методи дослідження. Для з’ясування ролі ферментів метаболізму ацетальдегіду (і їх блоку) у стимуляції ефективності біоконверсії етанолу в ацетальдегід було отримано ряд мутантних штамів метилотрофних дріжджів після мутагенізації клітин УФ-опроміненням і селекції на відповідних середовищах. Активності алкогольоксидази, каталази, алкогольдегідрогенази, редуктаз формальдегіду та ацетальдегіду, формальдегіддегідрогенази, альдегіддегідрогенази, ацетил-КоА синтетази визначали у безклітинних екстрактах або пермеабілізованих дигітоніном клітинах. Концентрацію біомаси визначали фотоколориметричним методом при 540 нм. Концентрацію білка в безклітинних екстрактах визначали за методом Лоурі. Етанольну катаболітну інактивацію ферментів метаболізму метанолу вивчали після визначення активностей алкогольоксидази та каталази інкубованих з етанолом клітин, враховуючи збільшення концентрації клітин під час росту. Біотрансформацію етанолу в ацетальдегід проводили, інкубуючи інтактні або пермеабілізовані дигітоніном клітини з етанолом та тріс-HCl буфером, рН 8,0, або бісульфітом натрію, в окремих експериментах у присутності фенілметилсульфонілфториду, у закритих ватними корками колбах на качалці (200 об./хв) при 30о С або 3о С. Порівняльні експерименти по вивченні ефективності процесу з використанням тріс(гідроксиметил)амінометану та бісульфіту натрію як зв’язуючих ацетальдегід агентів при 30о С проводили як без додаткової аерації, так і в умовах примусової аерації потоком повітря. Ефективність біоконверсії етанолу в ацетальдегід розраховували після вимірювань вмісту ацетальдегіду, який утворився, та етанолу, який залишився у культуральній рідині. Після певних проміжків часу інкубації визначали активність алкогольоксидази клітин. Ультраструктуру клітин дріжджів вивчали з використанням методів трансмісійної електронної мікроскопії. Проводили статистичну обробку результатів.

Наукова новизна. Вперше запропоновано новий метод виділення мутантів метилотрофних дріжджів з підвищеною питомою активністю алкогольоксидази.

Отримано мутанти H. polymorpha з пошкодженням глюкозної катаболітної репресії синтезу ферментів метаболізму метанолу, конститутивним синтезом алко---гольоксидази у середовищі з глюкозою та підвищеною активністю фермента. Завдяки стабілізації активності алкогольоксидази у присутності етанолу в оптимальних умовах без додаткової аерації киснем досягнено максимальної ефективності біоконверсії етанолу в ацетальдегід (96,4%) клітинами мутанта 7-4А. Використання клітин такого спеціально сконструйованого мутанта метилотрофних дріжджів в якості біокаталізатора конверсії етанолу в ацетальдегід запропоновано вперше.

Оптимізовано умови проведення процесу. Вперше пропонується використання для біоконверсії етанолу у оцтовий альдегід попередньо пермеабілізованих дигітоніном клітин, а також додавання до інкубаційної суміші одночасно з етанолом інгібітора вакуолярних протеїназ - фенілметилсульфонілфториду.

Практичне значення одержаних результатів. Вперше запропоновано метод виділення мутантів метилотрофних дріжджів з підвищеною активністю промислово-важливого фермента алкогольоксидази. Метод базується на відборі колоній з вищою, ніж у вихідного штаму, активністю алкогольоксидази за наявності у реакційній суміші для якісного визначення активності фермента специфічного інгібітора алкогольоксидази – азиду натрію.

Інтактні клітини мутанта метилотрофних дріжджів 7-4А з порушеною глюкозною катаболітною репресією, конститутивним синтезом алкогольоксидази в середовищі з глюкозою та підвищеною активніс---тю фермента можуть бу---ти рекомендовані для їх використання одноразово і повторно у циклічних процесах конверсії етанолу в ацетальдегі---д.

Клітини штаму 7-4А можуть застосовуватися для біоконверсії етанолу безпосередньо зі спиртової бражки в ацетальдегід з економією витрат, пов’язаних з перегонкою етанолу та його виділенням у вигляді чистого продукту. На першому етапі етанол утворюється в результаті ферментації глюкози дріжджами Saccharomyces cerevisiae. Другий етап полягає у перенесенні бражки у інший реактор, де етанол окислюється до ацетальдегіду клітинами H. polymorpha. Завдяки низькій температурі кипіння ацетальдегіду (20,8о С), він швидко випаровується і може бути виділений в очищеній формі.

Особистий внесок здобувача. Здобувач є безпосереднім виконавцем всієї експериментальної роботи. Самостійними є вибір методів дослідження, проведення експериментів та отримання експериментальних даних. Автором самостійно опрацьовано значний об’єм вітчизняної та закордонної літератури по темі виконуваних наукових експериментів. Розробка робочих гіпотез, планування дослідів, пошук нових методів, аналіз, інтерпретація і узагальнення результатів експериментів здійснювались спільно з науковим керівником, д.б.н., професором А.А. Сибірним. Розробка методик та перерахунків (зокрема ефективності біоконверсії етанолу до ацетальдегіду) проводилася у співробітництві із д.б.н., с.н.с., професором М.В. Гончаром. Електронномікроскопічні дослідження ультраструктури клітин, а також конструювання обладнання для експериментів по біоконверсії етанолу в ацетальдегід в умовах прямої аерації потоком повітря було проведено у співпраці з к.б.н., с.н.с. О.Р. Кулачковським.

Апробація результатів дисертації. Апробація роботи відбулася на засіданні кафедри генетики та біотехнології біологічного факультету Львівського державного університету імені І. Франка у лютому 1997 року, на міжкафедральному семінарі кафедр генетики та біотехнології, мікробіології і біохімії біологічного факультету Львівського національного університету імені І. Франка у грудні 2001 року, а також на розширеному семінарі відділів молекулярної генетики і біотехнології та регуляторних систем клітини Інституту біології клітини НАН України у жовтні 2002 року. Основні положення дисертації доповідалися на 16-й Міжнародній конференції по дріжджах у Від---ні (Австрія), 8-му Міжнародному симпозіумі по дріжджах у Атлан---ті (США), Міжнародній конференції по генетиці і молекулярній біології неконвенційних дріжджів у Базелі (Швейцарія) у 1992 ро---ці, І Установчому з’їзді Українського мікробіологічного това---риства у Одесі у 1993 році, на 7-му Міжнародному симпозіумі з генетики промислових мікроорганізмів у Монреалі (Канада) у 1994 році, 7-му Европейському конгресі по біотехнології в Ніцці (Франція) у 1995 році, на звітних наукових конференціях молодих вчених біологічного факультету ЛНУ імені І. Франка у 1996-1998 роках та 2002 році, на 1-й Всесвітній конференції по Hansenula polymorpha у Дюссельдорфі (Німеччина), 10-му Міжнародному симпозіумі по дріжджах у Арнхемі (Голандія), 3-му INTAS міждисциплінарному симпозіумі по загальній біохімії, біотехнології і екології у Москві (Росія) у 2000 році, 21-му міжнародному спеціалізованому симпозіумі по дріжджах “Біохімія, генетика, біотехнологія і екологія неконвенційних дріжджів” у Львові у 2001 році.

Публікації. Основні результати досліджень викладені у 16 друкованих працях, в тому числі у 6 статтях та 10 тезах конференцій.

Структура дисертації. Робота складається з вступу, огляду літератури, розділу з описом матеріалів і методів, розділу з викладом експериментальних досліджень і їх обговоренням, висновків, списку використаних джерел та додатку. Повний обсяг дисертації складає 127 сторінок. Робота ілюстрована 18 таблицями і 35 рисунками. Список використаних літературних джерел складається із 357 найменувань.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ

Огляд літератури. Наводяться дані про використання ацетальдегіду і його синтез в хімічній індустрії. Висвітлено основні принципи розроблених процесів біотехнологічного виробництва ацетальдегіду з використанням ферментів та клітин мікроорганізмів. Детально охарактеризовано метилотрофні дріжджі як біотехнологічний об’єкт, специфічні шляхи метаболізму вуглецевих сполук та способи регуляції ферментів метаболізму метанолу, розглянуто функції, механізми біогенезу та деградації мікротілець у метилотрофних дріжджів.

Матеріали і методи. В роботі використовували наступні штами метилотрофних дріжджів Hansenula polymorpha: 356 (leu2), 22 (leu10), LR9 (ura3) – дикого типу; мутантні штами - А3 (fdr adr adh) [Сибирный и соавт., 1990]; А3-16 (fdr adr adh ald) [Мороз и соавт., 1994]; 33 (leu10 gcr1) [Мороз и соавт., 1994; Kulachkovsky et al., 1998]; K-105 (gcr1 catX) [Gonchar et al., 1998; Гончар, 1998]; S-47 (gcr1 catX) [Мороз и соавт., 1994]; 356-83 (fld) [Sibirny et al., 1990]; 33-7 (gcr1), 33-7A (gcr1), 7-4A (gcr1 EAO) [Мороз и соавт., 1994; Moroz et al., 2000]; 33-7-62 (gcr1 adr adh), 33-7-30 (gcr1 adr adh); мутанти з пошкодженою етанольною інактивацією алкогольоксидази: 7-4А’ (gcr1 EAO) та 7-4AF33 (gcr1 EAO acs) [Moroz et al., 2000]. Дослідження проводились також із штамами метилотрофних дріжджів Pichia methanolica: МН4 – дикого типу; мутантними штамами – 2230 (arg1 acs1), 2468 (arg1 acs2), 2480 (ade2 acs3), 798 (ade2 his1 his4 icl1), 2113 (arg1 ade2 mdd1), 2094 (arg1 ade2 pck1) [Tolstorukov et al., 1989; Kulachkovsky et al., 1997; Kulachkovsky et al., 1998].

Дріжджі зберігали при 4о - 6о С на скошеному агарі з повним середовищем, приготованим на основі пивного сусла. Умови культивування дріжджів і склад середовищ описано [Sibirny et al., 1987; Sibirny, 1996]. В якості джерела вітамінів та мікроелементів використовували дріжджовий екстракт (0,5 або 1,0 г/л). Концентрація джерел вуглецю (сахарози, глюкози, гліцерину, етанолу, ацетату, метанолу і ін.) у ростовому середовищі, якщо не вказано інакше, становила 1%.

Мутації індукували УФ-світлом. Використовували дозу опромінення, яка забезпечувала 10% виживання клітин. Відбір мутантів проводили за методами позитивної чи негативної селекції, у окремих випадках на основі скринінгу забарвлених у бурий колір колоній після якісного визначення активності алкогольоксидази безпосередньо на чашках за методом [Сибирный и Титоренко, 1986] або за модифікованим нами методом [Moroz et al., 2000]. Аналізували щонайменше 10 – 20 тис. колоній.

Активності алкогольоксидази [Sibirny et al., 1987], каталази [Luck, 1963], алкогольдегідрогенази [Racker, 1955], формальдегідредуктази [Сибирный и соавт., 1990], формальдегіддегідрогенази [Schutte et al., 1976], альдегіддегідрогенази [Jacobson and Bernovsky, 1974], ацетил-КоА синтетази [Klein and Jahuke, 1968] визначали у пермеабілізованих дигітоніном клітинах [Сибирный и Шавловский, 1981] або у безклітинних екстрактах [Сибирный и соавт., 1990; Сибирный и соавт., 1987]. Активність редуктази ацетальдегіду визначали у ідентичних умовах, як і редуктази формальдегіду, використовуючи замість формальдегіду ацетальдегід як субстрат [Мороз и соавт., 1994]. Питому активність ферментів виражали у Од/мг клітин або білка.

Концентрацію білка у безклітинних екстрактах визначали за методом [Lowry et al., 1951]. Концентрацію клітин визначали фотоколориметричним методом при 540 нм.

Етанольну катаболітну інактивацію ферментів метаболізму метанолу вивчали, аналізуючи активності алкогольоксидази і каталази (з врахуванням збільшення концентрації біомаси під час росту) клітин, інкубованих з етанолом (контроль – середовище без джерела вуглецю, з сорбітолом чи 2-дезокси-D-глюкозою) [Kulachkovsky et al., 1997].

Для біоконверсії етилового спирту в ацетальдегід інтактні (пермеабілізовані дигітоніном) клітини інкубували з етанолом (у окремих експериментах у присутності фенілметилсульфонілфториду як інгібітора протеїназ) у тріс-HCl буфері, рН 8,0, або розчині NaHSO3 при 30о С або 3о С на качалці (200 об./хв) у закритих ватними корками колбах без примусової аерації киснем [Мороз и соавт., 1994; Moroz et al., 2000]. При вивченні можливості використання клітин у циклічному процесі біотрансформації після певних проміжків часу клітини відмивали і переносили у свіжу інкубаційну суміш з етанолом та тріс-HCl буфером, рН 8,0. Після кожного циклу визначали процент виживання клітин висівом їх (у розрахунку 100 колоній на чашку) на агаризоване середовище з глюкозою [Moroz et al., 2000]. З метою порівняння рівнів зв’язування утвореного під час біоконверсії ацетальдегіду тріс(гідроксиметил)амінометаном та бісульфітом натрію суспензію клітин та етанол інкубували у герметично закритих колбах в умовах прямої аерації потоком повітря при 30о С. Ацетальдегід відокремлювали з культуральної рідини пропусканням випаровуваного газового потоку через ідентичної концентрації розчини зв’язуючих агентів, що містилися у двох послідовно з’єднаних пробірках як описано [Zall, 1990]. Після певних проміжків часу проби відбирали, клітини від культуральної рідини відокремлювали центрифугуванням для визначення активності алкогольоксидази. З комплексу з трісом або зі складу бісульфітної сполуки зв’язаний ацетальдегід вивільняли (для визначення концентрації) як описано [Murray et al., 1989; Мороз и соавт., 1994; Kulachkovsky et al., 1997; Moroz et al., 2000] та [Zall, 1990], відповідно. У культуральній рідині визначали вміст ацетальдегіду, який утворився, у реакції з використанням 3-метил-2-бензотіазолінон-гідразону [Paz et al., 1965], етанолу, який залишився після інкубації [Гончар і співавт., 1991], ацетату [Acetic acid, 1987] та перекису водню [Гончар, 1998]. Розрахунок ефективності біоконверсії (в мольних процентах) вели як з врахуванням випаровування ацетальдегіду і етанолу в процесі конверсії, так і без [Мороз и соавт., 1994; Kulachkovsky et al., 1997; Moroz et al., 2000]. Біоконверсію метанолу у формальдегід проводили в ідентичних умовах, як описано для експериментів по біоконверсії етанолу в ацетальдегід. Інтактні клітини інкубували з метанолом у калій-фосфатному буфері, рН 7,5, при 30о С на качалці (200 об./хв). Після певного часу інкубації визначали активність алкогольоксидази клітин. У культуральній рідині визначали вміст формальдегіду за методом [Nash, 1953]. Ефективність біоконверсії метанолу у формальдегід розраховували без врахування втрат через випаровування летких сполук ідентично, як описано для розрахунку ефективності біоконверсії етанолу в ацетальдегід без врахування випаровування [Мороз и соавт., 1994].

Електронномікроскопічні дослідження ультраструктури клітин проводили як описано [Reynolds, 1963; Сибирный и соавт., 1996; Kulachkovsky et al., 1997; Kulachkovsky et al., 1998]. Ультратонкі зрізи отримували на ультрамікротомі УМТП-6. Перегляд і фотографування зразків проводили на електронних трансмісійних мікроскопах УЕМВ-100Б і ПЕМ-100 при прискорюючій напрузі 75 кВ.

Для всіх експериментів проведено статистичну обробку результатів [Деркач і співавт., 1974; Деркач і співавт., 1977; Иванов и Погорелюк, 1990].

Результати і їх обговорення.

Оцінка ролі мутацій, які впливають на метаболізм ацетальдегіду, у стимуляції ефективності біоконверсії етилового спирту в ацетальдегід клітинами мутантних штамів метилотрофних дріжджів Hansenula polymorpha.

З’ясовано вплив мутацій, які обмежують метаболізм ацетальдегіду, а також порушують регуляцію синтезу алкогольоксидази (пошкодження глюкозної катаболітної репресії), на ефективність біотрансформації 0,217М (1%) етанолу в ацетальдегід при 30о С клітинами відповідних мутантних штамів H. polymorpha (рис. 1).

Використання для біоконверсії етанолу в ацетальдегід вирощених у середовищі з метанолом клітин мутантів А3 з відсутньою активністю редуктази ацетальдегіду та А3-16 з подвійним генетичним блоком редуктази ацетальдегіду і альдегіддегідрогенази сприяє підвищенню ефективності процесу на 23,1% і 55,9%, відповідно, порівняно з використанням для біотрансформації клітин штаму дикого типу 356. Ефективність біоконверсії з врахуванням втрат через випаровування летких сполук (Y) штамів А3, А3-16 та 356 становила 39,1%, 49,5% та 31,8%, відповідно.

Формальдегіддегідрогеназа не бере участі у метаболізмі ацетальдегіду у H. рolymorpha. Ефективність біоконверсії етанолу в ацетальдегід не відрізнялася при використанні клітин мутанта 356-83 з відсутньою формальдегіддегідрогеназою та штаму дикого типу (Y виявилася рівною 33,9% та 31,8%, відповідно). Відсутність формальдегіддегідрогенази у мутанта 356-83 була причиною підвищення рівня нагромадження формальдегіду при інкубації його клітин з метанолом майже втричі у порівнянні з клітинами штаму дикого типу.

Пошкодження глюкозної катаболітної репресії синтезу алкогольоксидази у мутантів 33 і S-47 стимулювало нагромадження при інкубації з етанолом їх клітинами, вирощеними у середовищі з глюкозою, підвищених кількостей ацетальдегіду у порівнянні із штамом дикого типу. Ефективність біотрансформації етанолу в ацетальдегід клітинами штаму S-47 з генетичним блоком каталази виявилася нижчою, порівняно з використанням клітин каталазо-вмісного штаму 33 (Y дорівнювала 44,2% і 51,8%, відповідно).

Використані для окислювальної конверсії етанолу в ацетальдегід клітини штаму 33 з активністю лише алкогольдегідрогенази (при відсутності активності алкогольоксидази) виявилися практично не здатними до нагромадження ацетальдегіду. Унікальною властивістю мутанта 33 (gcr1) з пошкодженою глюкозною катаболітною репресією і конститутивним синтезом алкогольоксидази у середовищі з глюкозою без індуктора (метанол) виявилася вища активність фермента у клітин, культивованих у середовищі з глюкозою, ніж з метанолом. Клітини, вирощені у середовищі з глюкозою, при інкубації їх з етанолом нагромаджували більше ацетальдегіду не лише у порівнянні з клітинами, вирощеними у середовищі з етанолом, але і метанолом (табл. 1). Таким чином, вирішальним фактором у визначенні ефективності конверсії етанолу в ацетальдегід виявилася активність алкогольоксидази клітин.

Найбільш ефективно біоконверсія етанолу в ацетальдегід відбувалася при використанні вирощених у середовищі з глюкозою клітин мутантів 33 (gcr1) та 33-7 (gcr1) (Y дорівнювала 51,8% та 64,3%, відповідно). Підвищення у 1,9 рази, порівняно із штамом 33, активності алкогольоксидази у мутанта 33-7 стимулювало зростання ефективності біоконверсії на 102,5%, порівняно із процесом, де використано клітини штаму дикого типу. Введення у штам 33-7 мутацій, які приводять до обмеження метаболізму ацетальдегіду (блоку алкогольдегідрогенази/редуктази ацетальдегіду), виявилося недоцільним.

Розроблено новий метод якісного визначення активності алкогольоксидази у колоніях дріжджів [Сибирный и Титоренко, 1986] для отримання мутантів з підвищеною активністю фермента. Для виявлення різниці між рівнями активності алкогольоксидази клонів, до агаризованої реакційної суміші додавали NaN3 [Moroz et al., 2000]. Дана сполука має здатність до стехіометричного (1:1) зв’язування з ФАД алкогольоксидази [Hopkins and Muller, 1987]. Властивість азиду натрію інактивувати фермент дозволяє титрувати алкогольоксидазу у реакційній суміші додаванням NaN3. В результаті повторного послідовного мутагенезу опроміненням УФ-світлом клітин штаму 33-7 (gcr1) та його похідних отримано мутанти 33-7А (gcr1) з активністю алкогольоксидази 5,71 Од/мг білка і 7-4А (gcr1 EAO) з активністю фермента 6,83 Од/мг білка (у 3,3 рази вищою, ніж у вихідного штаму 33). У кожному кроці селекції використовували зростаючі концентрації (2 – 8мМ) NaN3 у агаризованій реакційній суміші для якісного визначення алкогольоксидази.

При порівнянні ефективності біоконверсії етанолу в ацетальдегід клітинами штамів 33, 33-7 та 33-7А (рис. 2А) виявилося, що її зростання відбувається (як при 30о С, так і при 3о С) внаслідок підвищення питомої активності алкогольоксидази у штамів. Суттєвим фактором підвищення ефективності біоконверсії етанолу в ацетальдегід також є забезпечення мінімальної втрати активності алкогольоксидази протягом інкубації клітин, зокрема при зниженні температури (3о С) (рис. 2Б). Незначне падіння ферментативної активності алкогольоксидази у присутності етанолу при 3о С спостерігається завдяки різкій психротолерантності фермента і, можливо, інгібуванню активності вакуолярних протеїназ.

Максимальну активність алкогольоксидази виявлено у клітин штаму 7-4А, вирощених до середини експоненційної фази росту (36-48 годин) у середовищі з 55,5 мМ (1%) глюкозою (рис. 3). В результаті використання методів трансмісійної електронної мікроскопії у вирощених у середовищі з глюкозою клітинах мутанта 7-4А виявлено численні пероксисоми (блок глюкозної репресії біогенезу мікротілець даного типу), формування яких є характерним для клітин штаму 356 лише при метилотрофному рості (рис. 4).

Підбір умов культивування клітин регуляторного мутанта H. рolymorpha 7-4А з підвищеною активністю алкогольоксидази для отримання високого виходу біомаси.

Вихід біомаси у стаціонарній фазі росту під час утилізації клітинами штаму 7-4А глюкози, порівняно з іншими перевіреними джерелами вуглецю (сахароза (2,0 г/л); етанол (1,7 г/л); глюкоза плюс лейцин (1,4 г/л)), виявився найнижчим (1,1 г/л).

Інкубація у середовищі з глюкозою (з додаванням 1,0 г/л дріжджового екстракту) вирощених у середовищі з етанолом і сконцентрованих до густини вихідної біомаси 3,0 г/л інтактних клітин штаму 7-4А дозволяє вже за 40-50 год отримати клітини з максимальною (1,5 Од/мг клітин) питомою активністю алкогольоксидази і досягнути виходу біомаси (3,9 г/л) у 3,5 рази вищого, ніж при звичайному вирощуванні клітин у середовищі з глюкозою до стаціонарної фази росту (рис. 5).

Оптимізація умов проведення біоконверсії етанолу в ацетальдегід клітинами штаму 7-4А.

Оптимізовано умови проведення біоконверсії етанолу в ацетальдегід клітинами штаму 7-4А. Ефективність зв’язування тріс-HCl буфером, рН 8,0, використаним у концентраціях 1 М і 3 М, утвореного під час біоконверсії (2,5 год) ацетальдегіду при 30о С (етанол – 0,217 М (1%) ) виявилася майже однаковою (Y = 79,3% і 78,2%, відповідно), хоча активність алкогольоксидази залишалася вищою у клітин, які інкубувалися у присутності 1 М буферу (рис. 6). В результаті вивчення впливу зростання концентрації тріс-HCl буферу, рН 8,0, в діапазоні від 0,1 М до 1 М на стимуляцію ефективності біоконверсії 0,217 М (1%) етанолу в ацетальдегід при 30о С виявлено, що ефективність процесу (Y) із застосуванням 1 М буферу є найвищою і становить 81,7 + 1,3% після 24 год інкубації клітин. Підвищення ефективності біотрансформації при використанні 2 М і 3 М буферу, порівняно з використанням 1 М буферу, виявлено не було (рис. 7А). Після інкубації протягом 24 год у 2 М і 3 М буфері у клітин виявлено значно нижчу активність алкогольоксидази, ніж після інкубації у тріс-HCl буфері в діапапазоні концентрацій від 0,1 М до 1 М (рис. 7Б). Ефективність біоконверсії 0,217М (1%) етанолу у ацетальдегід виявилася приблизно такою ж, як і 0,435М (2%) етанолу (Y = 79,3% і 72,1%, відповідно) після інкубації клітин у 1 М тріс-HCl буфері протягом 2,5 год при 30о С (рис. 8А). Ефективність біоконверсії 2,173 М (10%) етанолу у ацетальдегід значно нижча, ніж 0,217 М (1%) етанолу після 2,5 год інкубації клітин у 3 М тріс-HCl буфері при 30о С (рис. 8Б). Хоча за 24 год інкубації клітин штаму 7-4А з 2,173 М (10%) етанолом та 3 М тріс-HCl буфером при 3о С нагромаджувалося 1,85 М ацетальдегіду, використання таких високих концентрацій субстрату як 2,173 М (10%) етанол і тріс(гідроксиметил)амінометанового буферу, рН 8,0, - 3 М, не сприяє підвищенню ефективності процесу біоконверсії. Отже, встановлено доцільність використання тріс-HCl буферу, рН 8,0, у концентрації 1 М для досягнення найбільш повного окислення 0,217М (1%) етилового спирту у оцтовий альдегід клітинами мутанта 7-4А.

Інтактні клітини (15 г/л [Duff and Murray, 1988; Duff et al., 1989]) штаму 7-4А успішно можуть бути використані у циклічних процесах біотрансформації етанолу в ацетальдегід при дотриманні оптимальних умов (табл. 2). Стимуляція ефективності біоконверсії етанолу в ацетальдегід спостерігалася при зниженні температури до 3о С.

Клітини штаму 7-4А можуть бути використані для біоконверсії при 30о С етанолу безпосередньо зі спиртової бражки в ацетальдегід. За 24 год інкубації клітини конвертували 55,9% 1,871М етанолу нефільтрованої бражки у ацетальдегід (ефективність біоконверсії (Y) 1,871 М розчину дистильованого етанолу в ацетальдегід становила 56,4% після 24 год інкубації клітин у ідентичних умовах).

Ефективність біоконверсії 0,217 М (1%) етанолу в ацетальдегід при 30о С клітинами штаму 7-4А з використанням 1 М тріс(гідроксиметил)амінометану як зв’язуючого ацетальдегід агента в умовах прямої аерації потоком повітря (6,5 см3/хв) та аерації, забезпечуваній струшуванням на качалці (200 об./хв), виявилася значно вищою, ніж при застосуванні 1 М розчину бісульфіту натрію, незалежно від способів аерації інкубаційної суміші. Рівень зв’язування ацетальдегіду в складі випаровуваного газового потоку розчином NaHSO3 виявився на 39,2% нижчим, ніж тріс(гідроксиметил)амінометаном в умовах примусової аерації повітрям.

Клітини мутантів метилотрофних дріжджів Pichia methanolica з блоком інактивації етанолом пероксисомних ферментів як біоконвертори етанолу в ацетальдегід.

З метою з’ясування впливу мутацій, які пошкоджують індуковану етанолом деградативну інактивацію алкогольоксидази, на акумуляцію ацетальдегіду під час конверсії з етанолу було використано клітини мутантів P. methanolica з відсутніми активностями ацетил-КоА синтетази та ізоцитратліази [Tolstorukov et al., 1989].

Незначна втрата питомої активності алкогольоксидази і каталази (залишкова активність становила понад 23,2% і 58,7%, відповідно) протягом 24 год інкубації вирощених у середовищі з метанолом клітин мутантів у середовищі з етанолом (1%) свідчить про пошкодження у них етанольної катаболітної інактивації ферментів метаболізму метанолу [Kulachkovsky et al., 1997]. Відомо, що 2-дезокси-D-глюкоза і сорбітол не викликають інактивації пероксисомних ферментів [Veenhuis et al., 1983; Cregg, 1987]. Значне та практично однакове сповільнення падіння питомої активності алкогольоксидази при інкубації вирощених у середовищі з метанолом клітин мутантів acs1-3 та icl1 у середовищах з етанолом, без джерела вуглецю, з 2-дезокси-D-глюкозою і сорбітолом свідчить про повне пошкодження у них катаболітної інактивації фермента, індукованої етанолом. В результаті електронномікроскопічних досліджень ультраструктури вирощених у середовищі з метанолом і інкубованих у присутності етилового спирту клітин мутантів acs1, acs2, acs3 та icl1, у них виявлено пошкодження індукованої етанолом автофагійної деградації пероксисом (макропексофагії) [Kulachkovsky, 1997].

Використання для біотрансформації етанолу в ацетальдегід при 30о С вирощених у середовищі з метанолом клітин мутантів P. methanolica acs1-3 та icl1 сприяло підвищенню ефективності процесу завдяки стабілізації активності фермента-каталізатора (рис. 9, А і Б).

Вплив пошкодження етанольної катаболітної інактивації алкогольоксидази на ефективність біоконверсії етанолу в оцтовий альдегід клітинами дріжджів H. polymorpha.

Недивлячись на позитивний вплив на ефективність біоконверсії 0,217М (1%) етанолу в оцтовий альдегід при 30о С мутацій, які приводили до порушення індукованої етанолом деградативної інактивації алкогольоксидази, у мутантів H. polymorpha 7-4AF33 і 7-4A’, похідних штаму 7-4А, їх фенотип виявився нестабільним.

На основі розшифрування молекулярних механізмів селективної автофагії пероксисом розроблено схему біоконверсії етанолу в оцтовий альдегід клітинами штаму 7-4А, у яких стабілізації активності алкогольоксидази в присутності етанолу (в результаті пошкодження або сповільнення інактивації фермента) досягнуто завдяки дії хімічних реагентів. Попередня пермеабілізація клітин після інкубації з дигітоніном та специфічний вплив на внутрішньоклітинні процеси доданого до реакційної суміші для біоконверсії одночасно з етанолом інгібітора вакуолярних протеїназ – фенілметилсульфонілфториду, дозволили додатково підвищити ефективність процесу при 30о С. В оптимальних умовах пермеабілізовані дигітоніном у присутності фенілметилсульфонілфториду клітини мутанта 7-4А за 24 год при 30о С конвертували 96,4% етилового спирту в ацетальдегід (рис. 10).

ВИСНОВКИ

У дисертації приведене теоретичне узагальнення і нове вирішення науково-практичної задачі продукування оцтового альдегіду, що виявляється в розробці модельної системи високоефективного біотехнологічного процесу окислювальної конверсії екзогенного етанолу в ацетальдегід алкогольоксидазою клітин регуляторного мутанта H. polymorpha, вирощених у середовищі з глюкозою. Досягнуто майже повного (96,4%) окислення етанолу в оцтовий альдегід (при 30о С в оптимальних умовах) під час інкубації клітин дріжджів у колбах на круговій качалці (200 об./хв) без додаткового постачання киснем.

1. Виявлено позитивний вплив мутацій, які блокують активності редуктази ацетальдегіду та альдегіддегідрогенази, на ефективність біоконверсії етанолу в оцтовий альдегід інтактними клітинами мутантних штамів H. polymorpha. Не сприяє підвищенню ефективності біоконверсії використання мутантів з відсутніми активностями формальдегіддегідрогенази та каталази. Алкогольдегідрогеназа (на відміну від алкогольоксидази) не забезпечувала ефективну біотрансформацію етанолу в оцтовий альдегід. Найвища ефективність процесу спостерігалася при використанні клітин мутанта H. polymorpha 33-7 з пошкодженою глюкозною катаболітною репресією синтезу ферментів метаболізму метанолу, конститутивним синтезом алкогольоксидази під час утилізації глюкози і підвищеною активністю фермента.

2. Розроблено новий метод отримання мутантів з підвищеною активністю алкогольоксидази, який полягає у використанні азиду натрію (як інактиватора фермента в результаті стехіометричного зв’язування з ФАД) у реакційній суміші для якісного визначення активності алкогольоксидази в колоніях дріжджів. Отримано мутант 7-4А з активністю алкогольоксидази до 6,8 Од/мг білка (підвищеною у 3,3 рази, порівняно з вихідним штамом 33) після культивування клітин у середовищі з глюкозою. Підібрано умови для отримання високого виходу біомаси штаму 7-4А.

3. Оптимізовано умови проведення біоконверсії етанолу в оцтовий альдегід клітинами (15 г/л) штаму 7-4А. Встановлено доцільність використання 1 М тріс-HCl буферу, рН 8,0, у інкубаційній суміші для біотрансформації з метою забезпечення ефективного окислення клітинами 0,217 М (1%) етилового спирту. Стимуляція ефективності конверсії спостерігалася при зниженні температури до 3о С.

4. Клітини штаму 7-4А можуть бути успішно використані у циклічних процесах біотрансформації та для конверсії етанолу в ацетальдегід безпосередньо зі спиртової бражки.

5. Показано, що мутації, які приводять до порушення індукованої етанолом деградативної інактивації алкогольоксидази, підвищують ефективність біоконверсії етанолу в ацетальдегід клітинами мутантів P. methanolica з генетичними блоками ацетил-КоА синтетази та ізоцитратліази.

6. У присутності інгібітора вакуолярних протеїназ – фенілметилсульфонілфториду, пермеабілізовані дигітоніном клітини мутанта 7-4A із пошкодженням або сповільненням етанольної інактивації алкогольоксидази в процесі макропексофагії, спричиненим використанням цих хімічних реагентів, при 30о С конвертували 96,4% екзогенного етанолу в ацетальдегід.

СПИСОК ОПУБЛІКОВАНИХ ПРАЦЬ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Мороз О.М., Кшеминская Г.П., Сибирный А.А. Биотрансформация этанола в уксусный альдегид диким и мутантными штаммами метилотрофных дрожжей Hansenula polymorpha // Микробиология. - 1994. - Т.63,№6. - С. 1050-1057.

2. Сибирный А.А., Кулачковский А.Р., Мороз О.М. Образование гибридных микротелец, глиокcипероксисом, содержащих алкогольоксидазу и малатсинтазу, у регуляторного мутанта метилотрофных дрожжей Pichia methanolica // Микробиология. - 1996. - Т. 65, №4. - С. 457-461.

3. Kulachkovsky A.R., Moroz O.M., Sibirny A.A. Impairment of peroxisome degradation in the mutants of methylotrophic yeast Pichia methanolica defective in acetyl-CoA synthetase and isocitrate lyase // Yeast. - 1997. - V. 13. - P. 1043-1052.

4. Kulachkovsky A.R., Stasyk O.V., Ksheminska H.P., Fayura L.R., Moroz O.M., Sibirny A.A. Nutrition and ultrastructure of the mutants of methylotrophic yeast defective in biogenesis and degradation of peroxisomes // Food Technol. Biotechnol. - 1998. - V. 36, №1. - P. 19-26.

5. Gonchar M.V., Maidan M.M., Moroz O.M., Woodward J.R., Sibirny A.A. Microbial O2- and H2O2-electrode sensors for alcohol assays based on the use of permeabilized mutant yeast cells as the sensitive bioelements // Biosensors & Bioelectronics. - 1998. - V. 13. - P. 945-952.

6. Moroz O.M., Gonchar M.V., Sibirny A.A. Efficient bioconversion of ethanol to acetaldehyde using a novel mutant strain of the methylotrophic yeast Hansenula polymorpha // Biotechnol. Bioeng. - 2000. – V. 68. – P. 44-51.

7. Sibirny A.A., Moroz O.M., Ksheminska G.P. The mutants of methylotrophic yeasts as a biocatalysts for ethanol transformation into acetaldehyde // Proc. of the 16-th International Conference on Yeasts. Genetics and Molecular Biology. - Vienna (Austria). - 1992.