ХАРКІВСЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ ІМЕНІ В.Н.КАРАЗІНА

ХОРУНЖА Ольга Володимирівна

УДК 577.32

ІОН-ГІДРАТНЕ ОТОЧЕННЯ І СТРУКТУРНІ ОСОБЛИВОСТІ ОПРОМІНЕНОЇ ДНК

03.00.02 – біофізика

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата фізико-математичних наук

Харків - 2004

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Інституті радіофізики та електроніки ім. О.Я.Усикова НАН України, м. Харків.

Науковий керівник

доктор фізико-математичних наук, професор Малєєв Володимир Якович, Інститут радіофізики та електроніки ім. О.Я.Усикова НАН України, завідувач відділу біофізики.

Офіційні опоненти:

- доктор фізико-математичних наук, старший науковий співробітник Сорокін Віктор Олександрович, Фізико-технічний інститут низьких температур ім. Б.І. Вєркіна НАН України, провідний науковий співробітник, (м. Харків);

- кандидат фізико-математичних наук, доцент Пахомов Валерій Інокентійович, Севастопольський національний технічний університет МОН України, доцент (м. Севастополь).

Провідна установа

Інститут фізики НАН України, відділ фізики біологічних систем, м. Київ.

Захист відбудеться " 21 " травня 2004 року о 15 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 64.051.13 у Харківському національному університеті імені В.Н. Каразіна за адресою: 61077, м. Харків, пл. Свободи, 4, ауд. 7-4.

З дисертацією можна ознайомитись у Центральній науковій бібліотеці Харківського національного університету імені В.Н. Каразіна за адресою: 61077, м. Харків, пл. Свободи, 4.

Автореферат розісланий " 20 " квітня 2004 року

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради Гаташ С.В.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Вивчення впливу іонізуючої радіації на ДНК є надзвичайно важливою біофізичною задачею, оскільки радіаційні ушкодження ДНК – основного генетичного компонента клітини – обумовлюють мутагенні, канцерогенні та інші патологічні ефекти. Для розуміння природи радіаційного ураження і вироблення методів лікування і профілактики ушкоджень необхідно з'ясування відповідних змін у будові ДНК. За останні десятиліття численні дослідження дозволили установити основні типи радіаційного ушкодження молекул ДНК, описати хімічні продукти модифікації і структурні зміни полімеру. Однак багато аспектів радіаційного ураження ДНК все ще мало чи зовсім не вивчені.

Відомо, що багато найважливіших властивостей нуклеїнових кислот (НК) (структуроутворення, стабільність, динаміка, взаємодія з лігандами й інш.) істотно визначаються взаємодією НК з водно-іонним оточенням. Саме ступінь гідратації і характер розподілу молекул зв'язаної води по гідратно-активних центрах обумовлюють існування тих чи інших конформацій ДНК і саме її функціонування. Характер радіаційної поразки ДНК також залежить від параметрів гідратації. Тому актуальним є детальне дослідження впливу опромінення на характеристики взаємодії ДНК-розчинник. Роботи такого типу дотепер практично не проводилися.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота виконувалася відповідно до держбюджетних тем відділу біофізики Інституту радіофізики та електроніки НАН України "Дослідження фізичних особливостей гідратованих біополімерів з урахуванням впливу іонізуючої радіації" (шифр "Гран", № 01.96U006110, постанова Бюро ВФА НАН України від 19.12.95, протокол № , 1996-2000 рр.), "Дослідження молекулярних механізмів дії гамма-опромінювання на ДНК, фібриноген та міжклітинні взаємодії" (шифр "Гамма", виконувалась за проектом Державного фонду фундаментальних досліджень України № .4/764, 1997-2000 рр.), "Фізичні механізми взаємодії новосинтезованих біологічно активних речовин з гідратованою ДНК" (Шифр "Ліганд", № U006336, постанова Бюро ВФА НАН України від 24.10.2000, протокол № , 2001-2003 рр.).

Мета і задачі дослідження. Метою роботи було з'ясування впливу іонізуючої радіації на параметри, що характеризують взаємодію ДНК з водно-іонним оточенням. Для досягнення поставленої мети вирішувались такі задачі:

1. Знаходження змін стану водно-іонного оточення, обумовлених впливом _радіації, для модельного синтетичного полінуклеотиду poly(A) в одно- і двоспіральній конформаціях за допомогою методу діелектрометрії в діапазоні надвисоких частот (НВЧ). Установлення відповідних змін структури poly(A).

2. Одержання даних про комплексну діелектричну проникність у діапазоні НВЧ, електропровідність, електрофоретичну рухомість, спектральні параметрі в інфрачервоному (ІЧ) діапазоні для нативної і _опроміненої в розчині ДНК. Визначення впливу _випромінювання на ступінь гідратації, електропровідність, ступінь полімерності ДНК. Виявлення відповідних змін структурного стану сахарофосфатного ланцюга й азотистих основ ДНК.

3. Вимір діелектричних параметрів й електропровідності похідного актиноцину - актиноцил-біс-(2-діметиламіноетил) аміну (ActII), комплексу ДНК-ActII і _опроміненого комплексу ДНКВизначення їхніх ступенів гідратації. Одержання електрофореграм і визначення ступеня полімерності _опроміненого і неопроміненого комплексів ДНК-ActII.

4. Одержання електрофореграм, ІЧ спектрів і діелектричних характеристик для ДНК, виділеної з печінки щурів, опромінених у зоні ЧАЕС. Виявлення відповідних змін полімерності, спіральної структури і параметрів іон-гідратного оточення ДНК.

Об'єкт дослідження – гідратна оболонка і структура молекул ДНК, poly(A) і комплексу ДНК-ActII.

Предмет дослідження – результат впливу іонізуючого випромінювання на іон-гідратну оболонку і структуру молекул ДНК, poly(A) і комплексу ДНК

Методи дослідження – методи диференціальної НВЧ діелектрометрії та п'єзогравіметрії застосовувалися для оцінки загальної величини гідратної оболонки молекул, метод кондуктометрії вживався для оцінки електропро-відності досліджуваних молекул і для оцінки числа одно- і двониткових розривів у ДНК; метод ІЧ спектроскопії використовувався для визначення конформації ДНК і стану її гідратно-активних центрів, метод гель-електрофорезу застосовувався для визначення ступеня полімерності нативних і опромінених зразків ДНК.

Наукова новизна одержаних результатів полягає в наступному:

1. Розроблено ефективний та інформативний комплексний підхід з використанням методів диференціальної НВЧ діелектрометрії, кондуктометрії, ІЧ спектроскопії і гель-електрофорезу для з'ясування впливу іонізуючої радіації на стан водно-іонного оточення і структуру ДНК.

2. Вперше знайдені зміни ступеня гідратації ДНК, одно- і двоспірального синтетичного полінуклеотиду poly(A), -опромінених іn vіtro у високих дозах (>350 Гр). Виявлено значні зміни в стані гідратної оболонки ДНК, виділеної з печінки щурів, що тривалий час знаходилися у зоні ЧАЕС.

3. На основі аналізу ІЧ спектрів вологих плівок ДНК показано, що часткове руйнування гідратного оточення ДНК пов'язано зі зменшенням гідратації дезоксирибоз, фосфатних груп і порушенням стопочної структури азотистих основ, а у випадку ДНК опромінених щурів - також зі зміною спіральної структури молекул.

4. Вперше виміряні діелектричні властивості похідного актиноцину ActІІ, комплексу ДНК –визначені параметри водно-іонної оболонки комплексу і зміни в них під дією -радіації.

Практичне значення одержаних результатів. Експериментальні результати, отримані в дисертації, подають нові відомості про роль води в структурі радіаційно-пошкоджених нуклеїнових кислот. Вони можуть бути використані в наукових установах, що займаються дослідженням впливу іонізуючих випромінювань на біологічні об'єкти і розробкою методик радіаційного захисту. Отримані дані про гідратацію комплексу ДНК із похідним актиноцину ActII, що має протипухлинну активність, важливі для вироблення рекомендацій при розробці лікарських препаратів, що взаємодіють з ДНК.

Особистий внесок здобувача. В опублікованих спільно зі співавторами наукових працях особистий внесок здобувача полягає: у роботах [1-11] у пошуку й аналізі літературних джерел, готуванні досліджуваних розчинів, в участі в проведенні розрахунків, у комп'ютерній обробці отриманих результатів, у співучасті в обговоренні, інтерпретації даних і написанні наукових статей; у роботах [1-3, ] у проведенні кондуктометрічних і діелектричних вимірів; у роботах [4, ] у проведенні вимірів методом ІЧ спектроскопії, в співучасті в проведенні вимірів методом п'єзогравіметрії; у роботах [1-3] у проведенні вимірів методом УФ спектроскопії; у роботах [1, , , ] в співучасті в обговоренні результатів електрофоретичних вимірів, у розробці методики зі застосуванням комп'ютерних програм для одержання денситограм із фотонегативів пофарбованих гелів.

Апробація результатів роботи. Результати роботи за темою дисертації були представлені й обговорені на: ІІ з'їзді Українського біофізичного товариства, (Харків, Україна, 1998); III International Symposium "Physics and Engineering of Millimeter and Submillimeter waves" (Kharkov, Ukraine, 1998); V Міжнародної конференції "Фізичні явища в твердих тілах" (Харків, Україна, 2001); Конференції молодих учених ІРЕ НАН України (Харків, Україна, 2001), усна доповідь "Вплив іонізуючого випромінювання на діелектричні властивості й структурний стан ДНК в розчині" відзначена дипломом I ступеня як краща доповідь у секції "Біофізика" (наказ №27 по ІРЕ НАН України від 13.12.2001); II International Conference on "Broadband Dielectric Spectroscopy and its Applications" (Leipzig, Germany, 2002); IІІ з'їзді Українського біофізичного товариства (Львів, Україна, 2002); II Харківської конференції молодих учених "Радіофізика и НВЧ электроника" (Харків, Україна, 2002); семінарах відділу біофізики ІРЕ НАН України; семінарі Харківського відділення Українського біофізичного товариства (Харків, Україна, 2003). Тези перерахованих доповідей опубліковано.

Публікації. Результати дисертації опубліковані в 11 наукових працях, у тому числі в шести статтях у вітчизняних фахових наукових журналах і в п'ятьох тезах доповідей національних та міжнародних конференцій.

Структура та обсяг дисертації. Дисертація складається з вступу, шести розділів і висновків. Повний обсяг дисертації складає 122 сторінки, містить 21 рисунок, 9 таблиць, з них 3 рисунка й 1 таблиця розміщені на 3 окремих аркушах. Список використаних джерел містить 185 найменувань на 19 сторінках.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

У вступі обґрунтовано актуальність теми дисертації, сформульовано мету і визначені задачі дослідження, відзначені наукова новизна і практичне значення роботи, приведені відомості про апробацію результатів.

У першому розділі представлено огляд літератури за темою дисертації. Сукупність відомих даних указує на те, що центральним об'єктом впливу іонізуючої радіації є молекула ДНК. У розділі приводяться загальні зведення про структуру А-, В- і Z-форм ДНК, які існують при визначених зовнішніх умовах. Показано, що стабільність спіральної структури ДНК у великій мірі визначається характером взаємодії макромолекули з водним оточенням, що є структурним елементом різних конформацій ДНК. Розглянуто гідратацію (взаємодію з розчинником) ДНК, описано відповідні гідратно-активні центри.

На підставі вивчених літературних даних виділено три механізми впливу іонізуючого випромінювання на ДНК: пряма дія – за рахунок безпосередньої взаємодії -квантів з атомами ДНК, непряма дія – обумовлена впливом продуктів радіолізу води (е-aq, ОН?, Hя ? інш.), опосередкована дія у живому організмі – в результаті взаємодії ДНК з іншими радіаційно-ураженими біомолекулами. Описано основні типи радіаційного ушкодження ДНК: модифікації сахарного фрагмента й азотистих основ, структурні зміни полімеру – утворення одно- й двониткових розривів ДНК, формування між- і внутрішньомолекулярних зшивок і т.д. У ряді робіт виявлена залежність від рівня гідратації типу пострадіаційних радикалів ДНК і рухомості радіаційно-утворених електронів у гідратному шарі.

Важлива роль гідратації у функціонуванні ДНК приводить до висновку про те, що для розуміння механізмів впливу випромінювання необхідні відомості про зміни під дією радіації у взаємодії 'ДНК – розчинник'. Однак у теперішній час такі дані в публікаціях відсутні, що робить актуальним проведення такого роду досліджень.

У другому розділі коротко розглянуто фізичні основи використовуваних методів дослідження: диференціальної НВЧ діелектрометрії (діапазон міліметрових довжин хвиль), ІЧ спектроскопії, п'єзогравіметрії та гель-електрофорезу; приведені характеристики вивчених препаратів.

Можливість застосування методу диференціальної діелектрометрії (довжина хвилі 7,6 мм або частота 39 ГГц) для вивчення ступеня гідратації розчинених у воді речовин визначається тим, що молекули зв'язаної води і розчиненої речовини менш рухливі, ніж молекули вільної води. Це приводить до зниження діелектричної проникності розчину (*=-і) у порівнянні з діелектричною проникністю чистої води. В основі методу лежить вимір різниць коефіцієнтів поглинання і різниць фазових зсувів між значеннями відповідних параметрів контрольних і досліджуваних розчинів, з яких потім з високою точністю (до 0,1% від величин і ) визначають різниці і . У величину вводиться поправка на електропровідність розчину ?. Оскільки в НВЧ діапазоні справедлива теорія Дебая полярних рідин, то виправданий перехід до опису діелектричних властивостей розчину параметрами s (низькочастотна межа величини розчину біополімеру) і ?s. Розрахунок ступеня гідратації щ (г води / 1 г НК) проводився за формулою:

,

де s – різниця між статичними діелектричними проникностями води і розчину НК, p – коефіцієнт, що залежить від форми молекули (1,58±0,08); v - питомий об'єм, см3/г; и – діелектричні проникності НК і води в ІЧ діапазоні (4). Формула справедлива при низьких концентраціях с (г розчиненої речовини на 1 г розчину).

Використання ІЧ спектроскопії в області 900-1800 см-1, що відповідає коливальним модам ДНК, дозволяє знаходити зміни структури й стану гідратних центрів ДНК під впливом радіації. Описано методика приготування плівкових зразків, одержання та обробки ІЧ спектрів. Похибка визначення частот складала 1_ см-1. У розділі коротко розглянуто метод п'єзогравіметрії, що використовувався для одержання ізотерм гідратації ДНК. Методи кондуктометрії (частота 10 кГц) і гель-електрофорезу використовувались у роботі для визначення, відповідно, іонної рухомості й ступеню полімерності нативних і опромінених зразків.

У розділі 3 наведено результати вивчення методом НВЧ діелектрометрії впливу -радіації на стан гідратної оболонки полінуклеотиду poly(A), обраного в якості початкового, моделюючого ДНК об'єкта дослідження. Вивчалися одно- і двониткові спіралі poly(A). У табл.1 приведені відомі параметри води й знайдені різниці , , , , s між значеннями відповідних параметрів опромінених і контрольних розчинів. Іонна сила розчинів складала 0,1 М КCl. При розрахунку ступеня гідратації зразків використовувалися значення коефіцієнта форми р=1,5 для poly(A) і р=1,58 для poly(AН+)·poly(AН+) і обмірювана пікнометрически величина питомого об'єму v=0,544 см3/г.

Таблиця 1

Характеристики розчинів poly(А) і poly(AН+)·poly(AН+) |

Вода |

poly(A),

с = 0,94% | poly(AН+)·poly(AН+),

с = 0,75%

Доза -опромінення, Гр | - | - | 370 | 1650 | - | 670 | 1650

рН (±0,1) | 6,3 | 6,3 | 6,3 | 6,2 | 4,0 | 4,5 | 4,5

, Нп/мм

(0,0006), Нп/мм | 2,82

- | 2,81

0 | -

0,0008 | -

0,0028 | 2,88

0 | -

-0,0027 | -

-0,0027

, радиан/мм

(0,0004), радіан/мм | 4,93

- | 4,91

0 | -

-0,0029 | -

-0,0022 | 5,21

0 | -

-0,0021 | -

-0,0114

(0,01) | 16,5

- | 16,4

0 | -

-0,03 | -

-0,04 | 18,9

0 | -

-0,01 | -

-0,10

(0,01) | 27,8

- | 27,5

0 | -

-0,01 | -

0,02 | 30,0

0 | -

-0,04 | -

-0,10

s

s(0,04) | 79,9

- | 78,8

0 | -

0,09 | -

0,20 | 77,8

0 | -

-0,18 | -

-0,11

h(1) мол. води/нукл. | - | 11 | 9 | 7 | 7 | 11 | 9-10

З табл.1 видно, що ступінь гідратації неопроміненої одноланцюгової спіралі poly(A) складає 11 молекул води на нуклеотид. При збільшенні дози ?-опромінення чітко просліджується тенденція зменшення ступеня гідратації одноланцюгового poly(A), при дозі 1650 Гр величина h складає 64% від величини гідратації неопроміненого полінуклеотиду. На основі літературних даних припущено, що цей ефект обумовлений виникненням внутрішньо-ланцюгових зшивок і утворенням пострадіаційних продуктів модифікації аденіну, що може привести, наприклад, до порушення стерічних умов існування водних містків між атомами азоту сусідніх основ.

Опромінення дволанцюгового полімеру на відміну від одноланцюгового привело до збільшення ступеня гідратації (на 55% для дози 670 Гр). Очевидно, виявлений ефект пов'язаний з переходом полинуклеотиду з дволанцюгового в одноланцюговий стан. В результаті відповідні гідратно-активні центри молекули стають доступними для взаємодії з розчинником.

У четвертому розділі подано результати вивчення впливу _радіації на ДНК. Для з'ясування ступеня полімерності зразків ДНК було проведено гель-електрофорез. На рис.1 наведено денситограми досліджуваних зразків ДНК (як приклад обрана доза 370 Гр). Положення смуги нативної ДНК (н-ДНК) щодо смуг маркерів свідчить про високу полімерність нативних макромолекул: їхня довжина в основному складає (20?50)·103 пар нуклеотидів (п.н.), що відповідає молекулярній масі 2107 Да. З рис.1 випливає, що опромінення приводить до розмивання кривої розподілу і зосередженню основної частини фрагментів в області (0,6?6)·103 п.н. або 106 Да. У той же час у розчині практично відсутні фрагменти з розмірами в десятки п.н. чи менш, що приводить до висновку про дуже незначний внесок у гідратацію, діелектричні й спектральні параметри кінцевих груп таких фрагментів.

Результати діелектричних і кондуктометричних вимірів контрольного й опроміненого розчинів ДНК з іонною силою 0,01 М NaCl представлені в табл.2. Приведені відомі параметри води і знайдені різниці , , s між значеннями відповідних параметрів опроміненого і контрольного розчинів. Для розрахунку ступеня гідратації ДНК використовували значення коефіцієнта форми р=1,58 і питомого об'єму v=0,581 см3/г.

З табл.2 видно, що радіаційний вплив у дозі 19 Гр практично не впливає на досліджувані характеристики, а в дозі 370 Гр викликає достовірні зміни діелектричних властивостей. Кількість молекул зв'язаної води на нуклеотид зменшується на 4 (20%) у порівнянні зі ступенем гідратації н-ДНК. Цей ефект обумовлений, мабуть, порушеннями структури водного оточення, що відбуваються внаслідок радіаційної модифікації нативної конформації ДНК, про перекручування якої свідчить поява великого числа розривів водневих зв'язків – до 10% при 370 Гр (розраховано з даних Collyns B. et al., 1965). Виявлено, що збільшення радіаційної дози до 1650 Гр не приводить до посилення дегідратації.

Таблиця 2

Діелектричні параметри розчинів ДНК

Параметри,t=21°С | Вода | ДНК, с = 0,75%

Доза -опромінення, Гр | - | - | 19 | 370

(0,01) | 17,0

- | 16,9

0 | -

0,01 | -

0,03

(0,01) | 28,2

- | 27,8

0 | -

0 | -

0,07

(0,02)103, Ом-1 | 0 | 2,22 | 2,22 | 2,20

s

s(0,04) | 79,6

- | 78,3

0 | -

-0,04 | -

0,20

h(1) молек. води/нукл. | - | 19 | 19 | 15

Відомо, що в результаті -опромінення в сахарному фрагменті відбуваються такі процеси, як розщеплення зв'язків Н-Сn, виникнення радикалів Cn, поява эпімерів дезоксирибозила, у тому числі в конформації подібної З3-ендо в гуаніновом нуклеотиді в Z-ДНК. У випадку таких перетворень кут між N-глікозидним зв'язком і напрямком її первісної орієнтації досягає 80-100°, що істотно позначається на розташуванні основи в просторі. Структура гідратної оболонки ДНК, мабуть, також повинна помітно змінитися. Тому виявлене зменшення ступеня гідратації може вказувати на наступні пострадіаційні порушення:

1) зміни в головному жолобку умов формування водних містків між метильною групою тиміну і 5-фосфатами тих же нуклеотидів, а також містків між атомами кисню фосфатів ланцюга (на атом кисню приходиться до 5 молекул води), а також на порушення умови утворення бідентатних містків між атомами азоту й кисню двох сусідніх пар основ.

2) зміна в мінорному жолобку орієнтації основ, що руйнує водні містки між атомами О2 тиміну й атомами N3 аденіну.

3) Зміна стану тих молекул гідратного хребта, що примикають до дефектних ділянок кістяка або гідратного хребта.

Слід зазначити, що у випадку сополімеру poly(dG-dС)poly(dG-dС), в якому є подібна відмінність орієнтації сахару від його орієнтації в В_ДНК, кількість молекул зв'язаної води на нуклеотид складає тільки 9, а не 19 [Umehara T. et al., 1990].

Для з'ясування конформаційного стану опроміненої ДНК і стану її гідратно-активних центрів були отримані ІЧ спектри недейтерованих і дейтерованих плівок ДНК в області поглинання сахарофосфатного ланцюга й азотистих основ при 0%, 76% і 92% відносної вологості (ВВ). З рис.2,а видно, що при 76 і 92% ВВ смуги поглинання антисиметричного коливання фосфатних груп атомів (as=1221 см-1) і внутрішньокільцевих коливань азотистих основ (=1713 см-1) мають частоти характерні для спіральної В-форми ДНК.

На рис.2,б при тих же ВВ приведено спектри плівок опроміненої ДНК (_ДНК) в області поглинання сахарофосфатного ланцюга й азотистих основ. При 92% ВВ смуги симетричного (s=1086 см_) і антисиметричного (as=1223 см-1) коливань фосфатних груп і смуги поглинання внутрішньокільцевих коливань дезоксирибози при 1=1053 см-1 і 2=971 см-1 мають частоти характерні для спіральної конформації В-типу. Однак інтенсивності цих смуг відрізняються від інтенсивностей аналогічних смуг н-ДНК.

Рис. 2. ІЧ спектри недейтерованих плівок нативної (а) і опроміненої в дозі 1650 Гр (б) ДНК тимуса теляти в області поглинання сахарофосфатного ланцюга й азотистих основ при ВВ: 1 – 0%; 2 – 76%; 3 – 92%.

У табл.3 представлено результати розрахунків відносної інтенсивності за формулою

,

де і - оптичні щільності в максимумі поглинання смуги при 0 і 92% ВВ.

Таблиця 3

Відносна інтенсивність смуг поглинання груп атомів фосфатів і дезоксирибози нативної й -опроміненої ДНК

ОВ, % | Нативна ДНК | -опромінена ДНК

, см-1 | Віднесення | Dвідн., % | , см-1 | Віднесення | Dвідн., %

0

92 | 1242

1222 | 38,2(5) | 1243

1223 | 28,2(5)

0

92 | 1097

1087 | 70,0(5) | 1094

1086 | 54,8(5)

0

92 | 1068

1053 | 1 | 20,5(5) | 1067

1054 | 1 | 3,3(5)

0

92 | 963

971 | 2 | 91,1(5) | 965

971 | 2 | 37,5(5)

Видно, що у випадку як н-ДНК, так і _ДНК, при зміні ВВ від 0% до 92% смуги поглинання коливань фосфатних груп s і as зазнають низькочастотний зсув з одночасним ростом інтенсивності. Зменшення на 10-15% відносної інтенсивності цих смуг у випадку _ДНК у порівнянні з н-ДНК (при практично однакових частотних зсувах при зміні вологості) свідчить про меншу гідратацію фосфатних груп _ДНК. Цей ефект підтверджує висунуте положення про дегідратацію _ДНК за рахунок порушення умов формування водних містків за участю атомів фосфатних груп.

З табл.3 також видно, що при збільшенні вологості плівок н_ДНК і _ДНК від 0% до 92% смуга поглинання дезоксирибози 1 зазнає низькочастотний зсув відповідно на 15 і 13 см-1, а смуга 2 – високочастотний зсув відповідно на 8 і 6 см-1. Одночасно зростають їхні інтенсивності. При цьому в порівнянні з н-ДНК інтенсивності смуг 1 і 2 для _ДНК на 20-50% нижче, що говорить про меншу гідратацію її дезоксирибози.

З рис.2,а,б також видно, що при 92% ВВ частота конформаційно-чутливої смуги поглинання азотистих основ =1710 см-1 для _ДНК відрізняється від частоти тієї ж смуги =1713 см-1 для н-ДНК. Це свідчить про зміну структури азотистих основ.

На рис.3,а,б приведено спектри поглинання н-ДНК і _ДНК у D2O при 0% і 76% ВВ. Відомо, що перехід ДНК із неупорядкованого стану (при 0% ВВ) у спіральну конформацію (при 76% або 92% ВВ) супроводжується високочастотним зсувом і гіпохромізмом смуг поглинання поза- й внутрішньокільцевих коливаннь кратних зв'язків основ, що пов'язано з виникненням резонансних взаємодій коливальних моментів переходів при утворенні “стопок” основ (Семенов і ін., 1984,1988). Такий же ефект видно на рис.3,а для смуги гуаніну  см-1 і смуги  см-1, що відноситься до аденіну і частково цитозину.

З рис.3,б також випливає, що ІЧ гіпохромізм _ДНК істотно ослаблено: на аденінової і гуанінової смугах для н-ДНК він дорівнює 46 і 35%, а для _ДНК він падає до 12 й 15% відповідно. УФ гіпохромізм при   нм для _ДНК виявився менше (в 1,5 рази), ніж для н-ДНК.

Рис. 3. ІЧ спектри дейтерованих плівок нативної (а) і опроміненої в дозі 1650 Гр (б) тимусної ДНК в області поглинання азотистих основ при ВВ: 1 - 0%; 2 - 76%.

Звідси випливає, що упорядкована "стопочна" структура основ _ДНК у значній мірі розупорядкована. Більш радіочутливими є АТ-пари: для смуги поглинання аденіну гіпохромізм дорівнює 34%, а гуаніну - 18%. Цей ефект корелює з вищезгаданим передбачуваним руйнуванням водних містків на атомі N3 аденіну. Не виключено, що більш близьке розташування водного хребта в мінорному жолобку до АТ-послідовності створює умови для кращого руйнування стопочної АТ-структури за рахунок утворення у зв'язаній воді продуктів радіолізу.

У п'ятому розділі приведені результати вивчення впливу _випромінювання на комплекс ДНК із похідним актиноцину, ActII, що є аналогом протипухлинного препарату актиноміцину

У табл.4 представлені результати діелектричних вимірів розчинів чистої ДНК, ActІІ, комплексу Днк-ActІІ з відношенням P/D=5 і ?-опроміненого в дозі 800 Гр комплексу. Концентрація солі NaCl у розчинах складала 0,08 М. При розрахунку ступеня гідратації використовували значення коефіцієнта форми р=1,58 і значення питомого об'єму v=0,581 см3/г для ДНК, v=0,732 см3/г для ActІІ і v=0,619 см3/г для комплексу ДНК-ActІІ. Видно, що ступінь гідратації ДНК склал 15 молекул води на нуклеотид (що відповідає існуючим оцінкам), а ліганд має більш високу гідратну активність у порівнянні з нуклеотидом ДНК: з однією молекулою ActІІ пов'язано близько 22 молекул води. Значення h комплексу склало в перерахуванні на 1 нуклеотид 34 молекули води. Зростання ступеня гідратації комплексу в порівнянні з сумарним значенням величин h для ДНК і ActІІ з урахуванням P/D=5 означає, що зв'язування ДНК з ActІІ приводить до появи в гідратній оболонці комплексу додаткових зв'язаних молекул води. Гамма-опромінення в дозі 800 Гр приводить до зменшення величини h до 28 (~20%), що свідчить, як і у випадку опромінення чистої ДНК, про часткове руйнування гідратної оболонки. Опромінення викликає також зріст електропровідності на 10%, указуючи на викид додаткових іонів натрію в розчин унаслідок радіаційної деструкції комплексу.

Таблиця 4

Діелектричні характеристики розчинів ДНК, ActII, комплексу ДНК-ActII і _опроміненого комплексу ДНК-ActII

Параметри,t=21°С | Вода |

ДНК, с=0,47% | Act II,

с=0,38% | комплекс ДНК-ActII | комплекс ДНК-ActII,

800 Гр

(0,01) | 18,45

0 | -

0,05 | -

0,09 | -

0,04 | -

-0,10

(0,01) | 29,16

0 | -

0,21 | -

0,38 | -

0,52 | -

0,40

(0,01)103, Ом-1 | 0 | 2,20 | 0,73 | 2,97 | 3,30

s

s(0,04) | 78,53

0 | -

0,81 | -

0,73 | -

1,71 | -

1,50

h(1), молек. Н2O/нукл. | - | 15 | 22 | 34 | 28

Дані электрофорезу вказують на те, що чиста ДНК характеризується смугою, яка близька до смуги маркера 23130 п.н., а смуга комплексу ДНК-ActII відстає від смуги контрольної ДНК. Тобто молекулярна маса комплексу більше ніж у чистої ДНК. Денситометрична крива опроміненого комплексу вказує на фрагментацію зразка: при порівнянні з кривою маркера видно, що основна частка фрагментів має розмір (1?10)?103 п.н. Таким чином, можна думати, що дегідратація опроміненого комплексу пов'язана зі змінами його структури, як і у випадку опромінення чистої ДНК.

У шостому розділі дано результати вивчення змін діелектричних властивостей і гідратації ДНК, обумовлених впливом на живий організм радіонуклідів зони Чорнобильської АЕС. Досліджувалася ДНК з печінки щурів 6-го покоління, що постійно знаходилися протягом 12 місяців у 30 км зоні ЧАЕС.

Гель-электрофорез показав, що ДНК опромінених тварин (ч-ДНК) складається з високомолекулярної (~23·103 п.н.) і низькомолекулярної (~600 п.н.) фракцій, що вказує на те, що її полімерність значно нижче, ніж у н-ДНК (>48•103 п.н.). Однак у зразку практично немає фрагментів з довжиною менш сотні пар нуклеотидів, що виключає вплив кінцевих ефектів на ступінь взаємодії ДНК-розчинник.

З табл.5 видно, що значення , і s, що описують відмінності параметрів води від параметрів розчинів, помітно менше для ч-ДНК, ніж для н-ДНК. Розрахунок гідратації показує, що для ДНК, виділеної з печінки опромінених тварин, вона складає лише 14 молекул води на нуклеотид (на 25% нижче, ніж для н-ДНК). Оскільки раніше (розділ 4) аналогічна дегідратація спостерігалася для ДНК, опроміненої in vitro, можна думати, що й у цьому випадку відбувається деструкція ДНК: зміна структурного стану ланцюга й азотистих основ. Для з'ясування цього питання були проаналізовани ІЧ спектри в областях поглинання сахарофосфатного ланцюга й азотистих основ, які були одержани Семеновим М.О. (Семенов М.О. et al , 1994).

Таблиця 5

Діелектричні параметри води і розчинів ДНК

Параметри, t=23?C | Вода | н-ДНК,

с = 0,65% | ч-ДНК,

с = 0,65%

(0005) | 18,0

0 | -

0,12 | -

0,09

(001) | 28,8

0 | -

0,38 | -

0,31

o

s (00) | 78,8

0 | -

1,19 | -

1,02

h, молекул води/ нуклеотид | - | 19 | 14

З рис.4,а,б випливає, що з ростом ВВ спектральні параметри смуг поглинання коливань сахарофосфатного ланцюга ДНК значно змінюються, причому не однаково для ч-ДНК і н-ДНК. Так, у випадку н-ДНК інтенсивність смуги поглинання дезоксирибози 2=972 см-1 значно зростає, а для чорнобильського зразка такий ефект є відсутнім. Смуга поглинання коливання фосфатної групи as=1224 см-1 н-ДНК також зазнає зріст інтенсивності при збільшенні ВВ, а у випадку ч-ДНК інтенсивність цієї смуги збільшується незначно, але при 56% ОВ відбувається розщеплення смуги на дві - з частотами 1228 см-1 і 1240 см-1. Ці ефекти вказують на деспіралізацію опроміненої ДНК, що підтверджується й відсутністю в спектрі смуги 1=1055 см-1, характерної для спіральних молекул.

Рис. 4. ІЧ спектри недейтерованих плівок ДНК печінки неопромінених (а) і опромінених (б) щурів в області поглинання сахарофосфатного ланцюга при ВВ: 1 – 0%; 2 – 56%; 3 – 90%.

Вплив радіації на структуру ДНК підтверджується й істотним зменшенням (в ~3 рази) величини ІЧ-гіпохромізму смуг поглинання коливань азотистих основ (аденіну і гуаніну) в опроміненій ДНК у порівнянні з нативною. Це вказує на розрив частини структуроутворюючих зв'язків. Значні зміни спостерігаються в області поглинання коливань карбонільних груп основ, що також вказує на деструкцію макромолекули.

ВИСНОВКИ

1. Застосування ефективного та інформативного підходу з використанням методів диференціальної НВЧ діелектрометрії, кондуктометрії, ІЧ спектроскопії і гель-електрофорезу дозволило комплексно вивчити вплив іонізуючої радіації на стан водно-іонного оточення і структуру ДНК.

2. Знайдено, що при збільшенні дози -опромінення до 1650 Гр спостерігається зменшення ступеня гідратації однониткової poly(A). Достовірно зафіксована 35%-ва дегідратація зразка, опроміненого в дозі 1650 Гр. Виявлено, що для двониткової poly(A) спостерігається збільшення значення ступеня гідратації на 55% у порівнянні з контролем при опроміненні в дозі 670 Гр і на 30% при опроміненні в дозі 1650 Гр. Показано, що зміни величини гідратного оточення poly(A) обумовлені появою модифікованих основ, утворенням зшивок ланцюгів, а у випадку poly(AH+)·poly(AH+) – додатково переходом полінуклеотиду з двониткової конформації в однониткову.

3. Виявлено зменшення ступеня гідратації ДНК, опроміненої іn vіtro у високих дозах -радіації (до 1650 Гр). Установлено, що вплив -випромінювання приводить до деполімеризації ДНК, а дегідратація макромолекул пов'язана з частковою дегідратацією дезоксирибоз, фосфатних груп і порушенням стекінгу азотистих основ.

4. Вперше виміряні діелектричні властивості похідного актиноцину ActII і його комплексу з ДНК. Установлено, що ступінь гідратації ActII складає 22 молекули зв'язаної води, утворення комплексу ДНК з ActII супроводжується збільшенням гідратації, а ?-опромінення приводить до фрагментації і часткової (до 20%) дегідратації комплексу.

5. Вперше виявлено зменшення ступеня гідратації на 25% для ДНК, виділеної з печінки білих щурів 6-го покоління, що протягом 12 місяців постійно знаходилися в 30-км зоні ЧАЕС. Показано, що дегідратація ДНК обумовлена зменшенням гідратації сахарофосфатного ланцюга, а також порушенням стопочної структури азотистих основ і спіральної структури молекули. Виявлено наявність високо- і низькомолекулярної фракцій у ДНК печінки опромінених щурів.

СПИСОК ОПУБЛІКОВАНИХ ПРАЦЬ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Кашпур В.А., Дубовицкая О.В., Красницкая А.А., Малеев В.Я. КВЧ диэлектрометрический метод исследования -облученной ДНК // Радиофизика и электроника. - 1997. - Т.2. - №2. - С.153-155.

2. Кашпур В.А., Дубовицкая О.В., Красницкая А.А., Малеев В.Я. Влияние _облучения на состояние ион-гидратной оболочки ДНК // Вісн. Харк. ун-ту. - №410. - Біофізичний вісник. - 1998. - Вип.1. - С.111-115.

3. Дубовицкая О.В., Кашпур В.А., Малеев В.Я. Влияние -облучения на гидратацию полирибоадениловой кислоты // Вісн. Харк. ун-ту. - №450. - Біофізичний вісник. - 1999. - Вип.2. - С.88-91.

4. Хорунжая О.В., Семенов М.А., Кашпур В.А., Больбух Т.В., Красницкая А.А., Малеев В.Я. Гидратация и структурное состояние -облученной ДНК по данным инфракрасной спектроскопии и пьезогравиметрии // Вісн. Харк. ун-ту. - №525. - Біофізичний вісник. - 2001. - Вып.1(8). - С.37-41.

5. Кашпур В.А., Хорунжая О.В., Красницкая А.А., Малеев В.Я, Семенов М.А. КВЧ диэлектрическая проницаемость и структурные изменения ДНК из печени крыс, облученных в Чернобыльской зоне // Радиофизика и электроника. - 2001. - Т.6. - №2-3. - С.345-349.

6. Хорунжая О.В., Кашпур В.А., Красницкая А.А., Малеев В.Я. Гидратация производного актиноцина и его интактного и _облученного комплексов с ДНК по данным КВЧ диэлектрометрии // Вісн. Харк. ун-ту. - №593. - Біофізичний вісник. - 2003. - Вып.1(12). - С.20-23.

7. Дубовицька О.В., Кашпур В.А., Красницька А.А. Діелектричні властивості -опромінених розчинів ДНК // Тези доповідей ІІ з’їзду Українського біофізичного товариства. - Харків (Україна). - 1998. - С.347.

8. Dubovitskaya O.V, Kashpur V.A., Krasnitskaya A.A., Mаleev V.Ya. Using of the EHF method for investigation of radiation-induced changes in DNA hydration shell // Proc. Third International Kharkov Symposium "Physics and Engineering of Millimeter and Submillimeter Waves" (MSMW'98). - Kharkov (Ukraine). - 1998. - P.748-750.

9. Хорунжая О.В., Семенов М.А., Кашпур В.А., Больбух Т.В., Красницкая А.А., Малеев В.Я. Влияние -облучения на структуру ДНК и ее гидратное окружение // Материалы V Международной конференции "Физические явления в твердых телах". - Харьков (Украина). - 2001. - С.76.

10. Gatash S., Gorobchenko O., Khorunzhaya O., Kashpur V., Maleev V. Dielectric permittivity of heterogeneous disperse systems with particles of various shapes and structure under influence of physical factors // Book of abstracts. 2nd International Conference on Broadband Dielectric Spectroscopy and its Applications. - Leipzig (Germany). - 2002. - P.T55.

11. Кашпур В.А., Красницька А.А., Семенов М.О., Хорунжа О.В. Вплив опромінення в зоні ЧАЕС на структуру і гідратне оточення ДНК з печінки щурів // Тези доповідей IІІ з'їзду Українського біофізичного товариства. - Львів (Україна). - 2002. - С.22.

АНОТАЦІЯ

Хорунжа О.В. Іон-гідратне оточення і структурні особливості опроміненої ДНК. – Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата фізико-математичних наук за спеціальністю 03.00.02  біофізика. – Харківський національний університет ім. В.Н. Каразіна, м. Харків, 2004.

Дисертація присвячена експериментальному вивченню впливу іонізуючої радіації на іон-гідратну оболонку і структуру ДНК. Робота виконана за допомогою комплексу сучасних фізичних методів (диференціальна НВЧ діелектрометрія, ІЧ спектроскопія, гель-електрофорез і ін.). Установлено, що ?-опромінення іn vіtro у дозах 370-1650 Гр приводить до значних змін структури і ступеня гідратації poly(A) і ДНК. Виявлено значні зміни стану гідратної оболонки і структури ДНК, виділеної з печінки щурів, підданих хронічному опроміненню в умовах зони ЧАЕС. Знайдено, що кількість зв'язаних з опроміненою ДНК молекул води зменшується на величину до 25%. Визначено параметри водно-іонної оболонки похідного актиноцину – актиноцил-біс-(2-діметиламіноетил) аміну (ActII), комплексу ДНК-ActII і зміни в них під дією -радіації.

Ключові слова: ДНК, гідратація, іонізуюча радіація, структура біополімеру, НВЧ діелектрометрія, ІЧ спектроскопія, гель-електрофорез.

АННОТАЦИЯ

Хорунжая О.В. Ион-гидратное окружение и структурные особенности облученной ДНК. – Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук по специальности 03.00.02  биофизика. Харьковский национальный университет им. В.Н. Каразина, г. Харьков, 2004.

Для выяснения причин и конкретных механизмов нарушения биохимических и физиологических процессов в облученном организме необходимо изучение пострадиационных изменений в структуре и функционировании биологически значимых макромолекул. Особенно важным является выявление структурных изменений в молекуле ДНК, поскольку ее повреждение носит генетический характер и может вызвать онкологические заболевания. К настоящему времени характер радиационных изменений молекулы ДНК выяснен достаточно детально – это появление одно- и двунитевых разрывов, модификация азотистых оснований и сахарного фрагмента, образование сшивок. Однако многие аспекты радиационного поражения ДНК все еще мало или совсем не изучены. Как известно, в стабилизации спиральной структуры нуклеиновых кислот большую роль играет гидратно-ионное окружение. В некоторых экспериментальных работах была обнаружена зависимость радиационного эффекта от соотношения 'вода – ДНК' в образце, но не изучалась связь между структурой облученной ДНК и ее гидратной оболочкой. Практически ничего не известно о вызванных излучением изменениях во взаимодействии ДНК с водным окружением.

Поэтому целью диссертационной работы являлось выяснение роли гидратации в пострадиационных изменениях структуры молекул ДНК, poly(A) и комплекса ДНК-ActII. Изучали водные растворы промышленно-выделенных биополимеров и комплекса ДНК-ActII, облученные ?-квантами 60Со; растворы ДНК, выделенной из печени крыс, подвергнутых комбинированному облучению в реальных условиях зоны ЧАЭС, а также приготовленные из этих растворов пленки биополимеров. Применение комплексного подхода с использованием различных экспериментальных методов позволило впервые с разных сторон описать взаимодействие биополимер  вода и соответствующие структурные изменения, вызванные облучением. Для оценки общей величины гидратной оболочки макромолекул применялись методы дифференциальной КВЧ диэлек-трометрии и пьезогравиметрии, для определения конформации биополимера и состояния его гидратно-активных центров использовался метод ИК спектроскопии, для определения степени полимерности нативных и облученных образцов ДНК применялся метод гель-электрофореза, для изучения изменения ионного окружения макромолекул использовался метод кондуктометрии.

Изучено воздействие -радиации на диэлектрические свойства и степень гидратации полирибоадениловой кислоты. Методом дифференциальной диэлектрометрии в миллиметровом диапазоне длин волн получены данные о комплексной диэлектрической проницаемости водных растворов poly(A) в одно- и двухцепочечной конформации при различных дозах -облучения. Обнаружено, что облучение в дозе 1650 Гр вызывает снижение степени гидратации односпирального полинуклеотида на 35%. Облучение двухспирального полинуклеотида в дозе 670 Гр приводит к увеличению значения степени гидратации на 55%, а в дозе 1650 Гр – на 30% по сравнению с контролем. Показано, что наблюдаемые эффекты можно объяснить образованием модифицированных оснований, возникновением сшивок цепей, а в случае двунитевого poly(A), кроме того, переходом полимера в односпиральную конформацию.

Методом КВЧ диэлектрометрии обнаружено уменьшение степени гидратации ДНК, облученной in vitro в высоких дозах -радиации (>350 Гр). Методами ИК спектроскопии и пьезогравиметрии проведено сравнительное исследование структурного состояния и гидратации -облученной и нативной ДНК в пленках при различной относительной влажности. Полимерность образцов определена методом гель-электрофореза. Установлено, что воздействие _излучения на ДНК привело к значительному уменьшению степени ее