АКАДЕМІЯ МЕДИЧНИХ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ ФАРМАКОЛОГІЇ ТА ТОКСИКОЛОГІЇ

БРУНЬ ЛіДіЯ ВолоДИМИРіВНА

УДК: 615:616 003.9:547.455.623.233.1 001.89

РЕПАРАТИВНі Властивості ГЛЮКОЗАМіНу

та його ПОхідних

14.03.05 — фармакологія

Автореферат
дисертації на здобуття наукового ступеня
кандидата біологічних наук

КИЇВ – 2004

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана на кафедрі клінічної фармації Національного фармацевтичного університету МОЗ України.

Науковий керівник: | доктор медичних наук, професор,

Заслужений діяч науки і техніки України

Зупанець Ігор Альбертович,

Національний фармацевтичний університет,

завідувач кафедри клінічної фармації

(м. Харків).

Офіційні опоненти: | доктор медичних наук, професор

Мохорт Микола Антонович,

Інститут фармакології та токсикології АМН України, завідувач відділу фармакології

серцево-судинних засобів (м. Київ);

доктор медичних наук, професор

Посохова Катерина Андріївна,

Тернопільська державна медична академія

ім. І.Я. Горбачевського,

завідувачка кафедри фармакології
(м. Тернопіль).

Провідна установа: Одеський державний медичний університет

МОЗ України, кафедра загальної та клінічної

фармакології (м. Одеса).

Захист відбудеться “ 21 ” квітня 2004 р. о 1300 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.550.01 при Інституті фармакології та токсикології АМН України за адресою: 03057, м. Київ, вул. Е. Потьє, 14.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту фармакології та токсикології АМН України за адресою: 03057, м. Київ, вул. Е. Потьє, 14.

Автореферат розісланий “ 20 ” березня 2004 р.

Вчений секретар
спеціалізованої вченої ради Д 26.550.01,

кандидат біологічних наук ____________І.В. Данова

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Проблема регенерації ран різної етіології продовжує залишатися актуальною (Д.С. Саркисов, 1993; Р.У. Липшиц, Т.В. Звягинцева, 1999). Це пов’язано з травматизмом побутового, спортивного, виробничого характеру, в умовах катастроф, стихійних лих, військових конфліктів та ін. (О.О. Шалімов та ін., 2002), постійним зростанням кількості хворих з порушенням метаболічних функцій, які виникають на фоні захворювань судин (варикозна хвороба, хронічна артеріальна та венозна недостатність), цукрового діабету. Ці хвороби приводять до виникнення ран, що тривало не загоюються, та посідають одне з провідних місць у світі за показниками смертності.

Одним із шляхів вирішення даної проблеми є використання препаратів для стимуляції репаративних процесів і наближення репаративної регенерації до фізіологічної (Е.А. Ефимов, 1987; С.Н. Турищев, 1998). Для лікування ран необхідно місцеве застосування м’яких лікарських засобів, які б мали багатоспрямовану дію та використовувалися в залежності від фази ранового процесу (РП) (М.И. Кузин, 1990; И.М. Перцев, 1999). Так, препарати, що використовуються у ІІ фазі РП, повинні мати гідрофільні основи з помірною дегідратуючою активністю, забезпечувати протизапальну, репаративну активність та захищати від суперінфекції (Е.П. Безуглая, 1996).

Однак, багатьом сучасним лікарським засобам притаманні ряд недоліків:
вузький спектр специфічної дії, недостатня ефективність, а також побічні ефекти, зокрема алергічні реакції у вигляді набряку, дерматиту, подразнення тканин (мазі: метилурацилова, “Левосин”), шкірний свербіж та заніміння (мазь “Мефенат”). Це обумовлює необхідність подальшого пошуку та розробки нових препаратів для місцевого застосування при ранових процесах, які б не мали цих недоліків.

Одним з перспективних напрямків сучасної фармації та медицини є використання речовин природнього метаболітного походження і створення на їх основі препаратів, які здатні коректувати плин ранового процесу.

Протягом багатьох років вченими Національного фармацевтичного університету проводиться пошук, синтез і розробка препаратів на основі аміноцукру
2-D-(+)-глюкозаміну (ГА) і його похідних, які мають широкий спектр фармакологічної активності: протизапальний, мембраностабілізуючий, антиоксидантний та кардіо-, гепато-, гастро-, пульмо-, хондропротекторні ефекти (І.А. Зупанець, 1988 - 2002). Вони також малотоксичні, що дозволяє вважати їх перспективними об’єктами для створення високоефективних лікарських засобів для лікування ран.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Роботу виконано відповідно до планів НДР Національного фармацевтичного університету "Хімічний синтез, виділення та аналіз нових фармакологічно активних сполук, встановлення зв'язку "структура-активність", створення нових лікарських препаратів" (№ державної реєстрації 0198U007011).

Мета та задачі дослідження. На основі скринінгових досліджень репаративних властивостей аміноцукру 2-D-(+)-глюкозаміну та його похідних визначити найбільш активну сполуку, придатну для створення препарату для місцевого застосування.

Для досягнення мети були поставлені такі задачі:

1. Провести скринінгові дослідження протизапальних та репаративних властивостей у ряду похідних 2-D-(+)-глюкозаміну. Встановити залежність протизапальної і репаративної дії досліджуваних сполук від їх хімічної структури.

2. Виявити найбільш активну та малотоксичну речовину.

3. На основі виділеної речовини розробити м’яку лікарську форму (крем) та провести дослідження її репаративних та протизапальних властивостей на різних моделях ранового процесу.

4. Оцінити місцевоподразнюючу та алергізуючу дію розробленого крему.

Об’єкт дослідження – 2-D-(+)-глюкозамін та його похідні, моделі ранового процесу, білі миші, щури, морські свинки, кролі.

Предмет дослідження – ефективність 2-D-(+)-глюкозаміну та його похідних, крему на основі похідного глюкозаміну – глюкозиламонійної солі етилового ефіру 4-карбетоксіоксанілоїлгідразиду щавлевої кислоти (ОГА) при лікуванні ран.

Методи дослідження – фармакологічні, токсикологічні, біохімічні, мікробіологічні, морфологічні та статистичні.

Наукова новизна одержаних результатів. Уперше проведений фармакологічний скринінг протизапальної і репаративної активності 21 сполуки 2-D-(+)-глюкозиламонійних похідних N-фенілантранілових та дикарбонових кислот. Встановлено елементи залежності "структура-токсичність-активність" у рядах сполук, що вивчаються. Визначено активні за протизапальною (Iа, Iв, ІІв, ІІз, ІІк, ІІл, IІм, IIIа) та репаративною (ІІв, ІІк, IIIа) дією малотоксичні речовини. Виділено речовину глюкозиламонійну сіль етилового ефіру 4-карбетоксіоксанілоїлгідразиду щавлевої кислоти (IIIа – ОГА), яка має виразні протизапальні (за широтою терапевтичної дії перевищує диклофенак натрію у 5,7 рази, кислоту мефенамову у 42,6 рази) та репаративні (рани загоювалися на 15-16 добу, у контролі – на 20-21 добу) властивості.

Розроблено м`яку лікарську форму (крем) на основі речовини IIIа. Встановлено, що зі зменшенням концентрації IIIа підвищується фармакологічна активність лікарської форми. В експерименті уперше визначено, що 1 % крем ОГА активує репаративні процеси, відновлює морфологічну структуру шкіри на 11-12 добу, тоді як у контролі це відбувається на 20-21 добу.

Уперше встановлено деякі ланки механізму репаративної дії препарату, що пов’язані з підвищенням синтезу білка, РНК, ДНК, оксипроліну, ГАГ (глікозаміногліканів), мукопротеїнів, колагенових волокон у рані. 1 % крем ОГА має протизапальну, антимікробну активність при відсутності алергізуючої та місцевоподразнюючої дії.

Практична значимість одержаних результатів. У результаті проведених досліджень виявлена сполука IIIа з високою протизапальною та репаративною активністю, яка перевищує за цими показниками диклофенак натрію та кислоту мефенамову.

На основі похідного ГА розроблено крем, який виявляє протизапальну та репаративну дію і в цьому плані не поступається мазі “Мефенат”, “Вундехіл” та характеризується більш широким спектром активності.

За матеріалами досліджень опублікований інформаційний лист “Оптимізація пошуку ефективних лікарських засобів на основі N-фенілантранілових кислот” (2003). За матеріалами досліджень отримано 5 патентів. Подана заявка на винахід
№ 2003109019 від 06.10.03. “Лікувально-профілактичний крем з ранозагоюючою, протизапальною та антимікробною активністю”.

Результати наукових досліджень впроваджено в навчальний процес кафедр фармакології, фармацевтичної хімії НФаУ, Запорізького державного медичного університету, кафедри фармакології Львівського національного медичного університету ім. Данила Галицького та у наукову роботу ЗАО “НВЦ Борщагівського ХФЗ”, ТОВ “ФК “Здоров'я”.

Особистий внесок здобувача. Автором самостійно проведено та проаналізовано патентно-інформаційний пошук, наукові літературні джерела з проблеми, обрано методичні підходи дослідження, визначені мета та задачі, виконано експери-ментальну частину роботи, проведений аналіз отриманих результатів, проведена статистична обробка експериментальних даних, оформлені таблиці та рисунки, сформульовані висновки, опубліковані основні положення дисертації.*

Апробація роботи. Результати роботи доповідались і обговорювались на наукових конференціях молодих учених (Харків, 2000-2003); Всеукраїнській науково-практичній конференції “Вчені України вітчизняній фармації” (Харків, 2000);
V міжнародному медичному конгресі молодих учених (Тернопіль, 2001);
II Національному з’їзді фармакологів України (Дніпропетровськ, 2001); науково-практичній конференції “Лекарства человеку” (Харків, 2001); Міжрегіональній науково-практичній конференції “Здобутки клінічної і експериментальної медицини” (Тернопіль, 2002); Всеукраїнській науково-практичній конференції “М’які лікарські засоби в сучасній фармації і медицині” (Харків, 2002); IX Конгресі Світової Федерації українських лікарських товариств (СФУЛТ) (Луганськ, 2002); III Міжнародній науково-практичній конференції “Наука і соціальні проблеми суспільства: медицина, фармація, біотехнологія” (Харків, 2003).

* Автор висловлює подяку доктору фармацевтичних наук, професору, завідуючому лабораторією рідинних та м'яких лікарських засобів Державного наукового центру лікарських засобів (м. Харків) М.О. Ляпунову за допомогу у розробці технології 1 % крему ОГА.

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 20 наукових робіт, з них 6 статей у наукових фахових виданнях, рекомендованих ВАК України, 5 патентів, 8 тез доповідей, 1 інформаційний лист.

Обсяг і структура дисертації. Дисертаційна робота викладена на 172 сторінках машинописного тексту та складається з вступу, огляду літератури, розділу “Матеріали та методи дослідження”, 3 розділів власних досліджень, висновків, списку використаних джерел літератури, що охоплює 227 найменувань, з них 141 вітчизняних і 86 закордонних авторів. Робота ілюстрована 21 таблицею, 5 рисунками, 23 фотографіями, 1 схемою.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ ДИСЕРТАЦІЇ

Методи дослідження. Експериментальні дослідження проведено на 1077 білих нелінійних мишах масою 18-22 г, 285 білих нелінійних щурах масою 180-220 г, 134 гвінейських морських свинках масою 650-750 г, 3 кролях породи Шиншила масою 1,6-1,9 кг. Тварини вирощені у розпліднику віварію ЦНДЛ НФаУ. Робота з тваринами проводилась згідно з Міжнародними вимогами про гуманне ставлення до тварин та з дотриманням вимог директиви 86/609/ЕЕС з питань захисту тварин. Евтаназію тварин проводили шляхом дислокації хребців шийного відділу та передозуванням ефірного наркозу.Етапи й основні методи досліджень представлені на схемі.

Фармакологічну оцінку антиексудативної дії проводили на моделі модифікованого карагенінового набряку лап у мишей (Л.В. Яковлева, И.А. Зупанец, 1987). Препаратами порівняння було обрано диклофенак натрію як стандартний нестероїдний протизапальний засіб (НПЗЗ) і кислоту мефенамову як НПЗЗ, що поєднує протизапальні та репаративні властивості.

Гостру токсичність досліджуваних речовин вивчали на мишах при пероральному введенні за експрес-методом Т.В. Пастушенко (1985). Клас токсичності визначали за загальноприйнятою класифікацією (К.К. Сидоров, 1973).

Величини EД30 - EД50 для найбільш активних сполук розраховували за допомогою методу найменших квадратів (Я.И. Хаджай, 1965, Г.Ф. Лакин, 1990).

Антиальтеративну активність сполук оцінювали у дозі EД50 на моделі стандартної скарифікованої рани у щурів (С.М. Дроговоз, І.А. Зупанець та ін., 2001).

Можливу шкірнорезорбтивну, шкірноподразнюючу, алергізуючу дію найбільш активної речовини вивчали за методом (И.В. Саноцкий, И.П. Иванова, 1975).

Вивчення гострої токсичності 1 % та 3 % кремів ОГА, основи препарату проводили за методом нашкірних аплікацій у щурів (Э.В. Компанцева и др., 2001).

Скринінгові дослідження, спрямовані на визначення активної й оптимальної концентрації крему ОГА, проводили на моделі стандартної скарифікованої рани у щурів (С.М. Дроговоз, І.А. Зупанець та ін., 2001). Препаратами порівняння були обрані мазь “Мефенат” як НПЗЗ, що має протизапальні та репаративні властивості, і мазь “Вундехіл” як препарат на основі природних субстанцій. Показниками ранозагоюючої дії препаратів були: відсоток зменшення площі ран, швидкість загоєння,

I етап | Скринінгові дослідження протизапальної активності на моделі

карагенінового набряку, гострої токсичності за методом

Т.В. Пастушенко, репаративної активності на моделі стандартної

скарифікованої рани

N-фенілантранілові кислоти (6 сполук)

Iа-R1=4-Cl; R2=Н;
2- COOH

Iб-R1=4-Cl; R2=Н;
3- COOH

Iв- R1=4-Cl; R2=Н;
4- COOH

Iг - R1= 3,5-Br; R2=
2-Br;
2- COOH

Iд- R1= 3,5-Br; R2=
3-Br;
3- COOH

Iе- R1= 3,5-Br; R2=
4-Br;
4- COOH |

2-D-(+)-глюкозамін і

2-D-(+)-глюкозиламонієві солі N-фенілантранілових кислот

(12 сполук)

IIа - R1=4-NO2; R2=Н,
3- COOH

IIб - R1=5-NO2; R2=Н,

2- COOH

IIв - R1=5-NO2; R2=Н;
4- COOH

IІг - R1=6-NO2; R2=Н;
2- COOH

IIд - R1=6-NO2; R2=Н; 3- COOH

IІе - R1=6-NO2; R2=Н; 4- COOH

IІж - R1= 3,5-Br; R2=Н; 2- COOH

IIз - R1= 5-Br; R2=Н;
2- COOH

IІи - R1=3,5-NO2; R2=Н;
3- COOH

IIк - R1=4-Cl; R2=Н;
4-COOH

IІл - R1=4-Cl; R2=Н;

2- COOH

IІм - ГА+ClЇ | 2-D-(+)-глюкозиламонієві солі етилових ефірів
N-R-оксамоїлгідразидів дикарбонових кислот

(3 сполуки)

IIIа - R1=
4-NHСOCONHNH

COсоос2н5

IIIб - R1=4-NHCO(CH2)2COО

IIIв - R1=4-NHCOCONHNHCO (CH2)2СОО

II етап | Скринінгові вивчення специфічної

фармакологічної активності кремів ОГА

на моделі стандартної

скарифікованої рани: –

гострої токсичності–

протизапальної активності (клінічні ознаки запалення)–

репаративної активності –

вплив препаратів на біохімічні показники: загальний клінічний аналіз крові, сіалові кислоти, АлАТ, АсАТ, ГАГ | на моделі лінійної різаної рани: –

тензіометричне вивчення репаративної активності–

вплив препаратів на біохімічні показники: білковий обмін: загальний білок, ДНК, РНК; сіалові кислоти, глікопротеїни–

гістологічне і гістохімічне вивчення структури ранової зони шкіри щурів (мукопротеїни, ГАГ, колаген)

Вивчення протизапальної активності на моделі

термічного опіку

Вивчення антимікробної активності за методом дифузії

в агар (“колодязів”)

III етап | Вивчення деяких ланок механізму репаративної дії

1 % крему ОГА на моделі повношарової “вирізаної” рани –

вплив препаратів на біохімічні показники: сіалові

кислоти, глікопротеїни, хондроїтинсульфати, ГАГ,

фракційний склад ГАГ–

цитологічне вивчення ранових біоптатів –

гістологічне і гістохімічне вивчення структури шкіри ран морських свинок (мукопротеїни, ГАГ, колаген)

IV етап | Вивчення нешкідливості 1 % крему ОГА

Вивчення можливої алергізуючої дії | Вивчення можливої

місцевоподразнюючої дії

Схема. Основні етапи і методи фармакологічних досліджень

активність. Запальну стадію ранового процесу оцінювали відповідно до визначених клінічних критеріїв. Стан периферичної крові тварин оцінювали на підставі загального клінічного аналізу крові в динаміці (Л.В. Козловская и соавт., 1994). Для оцінки запального процесу визначали вміст сіалових (нейрамінових) кислот у сироватці крові за допомогою методу (J. Hess, 1973). Цитолітичну реакцію визначали за рівнем показників аланін- та аспартатамінотрансферази (АлАТ, АсАТ) у сироватці крові за методом (S. Reitman, S. Frankel, 1957). За динамікою зміни вмісту ГАГ у сироватці крові оцінювали перебіг фаз ранового процесу (П.Н. Шараев и др., 1978).

Подальше вивчення репаративної активності проводили на моделі лінійної різаної рани у щурів (Г.И. Лавринцева, Г.А. Оноприенко, 1996), яку досліджували відповідно до показників міцності рубця (тензіометрії) і вмісту загального білка колориметричним методом, концентрації РНК і ДНК у гомогенаті шкірної рани щурів спектрофотометричним методом (В.Г. Колб, В.С. Камышников, 1982). Вміст колагенових білків визначали відповідно оксипроліну в рановій поверхні (Л.И. Слуцкий, 1969). Протизапальну активність у сироватці крові оцінювали відповідно рівню сіалових кислот за методом (J. Hess, 1973), а також глікопротеїнів за методом (В.Г. Колб, В.С. Камышников, 1982). Гістоморфологічне та гістохімічне вивчення шкіри щурів на даній моделі проводили за допомогою тестів, які дозволяли виявити ГАГ, мукопротеїни, колагенові волокна (Н.А. Юрина, 1999).

Протизапальну активність 1 % крему ОГА вивчали на моделі термічного запалення у мишей (В.В. Гацура, 1974).

Антибактеріальну активність субстанцій та кремів ОГА різних концентрацій досліджували методом дисків (“колодязів”) (Б.М. Даценко, 1995).

Поглиблене вивчення репаративної активності проводили на моделі повношарової “вирізаної” рани у морських свинок (В.В. Серов, А.Б. Шехтер, 1981). Цитологічне дослідження ранових біоптатів проводили за методом (Н.А. Юрина, 1999). Метаболічну функцію оцінювали за вмістом хондроїтинсульфатів (Л.И. Слуцкий, 1982). Вивчення фракційного складу та суми ГАГ у сироватці крові експериментальних тварин проводили за методом (М.Р. Штерн и др., 1982) з поділом ГАГ сироватки крові на фракції гіалуронатів, хондроїтинсульфатів і високосульфатованих ГАГ. У кожній пробі вміст ГАГ визначали за методом (Н.М. Фильчагина и др., 1982).

Алергізуючі властивості оцінювали за методом нашкірних аплікацій (Е.В. Компанцева и др., 2001), у тесті непрямої дегрануляції тучних клітин (Л.М. Ишимова, 1971), на моделі шкірної анафілаксії (Е.А. Иевлева и др., 1974; Х. Фримель, 1987) та тесті "кон'юнктивальна проба" (Г.П. Трубецкая, 1978).

Місцевоподразнюючу дію досліджуваного препарату вивчали (Оценка воздействия вредных химических соединений на кожные покровы и обоснование ПДУ загрязнений кожи (методические рекомендации), 1980).

Статистичну обробку результатів проводили з використанням методів варіаційної статистики за допомогою t-критерію Ст’юдента (Г.Ф. Лакин, 1990).

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ОБГОВОРЕННЯ

Вивчення залежності протизапальних, репаративних властивостей і

токсичності D-(+) глюкозаміну та його похідних від хімічної структури

З числа вивчених субстанцій найбільш виражена протизапальна активність та низька токсичність відзначена у N-фенілантранілових кислот (Iа, Iв), глюкозаміну гідрохлориду (ІІм), глюкозиламонійних солей N-фенілантранілових кислот (ІІв, ІІз, ІІк, ІІл) і глюкозиламонійної солі етилового ефіру щавлевої кислоти (IIIа) (табл. 1).

Таблиця

Хімічна структура, середньоефективні дози, гостра токсичність і терапевтичний

індекс субстанцій, що виявили найбільш високий антиексудативний ефект на моделі карагенінового набряку у мишей (M+m, n=10)

Шифр сполук та назва препарату |

R1 |

R2 |

Положення COOH |

ЕД50, мг/кг |

ЛД50, мг/кг | Терапевтичний індекс

Iа | 4-Cl | H | 2' | 13,3±5,4 | 3060

(24803630) | 230,08

Iв | 4-Cl | H | 4' | 15,15±6,54 | 3430

(27804070) | 226,40

IIв | 5-NO2 | H | 4' | 14,61±6,24 | 3700

(30604340) | 253,25

IIз | 5-Br | H | 2' | 14,8±6,41 | 3700

(30604340) | 250,0

IIк | 4-Cl | H | 4' | 15,2±6,0 | 3700

(30604340) | 243,42

IIл | 4-Cl | H | 2' | 14,7±5,34 | 3430

(27804070) | 233,33

IIIа | 4-NHCOCONHNHCOсоос2н5 | 15,0±6,46 | 3850

(31204570) | 256,67

Глюкозаміну гідрохлорид

IIм |

50,0±5,2 |

>10000 |

>200,0

Диклофенак натрію | 2,6-Cl | 2' | 8,0 | 360

(311ч394) | 45,0

Мефенамова кислота | 2,3-CН3 | 2' | 100,0 | 602

(519686) | 6,02

При зіставленні антиексудативного ефекту з хімічною структурою в першій та другій групах сполук виявляється залежність активності речовин від розташування карбоксильної групи. Збільшення активності і зменшення токсичності відзначається при її розташуванні за нефенілантраніловим фрагментом в наступній послідовності 3'<4' (Іа, ІІв, ІІк) 2' (Ів, ІІз, ІІл). У третій групі сполук відзначена залежність збільшення антиексудативного ефекту зі збільшенням маси замісника. Найбільш виразну активність і низьку токсичність виявила речовина IIIа.

Відібрані 8 сполук піддали подальшому скринінговому вивченню репаративного ефекту. У другій групі сполук визначається сполучення антиексудативного і антиальтеративного ефектів в 4' положенні карбоксильної групи за нефенілантраніловим фрагментом. Прояві репаративної активності сприяли замісники за фенілантраніловим фрагментом нітро- (Iiв), хлор- (IIк). У третій групі найбільш вираженою за даною активністю є субстанція, що містить етиловий ефір 4-карбетоксіоксанілоїл-гідразид щавлевої кислоти (IIIа). Тривалість загоєння у зазначених сполук складала 15-16 діб, у контрольній групі – на 21-22 доби, при введенні диклофенаку натрію на – 20-21 добу, кислоти мефенамової – на 17-18 добу. Глюкозаміну гідрохлорид (Iiм) не інгібував репаративний процес (рани загоювались на 19-20 добу), що вказує на його профілактичну дію. Таким чином, субстанції Iiв, IIк, IIIа поєднують антиексудативний і антиальтеративний ефекти та, відповідно кореляції швидкості загоєння і активності препаратів, справляють лікувально-профілактичну дію.

Однак фенілантранілові кислоти мають більш високу токсичність у порівнянні з глюкозиламонійними солями фенілантранілових кислот. При найменшій токсичності ЕД50 глюкозаміну гідрохлориду є найвищою з усіх вивчених сполук. Гостра токсичність нітро- (Iiв) і хлорвмісних (IIк) похідних поступається перед речовиною IIIа. При нашкірному нанесенні розчинів IIIа у концентраціях від 1 % до 10 % протягом 30 діб не відмічено загибелі тварин, ознак запалення, подразнення. Вказана речовина є оригінальною молекулою, яка поєднує два природні метаболіти організму людини: ГА і щавлеву кислоту, що обумовлює можливість фізіологічного впливу на механізм запалення і регенерації при високій ефективності і низькій токсичності. Відібрана субстанція використовувалася для розробки 1 % та 3 % кремів.

Вивчення специфічної активності кремів ОГА

У попередніх тестах встановлена відсутність токсичного впливу кремів ОГА різних концентрацій і основи препарату на шкіру щурів при щодобових аплікаціях протягом 14 діб. У щурів зберігався нормальний апетит, рефлекторна збудливість. На шкірі не спостерігалось ознак запалення, подразнення, інфільтрації.

У результаті проведеного скринінгу на моделі стандартної скарифікованої рани у щурів було встановлено, що добове зменшення площі рани складало в контролі 4,5 %, при нанесенні основи – 4,9 %, при лікуванні 1 % кремом ОГА – 8,0 %, 3 % кремом ОГА – 7,6 %, маззю “Мефенат” – 6,0 %, маззю “Вундехіл” – 4,9 %. За показником активності загоєння найбільш активний 1 % крем ОГА перевищував контроль в 7,3 рази, основу препарату – в 7,0 рази, мазь “Вундехіл” в – 3,0 рази (рис. 1).

Рис. 1. Репаративна активність на моделі стандартної скарифікованої рани у щурів при лікуванні кремами ОГА та препаратами порівняння

*- р<0,05 по відношенню до контрольної патології при нанесенні основи препарату

Термін загоєння при лікуванні 1 % кремом ОГА склав 11-12 діб, маззю “Вундехіл” - 18-20 діб, маззю “Мефенат” - 13-14 діб, у нелікованої групи загоєння відбувалося на 21-22 добу. Спряженість показників швидкості загоєння й активності при лікуванні кремами ОГА і маззю “Мефенат” вказує на лікувально-профілак-тичний ефект даних лікарських форм; при нанесенні мазі “Вундехіл” і основи кореляції цих показників не відмічено, що вказує на їх профілактичний ефект.

У результаті проведених досліджень була встановлена сукупність клінічних ознак, що обумовлюють плин першої (запальної) фази ранового процесу. Більш виражено запалення нівелювалось при використанні 1 % крему ОГА (рис. 2).

Протизапальну активність кремів ОГА підтвердили при вивченні загального клінічного аналізу крові. Відмічено, що при лікуванні кремами ОГА та маззю “Мефенат” по відношенню до контрольної патології вірогідно підвищувався рівень гемоглобіну, кількість еритроцитів, нормалізувались показники лейкоцитарної формули, знижувався рівень лейкоцитів, сіалових кислот, ГАГ. Гіпоферментемія АлАТ, АсАТ підтверджує цитопротекторну дію кремів ОГА та мазі “Мефенат”.

Таким чином, відповідно до показників добового зменшення площі ран, швидкості загоєння, ранозагоювальної активності, терміну епітелізації, клінічних критеріїв ознак запалення, біохімічних досліджень на моделі стандартної скарифікованої рани у щурів встановлено, що зі зменшенням концентрації діючої речовини незнач-

1 2 3 4 5 6 Доби

Рис. 2. Протизапальна активність на моделі стандартної скарифікованої рани у

щурів відповідно до клінічних критеріїв запальної стадії ранового процесу при

лікуванні кремами ОГА та препаратами порівняння –

контроль; – основа; – 1 % крем ОГА;

– 3 % крем ОГА; – мазь “Мефенат”; – мазь “Вундехіл”

* - р<0,05 по відношенню до контрольної патології

но змінюється репаративна та протизапальна активність між кремами ОГА. Найбільш ефективним є 1 % крем ОГА, який незначно відрізнявся відповідно до зазначених показників у порівнянні з маззю “Мефенат” та вірогідно відповідно до мазі “Вундехіл”, основи препарату. 1 % крем ОГА представлений наступним складом:

Глюкозиламонійна сіль етилового ефіру

4-карбетоксіоксанілоїлгідразиду щавлевої кислоти 1,0

Пропіленгліколь 45,0

Проксанол-268 21,0

Поліетиленоксид - 400 30,0

Препарат ОС - 20 0,9

Спирти вищих жирних фракцій С(16) - С(20) 2,1.

Показники активності препаратів на моделі лінійної різаної рани у щурів узгоджуються з викладеними даними. Так, показник тензіометрії на 6 добу експерименту при лікуванні 1 % кремом ОГА склав 80,3 %, 3 % кремом ОГА – 60,8 %, маззю “Мефенат” – 11,7 %, маззю “Вундехіл” – 34,0 %. При лікуванні 1 % кремом ОГА підвищувався рівень кількості загального білка, ДНК, РНК, оксипроліну у гомогенаті шкірної рани, і вірогідно відрізнявся від препаратів порівняння. Зниження рівня сіалових кислот та глікопротеїнів у сироватці крові щурів підтвердило виражену протизапальну активність 1 % і 3 % кремів ОГА, мазі “Мефенат”.

Гістологічними та гістохімічними методами підтверджено, що при лікуванні
1 % кремом ОГА відсутня запальна реакція, відмічається зріла грануляційна тканина та інтенсивна реакція на ГАГ, виражена на мукопротеїни та колаген. При лікуванні 3 % кремом і препаратами порівняння судини грануляційной тканини були заповнені лімфоцитами, відмічена помірна запальна реакція, помірно виражена реакція на ГАГ, мукопротеїни та виражена на колаген.

Протизапальна активність препаратів на моделі термічного опіку при лікуванні основою препарату склала 8,0 %, 1 % кремом ОГА – 58,0 %, 3 % кремом ОГА 39,6 %, маззю “Мефенат” – 30,0 %, маззю “Вундехіл” – 18,6 %. Активність при лікуванні кремами ОГА відрізнялася у 1,46 разів. Найбільш активний крем перевищував мазь “Мефенат” у 1,9, мазь “Вундехіл” у 3,1 рази.

Антибактеріальна активність визначена у субстанції і кремів ОГА по відношенню до грампозитивних і грамнегативних мікроорганізмів. Встановлено, що найбільш чутливими до них виявилися: S. аureus, P. аeruginosa, S. рyogenes та дріжджеподібний гриб C. albicans. Підвищення даного виду активності відбувається зі збільшенням концентрації субстанції. У концентрації розведення ОГА від 1 % до 5 % діаметри затримки зони росту мікроорганізмів склали: S. аureus (d=18-22 мм), P. аeruginosa (d=20-22 мм), S. рyogenes (d=18-20 мм). Антимікотична активність по відношенню до дріжджеподібного гриба C. albicans (d=26-32 мм) найбільш виражено проявилася у концентрації 3 %. Між 1 % та 3 % кремами ОГА суттєвих відмінностей не відмічено. Найбільш виражена чутливість встановлена у S. аureus (d=24-26 мм). ГА та препарати порівняння антибактеріальної активності не проявили.

При поглибленому вивченні репаративної дії 1 % крему ОГА на моделі повношарової “вирізаної” рани у морських свинок термін загоєння склав при лікуванні 1 % кремом ОГА – 30-31 добу, маззю “Мефенат” – 31-32 доби, маззю “Вундехіл” – 35-36 діб, у контрольній групі – 40-41 добу, що підтверджує результати, отримані на вище наведених моделях.

При застосуванні 1 % крему ОГА, мазі “Мефенат” цитологічним дослідженням встановлено, що до 9 доби спостерігався регенераторно-запальний тип цитограм, встановлена переважна кількість нейтрофілів і фібробластів, що підтверджує їх перевагу по відношенню до мазі “Вундехіл”, при використанні якої відповідна картина встановлювалась на 11 добу.

На 14 добу при лікуванні 1 % кремом ОГА у сироватці крові знижувався рівень сіалових кислот, глікопротеїнів, що свідчить про зменшення запальної реакції; підвищувався рівень хондроїтинсульфатів у 2,68 рази по відношенню до контролю, що свідчить про підвищення метаболічних процесів у рані. У рановій зоні шкіри відмічена чітка орієнтація фібробластів при формуванні колагенової основи сполучної тканини. Кількісний вміст мукопротеїнів відповідав помірно вираженій, а ГАГ та колагену - вираженій реакції. У групах, що лікували препаратами порівняння, рівень хондроїтинсульфатів був вірогідно нижчий, кількість фібробластів була значно меншою, кількість мукопротеїнів, ГАГ та колагену відповідала помірно вираженій реакції.

На 21 добу при аплікаціях 1 % крему ОГА нівелювався запальний процес у сироватці крові відповідно до біохімічних показників, що вивчались. У рановій зоні відмічена ніжна рубцева тканина, виражена кількість мукопротеїнів, ГАГ та колагену – помірно виражена. У сироватці крові при зниженні запалення, утворенні грануляційної тканини і епітелізації вміст ГАГ та хондроїтинсульфатів знижувався, що відповідає їх підвищеній локалізації у шкірі. У контрольній групі тварин спостерігали підвищення рівня хондроїтинсульфатів у 3,5 рази, виражену кількість мукопротеїнів, розволокнення та набухання новоутворених колагенових волокон.

На 30 добу при лікуванні 1 % кремом ОГА нормалізувались біохімічні показники крові та структура шкіри. Також було відмічено збільшення кількості волосяних фолікулів. Кількісне відношення мукопротеїнів відповідало помірно вираженій, а ГАГ та колагену - виразній реакції. Відмічено, що при лікуванні 1 % кремом ОГА розвивається більш виразний, ніж при лікуванні маззю “Мефенат”, негіпертрофований рубець, що пояснюється більш виразним ступенем зменшення запальної реакції при лікуванні 1 % кремом ОГА. На момент відторгнення струпу (14 доба) у даній групі відмічається зріла грануляційна тканина, на яку наростає регенеруючий епітелій, що приживається міцно та швидко за рахунок визначного ступеня зрілості грануляційної тканини. Поєднаний вплив новоутвореного епітелію та грануляційної тканини при її переході у сполучну захищає її від “перезрівання” та, як наслідок, утворення келоїдного рубця. У контрольній групі рівень хондроїтинсульфатів та глікопротеїнів залишався підвищеним, що вказує на наявність запалення. На рановій поверхні визначалась помірно виражена кількість мукопротеїнів, ГАГ та колагену, груба рубцева тканина. Нормалізація біохімічних показників та повна епітелізація у контрольній групі відзначалась 10 добами пізніше.

У сироватці крові морських свинок на даній моделі у період дозрівання грануляційної тканини і епітелізації (14 доба) в контрольній групі та групах, що лікували препаратами порівняння, знижувався вміст I (хондроїтин-4-сульфатів) та IiI (високосульфатованих) фракцій ГАГ, що відповідає іх сумарному вмісту у шкірі. При лікуванні 1 % кремом ОГА знижувався вміст Ii (хондроїтин-6-сульфатів) і Iii фракції ГАГ. Гістологічне і гістохімічне вивчення шкіри ранових зон показало, що застосування 1 % крему ОГА сприяло формуванню більш ніжно-волокнистого і косметичного рубця, максимальному наближенню ушкодженого покриву до норми у порівнянні з маззю “Мефенат”.

Таким чином, можна припустити, що механізм дії 1 % крему ОГА пов’язаний зі стимулюванням синтезу РНК, ДНК, білка, ГАГ, мукопротеїнів, оксипроліну, колагену у рановій поверхні. Молекула ОГА, що поступає при аплікаціях 1 % крему ОГА, поставляючи екзогенно ГА, стимулює синтез ГАГ. ГА, в свою чергу, індукує фактори, що стимулюють процеси регенерації лімфокінів, кейлонів та інших, які підсилюють формоутворюючі процеси сполучної тканини (Корж М.О., Дедух Н.В., І. А. Зупанець та ін., 1999).

При вивченні можливої сенсибілізуючої дії 1 % крему ОГА при щодобових аплікаціях протягом 20 діб на пошкоджену та непошкоджену шкіру не виявлено збільшення товщини шкірної складки, підвищення температури шкіри, рівня лейкоцитів у крові. Можлива алергізуюча дія у вигляді гіперемії, інфільтрації на шкірі, у сироватці крові у вигляді дегрануляції тучних клітин, шкірної анафілаксії не відмічена. У тесті "кон'юнктивальна проба" у морських свинок була відсутня гіперемія та інфільтрація на протязі 1, 24, 48 годин. При вивченні можливої місцевоподразнюючої дії не виявлено кон'юнктивіту у кролів.

Таким чином, проведені дослідження свідчать, що 1 % крем ОГА є високо-ефективним засобом метаболітного типу дії з виразними ранозагоювальними, протизапальними, антимікробними, гіпоалергенними властивостями та може рекомендуватись для лікування у другій та третій фазах ранового процесу.

ВИСНОВКИ

У дисертацїї наведено теоретичне узагальнення і нове рішення актуальної наукової задачі – пошуку нових засобів з репаративними властивостями. На основі найбільш активної та менш токсичної речовини глюкозиламонійної солі етилового ефіру 4-карбетоксіоксанілоїлгідразиду щавлевої кислоти розроблено 1 % крем репаративної та протизапальної дії.

1. З 21 досліджуваної сполуки (похідних глюкозаміну) 8 речовин виявили антиексудативну активність на моделі карагенінового набряку у мишей. Їх широта терапевтичної дії перевищує диклофенак натрію у 4,4-5,7 рази, кислоту мефенамову у 33,2-42,6 рази. У глюкозиламонійних солей фенілантранілових та дикарбонових кислот, які поєднують антиексудативну та антиальтеративну активність (ІІв, ІІк, IIIа), термін загоєння ран на моделі стандартної скарифікованої рани у щурів склав 15-16 діб, тоді як у групі, яку не лікували, 21-22 доби, при лікуванні диклофенаком натрію – 20-21 добу, кислотою мефенамовою – 17-18 діб.

Встановлено, що підвищення антиексудативної активності відзначається при положенні карбоксильної групи за нефенілантраніловим фрагментом в послідовності – 3'<4'2'.

2. Найбільш виразні протизапальні та репаративні властивості має глюкозиламонійна сіль етилового ефіру 4-карбетоксіоксанілоїлгідразиду щавлевої кислоти (ОГА – IIIа). При пероральному введенні білим мишам ЛД50 = 3850 мг/кг, ЕД50 = 15 мг/кг, а при нашкірному нанесенні білим щурам розчинів в концентрації від 1 % до 10 % не відмічалось ознак запалення та була відсутня шкірноподразнююча дія.

3. 1 % та 3 % креми ОГА на моделі стандартної скарифікованої рани у щурів за показниками репаративної активності, швидкістю та термінами загоєння ран не відрізняються між собою. Репаративна активність на моделі лінійної різаної рани при лікуванні 1 % кремом ОГА складає 80,3 % (р0,05), 3 % кремом-60,8 % (р0,05).

4. 1 % крем ОГА має виразні протизапальні властивості: на моделі термічного опіку у мишей на 58 % зменшує набряк у порівнянні з контрольною групою. Протизапальна активність цього крему у 1, 9 рази перевищує мазь “Мефенат” та у 3,1 рази мазь “Вундехіл” (р0,05).

5. У дослідах in vitro на твердих поживних середовищах за методом дифузії в агар 1 % крем ОГА виявляє антимікробні властивості по відношенню до S. aureus (d=24 мм), P. aeruginosa (d=14 мм), S. pyogenes (d=12 мм), C. albicans (d=12-14 мм).

6. При поглибленому вивченні репаративної активності 1 % крему ОГА на моделі повношарової “вирізаної” рани у морських свинок встановлено позитивний вплив ІІ та ІІІ фракцій ГАГ на загоювання, що приводить до утворення ніжно-волокнистого та косметичного рубця шкіри.

7. Механізм репаративних властивостей 1 % крему ОГА обумовлений підвищенням синтезу РНК, ДНК, білка, оксипроліну, ГАГ, колагену та мукопротеїнів у рані.

8. 1 % крем ОГА не викликає гіперемії та інфільтрації на шкірі, не змінює температуру шкіри, товщину шкірної складки, не підвищує кількість лейкоцитів у крові за методом нашкірних аплікацій, у тесті непрямої дегрануляції тучних клітин, на моделі шкірної анафілаксії не виявляє алергізуючої дії та не має місцевоподразнюючих властивостей (“кон'юнктивальна проба”).

9. 1 % крем ОГА, що має репаративну та протизапальну дію, ефективний у лікуванні ран різного генезу, запальних процесів шкіри і в цьому відношенні перевищує мазь “Мефенат” та мазь “Вундехіл”.

ПЕРЕЛІК ПРАЦЬ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Зупанець І.А., Ісаєв С.Г., Ярьоменко В.Д., Павлій О.І., Семенов А.М., Місюрьова С.В., Пропіснова В.В, Брунь Л.В. Фармакологічна активність Д -(+)-глікозил-амонієвих солей заміщених бензойної кислоти / Актуальні питання медичної та фар-мацевтичної науки та практики: Зб. наук. статей, випуск VІІ. - Запоріжжя: ЗДМУ. 2001. С. 29-33; (особисто здобувачем проведено огляд літератури, експериментальні дослідження, статистична обробка даних, підготовка статті).

2. Бездетко Н.В., Брунь Л.В., Дедух Н.В., Павлий А.И., Исаев С.Г., Отришко И.А. Применение аминосахара глюкозамина и его производного оксаглюкамина в качестве репаративного средства / Лекарства – человеку: Сб. науч. статей. – Х. – 2001. – Т. XVІ, № 1-2. – С. 64-69; (особисто здобувачем проведено огляд літератури, експериментальні дослідження, статистична обробка даних, підготовка статті).

3. Павлій О.О., Брунь Л.В., Ісаєв С.Г., Зупанець І.А. D-(+)-глюкозиламонієві солі N-фенілантранілових кислот, їх синтез та біологічна активність // Медична хімія. 2002. Т. VІ, № 3. С. 43-46; (особисто здобувачем проведено огляд літератури, експериментальні дослідження, статистична обробка даних, підготовка статті).

4. Зупанец И.А., Брунь Л.В., Ляпунов Н.А., Павлий А.И. Фармакологическое изучение кремов глюкозиламмонийной соли этилового эфира 4-карбэтоксиоксани-лоилгидразида щавелевой кислоты // Вісник фармації. 2002. – №2 (30). С. 114-116; (особисто здобувачем проведено огляд літератури, експериментальні дослідження, статистична обробка даних, підготовка статті).

5. Брунь Л.В., Ляпунов М.О., Павлій О.І. Фармакологічний скринінг кремів похідного аміноцукру глюкозаміну - глюкозиламонійної солі етилового ефіру
4-карбетоксіоксанілоїлгідразиду щавлевої кислоти // Клінічна фармація. 2002.
Т. 6, №4. С. 52-56; (особисто здобувачем проведено огляд літератури, експериментальні дослідження, статистична обробка даних, підготовка статті).

6. Брунь Л.В., Зупанець І.А., Ісаєв С.Г., Павлій О.О. Експериментальне вивчення взаємозв’язку протизапальних і репаративних властивостей N-фенілантрані-лових кислот та похідних глюкозаміну // Фізіологічно активні речовини. 2002. №2 (34). С. 65-69; (особисто здобувачем проведено огляд літератури, експериментальні дослідження, статистична обробка даних, підготовка статті).

7. Пат. 55973 А України, МПК 7 С07С205/00, А61К31/195. D-(+)-глюкозила-монієва сіль 4-хлор-N-(4'-карбоксифеніл) антранілової кислоти, яка проявляє протизапальну, анальгетичну активність / О.О. Павлій, Л.В. Брунь, С.Г. Ісаєв, І.А. Зупанець, Л.В. Яковлєва; Національний фармацевтичний університет (Україна). -
№ 2002086539; Заявл.: 06.08.02; Опубл.: 15.04.03; Бюл. № 4. 4 с.; (особисто здобувачем проведено патентний пошук, експериментальні дослідження, статистична обробка даних).

8. Пат. 56772 А України, МПК 7 С07С 229/58, А61К 31/165. 4-Хлор-N-(2'-карбоксифеніл) антранілова кислота, яка проявляє протизапальну, анальгетичну активність / С.Г. Ісаєв, І.А. Зупанець, Л.В. Брунь, О.О. Павлій, О.І. Павлій, В.А. Ханін; Національний фармацевтичний університет (Україна). - №2002097206; Заявл.: 05.09.02; Опубл.: 15.05.03; Бюл. № 5. 4 с.; (особисто здобувачем проведено патентний пошук, експериментальні дослідження, статистична обробка даних).

9. Пат. 62088 А України, МПК 7 С07С229/58, А61К31/165. D-(+)-глюкозила-монієва сіль 5-бром-N-(2'-карбоксифеніл) антранілової кислоти, яка проявляє протизапальну, анальгетичну активність / С.Г. Ісаєв, І.А. Зупанець, Л.В. Брунь, О.О. Павлій, О.І. Павлій, Л.В. Яковлєва, В.А. Ханін, Г.В. Зайченко, К.О. Іванова; Національний фармацевтичний університет (Україна). - № 2002108094; Заявл.: 11.10.02; Опубл.: 15.12.03; Бюл. № 12. 4 с.; (особисто здобувачем проведено патентний пошук, експериментальні дослідження, статистична обробка даних).

10. Пат. 57492 А України, МПК 7 С07С 229/58, А61К 31/165. Нітро- та хлорзаміщені N-(карбоксифеніл) антранілової кислоти, що проявляють протизапальну, репаративну та анальгетичну активність / І.А. Зупанець, С.Г. Ісаєв, Л.В. Брунь,
О.О. Павлій, О.І. Павлій; Національний фармацевтичний університет (Україна). -
№ 2002108649; Заявл.: 31.10.02; Опубл. 16.06.03; Бюл. № 6. 4 с.; (особисто здобувачем проведено патентний пошук, експериментальні дослідження, статистична обробка даних).

11. Пат. 62112 А України, МПК 7 С07С 229/58, А61К 31/165. D-(+)-глюкозила-монієва сіль 5-нітро-N-(4'-карбоксифеніл) антранілової кислоти, яка проявляє протизапальну, репаративну та анальгетичну активність / Л.В. Брунь, І.А. Зупанець,
С.Г. Ісаєв, О.О. Павлій, В.А. Ханін; Національний фармацевтичний університет (Україна). - № 2002119152; Заявл.: 18.11.02; Опубл. 15.12.03; Бюл. № 12. 6 с.; (особисто здобувачем проведено патентний пошук, експериментальні дослідження, статистична обробка даних).

12. Ісаєв С.Г., Зупанець І.А., Павлій О.О., Брунь Л.В. Синтез нітро-
-фенілантранілових кислот у твердій фазі та їх біологічна активність // Вісник фармації. 2001. – №3 (28). С. 44-45.

13. Зупанець І.А., Брунь Л.В. Використання похідних глюкозаміну у якості репаративних засобів // Клінічна фармація. 2000. – Т. 4, №4. С. 75.

14. Зупанец И.А., Брунь Л.В. Андреева Е.А. Регуляция метаболизма репаративной регенерации при местном применении производного аминосахара глюкозамина 4-карбэтоксиоксанилоилгидразида щавелевой кислоты // Вісник