КИЇВСЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ імені ТАРАСА ШЕВЧЕНКА

КУЦИН

ОЛЕНА БОРИСІВНА

УДК: 582.26 (262.5):577:661.185.6:581.5 (043)

ОСОБЛИВОСТІ ФУНКЦІОНУВАННЯ ВОДОРОСТЕЙ-МАКРОФІТІВ ЧОРНОГО МОРЯ В УМОВАХ ЗАБРУДНЕННЯ ВОДНОГО СЕРЕДОВИЩА ДЕТЕРГЕНТАМИ

03.00.12 фізіологія рослин

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Київ 2004

Дисертацією є рукопис

Робота виконана на кафедрі ботаніки Одеського національного університету

ім. І.І. Мечникова

Науковий керівник: кандидат біологічних наук, доцент

Ткаченко Федір Петрович

Одеський національний університет

імені І.І. Мечникова,

доцент кафедри ботаніки

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор,

членкор НАН України

Мусатенко Людмила Іванівна

Інститут ботаніки імені М.Г. Холодного НАН України

Завідувач відділу фітогормонології

Доктор біологічних наук, доцент

Паршикова Тетяна Вікторівна

Київський національний університет

Імені Тараса Шевченка,

Професор кафедри фізіології

та екології рослин

Провідна організація: Донецький національний університет,

Міністерство освіти та науки України

Захист дисертації відбудеться 21 червня 2004 року о 16 00 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.001.24 Київського національного університету імені Тараса Шевченка за адресою: м. Київ, пр-т Глушкова 2, корпус 12, біологічний факультет, ауд. 434.

Поштова адреса: 01033, Київ-33, вул. Володимирська, 60, спецрада Д. 26.001.24, біологічний факультет

З дисертацією можна ознайомитися у бібліотеці Київського національного університету імені Тараса Шевченка за адресою: м. Київ, вул. Володимирська, 58

Автореферат розісланий 20 травня 2004 р.

Вчений секретар

Спеціалізованої вченої ради Андрійчук Т.Р.

Актуальність теми. В останні десятиліття значення антропогенного фактору в забрудненні навколишнього середовища й погіршенні гідрохімічних показників якості води Чорного моря стає основним. Його вплив у ряді випадків має катастрофічні для біоти наслідки (Зайцев, 1992). Водорості відіграють важливу роль в процесах біологічного самоочищення забруднених вод, а також виступають важливими індикаторними організмами при проведенні екологічного моніторингу (Калугина-Гутник, 1975; Водоросли ..., 1989).

До числа широко розповсюджених і небезпечних забруднювачів морського середовища відносять синтетичні миючі засоби (СМЗ), що потрапляють у морське середовище зі стічними водами (Паршикова, 2002). Обсяг викидів стічних вод у Чорне море складає в цілому по Україні 265 млн. м3/рік, а по Одеському регіону 135,7 млн. м3/рік (Долинский и др., 1999). Разом з ними у Чорне море надходить велика кількість забруднюючих речовин: близько 400 тис. т біогенних речовин, 2 млн. т органічних сполук, 410 тис. т нафтопродуктів, 20 тис. т детергентів, 700 т летких фенолів та ін. (Виноградов, 1987; Долинский и др., 1999) У цілому ж по Одеській затоці (Ilyin …, 2000) за останні роки, у залежності від сезону, вміст детергентів нерідко перевищував гранично допустиму концентрацію (100 мкг/л) у 6 -9 разів. Однак, механізми впливу останніх як самостійно, так і в комплексі з іншими типами забруднення на формування альгоценозів морських макрофітів не з’ясовані. Зокрема, недостатньо вивчені фізіолого-біохімічні основи процесів адаптації клітин водоростей-макрофітів Чорного моря до впливу забруднення водного середовища детергентами. З’ясування цих питань необхідно не лише для оцінки толерантності найбільш поширених видів водоростей до даного типу забруднення, але й для інтенсивного розвитку аквакультури на морському шельфі.

Зв'язок роботи з науковими програмами. Дисертаційна робота виконувалася в межах бюджетної теми науково-дослідної роботи кафедри ботаніки Одеського національного університету "Еколого-біологічне вивчення наземної та водної флори Північно-Західного Причорноморя з метою охорони, раціонального використання та управління продукційним процесом". № реєстрації ОНУ 194; № держреєстрації 0100U005407, в якій дисертантка була співвиконавцем.

Мета і завдання дослідження. Метою нашої роботи було з’ясувати особливості перебігу фізіолого-біохімічних реакцій водоростей-макрофітів в умовах забруднення морського середовища детергентами та можливість їх використання як індикаторних організмів для біотестування забруднення даними полютантами й введення в аквакультуру.

Для досягнення поставленої мети необхідно було вирішити наступні завдання:

1.Дослідити фізіологічні реакції найбільш поширених представників домінуючих відділів водоростей-макрофітів на забруднення водного середовища детергентами як окремо, так і в суміші з нафтою й важкими металами, за фотосинтетичною активністю водоростей та вмістом основних груп пігментів;

2.Визначити продуктивність альгоценозів в умовах комплексного та самостійного забруднення детергентами за:

темпами приросту біомаси і морфологічної мінливості клітин;

динамікою вмісту вітаміну С;

вмістом в клітинах водоростей білків, найважливіших амінокислот, як показників якості білків.

3.Провести порівняльну оцінку стійкості досліджуваних видів водоростей до дії детергентів як окремо, так і в умовах комплексного забруднення та визначити їх роль як можливих біоіндикаторів;

4.Застосувати фізіолого-біохімічні реакції водоростей-макрофітів для встановлення ступеню забруднення районів Одеської затоки детергентами.

Об’єкт дослідження функціонування та продуктивність водоростей-макрофітів в умовах забруднення водного середовища детергентами.

Предмет дослідження фізіолого-біохімічні параметри водоростей-макрофітів як біоіндикаторів детергентного забруднення.

Методи дослідження застосування біохімічних методів визначення пігментів, фотосинтетичної активності, білків та їх амінокислот, вітаміну С, редукуючих цукрів, методи спектрофотометрії та іонообмінної хроматографії, статистичного аналізу та математичної обробки даних.

Наукова новизна отриманих результатів. Вперше проведено комплексне дослідження фізіолого-біохімічних параметрів морських водоростей-макрофітів під впливом детергентів, як самостійно, так і в в комплексі з іншими полютантами (нафта, детергенти і ВМ).

Визначено ступінь впливу детергентів як окремо, так і в комплексах забруднювачів на фотосинтетичну активність, пігментну систему, парметри біопродуктивності альгоценозів. Виявлено типи морфологічних аномалій клітин водоростей (на прикладі кладофори), що викликані забрудненням водного середовища. Доведено, що у водоростей цієї екологічної групи немає специфічних реакцій на дію поверхнево активних речовин.

Вперше (за стандартами ФАО/ВООЗ) дана оцінка зміни якості білків морських водоростей-макрофітів при забрудненні морського середовища не лише самостійними детергентами, але й в їх суміші з нафтою та ВМ.

Встановлено, що детергенти за рядом параметрів ФАО/ВООЗ переважно знижують біологічну цінність білків водоростей. Виявлено синергізм дії детергентів у комплексі з іншими типами забруднення. Визначені відміни у чутливості різних видів багатоклітинних водоростей до забруднення водного середовища детергентами.

Практична значимість отриманих результатів. Проведено порівняльний аналіз фізіолого-біохімічних параметрів водоростей-макрофітів з метою виявлення чутливих біомаркерів впливу забруднення водного середовища детергентами.

Доведено, що детергенти є істотним фактором, який негативно впливає на фотосинтетичну активність макроводоростей і на загальну продуктивність моря в цілому. В умовах забруднення водного середовища детергентами й іншими полютантами не лише змінюється якість води, але й погіршується якість водоростевих білків та їх біологічна повноцінність. Це дає підставу вважати, що виявлені зміни є однією з причин не лише зниження потенційної продуктивності донних фітоценозів, але й відмирання морських макрофітів як важливого ланцюга самоочищення й формування продуктивності водних екосистем. Дана оцінка ступеня забруднення Одеської затоки. Рекомендовані фізіолого-біохімічні параметри для моніторингу забрудненості морських донних ценозів.

Отримані результати досліджень стали основою нового розділу курсу "Нижчі рослини" (розділ водорості), спецкурсу "Альгологія" і великого спецпрактикуму. Крім того, отримані дані ввійшли до методичної розробки Одеської філії Інституту біології південних морів НАН України з моніторингу стану морських водних систем.

Особистий внесок здобувача. Особистий внесок здобувача у виконаній роботі полягає в підготовці й проведенні експериментальних досліджень, інтерпретації отриманих результатів, підготовці публікацій за темою дисертації. Всі експериментальні матеріали, використані в дисертації, отримані особисто автором або з його участю. Текст дисертації й автореферату написаний автором особисто,але інтерпретації окремих результатів і закономірностей подані з урахуванням порад наукового керівника та інших фахівців.

Апробація роботи. Результати наукової праці були представлені на міжнародних наукових конференціях "Екологічні проблеми Чорного моря" (Одеса, ОЦНТІ, 1999, 2000), науково-практичній конференції "Екологічні проблеми водних екосистем та забезпечення безпеки життєдіяльності на водному транспорті" (Одеса, 2001), XI з'їзді Українського ботанічного товариства (Харків, 2001), на наукових семінарах біологічного факультету ОНУ (2001, 2002).

Публікації. За темою дисертації опубліковано 8 наукових праць, з них 4 статті в спеціальних виданнях з рекомендованого переліку ВАКу України.

Структура та об’єм дисертації. Дисертаційна робота складається із вступу, 5 розділів, висновків та списку літератури. Загальний об’єм роботи 133 сторінки, включаючи 21 таблицю та 30 рисунків. Список використаної літератури містить 233 джерела, 61 з яких на іноземних мовах.

МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ

Характер впливу синтетичних миючих засобів (детергентів) як самостійно, так і в комплексі з іншими типами забруднення, розповсюдженими в Одеській затоці (нафтою і важкими металами), визначали методом біотестування в лабораторних умовах.

Об’єктом досліджень були типові для Чорного моря представники водоростей-макрофітів: з Clorophyta Cladophora vagabunda (L.) Hoek та Enteromorpha intestinalis (L.) Link. та Rodophyta Ceramium rubrum (Huds.) Ag. і Porphyra leucosticta Thur.

Проби відбирали в Одеській затоці Чорного моря (Дача Ковалевського, Біостанція ОНУ та торговий порт) у період іх активного росту на глибині 0,3 – 0,5 м на горизонтальних поверхнях каменів і бетонних споруд (причалах, хвилеломах, дамбах). Ідентифікацію видів водоростей проводили за визначником А.Д. Зинової (1967).

Досліди проводили в чашках Петрі з об’ємом морської води 40 мл, вихідна наважка водоростей 500 мг. Водоростімакрофіти вирощували при температурі 20 22 є? і природному режимі освітлення. Біологічна повторюваність дослідів п'ятикратна. Як об’єкти тестування СМЗ були використані детергенти "Лотос" та "Е" у концентраціях 100 (гранично допустима концентрація (ГДК)), 500 та 1000 мкг/л. Використані концентрації детергентів відповідали реальним, які реєструються в досліджуваних природних водах (Ilyin, 2000).

Хімічний склад детергентів у %: "Лотос" ПАР (алкілсульфати, сульфанол) 20, триполіфосфат Na 40, силікат Na 30, алкілоламіди 2, КМЦ 2, сульфат Na 2,7; оптичний відбілювач 0,1, віддушка 0,1, вода; "Е" АПАР і відбілюючий агент 15, НПАР і фосфонат до 5, фосфат до 15, сульфат, карбонат Na 30, антивспінювач, КМЦ 2, ензими 3,5 5 оптичний висвітлювач, віддушка, вода (Справочник ..., 1984).

Для визначення впливу комплексного забруднення на обрані види водоростей була використана суміш токсикантів, яка складалась зі СМЗ "Е", нафти та іонів міді (CuSO4) в 3-х концентраціях: 1) 0,02 мл/л нафти, 100 мкг/л СМЗ "Е" і 5 мкг/л міді (суміш із ГДК кожного інгредієнта суміш 1); 2) - 0,1 мл/л нафти, 500 мкг/л СМЗ "Е" і 25 мкг/л міді (концентрація полютантів, збільшена в 5 разів суміш 2); 3) - 0,2 мл/л, 1000 мкг/л і 50 мкг/л, відповідно (збільшення в 10 разів суміш 3).

Контрольні рослини експонувалися в чистій морській воді. Визначення приросту біомаси водоростей, зміну розчинів детергентів і комплексу забруднювачів проводили щотижнево. На 21 день досліду (для окремих детергентів) та на 15 день (для комплексного забруднення) в клітинах зелених водоростей визначали вміст суми хлорофілів а+b та суму каротиноїдів за допомогою спектрофотометра СФ-10 (Методы …, 1987), інтенсивність фотосинтезу за методом Вінклера, кількість аскорбінової кислоти за методом Прокошева (Методы …, 1975), вміст білків водоростей визначали за кількістю азоту, з коефіцієнтом перерахунку 6,25. Амінокислотний склад водоростевих білків визначали методом іонообмінної хроматографії на амінокислотному аналізаторі “Н - 835” Hitachi (Японія) (Методы …, 1987). Біологічну цінність білка досліджуваних водоростей оцінювали за відповідними стандартами ФАО/ВООЗ, співвідношенням лейцин/ізолейцину, незамінних/замінних амінокислот (Покровский, 1975). Морфологічні особливості клітин тестованих водоростей визначали за допомогою світлового мікроскопу Ergaval (Carl-Zeiss., Jena, ФРН). Фотографування об'єктів здійснювали за допомогою фотоапарата "Зеніт Е" і фотонасадки МФН-3.

Екологічний стан трьох різних за ступенем забруднення районів Одеської затоки Дача Ковалевського, Біостанція ОНУ та торговий порт оцінювали за такими біохімічними показниками водоростей: вмістом редукованих цукрів, вітаміну С , білків, їх якості та амінокислотного складу (Методы …, 1975). Вміст важких металів визначали на атомно-адсорбційному спектрофотометрі ААS-3 (Німеччина). Статистичну обробку отриманих даних проводили за допомогою комп'ютерної програми STATISTICA 5.0 for Windows.

ФІЗІОЛОГО-БІОХІМІЧНІ ПАРАМЕТРИ ВОДОРОСТЕЙ-МАКРОФІТІВ В УМОВАХ ЗАБРУДНЕННЯ ВОДНОГО СЕРЕДОВИЩА ОКРЕМИМИ ДЕТЕРГЕНТАМИ І КОМПЛЕКСОМ ЗАБРУДНЮВАЧІВ (НАФТА, ВМ І ДЕТЕРГЕНТИ)

Пігментна система. Як відомо (Рейвн та ін., 1990), визначальним моментом у біопродукційних процесах водоростей є функціонування в процесі фотосинтезу їх пігментних систем.

Дослідження дії СМЗ на тестовані водорості Cladophora vagabunda (L.) Hoek, Enteromorpha intestinalis (L.) Link. виявили, що детергенти помітно впливали на функціонування їх пігментної системи. Так, при впливі детергенту "Лотос" з невисокою концентрацією в клітинах C. vagabunda спостерігається підвищення вмісту суми хлорофілів а+b на 17% від контролю. Зі збільшенням же концентрації полютанту до 1000 мкг/л вміст зелених пігментів істотно зменшується (на 21%) (Р 0,05) (рис.1. А).

Каротиноїди є природними протекторами зелених пігментів (Лук'янова, Шмідт, 1993). Підвищення вмісту каротиноїдів у клітинах водоростей є одним із шляхів їх адаптації до забруднення. Нами встановлено, що зі збільшенням концентрації СМЗ "Лотос" до 1000 мкг/л сума каротиноїдів у клітинах випробуваної водорості збільшується й перевищує контроль на 50 % (Р 0,05) (рис. 1. А). При цьому співвідношення суми хлорофілів до каротиноїдів зменшується від контрольного показника (5) на 48 % (2,6). Цей факт свідчить про токсичну дію детергенту.

Рис. 1. Вплив детергентів "Лотос" (А), "Е" (Б) та комплексного забруднення (В) на вміст пігментів у Cladophora vagabunda (L.) Hoek.

Примітка: тут і на рисунку 2 сума хлорофілів a+ b; сума каротиноїдів; 1 суміш 1, 2 суміш 2 * відмінності від контролю і ** відмінності між варіантами досліду вірогідні при Р 0,05;

В E. intestinalis спостерігалась інша реакція на дію цього детергенту. Вміст суми зелених пігментів у клітинах даної водорості зі збільшенням концентрації СМЗ "Лотос" до 1000 мкг/л перевищував контроль на 12 % (Р 0,05), відповідно (рис. 2. А). Проте в клітинах даної водорості спостерігається і зростання сумарного вмісту каротиноїдів. Співвідношення зелених пігментів до каротиноїдів з підвищенням концентраціїї полютанта до 1000 мкг/л зменшується від контрольного показника на 25 % що, як і для попереднього виду, свідчить про погіршення стану водорості.

Дещо інша реакція спостерігалася у досліджуваних водоростей при дії на них СМЗ "Е". В клітинах C. vagabunda під впливом цього полютанту з концентрацією

500 мкг/л спостерігалось збільшення вмісту як суми хлорофілів (на 18 % від контролю) так і каротиноїдів (на 60 %). Їх показники були значно вищими при цій концентрації, ніж у варіанті з детергентом "Лотос" (рис. 1. Б). Але з підвищенням концентраціїї детергенту до 1000 мкг/л співвідношення суми хлорофілів до каротиноїдів зменшувалось від контрольного на 50 %. Тобто висока концентрація даного детергенту спричинила більш токсичний вплив ніж СМЗ "Лотос".

У E. intestinalis вміст суми зелених пігментів із збільшенням концентрації детергенту "Е" перевищував показник контрольних рослин від 35% (при 100 мкг/л) до 65% (при 1000 мкг/л) (Р 0,05) (рис. 2. Б). Сума каротиноїдів – майже не змінювалася, тобто їх співвідношення до зелених пігментів постійно зростало. Це свідчить про те, що детергент "Е" спричинив більш стимулюючий вплив на дану водорість ніж СМЗ "Лотос".

Підвищений вміст зелених пігментів у водоростях, які знаходились під впливом невисоких концентрацій детергентів, може бути пов’язаний з адаптацією організму до зниженої інтенсивності освітлення (Муравйова, 2002).

Таким чином, пігментні системи досліджуваних нами видів водоростей чітко реагують на токсичну дію детергенту. За даним показником до більш вразливих можна віднести C. vagabunda, а до більш толерантних E.intestinalis.

При дослідженні впливу детергентів на біохімічні параметри водоростей-макрофітів варто враховувати те, що в природному середовищі (морській воді) гідробіонти, у тому числі й макрофіти, знаходяться під впливом суміші різних полютантів (нафти, ВМ, детергентів тощо). Комплекс цих забруднювачів часто здійснює більш токсичний вплив на гідробіонтів, ніж кожний з них окремо (Ставська, 1981; Паршикова та ін., 1988).

При впливі на тестовані водорості комплексного забруднення нами було встановлено, що суміш детергенту, нафти та іонів міді з концентрацією, що відповідає ГДК кожного токсиканту (суміш 1), викликала зниження вмісту суми хлорофілів в клітинах тестованої водорості C. vagabunda на 51 % (Р 0,05) у порівнянні з контролем (Р 0,05). У той же час відомо, що нафта (Ткаченко та ін., 1983), Cu2+ (Величко, 1984) і детергенти (Куцин, 2001) в однофакторних експериментах з концентраціями токсикантів, які дорівнюють ГДК, не викликали змін вмісту цих пігментів у клітинах Cladophora Kutz. З підвищенням концентрації суміші токсикантів у 5 разів (суміш 2) вміст суми хлорофілів зменшувався на 59 % відповідно від контролю (Р 0,05) (рис. 1 В).

Сумарний вміст каротиноїдів у клітинах тестованої водорості з підвищенням концентрації суміші (у 5 разів) також значно знижувався (на 80 % від контрольного показника (Р 0,05). Це свідчить про те, що стан клітин C. vagabunda при дії суміші токсикантів був критичним.

Зменшення вмісту пігментів в клітинах водорості може бути пов’язане з тим, що іони міді інактивують ферменти, які беруть участь у синтезі пігментів (Горбунов, 1993). Крім того, іони міді здатні заміщувати іони магнію у молекулі хлорофілу. Це призводить до порушення світлоконцентраційної функції пігментної системи (Kupper et al., 1996).

E. intestinalis під впливом суміші токсикантів виявила більшу стійкість, ніж C. vagabunda, оскільки вміст суми хлорофілів в її клітинах збільшувався й перевищував контроль на 60 % (суміш 2) (рис. 2. В). Вміст каротиноїдів під впливом суміші 2 різко збільшувався й перевищував показник контрольних рослин в 2,5 рази (Р 0,05). Можливо, у даному випадку спостерігається захисна реакція водорості на забруднення.

Висока концентрація (суміш 3) викликала загибель тестованих водоростей.

Проведені нами дослідження показали, що пігментна система водоростей-макрофітів виявила видові особливості реакцій водоростей-макрофітів на забруднення водного середовища окремими детергентами та сумішшю полютантів.

Інтенсивність фотосинтезу. Безумовно, описані зміни у динаміці вмісту пігментів в таломах водоростей, що знаходилися під впливом полютантів, не можуть не впливати на продуктивність, яка реалізуюється в процесі фотосинтезу (Паршикова, 2002).

Інтенсивність фотосинтезу (ІФ) зелених (C. vagabunda, E. intestinalis) і червоних водоростей (C. rubrum і P. leucosticta) як в однофакторному, так і в багатофакторному експериментах вивчали з використанням 3-х годинних експозицій: 1, 3 і 4 години.

Нами було встановлено, що в C. vagabunda ІФ під впливом мінімальних концентрацій миючих засобів "Лотос" і "Е" через 1 годину тестування була меншою від контрольного показника на 17 %. Зі збільшенням концентрацій детергентів до 1000 мкг/л і часу тестування до 4 годин, показник ІФ даної водорості зменшився на 63 і 65 %, відповідно від контролю.

Дещо інша реакція спостерігалася в E.intestinalis, що знаходилася в розчині СМЗ "Лотос": при концентрації 100 мкг/л за 1 годину експонування відзначався стимулюючий ефект на життєдіяльність водорості (ІФ перевищувала контроль на 32 %), але зі збільшенням часу тестування до 4 годин й концентрації детергенту до 1000 мкг/л ІФ знижувалася на 67 % в порівнянні з контролем.

Детергент "Е" діяв на ІФ випробуваної водорості більш токсично. Наприкінці тестування (4 години) при концентрації полютанту 1000 мкг/л ІФ E. intestinalis зменшувалася на 83 % від контролю.

В умовах дії комплексного забруднення на C. vagabunda і E. intestinalis нами було встановлено, що зі збільшенням часу експозиції до 4-х годин і концентрації суміші в 5 разів показник ІФ тестованих водоростей зменшувався: у C. vagabunda на 70 % від контролю, а в E. Intestinalis 89 % (Р 0,05).

Відмінності в реакції водоростей на вплив детергентів і комплексного забруднення за показниками ІФ спостерігались і серед червоних водоростей Ceramium rubrum і Porphyra leucosticta. Так, при дії детергентів "Лотос" та "Е" з концентраціями 500 і 1000 мкг/л вже через 1 годину експонування показник ІФ C. rubrum знизився стосовно контролю на 20 і 46 % ("Лотос") і на 42 і 47 % ("Е"), відповідно (Р 0,05). Зі збільшенням часу тестування (до 4 годин) ІФ знижувалася й складала у варіанті зі СМЗ "Лотос" 50 %, а у варіанті зі СМЗ "Е" 38 % від контролю.

Показник ІФ у Porphyra leucosticta під впливом детергентів також характеризувався обернено пропорційною залежністю від їх концентрації: зі збільшенням концентрації полютантів (до 1000 мкг/л) і часу тестування (до 4-х годин) ІФ водорості суттєво знижувалася (Р 0,05). Як свідчать одержані дані, досліджувана водорість виявилася менш стійкою до дії забруднювачів, ніж інші тестовані водорості-макрофіти.

При впливі суміші токсикантів на тестовані червоні водорості їх показник ІФ зі збільшенням концентрації суміші в 5 разів і часу тестування до 4 годин закономірно знижувався.

Збільшення концентрації суміші в 10 разів виявилося для тестованих водоростей (як зелених, так і червоних) високо токсичним. Внаслідок цього процес фотосинтезу реєструвався на дуже низькому рівні й тільки протягом 1 години експонування.

Таким чином, ми встановили, що суміш полютантів в усіх концентраціях негативно впливає на процес фотосинтезу досліджуваних водоростеймакрофітів.

Отримані нами дані свідчать про те, що окремо взяті детергенти в меншій мірі негативно впливають на фотосинтетичну активність пігментної системи досліджуваних водоростей-макрофітів, ніж у взаємодії з іншими полютантами.

Зі збільшенням концентрації полютантів їх негативний вплив підсилюється незалежно від видових характеристик водоростей.

Вміст білків, їх амінокислотний склад і біологічна цінність. Відомо (Паршикова, 1988), що детергенти порушують цілісність мембранних структур клітин водоростей. Це призводить до посилення проникності останніх й нагромадження в них чужорідних хімічних речовин. За рахунок своєї гідрофільної частини молекули ПАР взаємодіють з білками, порушуючи їх нативну конфігурацію. Ліпофільною гідрофобною частиною молекули ПАР взаємодіють з ліпідами (Микробиологическая ..., 1988).

Аналізуючи отримані нами дані щодо впливу детергентів на вміст білків тестованих водоростей C. vagabunda і E. intestinalis у різних варіантах досліду, ми відзначаємо, що даний показник не перевищує контроль й при збільшенні концентрації детергентів ("Лотос" і "Е") до 1000 мкг/л зменшується лише на 5 та 9 %, відповідно.

Під впливом суміші токсикантів було встановлено, що вміст білка в C.vagabunda зменшився в порівнянні з контролем на 36 (суміш 1) і 43 % (суміш 2). Зниження вмісту білка даної водорості може свідчити про стресовий стан досліджуваного виду водорості.

В E. intestinalis суміш полютантів 1 і 2 підвищувала вміст білка у порівнянні з контролем на 57 і 29 %. У даному випадку у водорості чітко спостерігалася захисна реакція на забруднення.

Таке підвищення вмісту білка в клітинах даної водорості узгоджується з відомими даними (Муравйова, 2002; Анцупова, 1989; 1999; Munda, 1986) про те, що в районах з великим антропогенним навантаженням у гідробіонтів (як у тварин, так і у водоростей) спостерігається підвищений вміст білкових речовин, ліпідів, вільних амінокислот, мікроелементів і каротиноїдів, тобто мають місце процеси формування захисних реакцій, які сприяють виживанню водоростей-макрофітів.

У складі білка C. vagabunda, що знаходиться під впливом детергентів та комплексного забруднення, нами було виявлено 17 амінокислот, з них 8 незамінних. В E. intestinalis 16 амінокислот, з яких 7 були незамінними.

Переважними амінокислотами в клітинах тестованих водоростей є глутамінова, аспарагінова, лейцин, пролін і аланін. Вони відіграють важливу роль в осморегуляції клітин і детоксикації шкідливих речовин, що надходять у них (Анцупова та ін., 1989). З наростанням концентрації детергентів і суміші полютантів вміст даних амінокислот збільшується, тобто виявляється захисна реакція водоростей на дію забруднювачів. Підвищення вмісту цих амінокислот, а також лізину, визначається, напевно, їх важливою (позитивною) роллю в адаптаційних процесах (Анцупова, 1999).

Нами встановлено, що детергенти як в однофакторному, так і в багатофакторному експериментах, також впливають на якість водоростевих білків, в основному знижуючи їх біологічну цінність.

Відомо, що біологічна цінність білків залежить не тільки від масової частки незамінних амінокислот, але й від вирівняності їх хімічного скору (відношення масової частки амінокислоти до еталону ФАО/ВООЗ у %) (Покровський, 1975). За складом незамінних амінокислот (8) білок тестованих водоростей є повноцінним, але незбалансованим за показниками їх хімічного скору. Скор окремих незамінних амінокислот у різних варіантах досліду, як в однофакторному, так і в багатофакторному, змінювався в широких межах (табл. 1.). Більш нестабільним був білок водоростей, які знаходилися під впливом СМЗ "Е" і комплексного забруднення.

Серед незамінних амінокислот лімітуючою (що визначає засвоюваність білка організмом у %) є метіонін (Покровський, 1975). СМЗ "Лотос" при малій концентрації (100 мкг/л) підвищував вміст даної амінокислоти у C. vagabunda на 31 % від стандарту ФАО/ВООЗ (Р 0,05). При більш високих концентраціях (500 мкг/л

Таблиця 1

Вплив детергентів та комплексного забруднення на біологічну цінність білка Сladophora vagabunda та Enteromorpha intestinalis

Незам. а-та Контроль Концентрація детергентів, мкг/л

Контроль Суміші полютантів Еталон

ФАО/

ВООЗ

"Лотос" "Е"

100 500 1000 100 500 1000 1 2

А* С* А С А С А С А С А С А С А С А С А С

С l a d o p h o r a v a g a b u n d a (L.) H o e k

Ліз 5,60,3 102 5,60,3 102 5,80,3 106 5,70,3 103 5,90,4 106 5,80,3 105 5,90,4 106 5,70,2 104 5,80,2 105 5,50,3 100 5,5

Мет 3,50,3 100 4,60,4* 131 3,20,2 91 3,00,2* 86 2,80,2* 80 3,00,2* 86 2,90,2* 83 3,80,1 109 2,50,1* 71 2,80,2* 80 3,5

Ілей 3,70,3 92 3,70,3 92 3,60,3 90 3,80,2 95 3,40,3 84 3,50,3 87 3,40,3 86 3,90,3 98 3,50,2* 88 3,20,2* 80 4,0

Лей 7,70,8 110 6,80,5* 97 6,80,5* 97 6,90,5* 99 7,80,5 111 7,10,5 101 7,30,4 104 7,50,4 107 8,00,8 114 7,80,6 111 7,0

Тре 4,80,4 120 4,00,4* 100 4,80,4 116 4,80,4 120 4,60,4 115 4,60,4 112 4,30,4* 111 3,50,2 88 5,00,4* 125 5,00,3* 125 4,0

Вал 5,70,3 114 5,70,3 114 5,60,2 112 5,90,4 118 5,40,3 108 5,00,2* 100 5,40,3 108 5,60,4 112 6,30,3* 126 6,20,3* 124 5,0

Тир+Фен 7,50,5 125 7,50,5 125 7,20,5* 120 7,00,4* 116 7,50,5 125 7,20,5* 120 6,80,4 113 4,50,5 75 4,80,6* 80 4,70,5 78 6,0

Трип 1,00,1 100 0,90,1 90 1,00,1 100 0,90,1 90 0,80,1* 80 0,80,1* 80 0,80,1* 80 - - - - - - 1,0

Незам/зам

а-ти 0,70 0,60 0,60 0,70 0,60 0,60 0,60 0,6 0,6 0,5 1,22,7

Лей/Ілей 2,08 1,83 1,88 1,82 2,29 2,03 2,15 1,9 2,3 2,4 1,52,0

E n t e r o m o r p h a i n t e s t i n a l i s (L.) L i n k

Ліз 5,00,2 91 5,30,4 96 5,10,2 91 5,00,1 91 5,00,3 91 5,20,3 95 5,30,2 96 4,40,2 80 4,80,1* 87 4,00,1* 73 5,5

Мет 4,70,2 134 2,20,4* 63 2,40,1* 69 2,70,4* 77 3,30,1* 94 2,60,3* 74 2,80,2* 80 2,60,2 74 2,20,2* 63 3,70,3* 106 3,5

Ілей 4,10,5 103 4,10,3 103 3,9 0,4 98 3,90,2 98 4,20,7 105 4,10,3 103 3,9 0,4 98 3,40,3 85 3,70,2 93 2,50,1* 63 4,0

Лей 7,30,7 104 7,40,8 106 7,4 0,5 106 7,60,5 109 7,70,6 110 7,50,4 107 7,5 0,6 107 7,20,5 103 8,70,4* 124 7,50,3* 107 7,0

Тре 6,30,4 158 6,30,5 158 6,4 0,4 160 6,10,5 152 6,20,3 155 6,10,6 153 6,1 0,4 153 5,50,5 138 5,60,3 140 5,80,4 145 4,0

Вал 6,60,4 132 6,70,3 134 6,8 0,4 136 6,60,7 132 7,20,5* 144 6,80,5 136 6,8 0,5 136 7,30,4 146 6,70,3* 134 6,80,2* 136 5,0

Тир+Фен 8,10,6 135 7,90,6 132 7,9 0,5 132 7,70,8 128 7,80,8 130 7,90,7 132 8,1 0,6 135 7,00,5 117 7,40,3 123 8,60,7* 143 6,0

Незам/зам

а-ти 0,94 0,66 0,89 0,89 0,93 0,89 0,90 0,6 0,6 0,5 1,22,7

Лей/Ілей 1,78 1,80 1,89 1,94 1,83 1,83 1,92 2,1 2,4 3 1,52,0

П р и м і т к а:* А- масова доля амінокислоти у білку, мг/ 100 мг п.с.р.; С- хімічний скор (відношення масової долі амінокислоти до еталону ФАО/ВООЗ, у %); п.с.р. – повітряна суха речовина; * відмінність від контролю вірогідна при Р 0,05.

і 1000 мкг/л) кількість метіоніну була меншою від контролю. СМЗ "Е" знижував кількість метіоніну в біомасі даної водорості у всіх варіантах досліду (на 17 – 20 %) (табл. 1.).

Суміш токсикантів (суміш 1 і 2) викликала зменшення вмісту метіоніну у C. vagabunda на 29 і 20 %, відповідно від рекомендованого стандарту. У той час як даний показник у контрольних рослинах перевищував його на 9 % (табл. 1.).

В E. intestinalis вміст метіоніну в контролі перевищував стандарт на 34 % (табл. 1.). Однак при впливі детергентів вміст даної амінокислоти знижувався і був меншим від стандартної величини на 37 (при 100 мкг/л) - 23 % (при 1000 мкг/л). У досліді зі СМЗ "Е" при тих же концентраціях детергенту ця величина хоч і була вищою, але залишалася меншою від стандарту. У багатофакторному експерименті зі збільшенням концентрації суміші в 5 разів у білку даної водорості спостерігається підвищення вмісту метіоніну на 6 % від еталона ФАО/ВООЗ (табл. 1.).

Ще одним критерієм біологічної цінності білка є відношення незамінних амінокислот лейцин/ізолейцин. За даним параметром білок C. vagabunda у досліді зі СМЗ "Лотос" відповідав прийнятим нормам (1,5 - 2,0), а при впливі СМЗ "Е" і комплексного забруднення перевищував верхню межу оптимальних величин (табл. 1.). В E. intestinalis білок щодо даних амінокислот у всіх варіантах досліду з детергентами відповідав прийнятим нормам, а у варіантах із сумішшю токсикантів перевищував верхню межу оптимальних величин у 1,5 рази (табл. 1.).

Таким чином, забруднення водного середовища як окремими детергентами, так і в комплексі з іншими полютантами викликає у водоростей-макрофітів збільшення вмісту амінокислот, що беруть участь в осморегуляції і детоксикації шкідливих речовин. Крім того, детергенти погіршують якість білка (змінюється вміст лімітуючих амінокислот), що знижує його біологічну цінність, а за тим і продуктивність біоценозів, у яких вони беруть участь.

Вміст вітаміну С. Характер дії токсикантів виявляється в його різноманітному впливі на біохімічні процеси, що відбуваються в клітинах водоростей, включаючи і метаболізм вітаміну С (аскорбінової кислоти), так як відомо (Губський, 2000), що вітамін С бере участь в окислювально-відновлювальних процесах живих клітин.

Проведені нами дослідження свідчать про те, що детергенти також по-різному впливають і на вміст аскорбінової кислоти в клітинах тестованих водоростей. Так, наприклад, детергент "Лотос" зі збільшенням концентрації до 1000 мкг/л знижував вміст вітаміну С в зеленій водорості C. vagabunda на 62 %, відповідно від контролю (Р 0,05).

Детергент "Е" з концентраціями 100 і 500 мкг/л здійснював на клітини C.vagabunda більш токсичний вплив, ніж СМЗ "Лотос". А концентрація 1000 мкг/л, знижувала даний показник усього лише на 39 % від контролю (Р 0,05).

Стосовно E. intestinalis детергент "Лотос" не виявляв сильної інгібуючої дії, а детергент "Е" підвищував даний показник на 80 (при 500 мкг/л) і 60 % ( при 1000 мкг/л) (Р 0,05) від контролю. Такий підвищений вміст аскорбінової кислоти в клітинах тестованої водорості є відповідною реакцією на дію полютантів. Оскільки вітамін С, крім окислювально-відновлюванних реакцій, може виконувати функцію антиоксиданту (Губський, 2000).

При дії ж комплексного забруднення (суміш 1 і суміш 2) на C. vagabunda і E.intestinalis у їхніх клітинах спостерігалося різке зниження вмісту вітаміну С на 34 – 36 % і на 40 - 21 % (при суміші 2) відповідно , від контролю (Р 0,05).

Таким чином, суміш використовуваних полютантів у всіх концентраціях викликає зменшення вмісту вітаміну С у досліджуваних водоростях.

Отримані нами результати свідчать про те, що кількісний вміст вітаміну С в клітинах тестованих водоростей залежить від хімічного складу синтетичних миючих засобів, їхніх концентрацій, а також від видової специфічності тест-об'єктів.

Динаміка приросту біомаси і морфологічна мінливість клітин водоростей-макрофітів. Відомо, що темпи приросту біомаси водоростей є інтегральним показником якості водного середовища (Паршикова та ін., 1988).

Нами встановлено, що СМЗ "Лотос" з концентраціями 100 і 500 мкг/л у перші 7 діб експонування не здійснював сильного негативного впливу на приріст біомаси C.vagabunda. З підвищенням концентрації детергенту до 1000 мкг/л біомаса поступово збільшувалася і перевищувала контроль на 6 % (Р 0,05). Однак при більш тривалому впливі (через 21 добу) детергент із концентраціями 500 і 1000 мкг/л повною мірою виявляв токсичну дію: почалося необоротне руйнування клітин і тому біомаса C. vagabunda при цих концентраціях зменшувалась в порівнянні з вихідною.

Під впливом детергенту "Е" ріст зеленої водорості C. vagabunda у перші 7 діб був більш пригніченим, ніж у варіанті з "Лотосом". Але при збільшенні часу тестування до 21 доби спостерігалася деяка адаптація кладофори до даних концентрацій детергенту. Біомаса водорості збільшувалася і навіть при концентрації "Е" 500 мкг/л перевищувала контроль на 17 % (Р 0,05). При концентрації 1000 мкг/л СМЗ "Е" із самого початку тестування виявляв гостро токсичну дію. Біомаса водорості в даному варіанті досліду постійно зменшувалася.

E. intestinalis виявилася більш вразливою до впливу детергентів "Лотос" і "Е", тому що зі збільшенням часу тестування (від 7 до 21 доби) і ступеня концентрації детергентів біомаса водорості зменшувалася.

Порушення осморегуляції й поява деяких морфологічних аномалій у клітинах водоростей під впливом детергентів нами простежені на прикладі C. vagabunda. Під впливом СМЗ "Лотос" у клітинах кладофори спостерігався увігнутий (при 100 мкг/л) і ріжковий (при 500 мкг/л) плазмоліз, що свідчить про дегідратацію її клітин. Молоді клітини втрачали колір та витягувалися у довжину. При максимальній концентрації (1000 мкг/л) детергент викликав лізис багатьох клітин кладофори.

Дія детергенту "Е" на морфологічні особливості клітин кладофори відрізнялася від аналогічної у варіанті з "Лотосом". Його мінімальна концентрація (100 мкг/л) викликала відповідну захисну реакцію кладофори у вигляді утворення клітин-акінет. Зі збільшенням концентрації даного полютанту в клітинах дослідної водорості спостерігалися агранульованість цитоплазми і деформація кінцевих клітин. Висока концентрація детергенту (1000 мкг/л) викликала лізис клітин даної водорості.

Таким чином, детергенти негативно впливали на приріст біомаси водоростей. Спостерігалася обернено пропорційна залежність між концентраціями токсикантів і величиною приросту біомаси. За винятком C. vagabunda, що знаходилась під впливом СМЗ "Е" з невисокими концентраціями.

Суміш токсикантів з невисокою концентрацією (ГДК кожного інгредієнта) уповільнює (стосовно контролю) процеси росту клітин C. vagabunda вже в перші 5 діб експонування (Р 0,05). З підвищенням концентрації суміші забруднювачів у 5 разів (суміш 2) і збільшенням часу експонування спостерігалося пригнічення ростових процесів даної водорості. Суміш 3 проявила гостро токсичну дію і клітини водорості відмирали. Крім змін у прирості біомаси даної водорості, під впливом забруднювачів відбувалося порушення також і морфології клітин. Суміш 1 викликала у даній водорості агранульованість цитоплазми й утворення клітинакінет, а при збільшенні концентрації в 10 разів клітини почали руйнуватися вже на 5 добу після початку тестування.

Е. intestinalis виявилася більш стійкою до впливу невисоких концентрацій комплексу токсикантів (приріст біомаси під впливом суміші 2 на 5 добу тестування зменшився лише на 20 % від контролю) (Р 0,05). Зі збільшенням часу проведення досліду і концентрації суміші токсикантів у 10 разів приріст біомаси водорості знижувався і в їх клітинах починалися незворотні деструктивні процеси, біомаса ставала меншою від початкової наважки навіть у перші 5 діб експонування.

Таким чином, вплив детергенту в комплексі з нафтою і ВМ на тестовані водорості виявився більш токсичним, ніж дія СМЗ окремо.

ФІЗІОЛОГО-БІОХІМІЧНІ ПОКАЗНИКИ ВОДОРОСТЕЙ-МАКРОФІТІВ В УМОВАХ РІЗНОГО СТУПЕНЯ ЗАБРУДНЕННЯ МОРСЬКОЇ ВОДИ

Отримані нами дані свідчать, що вміст синтетичних ПАР (детергентів) в Одеській затоці перевищує гранично допустиму концентрацію (100 мкг/л) у районі Біостанції ОНУ в 3,00 рази (295 мкг/л), у районі Дачі Ковалевського ( у 3,20 рази 320 мкг/л) і в районі торгового порту - у 3,03 рази (303 мкг/л). Однак потрібно відзначити, що концентрація СПАР в морській воді, залежно від природних умов, може варіювати в широких межах (Журавель, 2001; Ilyin еt al., 2000). Крім того, в Одеській затоці (Брянцев та ін., 2000; Дятлов, 2001) відзначається підвищений вміст й інших токсичних речовин (нафта й нафтопродукти, важкі метали, пестициди тощо), що нерідко перевищують ГДК у кілька разів. Одним з найбільш забруднених районів Одеської затоки є акваторія Порту (Дятлов, 2001).

Як відомо (Христофорова, 1989), водорості-макрофіти можуть служити індикаторами забруднення водного середовища важкими металами. За нашими даними, водорості-макрофіти (Enteromorpha intestinalis та Ceramium rubrum), відібрані з різних районів Одеської затоки, накопичують у клітинах такі ВМ, як Cd, Pb, Cu і Zn у різній кількості, у залежності від ступеня забруднення районів. Нами визначено, що максимальний вміст останніх накопичується в клітинах C.rubrum, а мінімальний у клітинах E. intestinalis. Максимальну кількість ВМ було виявлено в біомасі водоростей, що зростають у районі торгового порту, а найменшу - в районі