МІНІСТЕРСТВО ОХОРОНИ ЗДОРОВ'Я УКРАЇНИ

ОДЕСЬКИЙ ДЕРЖАВНИЙ МЕДИЧНИЙ УНІВЕРСИТЕТ

ТІРОН ОКСАНА ІВАНІВНА

УДК 612.357.6-055.6:612.014.482.4:576.315.42

СТАН РЕАКЦІЙ ПОСТТРАНСЛЯЦІЙНОЇ МОДИФІКАЦІЇ
БІЛКІВ ХРОМАТИНУ ПЕЧІНКИ І ЇХ КОРЕКЦІЯ
У ВИВОДКУ ОПРОМІНЕНИХ ЩУРІВ

14.03.04 – патологічна фізіологія

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата медичних наук

Одеса - 2003

Дисертацією є рукопис

Робота виконана в Одеському державному медичному університеті МОЗ України

Науковий керівник: доктор біологічних наук, професор

НАПХАНЮК Володимир Клеонтійович,

Одеський державний медичний університет

МОЗ України, завідувач кафедри гістології,

ембріології та цитології

Офіційні опоненти: доктор медичних наук, професор,
заслужений діяч науки і техніки України,
ГОЖЕНКО Анатолій Іванович,

Одеський державний медичний університет
МОЗ України, завідувач кафедри загальної
та клінічної патологічної фізіології

доктор медичних наук, професор

РОГОВИЙ Юрій Євгенович,
Буковинська державна медична академія
МОЗ України, професор кафедри

патологічної фізіології

Провідна установа: Донецький державний медичний університет
МОЗ України ім. М. Горького,
кафедра патологічної фізіології, м. Донецьк

Захист дисертації відбудеться “ 17 ” _грудня 2003 року о 11 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 41.600.01 при Одеському державному медичному університеті (65026, м. Одеса, пров. Валіховський, 2).

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Одеського державного медичного університету (65026, м. Одеса, пров. Валіховський, 3).

Автореферат розісланий “ 15 ” листопада 2003 р.

Вчений секретар
спеціалізованої вченої ради

к. мед. н., доцент Годован В. В.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Останнє десятиріччя характеризується значним погіршенням екологічної ситуації, що природно відбивається на здоров’ї населення України та тривалості життя людини (Ткачишин В.С., 2000; Чижик В.В., Бенядь В.П., 1998). Одним з провідних факторів такої ситуації є те, що у середовищі проживання сучасної людини існує багато хімічних сполук, які надходять до її організму з повітрям, водою та їжею в підвищених концентраціях, а інактивація цих сполук відбувається в печінці.

Аварія на Чорнобильській АЕС призвела до надзвичайної екологічної ситуації, яка поставила перед сучасною медичною наукою принципово нову проблему, суть якої полягає в тому, що значні контингенти населення підпали під дію низько інтенсивного, як зовнішнього, так і інкорпорованого g-опромінення (Омельчук С.Т., 2000; Гераськин С.А., 1995).

Радіаційна медицина сьогодні приділяє значну увагу проблемі наслідків хронічного впливу на людину іонізуючого випромінювання за умов малих доз та інтенсивностей (Бурлакова Е.Б. та співавт., 1999; Мазурик В.К., Михайлов В.Ф., 1999). Дослідженню впливу g-опромінення на морфологічний стан печінки присвячена значна кількість експериментальних та клінічних робіт (Аношина М.Ю. та співавт., 1998; Козлова Н.В., 2001). Експериментально досліджені викликані опроміненням зміни структурних характеристик генома (Обатуров Г.М., 1996); ядерних мікросомальних, мітохондріальних, плазматичних мембран (Эйдус Л.Х., 1999; Котеров А.Н., 2000), клітинна проліферація, процеси, які лежать в основі радіорезистентності/радіочутливості (Рождественский Л.М., 1999). Встановлено, що радіаційні ефекти мають загальну молекулярну основу – пошкодження ДНК та її репарація (Скалацкая С.И., 1995), а в реалізації ушкоджуючої дії g-опромінення значна роль відводиться активізації процесів перекисного окислення ліпідів (Губський Ю.І., 1999; Копильчук Г.П. та співавт., 2002).

На сьогодення в медичній науці достатньо широко дискутуються питання про “критичні” метаболічні процеси, органи та тканини, клітинні структури, які формують первинну реакцію-відповідь на дію будь-якого несприятливого фактору (Кудряшов Ю.Б., 1987). До таких систем, в першу чергу, відносять структури, які відповідають за біосинтез білка та збереження генетичної інформації. Порушення ДНК-білкових взаємодій в хроматині і пов’язані з цим зміни транскрипції у клітинах ураженого організму обумовлюються, як порушенням первинної структури, так і змінами заряду білкової молекули (Осипов А.Н., 1999). У зв’язку з цим, важливим є дослідження особливостей реакцій посттрансляційної модифікації білків хроматину у опромінених ссавців та їх нащадків.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота виконана відповідно до плану науково-дослідних робіт кафедри гістології, ембріології та цитології Одеського державного медичного університету і є фрагментом теми “Розробка шляхів направленої регуляції метаболічних процесів в поколіннях опромінених тварин” (№ держреєстрації 0196U017677). Дисертант є співвиконавцем цієї теми.

Мета і задачі дослідження. З’ясувати механізми зрушень реакцій посттрансляційної модифікації білків хроматину ядер клітин печінки у пізньому ембріогенезі та постнатальному онтогенезі щурів, отриманих від самців та самок, які перед спарюванням зазнали тривалої дії g-опромінення у низьких дозах, та розробити шляхи патогенетичної корекції цих зрушень.

Для досягнення цієї мети були поставлені наступні задачі:

1. Дослідити динаміку вікових змін активності реакцій фосфорилювання і АДФ-рибозилювання гістонових і негістонових білків хроматину ядер клітин печінки в ембріогенезі, ранньому постнатальному періоді і у щурів віком 30, 45, 90 та 365 діб за фізіологічних умов.

2. З’ясувати стан процесів фосфорилювання і АДФ-рибозилювання білків хроматину ядер клітин печінки статевозрілих самців і самок щурів, які зазнали тотального тривалого впливу g-опромінення у сумарних дозах 0,75 та 1,0 Гр.

3. Дослідити вікові і статеві особливості активності реакцій фосфорилювання білків хроматину ядер клітин печінки щурів, отриманих від самців і самок, які зазнали тотального тривалого
g-опромінення у сумарних дозах 0,75 та 1,0 Гр.

4. Дослідити вікові і статеві особливості активності реакцій АДФ-рибозилювання білків хроматину ядер клітин печінки щурів, отриманих від самців та самок, які зазнали тотального тривалого g-опромінення у сумарних дозах 0,75 та 1,0 Гр.

5. Визначити стан процесів фосфорилювання і АДФ-рибозилювання білків хроматину ядер клітин печінки опромінених щурів, які під час дії радіаційного фактору отримували глутаргін і біологічно активну харчову добавку з розторопші плямистої, а також з’ясувати стан зазначених процесів у нащадків таких щурів.

6. Дослідити морфофункціональні особливості тканин печінки радіаційно уражених щурів і їх нащадків першого покоління.

Об’єкт дослідження – зрушення у тканинах печінки опромінених щурів і їх нащадків.

Предмет дослідження – процеси фосфорилювання і АДФ-рибозилювання білків хроматину ядер клітин печінки та морфофункціональний стан тканин печінки опромінених щурів і їх нащадків.

Методи дослідження – патофізіологічні, біофізичні, біохімічні, морфологічні, статистичні.

Наукова новизна отриманих результатів. У результаті проведених комплексних досліджень вперше визначена динаміка змін активності процесів посттрансляційної модифікації гістонових і негістонових білків хроматину ядер клітин печінки на різних етапах онтогенезу нащадків радіаційноуражених і інтактних щурів. Встановлено існування залежності між особливостями фосфорилювання і АДФ-рибозилювання білків хроматину і морфофункціональними властивостями тканин печінки. Вперше досліджені ефекти використання під час опромінення глутаргіну і біологічної добавки з розторопші плямистої і визначені механізми їх впливу на зазначені процеси в опроміненому організмі.

В роботі отримала подальший розвиток проблема статевої диференціації функціональних властивостей печінки. Вперше встановлено існування статевих відмінностей процесів фосфорилювання і АДФ-рибозилювання білків хроматину нащадків інтактних і опромінених щурів.

На відміну від існуючих робіт вперше одночасно виявлені нові фенотипічні прояви радіаційноіндукованих пошкоджень геному на молекулярному рівні – зрушення процесів посттрансляційної модифікації білків хроматину, і клітинному – зміни мітотичної активності гепатоцитів у нащадків опромінених щурів. Визначені можливі шляхи попередження радіаційноіндукованих ушкоджень геному і їх реалізації у поколіннях опромінених тварин.

Практичне значення одержаних результатів. Цінність роботи полягає у розкритті раніш невідомих патофізіологічних механізмів реалізації генетичних ефектів опромінення тварин в організмі їх нащадків і розробці шляхів їх метаболічної корекції. Положення і висновки роботи впроваджені до навчального процесу та використовуються при читанні лекцій і на практичних заняттях кафедр гістології, ембріології та цитології, загальної та клінічної фармакології, клінічної імунології, генетики та медичної біології, нормальної фізіології, загальної та клінічної патологічної фізіології, патологічної анатомії Одеського державного медичного університету.

Особистий внесок здобувача. Дисертація є особистою науковою працею автора. Внесок дисертанта у її виконання полягає у проведенні інформаційного пошуку та аналізі літературних джерел, плануванні і проведенні досліджень, узагальненні одержаних результатів, написанні та оформленні дисертації. Участь автора у підготовці матеріалів, висвітлених у роботах, опублікованих у співавторстві, є визначальною і полягає у проведенні літературного пошуку, експериментальних досліджень, статистичній обробці та аналізі отриманих результатів, формулюванні висновків.

Апробація результатів дисертації. Основні результати дослідження доповідались на VI Міжнародній науково-практичній конференції “Сучасні досягнення валеології та спортивної медицини” (Одеса, 2000), 70-й підсумковій конференції студентів та молодих вчених ОДМУ (Одеса, 2001), VIІ Міжнародній науково-практичній конференції “Сучасні досягнення валеології та спортивної медицини” (Одеса, 2001), VIІІ Міжнародній науково-практичній конференції “Сучасні досягнення валеології та спортивної медицини” (Одеса, 2002), IХ Міжнародній науково-практичній конференції “Сучасні досягнення валеології та спортивної медицини” (Одеса, 2003).

Публікації за матеріалами дисертації. Опубліковано 11 наукових праць, з них 6 статей у фахових журналах та 5 у збірниках конференцій.

Обсяг і структура дисертації. Дисертаційна робота викладена на 202 сторінках машинопису і складається із вступу, огляду літератури, матеріалів та методів досліджень, двох розділів, в яких відображені результати власних досліджень, висновків, списку використаних джерел, який містить 110 джерел надрукованих кирилицею і 122 – латиницею, та додатків. Дисертація ілюстрована 29 таблицями.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріали та методи дослідження. Експериментальні дослідження проведені на 650 щурах різного віку та 50 зародках щурів лінії Вістар. Усі тварини утримувалися за стандартних умов віварію. Дослідження сплановано з урахуванням основних положень моделювання експериментів по вивченню успадкованих радіаційних ефектів у ссавців. Всі дослідні тварини, у відповідності до мети та задач дослідження, були розподілені на групи.

Здорових статевозрілих самців і самок віком три місяці та вагою
180-200 г натщесерце піддавали тотальному g-опроміненню на гама-терапевтичній установці АГАТ-Р (ізотоп 60Со), за технічних умов: потужність дози 107 рад/хв, відстань від джерела до поля 0,75 м; поле 0,2 х 0,2 м; по 0,15 та 0,1 Гр (експозиція у першому випадку 8, у другому 6 секунд) кожні 72 години до досягнення сумарної дози 0,75 та 1,0 Гр відповідно.

Відповідні групи тварин під час опромінення, з першого по останній день дії радіаційного фактора, включно, отримували біологічно активну харчову добавку з розторопші плямистої (виробник АТ ЗТ УРРТП “Шанс-Драгстор”, м. Київ), та глутаргін - (виробник ТОВ “Фармацевтична компанія “Здоров’я”, м. Харків). Біологічно активну харчову добавку з розторопші плямистої додавали до раціону дослідних щурів тричі на день по 0,3 г. При цьому кількість силімарину на добу складала приблизно 80 мг/кг маси тіла. Глутаргін вводили внутрішньочеревно двічі на добу по 1 мл 4 % розчину, що складало 400 мг аргініну глутамату на кг маси тіла на добу. Доза вибрана з урахуванням рекомендацій про визначення равноефектних доз для тварин та людини, виходячи з кількості лікарського засобу на поверхню тіла.

На 12-ту добу після завершення дії іонізуючої радіації проводили спарювання опромінених самців і самок. Відбір самок для запліднення та визначення першого дня вагітності проводили за методиками отримання тварин з точно датованим строком вагітності. До експерименту брали 18-денних зародків, щурят віком 2, 14, 30, 45, 90, 365 діб, отриманих від інтактних та опромінених самців і самок, а також безпосередньо опромінених тварин на 12-ту добу після завершення дії радіаційного фактору.

Для дослідження реакцій фосфорилювання і АДФ-рибозилювання експериментальним тваринам внутрішньочеревно вводили відповідно 6,0 МБк NaH232PO4 і 8,0 МБк 3H-рибози на 100 г маси тіла. Через 2 години щурів декапітували, вилучали і гомогенізували печінку. Ядра клітин печінки отримували за Pogo F.O. з співав., 1967; хроматин за Teng C.S. та співав., 1979. Лабільно зв’язані з ДНК негістонові білки (лНГБ) отримували за Tengта співав., 1979; гістони отримували за Bohm J. та співав., 1990. Після екстракції гістонових білків отримували фракцію міцнозв’язаних з ДНК негістонових білків (мНГБ) (Уманский С.Р. и соавт., 1975). Електрофорез гістонів проводили у гелевих блоках (Pangyim S., Chalkley R.,1969). Забарвлені гелі сканували на спектрофотометрі Specord-UV-Vis. Концентрацію білка визначали за Desoye G., Porshke D., 1980. Підрахунок радіоактивності у зонах гелю проводили за методом Aloye V.S., 1979. Підраховували кількість імпульсів за хвилину на 1 мг білка.

На зрізах тканин печінки забарвлених гематоксиліном та еозином, залізним гематоксиліном за допомогою методу світлової мікроскопії, з використанням комп’ютерної програми „ВидиоТесТ - Мастер” (Росія), підраховували кількість фігур нормальних мітозів, патологічних мітозів на 10000 гепатоцитів. Отримані результати досліджень були опрацьовані з використанням стандартних пакетів програм „StatSoft Statistica 6.0”.

Основні результати дослідження. У результаті проведених досліджень встановлено, що 18-денним зародкам інтактних самців і самок притаманний високий рівень АДФ-рибозилювання як гістонових, так і негістонових білків хроматину ядер клітин печінки, що пояснюється інтенсивним перебігом процесів диференціації, високою активністю геному (рис. 1). Зниження активності реакцій АДФ-рибозилювання гістонових та негістонових білків хроматину після народження пов’язане з пристосуванням організму щурів до нових умов існування, що потребує якісно іншої регуляції функціонування фізіологічних процесів і забезпечується змінами активності геному. Зменшення АДФ-рибозилювання гістонів у певних ділянках хроматину призводить до його перебудови і активації раніш неактивних ділянок. Змінюється при цьому і баланс між приєднанням залишків АДФ-рибози до білків і їх полімеризації, відбувається просторова перебудова білків і хроматину, завдяки чому регулюється активність геному. Зменшення включення молекул АДФ-рибози до гістонових і негістонових білків пояснює і виявлене нами зниження мітотичної активності гепатоцитів у інтактних дводенних самців і самок порівняно з 18-денними зародками.

Інтенсифікація АДФ-рибозилювання всіх досліджуваних білків хроматину у 14-денних самців і самок свідчить про високу транскрипційну активність у цей період, яка обумовлена інтенсивним ростом і розвитком організму. Виявлені коливання активності процесів АДФ-рибозилювання, поруч зі змінами мітотичної активності, підтверджують функціональну значимість короткотривалих модифікацій білка у локальних ділянках хроматину.

На наступних досліджуваних етапах онтогенезу активність реакцій АДФ-рибозилювання білків хроматину знижувалася, що супроводжувалося зменшенням мітотичної активності гепатоцитів і було обумовлене уповільненням темпів росту організму, меншою інтенсивністю процесів диференціації. Привертає увагу той факт, що у 365-денних самок активність реакцій АДФ-рибозилювання всіх досліджуваних білків, за виключенням мНГБ, не зазнавала статистично достовірних змін порівняно з 90-денними, що свідчить про збереження функціональних властивостей ферментних систем, які забезпечують рівновагу між приєднанням і відщепленням молекул АДФ-рибози до білків хроматину.

Рис. 1. Динаміка змін активності реакцій фосфорилювання і АДФ-рибозилювання лНГБ (А) і сумарних гістонів (сумГ) (Б) хроматину інтактних щурів:

1 – Самці, АДФ-рибозилювання;

2 – Самки, АДФ-рибозилювання;

3 – Самці, фосфорилювання;

4 – Самки, фосфорилювання.

Відомо, що збільшення активності АДФ-рибозилювання гістонів, особливо гістону Н1, призводить до локального зменшення компактності структури хроматину і полегшення його репарації у разі ушкодження, а також те, що під час старіння порушаються переходи хроматину між різними функціональними станами, утворюються ділянки незворотної його компактизації, з’являються одно- та двониткові розриви ДНК, зшивки ДНК-ДНК, ДНК-білок. З огляду на це, збільшення активності АДФ-рибозилювання гістонів Н2А і Н2В відповідно на 18,4 і 16,7 %, мНГБ на 19,6 % і лНГБ на 24,4 % у 365-денних самців може свідчити на активацію процесів репарації молекул ДНК у гепатоцитах цих тварин.

Взагалі ж активність АДФ-рибозилювання у 365-денних самців порівняно з 90-денними пригнічувалася. Отже, у 365-денних інтактних самців на фоні зростання кількості патологічних мітозів виявлена дезорганізація процесів АДФ-рибозилювання білків хроматину, що, у свою чергу, може призводити до просторових змін комплексу білків з ДНК, екранування регуляторних зон у хроматині і ділянок ДНК, які потребують дії ферментів репарації. Слід зазначити, що на всіх досліджуваних етапах онтогенезу, за виключенням негістонових білків у 365-денних тварин, активність реакцій АДФ-рибозилювання білків хроматину була вищою у самок.

Привертають увагу кількісні розбіжності у активності процесів АДФ-рибозилювання, які були найбільш помітними у зародків і дводенних щурят – тобто в періоди, коли вони знаходяться під гормональним впливом самок; а також у період статевого дозрівання і статевої зрілості.

У результаті проведених досліджень встановлено, що на всіх досліджуваних етапах онтогенезу активність фосфорилювання гістонових і негістонових білків була вищою у інтактних самок. Привертає увагу, також, зростання активності приєднання залишків фосфорної кислоти до всіх досліджуваних білків хроматину на 45-ту добу життя, як самців так і самок, під час високої інтенсивності процесів статевого дозрівання. З іншого боку у результаті конформаційних змін гістонових і негістонових білків внаслідок їх фосфорилювання може змінюватися активність певних ділянок хроматину і активуватися гени які відповідають за статеву диференціацію. Отже, можна припустити існування зворотнього зв’язку між змінами активності генома пов’язаними з фосфорилюванням гістонових і негістонових білків хроматину і гормональним фоном організму.

У інтактних дводенних самців і самок порівняно з зародками, у 45-денних тварин порівняно з 30-денними, всі досліджувані білки фосфорилювалися інтенсивніше, що пояснюється активацією адаптаційних реакціях організму вкрай необхідною в умовах пристосування до змін оточуючого середовища після народження, в першому випадку, і активацією процесів статевого дозрівання у другому. Адже відомо, що приєднання залишків фосфора в невеликих кількостях корелює зі збільшенням ділянок транскрипційно активного хроматину.

Привертає увагу збільшення активності реакцій фосфорилювання лНГБ у 365-денних самок порівняно з 90-денними, а також переважання інтенсивності приєднання залишків фосфорної кислоти до лНГБ, ніж до мНГБ. На нашу думку, це свідчить про активацію адаптаційних систем у самок з метою збереження ефективної регуляції геному під час старіння, до того ж негістонові білки приймають участь у специфічній регуляції активності геному. Враховуючи те, що у самців подібних змін не спостерігалося можна припустити у них меншу стабільність систем, що забезпечують регуляцію геному.

За умов опромінення у сумарній дозі 0,75 і 1,0 Гр зрушення процесів АДФ-рибозилювання і фосфорилювання білків хроматину, пригнічення мітотичної активності і зростання кількості патологічних мітозів було менш виразним у самок, ніж у самців. Це свідчить, по-перше, про існування взаємозв’язку між глибиною зрушень посттарнсляційних модифікацій білків хроматину і виразністю порушень клітинного циклу. По-друге, про більшу резистентність самок до дії тривалого g-опромінення порівняно з самцями (рис. ).

На 12-ту добу по завершенні опромінення у сумарній дозі 0,75 Гр у самців і самок зростала інтенсивність фосфорилювання лНГБ і гістону Н4, а решти білків зменшувалася. Відомо, що особливо ефективно активують транскрипцію фосфорильовані негістонові білки. Поруч з цим, зменшення приєднання залишків фосфорної кислоти до решти досліджуваних білків навпаки вказує на компактизацію хроматину і зменшення транскрипційної активності. Виявлені зрушення свідчать на користь дезорганізації механізмів регуляції активності геному і на клітинному рівні супроводжувалися пригніченням мітотичної активності і різким зростанням у мікропрепаратах печінки кількості фігур патологічних мітозів.

Рис. 2 Активність реакцій фосфорилювання (А) і АДФ-рибозилювання (Б) білків хроматину клітин печінки щурів опромінених у сумарній дозі 0,75 Гр, порівняно з інтактними тваринами (0):

* - відсутність статистично достовірних відмінностей порівняно з інтактними тваринами;

1 - самці (для всіх білків);

2 - самці (для всіх білків).

У опромінених у сумарній дозі 0,75 Гр самців, порівняно з інтактними тваринами, загальна активність АДФ-рибозилювання зростала, про що свідчило посилення приєднання залишків фосфорної кислоти до СумГ на 20,3 %. Посилювалося АДФ-рибозилювання гістонів Н1, Н4, що може призводити до локального розпушення хроматину і полегшення доступу до ушкодженої ДНК ферментів репарації. У сукупності з посиленням АДФ-рибозилювання лНГБ, це може свідчити про існування пошкоджених дією g-радіації ділянок ДНК, по-перше; по-друге, про активацію систем репарації. Але, поруч з цим, пригнічення приєднання залишків АДФ-рибози до мНГБ, гістонів Н2А, Н2В і Н3, може викликати компактизацію хроматину і погіршення доступу ферментів репарації до ДНК. Тобто, має місце дезорганізація функціонування репаративних систем. Проявом чого на клітинному рівні є збільшення кількості патологічних мітозів.

Слід зазначити, що у опромінених самок зрушення АДФ-рибозилювання білків хроматину були менш виразні, ніж у самців, що може свідчити на нашу думку, про більшу ефективність функціонування репаративних систем у самок. Останнє припущення підтверджується меншою кількістю патологічних мітозів у самок, ніж у самців.

У свою чергу, опромінення щурів у сумарній дозі 1,0 Гр призводило до таких самих за напрямком, але більш глибоких кількісно зрушень процесів фосфорилювання білків хроматину як самців, так і самок. На нашу думку це свідчить про пригнічення транскрипційної активності хроматину у опромінених тварин, порушення регуляції активності геному. Поруч з цим, у опромінених у дозі 1,0 Гр щурів посилювалося АДФ-рибозилювання лНГБ, СумГ, гістонів Н1 і Н4, у той же час відбувалося пригнічення АДФ-рибозилювання решти білків. Про значно глибшу дезорганізацію процесів АДФ-рибозилювання у більш тривало опромінених самців свідчила і послідовність у якій зменшувалася активність зазначених процесів: лНГБ > СумГ = Н1= мНГБ > Н3 = Н2А = Н4 > Н2В (у інтактних самців: мНГБ > лНГБ > СумГ = Н1 > Н3 > Н2А > Н2В > Н4). Природно, що ці зрушення супроводжувалися на клітинному рівні більш глибокими змінами мітотичної активності і збільшенням кількості фігур патологічних мітозів.

Слід зазначити, що у самок, опромінених у сумарній дозі 1,0 Гр, на відміну від опромінених у сумарній дозі 0,75 Гр, зміни активності реакцій АДФ-рибозилювання білків хроматину по-перше були більш значними, по-друге, за напрямком такими як і у самців і супроводжувалися зростанням кількості патологічних мітозів. Але, у опромінених самок, у всіх групах порівняння, радіаційноіндуковані зрушення були менш виразні ніж у самців.

Нарешті, застосування глутаргіну і біологічно активної добавки з розторопші плямистої під час опромінення супроводжувалося меншою дезорганізацією посттрансляційних модифікацій білків хроматину і ми вважаємо, що наслідком цього було виявлене зменшення у таких тварин кількості патологічних мітозів і тенденція до нормалізації мітотичної активності гепатоцитів.

Особливої уваги заслуговує за таких умов можливість виникнення і успадкування нелетальних ушкоджень геному, їх фенотипічна реалізація в організмі нащадків опромінених тварин. Дійсно, нами були виявлені відмінності у посттарнсляційних модифікаціях білків хроматину ядер клітин печінки самців і самок, отриманих від опромінених щурів. Так, 18-денним зародкам, 2- і 14-денним самцям, отриманим від опромінених у дозі 0,75 Гр щурів, притаманний більш високий рівень фосфорилювання всіх досліджуваних білків, ніж у інтактних. Тобто, у період підготовки до пологів та під час пристосування до нових умов оточуючого середовища нащадкам опромінених щурів необхідний вищий рівень активності геному.

На решті досліджуваних етапів онтогенезу самцям, отриманим від опромінених у дозі 0,75 Гр щурів, притаманна нижча активність реакцій фосфорилювання досліджуваних білків, отже менший рівень транскрипційної активності хроматину, що не виключає, на наш погляд, неефективної або несвоєчасної відповіді при дії несприятливих факторів. Підтвердженням цього можуть бути різнонаправлені зрушення активності реакцій фосфорилювання білків хроматину у 45-денних самців, отриманих від опромінених щурів (тобто на початку та під час статевого дозрівання), порівняно з 30-денними.

У самців, отриманих від опромінених щурів, на відміну від інтактних тварин, починаючи з другої доби життя активність фосфорилювання негістонових білків поступово зменшувалася, що свідчить про недостатню ефективність регуляції активності геному у нащадків опромінених щурів. Адже статеве дозрівання супроводжується перебудовою функціонування багатьох гормонально-залежних систем організму в основі чого лежить зміна активності певних генів, у свою чергу негістонові білки забезпечують специфічну регуляцію активності геному. Отже, зрозумілим стає підвищення фосфорилювання лНГБ і мНГБ у інтактних самців на 45-ту добу життя і можливість негативних наслідків її відсутності у нащадків опромінених щурів.

У свою чергу, у самок, отриманих від опромінених у дозі 0,75 Гр щурів, динаміка вікових змін активності фосфорилювання лНГБ і мНГБ співпадала з такою у інтактних тварин. До того ж, з другої по 14-ту добу у них зростала активність приєднання залишків фосфорної кислоти до негістонових білків. Останнє може свідчити про достатню ефективність, мобільність регуляції активності геному у самок, отриманих від опромінених щурів, але не виключає існування певних труднощів під час адаптації до нових умов існування.

Динаміка вікових змін активності фосфорилювання досліджуваних білків у самок, отриманих від опромінених щурів, була такою як і у інтактних. Лише до гістону Н3, у період з другої по 14-ту добу посилювалося приєднання залишків фосфорної кислоти. Привертають увагу кількісні відмінності у активності фосфорилювання білків хроматину самок-нащадків опромінених щурів в період: 18-денні зародки – 30-денні щурі. Відомо, що для певної активності хроматину притаманний певний рівень фосфорилювання білків хроматину. Тому, враховуючи той факт, що динаміка вікових змін активності фосфорилювання білків хроматину самок-нащадків опромінених і інтактних щурів майже збігається, існування цих відмінностей можна пояснити динамічними змінами регуляції активності геному під час пристосування до нових умов оточуючого середовища.

Нарешті, як і у самців, у самок формувався якісно інший рівень активності фосфорилювання білків хроматину по досягненні тваринами статевої зрілості. Слід підкреслити, що на відміну від інтактних самців, у самців, отриманих від опромінених щурів, активність фосфорилювання всіх досліджуваних білків була нижчою, а у самок тільки гістонових; а негістонових переважала показники інтактних тварин. Привертає увагу і пригнічення активності фосфорилювання всіх білків хроматину під час старіння у самців і самок (у останніх в меншому ступені), отриманих від опромінених у дозі 0,75 Гр щурів.

У самок, отриманих від опромінених у дозі 1,0 Гр щурів, динаміка вікових змін активності фосфорилювання всіх досліджуваних білків була такою, як і у інтактних тварин. Але, на відміну від нащадків опромінених у дозі 0,75 Гр, у них на перших трьох досліджуваних етапах онтогенезу всі білки хроматину фосфорилювалися більш інтенсивно ніж у одновікових інтактних самок, а починаючи з 30-ї доби життя і до 365-денного віку включно – менш інтенсивно. На нашу думку це свідчить про більшу інертність систем, які забезпечують фосфорилювання білків хроматину і меншу транскрипційну активність хроматину у самок, отриманих від опромінених у дозі 1,0 Гр щурів.

Особливої уваги заслуговують зрушення у самців, отриманих від опромінених у дозі 1,0 Гр щурів. Так, на всіх досліджуваних етапах поруч з білками фосфорилювання яких зростало у 2 – 3 рази, приєднання залишків фосфорної кислоти до інших білків значно пригнічувалося, що на нашу думку свідчить про дезорганізацію систем, які забезпечують зазначені посттрансляційні модифікації білків хроматину (рис. 3). Слід підкреслити, що поступово, з віком, у таких самців збільшувалася кількість досліджуваних білків, фосфорилювання яких пригнічувалося порівняно з інтактними тваринами. Нарешті зазнавала істотних змін і динаміка вікових змін активності фосфорилювання гістонових білків хроматину ядер клітин печінки таких самців.

У свою чергу були виявлені зміни активності реакцій АДФ-рибозилювання у нащадків опромінених щурів. Виявлені зміни активності АДФ-рибозилювання, на наш погляд, свідчать про дезінтеграцію цих процесів. Так, у самців, отриманих від опромінених щурів на всіх досліджуваних етапах онтогенезу поруч з пригніченням приєднання залишків АДФ-рибози до одних білків хроматину, до інших воно значно інтенсифікується, або дорівнює показникам інтактних тварин. Привертає увагу той факт, що у самок, отриманих від опромінених у дозі 0,75 Гр щурів, відхилення від показників інтактних тварин значно менш виразні ніж у самців.

Привертають увагу зміни активності АДФ-рибозилювання білків хроматину у самок, отриманих від опромінених у дозі 1,0 Гр щурів. Так, у них переважає активація зазначених процесів, що може свідчити про інтенсифікацію процесів репарації. Але, поруч з білками до яких залишки АДФ-рибози приєднувалися більш інтенсивно, до окремих білків це приєднання пригнічувалося. На нашу думку, це може призводити до зменшення ефективності функціонування репаративних систем. Останнє припущення підтверджується зростанням у препаратах печінки кількості фігур патологічних мітозів. Відомо, що кількість приєднання до білків молекул АДФ-рибози корелює з компактизацією хроматину. Отже, посилення АДФ- рибозилювання призводить до розпушення хроматину і полегшення доступу до ушкоджених ділянок ферментів репарації. У даному випадку можливо розпушення хроматину не досягає належного ступеню, адже АДФ-рибозилювання частини білків пригнічується.

Рис. 3 Активність реакцій фосфорилювання білків хроматину самців, отриманих від опромінених у сумарній дозі 1,0 Гр щурів:

1 – СумГ, інтактні самці;

2 – СумГ, нащадки опромінених щурів;

3 – Гістон Н1, нащадки опромінених щурів;

4 – Гістон Н2В, нащадки опромінених щурів.

Особливої уваги заслуговує динаміка вікових змін активності процесів АДФ-рибозилювання негістонових білків у самців і самок, отриманих від опромінених у дозі 1,0 Гр щурів, яка кардинально відрізнялася від такої у інтактних тварин. Це вказує на порушення специфічної регуляції активності геному і на клітинному рівні находить відображення у зменшенні мітотичної активності гепатоцитів і зростанні кількості фігур патологічних мітозів.

Нарешті, у самців і самок, отриманих від тварин, яким підчас опромінення вводили глутаргін, а до раціону додавали біологічно активну добавку з розторопші плямистої, виразність негативних зрушень процесів фосфорилювання і АДФ-рибозилювання білків хроматину ядер клітин печінки була значно меншою. Поруч з цим, у таких тварин у меншому ступені пригнічувалася мітотична активність гепатоцитів і у мікропрепаратах печінки визначалася менша кількість фігур патологічних мітозів.

ВИСНОВКИ

У дисертації наведене теоретичне узагальнення і нове вирішення проблеми успадкованих наслідків тривалого впливу на організм ссавців іонізуючого випромінювання у малих дозах, що виявляється у з’ясуванні закономірностей змін реакцій фосфорилювання і АДФ-рибозилювання гістонових і негістонових білків хроматину ядер клітин печінки у пізньому ембріогенезі та постнатальному онтогенезі щурів – нащадків опромінених попередників та визначенні їх зв’язку з мітотичною активністю гепатоцитів, що може бути використано для розробки шляхів попередження вказаних зрушень.

1. Кожному етапу онтогенезу інтактних самців і самок щурів притаманна певна активність реакцій фосфорилювання і АДФ-рибозилювання гістонових і негістонових білків хроматину ядер клітин печінки, що відповідає їх фізіологічному розвитку. Напрямок вікових змін активності реакцій фосфорилювання однаковий у самців і самок, але кількісно інтенсивність приєднання залишків фосфорної кислоти до всіх досліджуваних білків вища у самок. Виявлені параметри свідчать про відмінності активності процесів фосфорилювання і АДФ-рибозилювання у інтактних самців і самок. Старіння супроводжується більш глибокими змінами посттрансляційних модифікацій білків хроматину у самців.

2. Тривале тотальне g-опромінення самців і самок щурів призводило до дезінтеграції реакцій фосфорилювання і АДФ-рибозилювання гістинових і негістинових білків хроматину клітки печінки. Що свідчить про порушення регуляції активності геному і дезорганізацію процесів репарації ушкоджених ділянок ДНК у опромінених щурів, причому у більшому ступені у самців і у тварин опромінених у сумарній дозі 1,0 Гр.

3. У самців і самок, отриманих від опромінених у сумарній дозі 0,75 Гр щурів, до 14-ї доби онтогенезу посилювалося фосфорилювання всіх досліджуваних білків, а починаючи з 30-ї - пригнічувалося. У самців – нащадків щурів опромінених у сумарній дозі 1,0 Гр не виявлені закономірності у інтенсивності фосфорилювання окремих білків на різних етапах онтогенезу. У самок динаміка вікових змін активності фосфорилювання всіх досліджуваних білків співпадала з такою у інтактних тварин. Але, на відміну від нащадків опромінених у сумарній дозі 0,75 Гр щурів, у них до 14-ої доби онтогенезу включно всі досліджувані білки фосфорилювалися більш інтенсивно, ніж у інтактних самок, а починаючи з 30-ої доби – менш інтенсивно. У сукупності це свідчить про менші фенотипічні прояви генетичних наслідків опромінення у самок, отриманих від опромінених щурів, ніж у самців.

4. У самців і самок, отриманих від опромінених у сумарній дозі 0,75 Гр щурів, вікова динаміка змін активності АДФ-рибозилювання гістонів і негістонових білків співпадала з такою у інтактних тварин. У нащадків, опромінених у дозі 1,0 Гр щурів, виявлені порушення вікової динаміки АДФ-рибозилювання негістонових білків на всіх досліджуваних етапах онтогенезу і гістонів, починаючи з 90-ої доби життя. У сукупності це свідчить про активацію у нащадків опромінених щурів процесів репарації на всіх досліджуваних етапах онтогенезу і разом з тим їх дезорганізацію, вираженість якої більша у самців, ніж у самок, і тварин, отриманих від щурів, опромінених в більшій сумарній дозі.

5. У статевозрілих самців і самок щурів, опромінених у сумарній дозі 0,75 і 1,0 Гр, а також їх нащадків першого покоління, виявлено пригнічення мітотичної активності гепатоцитів і зростання кількості фігур патологічних мітозів у препаратах печінки. Вираженість даних змін була більшою у самців, ніж у самок та у нащадків щурів опромінених у більшій сумарній дозі. Виявлено прямо пропорційний зв’язок між глибиною порушень процесів посттрансляційної модифікації білків хроматину і порушеннями клітинного поділу гепатоцитів.

6. Патогенетично обгрунтовано та експериментально підтверджено, що застосування впродовж усього періоду опромінення глутаргіну і біологічно активної добавки з розторопші плямистої зменшувало дезорганізацію процесів фосфорилювання і АДФ-рибозилювання білків хроматину і мітотичної активності гепатоцитів, зменшувало кількість фігур патологічних мітозів у препаратах печінки опромінених щурів і їх нащадків.

Список опублікованих праць за темою дисертації

1. АДФ-рибозилювання білків хроматину ядер гепатоцитів щурів за умов тривалого g-опромінення // Вісник морської медицини. - 2001. - № 3. - С. 177 - 180. (співавт. Напханюк В.К.; внесок автора – проведення експерименту, аналіз результатів, написання статті).

2. Вплив хронічного g-опромінення низькими дозами на процеси фосфорилювання гістонів і негістонових білків хроматину ядер гепатоцитів // Одеський медичний журнал. - 2001. - № 6. - С. 10 - 12.

3. АДФ-рибозилювання білків хроматину ядер клітин печінки в онтогенезі покоління, отриманого від радіаційно уражених щурів // Вісник Вінницького державного медичного університету. - 2003. - Т. 7, № 1 / 1. - С. - 51. (співавт. Напханюк В.К.; внесок автора – проведення експерименту, аналіз результатів досліджень, оформлення статті).

4. Особливості мітотичної активності гепатоцитів щурят, отриманих від опромінених попередників // Вісник морфології. - 2003. - Т. 9, № 1. - С. 7 - 9. (співавт. Напханюк В.К., Ульянов В.О.; внесок автора – проведення експерименту та аналіз результатів).

5. Фосфорилювання гістонових та негістонових білків хроматину ядер клітин печінки в онтогенезі покоління, отриманого від радіаційно уражених щурів // Одеський медичний журнал. - 2003. - № . - С. 42 - 45. (співавт. Напханюк В.К.; внесок автора – проведення експерименту, аналіз результатів, написання статті).

6. Фармакологічна корекція радіаційноіндукованих метаболічних зрушень у гепатоцитах статевозрілих щурів // Вісник проблем біології і медицини. - 2003. - № . - С. 26 - 30. (співавт. Напханюк В.К., Ульянов В.О.; внесок автора – проведення експерименту та аналіз результатів).

7. Вплив тотального хронічного g-опромінення в дозі 0,75 Гр на фосфорилювання гістонів та негістонових білків хроматину ядер гепатоцитів // Матеріали VI Міжнародної науково-практичної конференції “Сучасні досягнення валеології та спортивної медицини”. - Одеса: Одес. держ. мед. ун-т., - 2000. - С. 253 - 255. (співавт. Напханюк В.К.; внесок автора – проведення експерименту та аналіз результатів).

8. Особливості АДФ-рибозилювання білків хроматину ядер гепатоцитів щурят, отриманих від опромінених щурів // Матеріали ювілейної 70-тої наукової конференції студентів і молодих учених, присвяченої 10-річчю незалежності України. - Одеса: Одес. держ. мед. ун-т. - 2001. - С. 89.

9. Особливості АДФ-рибозилювання білків хроматину ядер гепатоцитів в онтогенезі покоління, отриманого від опромінених щурів в малих дозах // Матеріали VIІ Міжнародної науково-практичної конференції “Сучасні досягнення валеології та спортивної медицини”. - Одеса: Одес. держ. мед. ун-т., - 2001. - С. 196 - 197. (співавт. Напханюк В.К.; внесок автора – проведення експерименту та аналіз результатів).

10. Стан посттрансляційної модифікації білків хроматину у виводку першого покоління, отриманого від опромінених щурів // Матеріали VIІІ Міжнародної науково-практичної конференції “Сучасні досягнення валеології та спортивної медицини”. - Одеса: Одес. держ. мед. ун-т., 2002. - С. 99 – 100. (співавт. Напханюк В.К.; внесок автора – проведення експерименту та аналіз результатів).

11. Радіаційноіндуковані порушення процесів посттрансляційної модифікації ядерних білків клітин печінки опромінених щурів та їх фармакологічна корекція // Матеріали IХ Міжнародної науково-практичної конференції “Сучасні досягнення валеології та спортивної медицини”. - Одеса: Одес. держ. мед. ун-т., 2003. - С. 196 – 197. (співавт. Напханюк В.К., Ульянов В.О.; внесок автора – проведення експерименту та аналіз результатів).

АНОТАЦІЯ

Тірон О. І. Стан реакції посттрансляційної модифікації білків хроматину печінки і їх корекція у виводку опромінених щурів. – Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата медичних наук за спеціальністю 14.03.04. – патологічна фізіологія. – Одеський державний медичний університет МОЗ України, Одеса, 2003.

Проведено дослідження активності процесів фосфорилювання і АДФ-рибозилювання гістонових і негістонових білків хроматину ядер клітин печінки у інтактних і опромінених у сумарних дозах 0,75 і 1,0 Гр щурів та їх нащадків. Досліджено взаємозв’язок між мітотичною активністю гепатоцитів і станом процесів фосфорилювання і АДФ-рибозилювання білків хроматину. З’ясовані ефекти застосування під час тривалого g-опромінення глутаргіну і біологічно активної добавки з розторопші плямистої.

Встановлено, що за фізіологічних умов існують статеві і вікові відмінності у активності реакцій фосфорилювання і АДФ-рибозилювання гістонових і негістонових білків. У опромінених самців і самок щурів, а також