МІНІСТЕРСТВО ОХОРОНИ ЗДОРОВ’Я УКРАЇНИ

НАЦІОНАЛЬНИЙ ФАРМАЦЕВТИЧНИЙ УНІВЕРСИТЕТ

Немятих Оксана Дмитрівна

УДК 615.2:616-001.83+616-08-039.71

ПОШУК ЗАСОБІВ ПРОФІЛАКТИКИ ГІПОКСІЇ ЗАМКНУТОГО ПРОСТОРУ

14.03.05. – фармакологія

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата фармацевтичних наук

Харків – 2004

Дисертацією є рукопис

Робота виконана в | Луганському державному медичному університеті МОЗ України.

Науковий керівник: | доктор медичних наук, професор, Заслужений діяч науки і техніки України ЛУК’ЯНЧУК Віктор Дмитрович, Луганський державний медичний університет МОЗ України, завідувач кафедри фармакології.

Офіційні опоненти: | доктор фармацевтичних наук, професор ЯКОВЛЄВА Лариса Василівна, завідувачка Центральної науково-дослідної лабораторії Національного фармацевтичного університету МОЗ України

доктор медичних наук, професор, Заслужений діяч науки і техніки України, БОБИРЬОВ Віктор Миколайович, завідувач кафедри експериментальної та клінічної фармакології Української медичної стоматологічної академії МОЗ України

Провідна установа: | Одеський державний медичний університет МОЗ України, кафедра загальної та клінічної фармакології

Захист дисертації відбудеться “26” березня 2004 р. о 1000 годині на засіданні Спеціалізованої вченої ради при Національному фармацевтичному університеті МОЗ України за адресою: 61002, м. Харків, вул. Пушкінська, 53

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Національного фармацевтичного університету МОЗ України за адресою: 61168, м. Харків, вул. Блюхера, 4

Автореферат розісланий “25_ лютого 2004 р.

Вчений секретар

Спеціалізованої вченої ради Д 64.605.01

доктор біологічних наук, професор | Малоштан Л.М.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність проблеми. Проблема пошуку високоефективних і безпечних антигіпоксантів серед природних та синтетичних сполук визначається центральною роллю гіпоксичного синдрому у виникненні і розвитку патологічних станів різного генезу. Широка поширеність киснедефіцитних станів, включаючи екстремальні, диктує гостру необхідність розробки нових шляхів їх фармакологічної корекції.

Рішення цієї проблеми особливо актуально для промислового регіону Донбасу, де нерідко мають місце виробничі аварії та катастрофи на вугледобувних підприємствах. Так, частота травматизму зі смертельним наслідком на шахтах у 7 разів вище, ніж в інших галузях промисловості (И.Сахань, 2002). За даними фахівців, на кожний 1 млн тонн вугілля, піднятий на-гора за останні 5 років, припадає 3,6-4,7 людських життів (В.Г. Климовицкий и соавт., 2002). За 2000 р летальність шахтарів склала 1,57%, що відповідає 306,27 нещасним випадкам. Тільки за 7 місяців 2002 р у глибоких вугільних шахтах травмовано 6850 чоловік і загинуло 158 гірників. Комплексний аналіз травматизму свідчить, що в основі генеза шахтних травм лежить гіпоксичний фактор (Г.А. Можаев, 1995, В.Н. Заболотный, 1994). Найчастіше плин невідкладних станів при завалах у вугільних виробках погіршується психологічним аспектом замкнутого простору.

Крім того, останнім часом значно збільшилась кількість випадків стихійних лих, військових катастроф і терористичних актів, за яких постраждалі потрапляють в умови гіпоксичної гіпоксії в поєднанні з гіперкапнією. Зокрема, досить згадати загибель 118 моряків підчовна “Курськ” (серпень 2000 р), а також життя сотен людей, що опинилися під уламками зруйнованого будинку в Сполучених Штатах Америки (вересень 2001р).

На жаль, дотепер надання першої медичної допомоги як на дошпитальному етапі, так і подальше лікування потерпілих в умовах гострої нестачі кисню та надлишкових кількостей вуглекислоти зводяться, головним чином, до застосування симптоматичних засобів лікування, які далеко не завжди забезпечують необхідну терапевтичну ефективність, що, по зрозумілих причинах, істотно позначається на рівні летальності потерпілих.

Виходячи з цього, приоритетним напрямком розвитку екологічної фармакології, у тому числі і фармакології екстремальних станів, як в Україні, так і в усьому світі, є пошук ефективних і безпечних антигіпоксантів. При вивченні лімітуючих ланок патогенезу екстремальних киснедефіцитних станів, які виникають у гірників глибоких вугільних шахт, встановлено, що центральне місце займають порушення енергетичного гомеостазу, оксидантно-прооксидантної рівноваги, синтезу продуктів метаболізму арахідонової кислоти, вуглеводного обміну і внутрішньоклітинної передачі сигналу (Л.В. Савченкова, 1999, Л.Д. Лукьянова, 2000).

Багатовекторність структурно-функціональних ушкоджень за умов гострої гіпоксії визначає пошук високоефективних протекторів, які здатні корегувати різні ланки патогенезу цього невідкладного стану. На сьогоднішній день експериментально доведена ефективність та молекулярно-біохімічні механізми антигіпоксичної дії біофлавоноїдів (Л.В. Савченкова, 1999), ацелізину та тіотриазоліну (О.Ю. Бибик, 2002), похідних ксантину (І.П. Бєлоусова, 2000), блокаторів кальцієвих каналів (К.М. Дзубан, 1996), бемітилу (О.А. Лисенко, 1994) і деяких інших препаратів на різних моделях гіпоксичного синдрому.

Останнім часом особливу увагу вчених привертає біологічна активність органічних сполук германію. Так, виявлені їх різнонаправлені ефекти, в т.ч. анксиолітичні, ноотропні властивості, а також антиоксидатна активність (В.В. Годован, 1998). Вивчена фармакокінетика та відзначена низька токсичність фізіологічно активних речовин, створених на основі комплексних сполук германію з біолігандами (Г.Г. Відавська, 2003, К.Ф. Шемонаєва, 2003). Таким чином, багатогранність фармакологічних ефектів, а також нешкідливість біогерманійорганічних речовин і створених на їх основі лікарських препаратів дозволяють розглядати ці сполуки в якості перспективних потенційних антигіпоксантів, що і послужило теоретичним обґрунтуванням до вивчення їх можливої протекторної дії при гіпоксії замкнутого простору.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота виконана в рамках плану наукових досліджень кафедри фармакології Луганського державного медичного університету “Експериментальна розробка засобів фармакокорекції екстремальних станів” (№ держ. реєстрації 0198U4009100, 1999-2003 рр), а також на прохання керівництва вугільних підприємств Донбасу (ДВАП “Шахта Крепенская” Державної холдингової компанії “Антрацит” (лист № 02-87 від 12.01.2002 р), ДВАП “Шахта ім.В.В. Вахрушева” Державної холдингової компанії “Ровеньки-Антрацит” (лист № 02-105 від 03.02.2002 р).

Мета та завдання дослідження. Мета роботи – обґрунтувати патогенетичну доцільність застосування координаційної сполуки германію з нікотиновою кислотою і з'ясувати можливі механізми її протекторної активності при гіпоксії замкнутого простору.

Для досягнення поставленої мети вирішувались наступні задачі:

1.

2.

3.

4.

5.

6.

Об'єкт дослідження – лікарська профілактика гіпоксичного синдрому, що розвивається в умовах гострої гіпоксичної гіпоксії з гіперкапнією.

Предмет дослідження - вивчення протекторної активності координаційної сполуки германію з нікотиновою кислотою при гіпоксії замкнутого простору.

Методи дослідження - використовувався комплексний методичний підхід із залученням набору біохімічних, біофізичних, фізико-хімічних, математичних методів дослідження та використанням методів експериментальної фармакотерапії, у т.ч. і фармакокінетики.

Наукова новизна одержаних результатів. У роботі вперше пред-ставлені теоретичне обґрунтування й експериментальне підтвердження доцільності використання представника принципово нового класу хімічних речовин – координаційної сполуки германію з біолігандом (нікотиновою кислотою) – у якості високоефективного і безпечного засобу захисту організму в умовах гіпоксії замкнутого простору, а також розроблений режим дозування вивчаємого антигіпоксанту при моделюємій формі гіпоксичного синдрому.

Вперше досліджені тонкі механізми протекторної дії МІГУ-1 на тлі гіпоксії замкнутого простору в частині його впливу на окислювально-антиоксидантну рівновагу та енергетичний гомеостаз, а також вивчені і проаналізовані в порівняльному аспекті параметри фармакокінетики МІГУ-1 у інтактних тварин і з гіпоксією замкнутого простору на етапах абсорбції, біотранспорту, розподілу і елімінації.

Отримані нові дані про здатність координаційної сполуки германію з нікотиновою кислотою виявляти протекторний ефект у відношенні ЕПР - активних компонентів мітохондриальної та мікросомальної електронтранспортних ланцюгів гепатоцитів в умовах гострого киснедефіцитного стану на тлі гіперкапнії. Вперше показана роль оксиду азоту в реалізації механізму протигіпоксичної дії МІГУ-1.

Практична значимість одержаних результатів. Експериментально обґрунтований підхід до лікарської профілактики гіпоксії замкнутого простору за допомогою координаційної сполуки германію з нікотиновою кислотою намітив один з перспективних шляхів цілеспрямованого синтезу оригінальних високоефективних елементоорганічних біологічно активних речовин, які володіють протигіпоксичною активністю з антиоксидантними властивостями, що використовується в роботі хіміків-синтетиків Одеського національного університету ім. І.І. Мечникова.

Результати експериментальних досліджень покладені в основу розробки і видання методичних рекомендацій “Пошук та експериментальне вивчення потенційних протигіпоксичних засобів” (2002), затверджених Державним Фармакологічним центром МОЗ України.

Матеріали досліджень впроваджені в навчальний процес на кафедрах фармакології Національного фармацевтичного університету України, Одеського, Вінницького, Запорізького державних медичних університетів, а також Української медичної стоматологічної академії.

Результати окремих фрагментів дослідження впроваджені в роботу науково-дослідних закладів: Інституту фармакології і токсикології АМН України, Державного наукового центра лікарських засобів МОЗ і НАН України, Інституту біоорганічної хімії і нафтохімії НАН України.

Отримані в роботі дані можуть служити експериментальним обґрунтуванням для досліджень у частині оптимізації фармакопрофілактики і терапії гіпоксичного синдрому.

Особистий внесок дисертанта. Автором самостійно сформульовані мета і задачі, визначені напрямок, обсяг і методичні підходи до дослідження, проведений патентно-інформаційний пошук з використанням серверів Yandex, Alta Vista, Rambler, а також медичної бази даних Medline мережі Інтернет.

Всі етапи експериментального дослідження, включаючи аналіз і узагальнення даних, статистичну обробку отриманих результатів, розробку основних положень роботи, її висновків, а також написання огляду літератури автором проведені особисто. Співавтори опублікованих робіт надавали консультативну допомогу з методичних і теоретичних питань.

Апробація результатів дисертації. Основні положення дисертаційної роботи доповідалися й одержали позитивну оцінку на: III Міжнародній конференції студентів і молодих вчених “Медицина - здоров'я XXI сторіччя” (Дніпропетровськ, 2002); Міжнародній науково-практичній конференції “Політравма - сучасна концепція надання невідкладної медичної допомоги” (Київ, 2002); IX Конгресі Всесвітньої Федерації Українських лікарських товариств (Луганськ, 2002); Міжнародній науково-практичній конференції молодих вчених “Вчені майбутнього” (Одеса, 2002); 57 Науково-практичній конференції студентів і молодих вчених Національного медичного університету ім. О.О. Богомольця “Актуальні проблеми сучасної медицини” (Київ, 2002); 139-й Британській фармацевтичній конференції (Лондон, 2002); спільних засіданнях кафедри фармакології Луганського державного медичного університету і Луганського відділення Українського наукового товариства фармакологів (Луганськ, 2002); І науково-практичній конференції студентів і молодих вчених “Актуальні питання сучасної неврології” (Луганськ, 2003); ІІ Міжнародній науково-практичній конференції “Динаміка наукових досліджень 2003” (Дніпропетровськ-Луганськ-Чернівці, 2003), VІІ З’їзді Всеукраїнських лікарських товариств (Тернопіль, 2003); Міжнародній науково-практичній конференції “Україна наукова 2003” (Дніпропетровськ, 2003), І Міжрегіональній конференції молодих вчених “Актуальні питання біології та медицини” (Луганськ, 2003).

Публікації. За матеріалами дисертаційної роботи опубліковано 23 наукових праці, в т.ч. 10 статей у періодичних журналах і виданнях, затверджених ВАК України, 1 методичні рекомендації, затверджені Державним Фармакологічним центром МОЗ України, 11 тез доповідей на наукових форумах, а також 1 деклараційний патент на винахід.

Структура та обсяг дисертації. Дисертація складається із вступу, огляду літератури, глави “Матеріали і методи досліджень”, 6 розділів власних досліджень, висновків, списку літератури, що містить 189 вітчизняних і 245 закордонних джерел. Робота викладена на 176 сторінках машинописного тексту, ілюстрована 18 малюнками і 24 таблицями.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріали та методи дослідження. Досліди виконані на 920 статевозрілих безпородних щурах-самцях лінії Wistar масою 150-200 г. В експерименті використовувалися тварини після проходження карантину в умовах віварію ЛДМУ протягом 14 діб.

Досліди проводили згідно правил GLP в рамках норм біоетики (довідка № 7/433 від 25.03.2003 р) згідно з методичними рекомендаціями Державного Фармакологічного центру МОЗ України (Киев, 2002).

Експериментальною моделлю служив патологічний процес, що розвивався у тварин в умовёNК`ёNМj@ёNКnёNК`ёNКЖёNКВёNКИёNМfёNМdёNККёNКfёNКК@ёNКМёNМ`ёNККёNМbёNМdёNККёNМ`ёNМfёNЖЖёNККёNКhёNКjёNКДёNМКёNКdёNК`ёNКИёNКИёNММ@ёNКfёNДfёNКМёNККёNКВёNМbёNДfёNДМ@ёNКn@ёNКfъц__ёМr`ёШВЬОb`jpёШВЬОМКb`hrёШВЬОЬаb`jp@ёNДfъцёМr`@ёNКМёNКjёNМ`ёNКВёNК`ёNКМёNКИёNДfёNДВёNМК@ёNКnёNКhёNДfёNКrёNМbёNКИёNМКёNКdёNК`ёNКДёNКp@ёNКd@ёNДfёNКnёNККёNКДёNМЖёNККёNКdёNК`ёNКИъцёМr`ёШВЬОb`jpёШВЬОМКb`hrёШВЬОЬаb`jp@ёNКpёNМjъцёМr`@@ёNКfёNКjёNМ`ёNКЖёNККёNКК__ёNКbёдвкЮиК@ёNДВёNКЖёNК`ёNМj@Pb`@ёNКhёNКЖъцёжкаКд@fъцRъцёжкаКд@@ъцёМr`ёШВЬОb`jpёШГngfe1049з експозицією 45 хвилин. Іншу форму гіпоксичної гіпоксії без гіперкапнії, але на тлі гіпертермії моделювали в спеціально розробленій співробітниками кафедри фармакології ЛДМУ гермокамері.

Первинний фармакологічний скринінг потенційних антигіпоксантів проводили на обох моделях гіпоксії серед 24 потенційних протекторів гіпоксичного синдрому, включаючи 6 оригінальних хімічних сполук з ряду похідних 2,4-тіазолідиндіонів і 2 координаційні сполуки германію. Лікарські засоби, що досліджувались, вводили однократно внутрішньоочеревинно за 60 хвилин до початку моделювання патології в дозах 1/10 LD50.

Ефективність препаратів на моделі гіпоксії замкнутого простору визначали за величинами коефіцієнту протигіпоксичного захисту (Кз) та відносного показника збільшення часу життя тварин (П):

_____________

Виражаємо щиру подяку професору І.Й. Сейфулліній за синтез МІГУ-1

; , де

Тд - середня тривалість життя тварин в дослідній групі;

Тк - середня тривалість життя тварин в контрольній групі,

а також клінічними симптомами перебігу патології.

Активність досліджуваних антигіпоксантів на моделі гіпоксичної гіпоксії з гіперкапнією на тлі температурного стресу оцінювали за виживанням:

Ефективність = ВЖд – ВЖк , де

ВЖд – виживання в дослідній групі, %;

ВЖк - виживання в контрольній групі, %,

а також станом клінічної картини досліджуваної форми гіпоксії.

Вивчення антиоксидантних властивостей сполук проводили на моделі ініційованого окислення метилових ефірів ненасичених жирних кислот, джерелом яких служив лінетол (виробництва ХФО “Биостимулятор”, Україна).

При розробці дозового режиму застосування найефективнішого (за даними комплексних скринінгових досліджень) антигіпоксанта МІГУ-1 вводили внутрішньоочеревинно в дозах: 50; 75; 100; 150; 200 мг/кг за 60 хвилин до початку моделювання патології. З метою визначення оптимального часу введення германійорганічний комплекс застосовували у встановленій оптимальній дозі 119,4 мг/кг в різні терміни: за 120; 60; 30 хвилин, а також безпосередньо перед початком дії пошкоджуючих факторів. Математичний аналіз залежності середньої тривалості життя тварин в умовах замкнутого простору від введеної дози МІГУ-1, а також кореляції величини коефіцієнту протигіпоксичного захисту з часом профілактичного введення сполуки проводили за допомогою загальноприйнятих методів інтерполяції.

В наступних серіях експерименту щурам дослідної групи МІГУ-1 вводили одноразово внутрішньоочеревинно у вигляді 1% водної суспензії в дозі 119,4 мг/кг за 77 хвилин до початку моделювання гіпоксії замкнутого простору.

Біосубстратами для проведення біофізичних, біохімічних, а також фізико-хімічних досліджень були сироватка крові, сеча, кора головного мозку та печінка тварин. Гомогенати тканин мозку і печінки готувалися на охолодженому (4°С) ізотонічному розчині натрію хлориду.

Антирадикальну активність МІГУ-1 на моделі екстремального киснедефіцитного стану, що досліджувався, вивчали біохемілюмінісцентним (БХЛ) методом. Для оцінки здатності сполуки впливати на динаміку перекисних процесів у дослідах in vitro в якості субстрату використовували стерильний 10% розчин альбуміну. БХЛ індукували перекисом водню (В.Д. Лук’янчук зі співавт., 1997), а також FeSO4·7H2O (Ю. І. Губський, В.В. Дунаєв, І.Ф. Бєленічев, 2002). Хемілюмінограми реєстрували на люменометрі “EMILITE-1105” виробництва фірми “Біо-Хім-Мак” Кінетику світіння в дослідах in vitro і in vivo оцінювали за амплітудою швидкого спалаху (I1), константою швидкості зміни інтенсивності світіння (К1), амплітудою повільного спалаху (I2), кінцевим значенням БХЛ (Iк), а також загальною світлосумою реакції (S).

Серед продуктів ліпопереокислення досліджували концентрацію початкових – дієнові кон’югати (ДК) (И.Д. Стальная, 1977) та кінцевих продуктів ПОЛ, що реагують з 2-тіобарбітуровою кислотою (ТБК-активні продукти) (И.Д. Стальная, Г.Г. Гаршвили, 1977).

При вивченні стану основних компонентів антиоксидантної системи захисту організму визначали активність супероксиддисмутази (СОД) (В.А. Костюк зі співавт., 1990), каталази (М.А. Королюк зі співавт., 1988), а також рівень глутатіону відновленого (J.Sedlack, H.Lindsay, 1968) та сульфгідрильних груп (G.L. Ellman. 1959). Забезпеченість організму ендогенними антиоксидантами в умовах експерименту оцінювали за станом перекисної резистентності еритроцитів (О.Г. Архипова, 1988). Фактор антиоксидантного стану розраховували як частку від добутку активності СОД і каталази на рівнень ТБК-реактантів.

Визначення рівня аденілових нуклеотидів в еритроцитах проводили методом тонкошарової хроматографії на пластинах фірми “Merk”, Німеччина (Н.Б.Захарова, В.И. Рубин, 1980). На підставі отриманих даних розраховували показники, що характеризують стан енергетичного обміну у вивчаємих умовах експерименту: енергетичний заряд (ЕЗ), енергетичний потенціал (ЕП), індекс фосфорилювання (ІФ) та порівняльний коефіцієнт (Кпор).

Активність ферментів енергетичного обміну в сироватці крові оцінювали за допомогою біохімічних наборів фірми “Randox”, Німеччина (глюкозо-6-фосфатдегідрогеназа, глютаматдегідрогеназа, лактатдегідрогеназа), а також “Human”, Німеччина (креатинкіназа).

В якості інгібітора NO-синтази використовували Nщ-нітро-L-аргінін (фірма “Across Organics”, Бельгія) (E. Kosenko et al., 1995).

Фармакокінетику МІГУ-1 вивчали шляхом визначення концентрації препарату в сироватці крові і сечі як інтактних щурів, так і тих, що одержували сполуку на тлі гіпоксії замкнутого простору. Біоматеріал забирали в динаміці: через 2; 4; 6; 12; 24 години з моменту введення германійорганічного комплексу. МІГУ-1 у досліджуваних біосубстратах ідентифікували за методикою В.Й. Кресюна, А.Г. Відавської, К.Ф.Шемонаєвої (2000) та проводили порівняльний аналіз наступних фармакокінетичних показників: константи швидкості абсорбції (К01), періоду напівабсорбції (t1/2,а), максимальної концентрації препарату в крові (Cк max), часу досягнення максимальної концентрації в крові (tк max), початкової заданої концентрації в крові (C0), об’єму розподілу (Vd), площі під фармакокінетичною кривою (AUC), константи швидкості екскреції із сечею (Кex), періоду напівекскреції (t1/2,ex), константи елімінації (kel), періоду напівелімінації (t1/2), максимальної концентрації в сечі (Cс max), часу досягнення максимальної концентрації в сечі (tс max), середнього часу перебування ксенобіотику в організмі (MRT) та загального кліренсу (Clr).

Зворотню взаємодію МІГУ-1 із транспортними протеїнами (сироватковим альбуміном, білками цільної сироватки крові і мембранами еритроцитів), а також модифікацію зв’язуючої здатності сироваткових протеїнів під впливом патології, що моделювалась, досліджували методом рівноважного діалізу (А.И. Луйк, В.Д. Лукьянчук, 1984).

Вміст довгоживучих вільних радикалів і металопротеїдних комплексів у гепатоцитах визначали за допомогою електронного парамагнітного резонансу (ЕПР) на ЕПР-спектрометрі фірми “Varian” марки E-109 (США). ЕПР-спектрометрію зразків печінки проводили в умовах низькотемпературної стабілізації в рідкому азоті (77?К). Стан мітохондриального і мікросомального ланцюгів транспорту електронів у гепатоцитах оцінювали через 6 і 24 години з моменту реоксигенації за положенням та амплітудою парамагнітних центрів гепатоцитів з g-факторами: 1,94 – залізосірчані білки (ЗСБ); 1,97 - Мо5+- вмісткі комплекси; 2,00 – вільні радикали; 2,03 – нітрозильні комплекси заліза (НКЗ); 2,17 - Мn2+-вмісткі парамагнітні центри; 2,25 - цитохром Р- 450.

Отримані дані оброблені статистично за допомогою критерію t Ст’юдента (Ю.И. Іванов, 1990), а також непараметричного критерію статистики – точного методу Фішера для чотирипільної таблиці (Е. В. Гублер, 1978)

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

У скринінговій серії дослідів вивчалися 16 відомих препаратів з різних фармакологічних груп, а також 8 оригінальних хімічних сполук, у спектрі фармакологічної активності яких виявляються різноспрямовані ефекти, в тому числі й антиоксидантна дія. Серед усіх досліджуваних потенційних протекторів гіпоксичного синдрому найвищу активність в плані збільшення часу життя тварин умовах замкнутого простору, виживання щурів на фоні поєднаної дії гіпоксичної гіпоксії та температурного стресу, а також найбільш сприятливого впливу на клінічні прояви гострої патології киснедефіцитного генезу реалізувала координаційна сполука германію з нікотиновою кислотою (табл.1).

Таблиця 1

Протигіпоксична активність відомих лікарських препаратів та оригінальних хімічних речовин на моделі гіпоксії замкнутого простору (n=6)

Препарат | Доза, мг/кг | Тривалість життя, хв | Р* | П, % | Кз

Контроль | - | 48,17±3,51 | - | - | -

Пентоксифілін | 100 | 57,17±2,32 | >0,05 | 18,68 | 1,18 | МІГУ-1 | 100 | 72,00±4,65 | <0,05 | 50,00 | 1,50

Кислота нікотинова | 84 | 47,50,34 | >0,05 | -0,01 | 0,99

Контроль | - | 43,50±1,09 | - | - | -

Ацелізин | 120 | 42,33±1,96 | >0,05 | -2,68 | 0,97 | Тіотриазолін | 120 | 44,33±2,08 | >0,05 | 1,91 | 1,02 | Контроль | - | 44,75±0,75 | - | - | -

Димексид | 200 | 50,67±4,45 | >0,05 | 13,22 | 1,15 | Берлітіон | 200 | 53,00±4,02 | >0,05 | 18,43 | 1,18 | Цитохром С | 50 | 52,33±5,24 | >0,05 | 16,93 | 1,16 | Контроль | - | 60,02±3,08 | - | - | -

Силібор | 150 | 67,50±3,03 | >0,05 | 12,66 | 1,12 | Контроль | - | 62,20±2,68 | - | - | -

Кверцетин | 100 | 80,83±2,12 | <0,05 | 30,00 | 1,30 | Фламін | 150 | 54,00±1,69 | >0,05 | -13,25 | 0,87 | Контроль | - | 44,00±2,61 | - | - | -

Пірацетам | 250 | 46,30±2,48 | >0,05 | 5,22 | 1,05 | Контроль | 37,20±1,35 | - | - | -

Ліпін | 100 | 38,83±1,97 | >0,05 | 4,38 | 1,04 | Контроль | - | 57,33±3,06 | - | - | - | Натрію оксибутират | 120 | 71,66±2,75 | <0,05 | 25,00 | 1,25 | Німотоп | 0,05 | 45,33±1,89 | <0,05 | -20,93 | 0,79 | б-Токоферолу

ацетат | 50 | 42,83±1,74 | <0,05 | -25,29 | 0,75 | Контроль | - | 42,00±1,44 | - | - | - | Емоксипін | 15 | 50,50±4,17 | >0,05 | 20,24 | 1,20 | Контроль | - | 48,17±0,65 | - | - | -

МІГУ-2 | 100 | 60,70±2,64 | <0,05 | 26,00 | 1,26

Les – 1 | 100 | 53,80±1,90 | <0,05 | 11,70 | 1,11

Les-2 | 100 | 55,50±5,23 | >0,05 | 15,22 | 1,15

Les-3 | 100 | 53,40±2,16 | >0,05 | 10,86 | 1,11

Les-4 | 75 | 52,50±3,24 | >0,05 | 9,00 | 1,10

Les-7 | 75 | 39,50±1,52 | <0,05 | -18,00 | 0,82 | Les-8 | 75 | 38,00±2,21 | <0,05 | -21,00 | 0,79 | Примітка: Р розраховано за допомогою критерію t Ст’юдента

Поряд з цим, в модельних дослідах встановлено її виражений антиоксидантний ефект.

Комплексні фармакометричні дослідження дозволили визначити оптимальний дозовий режим МІГУ-1, а саме: доза дорівнює 117,4 мг/кг при введенні сполуки за 77 хвилин до початку дії пошкоджуючих факторів.

Біохемілюмінісцентний аналіз в дослідах in vivo дозволив встановити, що координаційна сполука германію з нікотиновою кислотою суттєво пригнічує інтенсивність протікання ланцюгових вільно-радикальних реакцій в сироватці крові та тканині мозку щурів з гіпоксією замкнутого простору. Це, перш за все, реалізується зниженням величин амплітуди швидкого та повільного спалахів БХЛ, кінцевого значення інтенсивності світіння, а також площі під кривою біохемілюмінісценції (рис.1). При поглибленому вивченні антирадикальних властивостей германійорганічної сполуки проводили досліди in vitro на двох моделях ініціації БХЛ: Н2О2 і Fe2+, які підтвердили здатність МІГУ-1 попереджувати процеси генерації вільних радикалів.

Рис.1. Вплив МІГУ-1 на динаміку показників БХЛ тканини мозку щурів з гіпоксією замкнутого простору

Примітка тут та далі: *- в порівнянні з інтактними тваринами (Р<0,05);

**- в порівнянні з контролем (Р<0,05)

В подальшому була виконана серія досліджень по визначенню впливу МІГУ-1 на рівень продуктів всіх етапів деградації фосфоліпідів клітинних мембран у сироватці крові та тканині мозку щурів в умовах гострої нестачі кисню на фоні гіперкапнії. Встановлено, що координаційна сполука германію з нікотиновою кислотою реалізує свою протекторну активність як в сироватці крові шляхом зменшення накопичення початкових продуктів ПОЛ – ДК в 1,23-1,56 рази і кінцевих, що реагують з ТБК, в 1,38-1,55 рази, так і в тканині мозку, значною мірою пригнічуючи їх продукцію в 1,27-3,13 та 1,12-1,73 рази, відповідно, в порівнянні з контролем.

Виходячи з того, що прооксидантно-антиоксидантний гомеостаз визначається не тільки інтенсивністю протікання процесів ліпопереокислення, але й функціонуванням антиоксидантної системи захисту організму, в окремій серії досліджень вивчали вплив германійорганічного комплексу з нікотиновою кислотою на стан основних її компонентів у тварин в умовах гіпоксичної гіпоксії, що розвивається на фоні гіперкапнії. Показано, що профілактичне введення антигіпоксанту, що досліджувався, істотно попереджає інактивацію центральних компонентів ферментативної ланки антиоксидантної системи – СОД та каталази як в сироватці крові, так і в головному мозку тварин з гіпоксією замкнутого простору. Поряд з цим, координаційна сполука германію з нікотиновою кислотою впливає на функціонування неферментативної ланки антиоксидантної системи шляхом підвищення рівня вільних сульфгідрильних груп (на 26-40 та 15-57%) і глутатіону відновленого (на 5-43 та 4-64%) в порівнянні з контролем в сироватці крові та тканині мозку, відповідно, у вивчаємій динаміці.

Вплив МІГУ-1 на забезпеченність організму ендогенними антиоксидантами оцінювали за таким інтегральним показником, як перекисна резистентність еритроцитів. Доведено, що введення субституенту проявляється різким (на 16-33%) зниженням числа гемолізованих еритроцитів в крові тварин з гіпоксією замкнутого простру в усі терміни дослідження.

З метою всебічної та максимально адекватної оцінки антиоксидантних властивостей германійорганічної сполуки нами була проаналізована динаміка такого показника, як фактор антиоксидантного стану. Встановлено, що при застосуванні комплексу германію з нікотиновою кислотою його величини досить істотно (в 1,41-2,88 в сироватці крові та в 1,73-2,48 рази в тканині мозку) зростають в порівнянні з контролем протягом всього періоду спостереження.

Таким чином, отримані дані дозволяють розглядати МІГУ-1 як антигіпоксант з вираженою антирадикальною та антиоксидантною активністю.

З огляду на причинно-наслідковий зв'язок між нагромадженням продуктів ПОЛ та порушенням процесів окисного фосфорилювання, нами проведено електронно–парамагнітний аналіз протигіпоксичної дії МІГУ– 1 у вивчаємих умовах експерименту. Показано, що введення координаційної сполуки германію з нікотиновою кислотою тваринам з гіпоксією замкнутого простору попереджає зниження рівня залізосірчаних білків, семихінонних радикалів, а також пригнічує продукцію нітрозильних комплексів заліза з одночасним запобіганням індукції цитохрому Р-450 та деградації Мо5+-вмістких парамагнітних центрів.

Враховуючи маркерну роль аденілових нуклеотидів в умовах гострої нестачі кисню нами досліджено вплив МІГУ–1 на динаміку вмісту АТФ, АДФ та АМФ в еритроцитах щурів з формою гіпоксії, що моделювалась. Так, показано, що профілактичне застосування вивчаємого антигіпоксанту перерозподіляє пул аденілових нуклеотидів на користь синтезу АТФ (рис.2), збільшуючи при цьому величини таких параметрів енергетичного обміну, як ЕЗ, ЕП, ІФ, Кпор. Поряд з цим, на фоні гіпоксії замкнутого простору і супутнього зниження рівня АТФ введення МІГУ-1 у розробленому режимі дозування проявляється збереженням активності ферментів енергетичного обміну, а саме: лактатдегідрогенази, глюкозо-6-фосфатдегідрогенази, а також креатинкінази. Більш того, германійорганічна сполука з нікотиновою кислотою підвищує активність глютаматдегідрогенази, яка входить до складу трансаміназного. шунта, що забезпечує економічність енергозабезпечення клітини (рис.3)

Таким чином, однією з сторон протигіпоксичної дії вивчаємої сполуки є її здатність корегувати вміст макроергів, а також попереджати пригнічення інтенсивності процесів тканинного дихання.

Рис. 2. Вплив МІГУ-1 на рівень аденілових нуклеотидів в еритроцитах щурів з гіпоксією замкнутого простору

Рис.3. Вплив МІГУ-1 на активність ферментів енергетичного обміну в сироватці крові щурів з гіпоксією замкнутого простору

Примітка: див. рис. 1

Виходячи з загальновідомої протекторної ролі ендогенного оксиду азоту в умовах нестачі кисню нами вивчено ступінь участі оксидазотного механізму в реалізації протигіпоксичного ефекту МІГУ-1. Встановлено, що на тлі пригнічення активності конститутивної та індуцибельної ізоформ NO-синтази у щурів в умовах гіпоксії замкнутого простору зменшується (на 3,25%) протекторна активність органічної сполуки германію, що досліджувалась.

Для проведення ефективної та безпечної фармакотерапії гіпоксичного синдрому було доцільним вивчити та проаналізувати фармакокінетичні характеристики МІГУ-1. Встановлено, що під впливом киснедефіцитної патології уповільнюються процеси всмоктування (величини tк max збільшуються в 2 рази) та розподілу вивчаємої сполуки по органах та тканинах (значення С0 зростають на 35%, Vd зменшуються в 1,5 рази) і відзначається інтенсифікація екскреторно-елімінаційних механізмів (показники t1/2ex, t1/2el, AUC зменшуються більш, ніж у 2 рази, та вдвічі зростають значення Кex, Кel, Clr). Поряд з цим, виявлено високий ступінь афінітету МІГУ-1 до окремих компонентів крові, зокрема альбуміну, білків цільної сироватки крові та мембран еритроцитів. При цьому германійорганічний комплекс у всіх трьох випадках зворотньо фіксується на біосубстраті лише одним активним центром (табл.2). Встановлено, що в умовах гострого дефіциту кисню істотно зменшується зв’язуюча здатність протеїнів сироватки крові відносно вивчаємої сполуки.

Таблиця 2

Кількісні показники зворотної взаємодії МІГУ-1 з різними біосубстратами

Біосубстрат | Касс, моль-1 .105 | N

Альбумін | 5,31 | 1

Сироватка крові | 4,69 | 1

Еритроцитарна маса | 4,58 | 1

Таким чином, експериментальне обґрунтування доцільності профілактичного застосування МІГУ-1 в умовах гіпоксичної гіпоксії з гіперкапнією дозволяє стверджувати, що германійорганічна сполука реалізує свою протекторну активність попередженням формування розповсюдженої мембранопатії шляхом ефективної регуляції прооксидантно-антиоксидантної рівноваги в силу реалізації вираженої антиоксидантної дії з антирадикальними властивостями. Поряд з цим, вивчаємий антигіпоксант корегує вміст основних компонентів мітохондриальної та мікросомальної електронтранспортних ланцюгів гепатоцитів, що стабілізує процеси тканинного дихання та детоксикації. Не менш важливу роль в протигіпоксичному ефекті МІГУ-1 відіграє його здатність зберігати рівень АТФ.

ВИСНОВКИ

У дисертації наведено нове рішення актуальної наукової проблеми, що визначається експериментальним обґрунтуванням доцільності та ефективності профілактичного застосування представника нового класу хімічних речовин – координаційної сполуки германію з нікотиновою кислотою – для попередження порушень, що виникають в умовах гострої гіпоксичної гіпоксії з гіперкапнією. Протекторна активність оригінального субстітуенту реалізується його здатністю позитивно впливати на найбільш вразливі ланки патогенезу екстремального киснедефіцитного стану за допомогою встановлених у роботі особливостей фармакодинаміки і фармакокінетики.

1. Комплексними скринінговими дослідженнями на моделях гіпоксії замкнутого простору та гострої гіпоксичної гіпоксії на тлі гіпертермії, встановлено, що з 24 вивчених сполук, у тому числі 8 оригінальних препаратів, найбільш високою протекторною активністю володіє координаційний комплекс германію з нікотиновою кислотою, що проявляється максимальним збільшенням значень коефіцієнту протигіпоксичного захисту і відносного показника збільшення часу життя (Кз=1,5, П=50%), а також найбільш високим виживанням щурів на тлі сприятливої клінічної картини гострого плину гіпоксичного синдрому. У дослідах in vitro показано, що МІГУ-1 реалізує антиоксидантні властивості на рівні препарату порівняння – ?-токоферолу ацетату.

2. Розроблено оптимальний режим дозування координаційної сполуки германію з нікотиновою кислотою в умовах гіпоксії замкнутого простору, згідно якого найбільш високу протекторну активність МІГУ-1 проявляє при його інтраперитонеальному введенні в дозі 117,4 мг/кг за 77 хвилин до початку дії пошкоджуючих факторів.

3. Біохемілюмінісцентний аналіз протигіпоксичної активності координаційної сполуки германію з нікотиновою кислотою в дослідах in vivo вказує на здатність субстітуенту істотно корегувати кінетику надслабкого світіння шляхом різкого (на 20%) зниження значень амплітуд швидкого спалаху в сироватці крові і тканині мозку, а також повільного спалаху БХЛ (на 13 %) у сироватці крові щурів з гіпоксією замкнутого простору. Профілактичне застосування МІГУ-1 зменшує площу під кривою біохемілюмінісценції, що свідчить про високу антирадикальну активність сполуки. Антирадикальні властивості вивчаємого антигіпоксанту підтверджені в дослідах in vitro на моделях ініціації БХЛ Н2О2 та Fe2+.

4. Координаційна германій-вмістка сполука з нікотиновою кислотою, що застосовується на тлі гострої гіпоксичної гіпоксії з гіперкапнією, чинить виражену мембранопротекторну дію, в основі якої лежать антиоксидантні властивості, які реалізуються в динаіці зниженням продукції початкових (дієнові кон’югати) та кінцевих (ТБК-реактанти) продуктів ліпопереокислення, а також попередженням зниження активності і вмісту основних компонентів антиоксидантної системи захисту організму (СОД, каталази, SH-вмістких біосубстратів, в тому числі глутатіону відновленого), в сироватці крові та тканині мозку тварин.

5. Особливістю фармакодинаміки комплексної германійорганічної сполуки, що використовується з профілактичною метою в умовах гіпоксії замкнутого простору, є її здатність корегувати в різний термін після початку реоксигенації дисбаланс в енергетичному гомеостазі за рахунок підвищення вмісту АТФ в клітинах крові, а також попередження модифікації активності ферментів енергетичного обміну (лактатдегідрогенази, кретинкінази, глюкозо-6-фосфатдегідрогенази) з одночасною активацією глютаматдегідрогенази, що забезпечує швидкий і ощадливий шлях ресинтезу макроергів.

6. Протекторна активність органічної сполуки германію, що досліджувалась, на тлі моделюємої форми гіпоксії корелює з рівнем ендогенного оксиду азоту. Про це свідчить зниження (на 3,25%) величини коефіцієнту протигіпоксичного захисту МІГУ-1, а також погіршення клінічних проявів гіпоксичного синдрому у тварин в умовах пригнічення активності індуцибельної та конститутивної ізоформ NO-синтази.

7. Однією із сторон механізму протекторної дії координаційної сполуки германію з нікотиновою кислотою у тварин на тлі гіпоксичної гіпоксії в поєднанні з гіперкапнією є її здатність попереджати зниження рівня залізосірчаних білків (у 2 рази), вільних радикалів (на 17%), а також пригнічувати нагромадження нітрозильних комплексів заліза (більш, ніж у 2 рази). Водночас, застосування МІГУ-1 запобігає деградації компонентів мікросомального ланцюга транспорту електронів.

8. Фармакокінетичні параметри координаційної сполуки германію з нікотиновою кислотою у щурів в умовах впливу моделюємої форми гіпоксії істотно змінюються в порівнянні з інтактними тваринами. Під впливом патології різко збільшуються значення таких кінетичних параметрів сполуки, як час досягнення максимальної концентрації в крові (у 2 рази), початкова задана концентрація МІГУ-1 в крові (на 35%), константа швидкості екскреції та елімінації (більш, ніж у 2,2 рази), час досягнення максимальної концентрації в сечі (у 1,5 рази), а також загальний кліренс (на 49%), при зменшенні величин об’єму розподілу (у 1,5 рази), площі під фармакокінетичною кривою (у 2,2 рази), періодів напівекскреції і напівелімінації (більш, ніж у 2 рази).

9. Германійорганічна сполука з нікотиновою кислотою з високим ступенем афінітету зв'язується із сироватковим альбуміном (Кас=5,31 моль-1), менше – з комплексом білків сироватки крові (Кас=4,69 моль-1) і мембранами еритроцитів (Кас=4,58 моль-1). При цьому у всіх трьох випадках МІГУ-1 фіксується на біосубстраті одним активним центром (N=1). На тлі гіпоксії замкнутого простору відбувається істотна модифікація зв’язуючої здатності сироваткових протеїнів у відношенні досліджуваного антигіпоксанту, що особливо різко виражено в перші 3 і 6 годин з моменту реоксигенації, коли значення Кас зменшуються в 3,6 і 1,7 рази, відповідно, в порівнянні з білками сироватки крові інтактних тварин.

ПЕРЕЛІК РОБІТ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Пошук та експериментальне вивчення потенційних протигіпоксичних засобів: Методичні рекомендації / В.Д. Лук’янчук, Л.В. Савченкова, О.Д. Немятих, В.М. Радіонов – К.: ДФЦ МОЗ України, 2002. – 27с (дисертантом виконані обробка і аналіз літературних даних, оформлення та підготовка рекомендацій до друку)

2. Немятих О.Д. Скринінг потенційних протекторів гіпоксії замкнутого простору // Вісник фармації. – 2002. - №3 (31). – С. 78-81

3. Немятых О.Д. Влияние координационного соединения германия с никотиновой кислотой на окислительно-антиоксидантное равновесие в мозге крыс с гипоксией замкнутого пространства // Фармаком. - 2002. - №3.- С.180-184

4. Лук’янчук В.Д., Немятих О.Д., Савченкова Л.В. Вплив координаційної сполуки германію з нікотиновою кислотою на кінетику рівня парамагнітних центрів гепатоцитів у щурів в умовах гіпоксії замкнутого простору // Ліки. – 2002. - № 5-6. – С. 81-85 (дисертантом виконані експериментальні дослідження, обробка та інтерпретація даних, підготовка матеріалів до друку)

5. Лук’янчук В.Д., Немятих О.Д, Кравець Д.С. Вплив гіпоксії замкнутого простору на фармакокінетику координаційної сполуки германію з нікотиновою кислотою // Український журнал екстремальної медицини ім. Г.О. Можаєва. – 2002. – Т.3, №3. – С.75-79 (дисертантом виконані експериментальні дослідження, обробка та інтерпритація даних, підготовка матеріалів до друку)

6. Розробка режиму дозування координаційної сполуки германію з нікотиновою кислотою в умовах гіпоксії замкнутого простору // О.Д. Немятих, І.Й.Сейфулліна, О.П. Гудзенко, Д.С. Кравець // Фармацевтичний журнал. – 2002. - №4 – С. 86-90 (дисертантом виконані експериментальні дослідження, обробка даних, підготовка матеріалів до друку)

7. Немятих О. Д. Вплив координаційних сполук германію з нікотиновою кислотою та нікотинамідом на біохемілюмінісценцію в модельних дослідах // Вісник фармації. – 2003. - №3. – С.14-17

8. Немятих О.Д., Сейфулліна І.Й, Лисенко О.А. Біохемілюмінісцентний аналіз протигіпоксичної дії координаційної сполуки германію з нікотиновою кислотою // Одеський медичний журнал. – 2003. - №1 (75). – С.21-24 (дисертантом виконані експериментальні дослідження, обробка даних).

9. Лукьянчук В.Д., Немятых О.Д. Влияние координационного соединения германия с никотиновой кислотой на активность ферментов энергетического обмена при экстремальном кислороддефицитном состоянии // Український журнал екстремальної медицини ім. Г.О. Можаєва. – 2003. – №1. – С.62-66 (дисертантом проведений патентний пошук, виконані експериментальні дослідження, обробка даних, підготовка матеріалів до друку)

10. Фармакологічні ефекти германійорганічних сполук / І.Й. Сейфулліна, О.Д. Немятих, В.Д. Лукянчук, Є.В. Ткаченко // Одеський медичний журнал. – 2002. - №6. – С.110-114 (дисертантом виконані пошук та аналіз даних літератури)

11. Сравнительная антиоксидантная активность потенциальных протекторов гипоксии замкнутого пространства в модельных опытах / И.И. Сейфуллина, Е.А. Лысенко, О.Д. Немятых, Л.В. Савченкова // Сб. научн. тр. “Лекарства-человеку”. – Харьков: НФАУ, 2002. - Т.XVII, №2. – С. 242-246 (дисертантом виконані експериментальні дослідження, обробка даних)

12. Немятых О.Д. Антиоксидантно-прооксидантный гомеостаз у крыс в условиях гипоксии замкнутого пространства на фоне введения комплексного соединения германия с никотиновой кислотой // Матер. II Міжнар. конф. студентів і молодих вчених “Медицина-здоров`я XXI сторіччя” – Дніпропетровськ, 2002. – С. 42

13. Савченкова Л.В., Немятих О.Д. Нові уявлення про патогенез гіпоксичної гіпоксії, що розвивається на тлі перегріву // Матер. І Всеукр. наук.-практ. конф. з міжнародною участю “Політравма-сучасна концепція надання медичної допомоги” – К., 2002. – С. 25 (дисертантом проведений патентний пошук, виконані оформлення тез, підготовка матеріалів до друку)

14. Немятих О.Д. Визначення оборотнього комплексоутворення германійорганічної сполуки з нікотиновою кислотою