АКАДЕМІЯ МЕДИЧНИХ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ ТРАВМАТОЛОГІЇ ТА ОРТОПЕДІЇ

ПЕНДЕЛЯ АНДРІЙ АНАТОЛІЙОВИЧ

УДК 616.72–007.248–089.843:618.29

ТРАНСПЛАНТАЦІЯ ФЕТАЛЬНИХ ТКАНИН В
КОМПЛЕКСНОМУ ЛІКУВАННІ ОСТЕОАРТРОЗУ

14.01.21. – "травматологія та ортопедія"

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата медичних наук

Київ – 2004

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана на кафедрі ортопедії та травматології Харківського державного медичного університету МОЗ України.

Науковий керівник: доктор медичних наук, професор ЛИТОВЧЕНКО

ВІКТОР ОЛЕКСІЙОВИЧ, Харківський державний

медичний університет МОЗ України, професор кафедри травматології та ортопедії

Офіційні опоненти:

Провідна установа:

Захист відбудеться 29.03.2005 року о 14 на засіданні спеціалізованої вченої ради Д.26.606.01 Інституту травматології і ортопедії АМН України (01601, м. Київ, вул. Воровського, 27).

З дисертацією можна ознайомитися в бібліотеці Інституту травматології і ортопедії АМН України за адресою: 01601, м. Київ, вул. Воровського, 27.

Автореферат розісланий 27.02.2005року.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради

доктор медичних наук Страфун С.С.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Остеоартроз найбільш розповсюджена форма суглобової патології, яка є результатом дії механічних та біологічних факторів, що порушують функції хондроцитів, процеси біодеградації і синтезу позаклітинного матриксу суглобового хряща і субхондральної кістки (Скляренко Є.Т., 1995; Крисюк А.П., 1998; Корж М.О., Дєдух Н.В., Зупанець І.А., 1999; Гайко Г.В., 2003; Коваленко В.М., Борткевич О.П., 2003; Altman.D. et al, 1991, 1996; Chard J.A., 2000).

За даними літератури захворювання уражує від 6,4 до 12% населення країн світу, остеоартрозом різного ступеня хворіє від 1012% населення України (Рыбачук О.И. и др., 1999; Пустовойт Б.А., 2003). Захворювання характеризується дегенерацією суглобового хряща, структурними змінами субхондральної кістки, синовіїтом, хронічним перебігом і тенденцією до прогресування. На більш пізніх стадіях відмічається розвиток деформації та порушення біомеханіки суглобів (Поливода А.Н. и др., 2003). В 11,5% така патологія призводить до інвалідності хворих найбільш працездатного віку, що вказує на велику медикосоціальну значимість проблеми (Гайко Г.В., 2003).

Тактика лікування хворих на дегенеративно-дистрофічні ураження синовіальних суглобів характеризується складністю, багатоетапністю, і насамперед низькою ефективністю, що пояснюється недостатньо вивченими етіопатогенетичними механізмами захворювання. Основу цієї хвороби складає порушення метаболізму та структури суглобового хряща, що в кінцевому результаті призводить до його дистрофії, а на більш пізніх стадіях до деструкції, з’являються остеофіти, порушення в організації субхондральної кісткової тканини (Косинская Н.С., 1961; Снисаренко П.И., 2000; Лучихина Л.В., 2001). Патогенез остеоартрозу до кінця не вивчено, проте більшість дослідників впевнена, що він пов’язаний з функціональною недостатністю хондроцитів, їх неспроможністю підтримувати на достатньому рівні метаболічні процеси в хрящовій тканині (Шумада И.В и др., 1990; Маланин Д.А. и др., 1997; Поворознюк В.В., Головач І.Ю.,1999; Buckwalter J.A., 1997; Conrozier T., 1998). На сьогоднішній день відсутня адекватна патогенетична терапія цього захворювання.

Сучасні принципи лікування остеоартрозу складаються із медикаментозної терапії, яка в свою чергу базується на використанні препаратів протизапальної дії – кортикостероїдів та нестероїдних препаратів, хондропротекторів, вітамінів, мінералів, препаратів, що поліпшують кровообіг, засобів системної ензимотерапії, тих, що пригнічують активність лізосомальних ферментів, стимулюють метаболічні процеси в організмі. Широко застосовано та обгрунтовано використання фізіотерапевтичних методів, лікувальної гімнастики, механотерапії (Венгер В.Ф., 1998; Крисюк А.П, 1998; Корж М.О., Філіпенко В.А., 1998; Коваленко В.М., 1998; Пастернак В.Н., 2001; Vane J.R., Botting R.M., 1996, 2000). Всі ці заходи дозволяють покращити функцію ураженого артрозом суглоба, але актуальним залишається пошук патогенетичних способів лікування цього захворювання з довготривалим ефектом (Поливода А.Н., 1997; Левенець В.М., 1998; Подрушняк Є.П., 1999; Вишневський В.А., 2003; Felson D.T., Lawrence R.C. et al., 2000).

В останній час розроблюються і застосовуються біологічні замінники синовіальної рідини з метою лікування остеоартрозу (Пашков О.Є., 1995; Бруско А.Т. и др., 1997; Герасименко І.С. та ін., 1998; Вирва О.Є., 2000).

Хірургічні методи лікування носять реконструктивно-відновлювальний характер та спрямовані на поліпшення анатомічних взаємовідносин в суглобі (коригуючі остеотомії, артропластики, кісткова пластика), при контрактурах оперативні втручання носять мобілізуючий характер: артроліз, міоліз, теноліз та інші, проте останні за клінічним результатом часто лише гальмують патологічний процес (Попов В.А., 1995; Пустовойт Б.А., 2003).

Артроскопічний дебридмент при остеогоноартрозі є ефективною процедурою, проте він також паліативний по суті, а стадія ремісії хвороби нетривала (Левенец В.М., Пляцко В.В., Коструб А.А., 1998; Чехович Г.Г., 1999, 2001; Герцен Г.И., 2000-2002; Зазірний І.М., Терновий М.К., 2002; Johnson L.L., 1986; Scbimmer R., Brilbart K., Duff C., 1993).

За наявністю показань при тяжких формах захворювання все ширше застосовується ендопротезування суглобів, особливо у пацієнтів старших за 50 років (Лоскутов О.Є., 1997; Корж М.О., Філіпенко В.А., 1998; Подрушняк Є.П., 1999).

В останні роки в медицині перспективним є застосування клітинної та тканинної фетотерапії з метою оптимізації та стимуляції відновлювальних процесів (Белоус А.М., Грищенко В.И., 1994; Репин В.С., Сухих Г.Т., 1998; Грищенко В.И. и др., 1999-2002).

Трансплантація фетальних тканин при суглобовій патології потребує подальшого ретельного вивчення, оскільки повідомлення з приводу цього перспективного напрямку поодинокі (Печенюк В.И., Рунович А.А., 2001; Яковцова И.И., Бабалян В.А., 2001; Жигун А.И. и др.,2003).

Незважаючи на те, що дослідники та лікарі поєднали свої зусилля, питання патогенезу, раціональної терапії остеоартрозу далекі від завершення (Лаврищева Г.И., Оноприенко Г.А., 1996; Корж М.О., Дєдух Н.В., Зупанець І.А., 1999; Радченко В.А., Дедух Н.В. и др., 2000).

У зв?язку з цим вивчення аспектів репаративного морфогенезу суглобового хряща, оцінка ефективності лікування хворих на остеоартроз, аналіз динаміки біохімічних маркерів захворювання при застосуванні фетальних клітин та розробка раціональної схеми фетальної терапії є актуальними.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами і темами. Дисертаційне дослідження виконано відповідно до державних комплексних міжвідомчих програм та міжнародної декади захворювання кісток та суглобів (2000-2010 рік) і плану наукових досліджень Харківського державного медичного університету, № держреєстрації 0104U002245.

Мета дослідження – підвищення ефективністі лікування хворих з остеоартрозом шляхом застосування ембріональних клітин в комплексному лікуванні.

Завдання дослідження:

1. Дослідити ступінь та виразність дистрофічно-дегенеративних змін на моделі остеоартроза.

2. Вивчити в експерименті вплив трансплантації фетальних клітин на перебіг репаративного хондрогенезу при остеоартрозі.

3. Провести порівняльну оцінку біохімічних показників: глікопротеїнів та глюкозаміногліканів, вмісту глюкозаміноглікансульфатів та їх фракцій в крові хворих на остеоартроз в процесі лікування.

4. Провести оцінку клінічного ефекту комплексу загальноприйнятого консервативного лікування хворих з остеоартрозом.

5. Обгрунтувати та розробити раціональну лікувальну тактику остеоартрозу шляхом застосування трансплантації фетальних клітин і тканин в комплексному лікуванні.

Об?єкт дослідження – остеоартроз різного ступеня тяжкості у хворих (94 пацієнти) та на моделі остеоартрозу у дорослих статевозрілих щурів (40 піддослідних тварин).

Предмет дослідження – перебіг дегенеративно-дистрофічних процесів у суглобовому хрящі при застосуванні кріоконсервованої суспензії ембріональних клітин в комплексному консервативному лікуванні остеоартрозу.

Методи дослідження динаміки дегенеративно-дистрофічного процесу в експерименті: електронномікроскопічний, статистичний та у хворих на остеоартроз: клінічний, біохімічний, рентгенологічний, статистичний.

Аналіз отриманих результатів проводили методами варіаційної статистики та математичного моделювання з використанням стандартних комп’ютерних програм “Microsoft Excel 2000” та “Статистика”.

Наукова новизна одержаних результатів.–

вперше вивчена роль впливу трансплантації ембріональних клітин на репаративні процеси у хондроцитах при остеоартрозі. –

вперше проведена порівняльна оцінка ефективності впливу на дегенеративні зміни в суглобі після трансплантації кріоконсервованої суспензії ембріональних гемопоетичних клітин та кріоконсервованої суспензії ембріональних мезенхімальних клітин. –

вперше патогенетично обґрунтовано роль та місце фетальної терапії в комплексному лікуванні хворих на остеоартроз. Визначена динаміка біохімічних показників в крові хворих на остеоартроз при застосуванні трансплантації фетальних клітин. Отримані кореляційні залежності дозволяють з достатнім ступенем вірогідності прогнозувати динаміку остеоартрозного процесу.

Практичне значення отриманих результатів. В результаті проведених комплексних клінікоекспериментальних досліджень була розроблена та теоретично обґрунтована раціональна схема комплексного лікування хворих з остеоартрозом шляхом застосування трансплантації кріоконсервованої суспензії ембріональних гемопоетичних клітин та кріоконсервованої суспензії ембріональних мезенхімальних клітин в залежності від стадії перебігу остеоартрозу. При набряково-больовому симптомокомплексі доцільно застосовувати кріоконсервовану суспензію ембріональних гемопоетичних клітин: при I-II ступені захворювання препарат вводиться внутрішньосуглобово одноразово в об?ємі 0,5-1,0 мл з клітинністю 8-20 ? 106/мл зі строком гестації 8-12 тижнів, при II-III ступені – в об’ємі 0,5-1,0 мл з клітинністю 20-50 ? 106/мл, зі строком гестації 7-10 тижнів та при порушенні функціонального стану суглобів – кріоконсервовану суспензію ембріональних мезенхімальних клітин: при I-II ступені захворювання препарат вводиться внутрішньосуглобово одноразово в об’ємі 0,5-1,0 мл з клітиністю 5-18 ? 106/мл, зі строком гестації 7-8 тижнів, при II-III ступені – в об’ємі 0,5-1,0 мл з клітиністю 18-60 ? 106/мл зі строком гестації 5-8 тижнів.

Впровадження результатів дослідження. Основні положення дослідження впроваджені в практику роботи Харківської обласної клінічної лікарні, міської клінічної лікарні №26 м. Харкова, міської клінічної лікарні швидкої медичної допомоги ім. Мещанінова м. Харкова.

Матеріали роботи використовуються в навчальному процесі кафедри ортопедії і травматології Харківського державного медичного університету.

Особистий внесок автора. Клінікорентгенологічні дослідження та їх оцінка проведені автором персонально. Статистична обробка, математичне моделювання та аналіз результатів дослідження проведені автором особисто. Самостійно здобувачем проводились експерименти на тваринах, виділення і забір морфологічного матеріалу для електронно-мікроскопічного дослідження, вибір пристроїв для оцінки морфологічних змін об’єктів дослідження. Автор здійснив дослідження біохімічних показників у хворих на остеоартроз. Здобувач особисто застосовував трансплантацію фетальних клітин хворим на остеоартроз та проводив клінічне спостереження в динаміці.

Апробація результатів дисертації. Результати проведених досліджень були повідомлені та обговорені: на I науково-практичній конференції Харківської обласної лікарні "Актуальні проблеми медицини" (Харків, 2002), на об’єднаному Пленумі ортопедів-травматологів і ревматологів (Київ, 2003), на науково-практичній конференції КМАПО "Ушкодження та захворювання колінного суглобу" (Київ, 2003), на науково-практичній конференції морфологів "Роль імунної, ендокринної та нервової систем у процесах морфогенеза і регенерації" (Запоріжжя, 2003), на науково-практичній конференції з міжнародною участю "Актуальные вопросы тканевой терапии и перспектива применения природних биологически активных веществ в современной медицине" (Одеса, 2003), на міжнародній науково-практичній конференції "Проблеми клітинної та тканинної трансплантації" (Івано-Франківськ-Яремча, 2003), на Всеукраїнський науково-практичній конференції з актуальних проблем ортопедії та травматології "Сучасні підходи до лікування остеоартрозу" (Харків, 2003), на обласній конференції Харківської обласної спілки ортопедів-травматологів (Харків, 2003), на II науково-практичній конференції Харківської обласної лікарні "Сучасні методи лікування та реабілітації травм і їх наслідків. Невідкладна допомога при захворюваннях і травмах" (Харків, 2003), на II Всеросійському симпозіумі з міжнародною участю "Клинические и фундаментальные аспекты тканевой терапии. Теория и практика клеточных биотехнологий" (Самара, 2004).

Публікації. Основні положення дисертації опубліковані в 6 друкованих роботах, в журналах, сертифікованих ВАК України, 2 патентах на винахід, 4 друкованих роботах в збірниках наукових праць.

Обсяг і структура дисертації. Дисертаційна робота складається зі вступу, аналітичного огляду літератури, 4 розділів власних досліджень, аналізу та узагальнення результатів, висновків, списку використаних джерел. Містить 137 сторінок машинописного тексту, 32 рисунки, 11 таблиць. Список літератури містить 266 джерел, з них 90 – іноземних авторів.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ ДИСЕРТАЦІЇ

Матеріали та методи дослідження. Експериментальна частина виконана на 40 статевозрілих щурах-самцях масою 180-200 г. Експеримент виконаний на базі віварію Інституту кріобіології та кріомедицини НАН України за методикою, запропонованою О.Є.Пашковим (1993) та О.П.Тимошенко (1999). Всі тварини утримувались в стандартних умовах віварію.

Тваринам, що були розподілені на 3 серії дослідів після артротомії, наносили дефект в ділянці суглобової поверхні виростків великогомілкової кістки 1-2 мм, проводили розтин фібулярної колатеральної зв’язки суглоба. На 21 добу, після формування остеоартрозу, що підтверджено макроскопічно та морфологічно, проводили внутрішньосуглобове введення: в першій (контрольній) серії (13 щурів) ? 0,15 мл фізіологічного розчину, в другій серії (13 щурів) ? 0,15 мл кріоконсервованої суспензії ембріональних гемопоетичних клітин (50000 клітин) 7-12 тижнів гестації, в третій серії (14 щурів) ? 0,15 мл кріоконсервованої суспензії ембріональних мезенхімальних клітин (50000 клітин) 5-8 тижнів гестації. Розрахунок кількості клітин, застосованих в експерименті проводили за методикою Інституту кріобіології та кріомедицини НАН України. Операції виконувались за умов асептики та антисептики. Для оцінки репаративних процесів у хондроцитах суглобового хряща, тварини першої серії були взяті в якості контролю до двох наступних. Виведення тварин з експерименту та забір матеріалу проводили на 28, 35 та 42 добу з початку експерименту (7,14,21 доба з моменту введення препаратів).

За піддослідними тваринами проводили гігієнічне спостереження, в дослід брали тварин без ознак гнійної інфекції у післяопераційному періоді. Тривалість спостереження 42 доби.

Електронномікроскопічне дослідження субмікроскопічної організації хондроцитів суглобового хряща щурів виконано за загальноприйнятими методиками.

В основу клінічної частини роботи закладені дані клінічних досліджень 94 пацієнтів з остеоартрозом. Спостереження складалися з трьох груп до першої клінічної групи дослідження було включено 37 пацієнтів, які мали остеоартроз, їм була проведена загальноприйнята фармакологічна корекція захворювання. У другій клінічній групі комплексне консервативне лікування хворих на остеоартроз доповнювалося трансплантацією кріоконсервованої суспензії ембріональних мезенхімальних клітин 5-8 тижнів гестації одноразово шляхом внутрішньосуглобової ін'єкції (27 хворих). Третю клінічну групу дослідження склали 30 пацієнтів з остеоартрозом, яким після загальноприйнятої фармакологічної корекції було проведено трансплантацію кріоконсервованої суспензії ембріональних гемопоетичних клітин 7-12 тижнів гестації одноразово шляхом внутрішньосуглобового введення.

Біопрепарати, що застосовані в дослідженні виготовлялися та зберігалися у Низькотемпературному банку біологічних об’єктів Інституту проблем кріобіології і кріомедицини НАН України. Кріоконсервована суспензія ембріональних гемопоетичних клітин являє собою суспензію живих клітин, які виділяються з печінки ембріонів людини (строк гестації 7–12 тижнів). Печінка ембріонів цього терміну розвитку на 60% містить гемопоетичні клітини-попередники, що і дозволяє розглядати її в якості джерела донорських клітин. Концентрація ядерних клітин в препараті складає 8-50 млн. в залежності від строків гестації ембріонів.

Кріоконсервована суспензія ембріональних мезенхімальних клітин представляє суспензію кріоконсервованих життєздатних мезенхімальних стовбурових клітин, які добувають із мезенхімальних та мезодермальних тканин ембріонів людини (5-8 тижнів гестації). Концентрація ядерних клітин в препараті складає 5-60 млн. в залежності від терміну гестації ембріонів.

Україна підписала Конвенцію Ради Європи про захист прав та достоїнств людини в зв’язку із застосуванням досягнень біології та медицини, отже в наукових закладах створені Комітети з біоетики, які розглядають питання регламенту клінічних і наукових досліджень на всіх етапах роботи з ембріональними тканинами. На проведення клінічних досліджень отримано дозвіл комітету з питань етики. Кожен біопрепарат має паспорт, який підтверджує безпечність трансплантаційного матеріалу для реципієнта, сертифікат про державну реєстрацію медичного імунобіологічного препарату (№371/03 – 3002 00 0000), ліцензію державної служби лікарських засобів і виробів медичного призначення (АА №669887). Усі пацієнти давали письмову згоду на участь у клінічних випробуваннях за встановленою формою.

Пацієнтів з остеоартрозом клініко-рентгенологічно розподілено за Н.С. Косинською (1961) на І-ІІІ ступені захворювання (таблиця 1), які хворіли від 1 року до 26 років, з частотою загострення остеоартрозного процесу від 1 до 4 разів на рік, з балом болю не менше 2,5 за 10-бальною візуальною аналоговою шкалою, індексом Лекена не менше 8. Під наглядом знаходились хворі з післятравматичним та ідіопатичним остеоартрозом. Всі вищеозначені пацієнти знаходилися на стаціонарному та амбулаторному лікуванні у травматологічному відділенні обласної клінічної лікарні м. Харкова та травматологічному відділенні міської клінічної лікарні № 26 м. Харкова за період 1999-2003 роки.

Таблиця 1

Співвідношення хворих в клінічних групах за стадією захворювання за Н.С.Косинською

Клінічні групи спостережень | Всього хворих | Стадія остеоартрозу (кількість хворих)

I | II | III

абс. | % | абс. | % | абс. | %

Перша клінічна (контрольна) група | 37 | 5 | 13,51 | 23 | 62,16 | 9 | 24,33

Друга клінічна група | 27 | 4 | 14,82 | 14 | 51,85 | 9 | 33,33

Третя клінічна група | 30 | 4 | 13,33 | 19 | 63,34 | 7 | 23,33

Серед хворих було 41 (43,6%) чоловіків і 53 (56,4%) жінки. Вік хворих коливався від 18 до 76 років, але групи за віковою належністюпрактично однотипні. Хворі віком від 18 до 39 років становили 14,9%, а від 40 до 59 років склали 57,4%, тобто саме працездатний вік, що свідчить про велику соціально-економічну значимість і важливість удосконалення лікувальної тактики у хворих із даною патологією.

Всім пацієнтам проводили повний комплекс клініко-лабораторних обстежень. Для вивчення віддалених наслідків лікування хворі на остеоартроз перебували під спостереженням протягом року після закінчення курсу лікування. Клініко-лабораторні показники, що характеризують суглобовий синдром, вивчали до і одразу після лікування, а також через 3, 6, 9 та 12 місяців, згідно з розробленим стандартизованим протоколом.

Для оцінки ефективності лікування були використані клінічні показники, які рекомендовані робочою групою ОМЕRАСТ – ІІІ (1996), а саме: тривалість та вираженість ранкової скутості (тугорухомість), больовий індекс, візуальна аналогова шкала болю (ВАШ), динаміка фізичної активності та оцінки якості життя хворого (EuroQol-5D), альгофункційний індекс Лекена, об'єм рухів в ураженому суглобі, наявність та вираженість синовіїту, тривалість ремісії, набрякання та деформація суглоба, загальна оцінка хворим та лікарем ефективності лікування, загальна оцінка хворим та лікарем переносимісті лікування, частота застосування анальгетиків.

Основною метою біохімічного дослідження була візуалізація особливостей динаміки біохімічних показників під впливом клітинної трансплантації у лікуванні хворих на остеоатроз та вивчення динаміки метаболічних параметрів.

Для інтегральної оцінки біохімічних змін за даними літератури найбільш оптимальними були наступні методи: вимірювання вмісту глікопротеїнів, протеогліканів, глюкозаміногліканів в сироватці крові, визначення загальних глюкозаміноглікансульфатів та їх пофракційного складу в сироватці крові. Біохімічні дослідження були проведені з дотриманням медичних та медико– етичних вимог.

Визначення рівня гексоз глікопротеїнів та глюкозаміногліканів в сироватці крові базується на вимірюванні по реакції з орцином вмісту загального рівня гексоз, пов?язаних з білками, та гексоз глюкозаміногліканів після їх осадження із сироватки крові цетилпіридинійхлоридом за методикою В.С.Камишнікова (2000).

Дослідження сумарних глюкозаміноглікансульфатів та їх фракцій в сироватці крові проводили за методикою О.П.Тимошенко, Ф.С.Леонтєвої (1982), що основана на осадженні глюкозаміногліканів за допомогою резохіну та подальшому вимірюванні ступеня помутніння проби. В якості стандарту використовували розчин гепарину, відомої концентрації.

Апаратна діагностика полягала в рентгенографії суглобів і визначенні ознак остеоартрозу: звуження суглобової щілини, збільшення щільності субхондральної кістки, наявність і вираженість остеофітів та анатомо-функційної невідповідності. Рентгенологічне дослідження проводили на апараті РУМ-20.

Результати експериментальних досліджень. Проведене електронномікроскопічне дослідження субмікроскопічної організації хондроцитів суглобового хряща щурів, яким моделювали остеоартроз показало адекватність моделі. У суглобовому хрящі протікали перебудови органел хондроцитів, характерні для остеоартрозу.

У експериментальних тварин при розвитку остеоартрозу спостерігаються як дистрофічні, так і деструктивні порушення органел хондроцитів. Дистрофічним змінам піддавалися мітохондрії, що набрякали, матрікс їх втрачав електронну щільність; цистерни гранулярного ендоплазматичного ретикулюма вакуолізувались; спостерігалася помірна гіпертрофія комплексу Гольджі. Описані вище зміни спостерігалися в значній кількості хондроцитів і можуть бути розцінені як адаптаційнокомпенсаторні, оскільки глибина і ступінь виразності цих процесів знаходилися у фізіологічних межах.

Поряд з дистрофічними змінами досить велика кількість хондроцитів мала діляночні деструкції мембранних внутрішньоклітинних структур. Діляночний лізіс відмічався в ядерній мембрані, зовнішній мембрані і крістах мітохондрій, мембранах гранулярного ендоплазматичного ретикулюма, що свідчило про катаболічні процеси на субклітинному рівні.

В основі цих патологічних процесів лежать порушення внутрішньоклітинної біоенергетики, структурним проявом якої є описані вище деструкції мітохондрій.

У зв'язку зі зміною окислювальновідновлюваних реакцій у хондроцитах спостерігається різке зниження синтетичної активності хондроцитів, що структурно підтверджується вакуолізацією і фрагментацією ендоплазматичного ретикулюма, а також різке зменшення кількості як зв'язаних з його мембранами рибосом, так і вільнорозташованих у цитоплазмі.

Таким чином, дослідження хондроцитів суглобового хряща щурів показало, що обрана модель остеоартрозу відповідає патогенетичним механізмам розвитку остеоартрозу на субклітинному рівні та найбільш близька за морфологічними ознаками до змін, які спостерігаються в клініці.

У I-й серії експериментальних тварин, яким вводили фізіологічний розчин істотних змін в ультраструктурі хондроцитів не спостерігалося. Збереглися дистрофічні зміни в частини хондроцитів у вигляді набрякання мітохондрій, розширення цистерн гранулярної ендоплазматичної сітки і гіпертрофія пластинчастого цитоплазматичного комплексу Гольджі. Інша частина клітин мала чітко виражені ознаки розвитку деструктивного процесу. У них виявлялися множинні осередки деструкції ядерної мембрани, зовнішніх мембран і кріст мітохондрій та гранулярного едоплазматичного ретикулюма.

Введення в суглоб зі змодельованим остеоартрозом кріоконсервованої суспензії ембріональних гемопоетичних клітин в II-й серії експериментальних тварин викликає підвищення активності репаративних внутрішньоклітинних процесів, що структурно підтверджується збільшенням кількості рибосом і полісом у цитоплазмі, гіперплазією гранулярного ендоплазматичного ретикулума і збільшенням числа кріст мітохондрій. Одночасно з цим спостерігається істотне зменшення кількості осередків деструкції внутрішньоклітинних мембран.

Аналогічна динаміка перебудови субмікроскопічної архітектоніки хондроцитів спостерігалася й у III-й серії експериментальних тварин зі змодельованим остеоартрозом після введення кріоконсервованої суспензії ембріональних мезенхімальних клітин. У цій серії відзначаються більш інтенсивні репаративні процеси, що структурно виражалася в гіперплазії мембран гранулярної ендоплазматичної сітки, на її мембранах збільшувалося число рибосом. До кінця експерименту ультраструктура хондроцитів набувала типової будови.

Таким чином, введення фетальних клітин в експерименті викликало стимуляцію репаративних процесів у хондроцитах на рівні внутрішньоклітинних мембран і органел.

Результати застосування фетальних клітин у хворих на остеоартроз. В залежності від стадії остеоартрозу, давності захворювання та ремісії, результатів клініко-біохімічних обстежень, пацієнтам, що склали першу клінічну групу (37 пацієнтів з остеоартрозом великих суглобів), був проведений комплекс консервативного лікування. Підхід до лікування хворих був індивідуальний, але практично ідентичним для всіх досліджених груп. Комплекс консервативного лікування включав наступні заходи: СПЗП внутрішньосуглобово або параартикулярно, НПЗП специфічні або селективні інгібітори ЦОГ2, хондопротектори, препарати, які поліпшують внутрішньокістковий та регіональний кровообіг, полівітаміни та мінерали, препарати ензимотерапії, місцеве лікування протизапальними гелями, ЛФК, масаж кінцівок, ФТЛ.

Клінічна оцінка ефективності лікування хворих на остеоартроз в першій клінічній групі, яка склала контрольну групу нашого дослідження, вказує на необхідність вдосконалювати комплекс консервативної терапії, оскільки результати лікування часто не задовольняють пацієнта та лікаря, а пошук чинників, що впливають на відновлювальні процеси в хондроцитах, залишається актуальними.

Виходячи із даних експериментальних досліджень, про стимуляцію репаративних процесів у хондроцитах в умовах деструктивнодистрофічних процесів у синовіальному суглобі, в основу лікувальної тактики у другій та третій клінічних групах був закладений принцип трансплантації кріоконсервованої суспензії ембріональних мезенхімальних клітин та кріоконсервованої суспензії ембріональних гемопоетичних клітин у комплексному консервативному лікуванні остеоартрозу.

В залежності від стадії остеоартрозного процесу, давності захворювання, тривалості ремісії, результатів клінікобіохімічних обстежень та особливостей перебігу деструктивнодистрофічного процесу, пацієнтам, що склали II клінічну групу було проведено комплекс консервативної терапії, аналогічний лікуванню в інших клінічних групах.

В комплексній медикаментозній терапії хворим другої клінічної групи було проведено трансплантацію кріоконсервованої суспензії ембріональних мезенхімальних клітин шляхом внутрішньосуглобового введення препарату пункційним способом одноразово в обємі 0,51,0 мл з клітинністю препарату 5,0 – 60,0 ? 6/мл, строк гестації становив 58 тижнів.

В III-ій клінічній групі проведений комплекс консервативної терапії був аналогічний застосованому лікуванню в інших клінічних групах.

В комплексній медикаментозній терапії в III клінічній групі було проведено трансплантацію кріоконсервованої суспензії ембріональних гемопоетичних клітин шляхом внутрішньосуглобового введення препарату пункційним способом 0,5-1,0 мл з клітинністю препарата 8 – 50?106/мл, строки гестації становили 7-12 тижнів.

Ефективність лікування оцінювалась за даними клінічних, біохімічних та рентгенологічних обстежень до та одразу після лікування, а також на 3, 6, 9, 12 міс. Тривалість ремісії у першій клінічній групі склала у середньому 9,7 міс (від 3,5 до 18 міс). Тривалість ремісії у II клінічній групі склала 11,5 міс (від 4 до 30 міс). Тривалість ремісії у III клінічній групі склала 11,1 міс (від 6 до 26 міс).

Динаміка болю представлена на діаграмах за візуальною аналоговою шкалою (рис.1) та больового індексу у суглобах (рис.2) у хворих кожної клінічної групи. Простежується достовірна різниця між клінічними групами (p<0,05), де застосовували трансплантацію фетальних клітин в комплексному лікуванні остеоартрозу та контрольною групою, в якій була проведена тільки стандартна загальноприйнята терапія. Найбільш виражене та тривале зниження больового синдрому за даними ВАШ та больового індексу відмічається в III клінічній групі, де було застосовано трансплантацію кріоконсервованої суспензії ембріональних гемопоетичних клітин.

Динаміка об’єму рухів колінних суглобів згрупована та представлена на діаграмі (рис.3), яка відображає незначне збільшення об’єму рухів в усіх клінічних групах, але більш стійке у II та III клінічних групах. Достовірна різниця між контрольною та дослідними групами становила (p<0,05).

Динаміка функціонального стану суглобів представлена в діаграмах (альгофункціональний індекс Лекена (рис.4), ранкова скутість суглобів (рис.5)), які вказують на достовірну різницю між клінічними групами, в яких проводили трансплантацію фетальних клітин та контрольною групою (p<0,05). Більший оптимізуючий ефект на функціональний стан суглобів визначено в II клінічній групі, де хворим застосовували трансплантацію кріоконсервованої суспензії ембріональних мезенхімальних клітин.

Таким чином, особливості лікувальної тактики хворих на остеоартроз, що полягають в застосуванні ембріональних клітин в комплексі з фармакологічною корекцією призводять до покращення клінічних показників з довготривалою ремісією, про що свідчать практично всі показники доказової медицини, а саме: тривалість та вираженість ранкової скутості, больовий індекс, візуальна аналогова шкала болю, динаміка фізичної активності та оцінки якості життя хворого (EuroQol-5D), альгофункційний індекс Лекена, об'єм рухів у пошкодженому суглобі, тривалість ремісії, набрякання та деформація суглоба, загальна оцінка хворим та лікарем ефективності лікування, загальна оцінка хворим та лікарем переносимісті лікування, частота застосування анальгетиків.

Результати досліджень біохімічних змін у сироватці крові хворих на остеоартроз. Результати вимірювання загальної кількості глікопротеїнів в сироватці крові та їх розподілу між фракціями представлено в таблиці 2. Відомо, що пофракційний спосіб визначення глікопротеїнів та глюкозаміногліканів дає змогу диференціювати метаболічні зрушення, обумовлені деструктивними та дезорганізаційними процесами в сполучнотканинних структурах від змін, викликаних реакцією організму на осередок ушкодження. Дослідження цих показників в динаміці дозволяє судити про перебіг хвороби та ефективність лікування. При цьому з’являється можливість слідкувати за динамікою патологічного процесу, встановлювати початок репаративних процесів в ураженому суглобі. Вважається, що індикатором деструктивних процесів можуть слугувати тільки зміни глюкозаміногліканів, що складають основу сполучної тканини. В той час як зростання загальних глікопротеїдів більшою мірою пов’язане із збільшенням кількості білків гострої фази та наявністю запального процесу в організмі.

Таблиця 2

Концентрація гексоз в сироватці крові хворих на остеоартроз та їх розподіл між фракціями глікопротеїнів та глюкозаміногліканів (г/л)

Група

досліджених | Загальний рівень гексоз,
г/л | Вміст гексоз глікопротеїнів, г/л | Вміст гексоз

глюкозаміно-гліканів,
г/л | Співідношення вмісту гексоз:

глюкозаміно-глікани/
глікопротеїни

Практично здорові, n=15 | 0,720,14 | 0,650,12 | 0,060,03 | 0,10,01

Остеоартроз, фармакологічна корекція, n=37

до лікування

одразу після лікування |

0,840,12

0,780,11 |

0,690,11

0,670,1 |

0,150,04

0,110,03 |

0,220,03

р<0,05

0,1640,02

Остеоартроз,

фармакологічна корекція + трансплантація,

КСЕМК, n=27

до лікування

одразу після лікування |

0,870,05

0,750,1 |

0,710,12

0,670,11 |

0,160,04

р<0,05

0,080,03 |

0,230,03

р<0,05

0,120,02

Остеоартроз,

фармакологічна корекція + трансплантація, КСЕГК, n=30

до лікування

одразу після лікування |

0,890,14

0,740,11 |

0,720,11

р<0,05

0,680,12 |

0,180,05

0,090,03 |

0,240,04

р<0,05

0,130,02

р<0,05 – достовірні відмінності між групою хворих на ОА та практично здоровими

Результати вимірювання загальної кількості глюкозаміноглікансульфатів в крові та їх розподілу між фракціями представлено в таблиці 3. Пофракційний спосіб визначення глюкозаміноглікансульфатів дає змогу диференціювати метаболічні зрушення, викликані деструктивними процесами в сполучнотканинних структурах суглоба від змін, викликаних реакцією організму на осередок ушкодження. Динаміка цих параметрів дає змогу судити про стадію хвороби, спостерігати за динамікою патологічного процесу, встановлювати початок репаративних процесів в ураженому суглобі та оцінювати терапевтичний ефект проведеного лікування.

Таблиця 3

Динаміка змін рівня глюкозаміноглікансульфатів та їх розподілу між фракціями у хворих на остеоартроз (умовні одиниці)

Група

досліджених | Глюкозаміно-глікансульфати, г/л | Фракція І, у.о. | Фракція ІІ, у.о. | Фракція ІІІ, у.о.

Практично здорові, n=15 | 12,11,4 |

5,80,6 |

3,90,4 |

2,80,3

I клінічна група, n=37

до лікування

після лікування |

18,42,1

р<0,05

15,61,7 |

8,40,8

р<0,05

7,60,8 |

5,70,6

р<0,05

4,80,4 |

4,30,5

р<0,05

3,40,4

II клінічна група, n=27

до лікування

після лікування |

19,12,1

р<0,05

14,81,5 |

8,70,9

р<0,05

7,10,7 |

5,90,7

р<0,05

4,10,4 |

4,70,5

р<0,05

3,30,2

III клінічна група, n=30

до лікування

після лікування |

17,91,6

р<0,05

13,61,5 |

8,90,8

р<0,05

6,20,7 |

5,50,5

4,40,6 |

4,60,4

р<0,05

3,10,3

р<0,05 – достовірні відмінності між групою хворих на ОА та практично здоровими

Біохімічні дослідження показали, що кількість глюкозаміноглікансульфатів підвищувалась у пацієнтів з остеоартрорзом як за рахунок їх загального рівня так і зростання їхнього вмісту в окремих фракціях. Найбільшою мірою це підвищення визначається у фракціях І і ІІ, які містять переважно хондроїтин-6-сульфати та хондроїтин-4-сульфати, які є специфічними для хрящової тканини. Незначні зміни показано для фракції ІІІ, яка переважно складається з гепаран- та дерматансульфатів.

Показано, що початкова деградація хондроїтинсульфатів відбувається в хрящовій тканині різної локалізації, метаболізм цих сполук здійснюється лізосомальними протеїназами і глікозидазами хондроцитів та інших клітин суглобової капсули або можуть підлягати дифузії в систему кровоплину. На наступному етапі хондроїтинсульфат повністю метаболізується в лізосомах печінки під дією сульфатаз та глікозідаз. Підвищення рівня хондроїтинсульфатів в крові хворих на остеоартроз свідчить про активацію деструкційних процесів в суглобі та недостатність механізмів їх утилізаціїї в організмі. Поряд з цим, у обстежених пацієнтів спостерігається підвищення проникненості кровоносних судин та лімфатичних протоків внаслідок розвитку запальної реакції, що також сприяє накопиченню в крові глюкозаміногліканів та хондроїтинсульфатів. Ці ознаки можуть бути також наслідками компенсаторних процесів, викликаних необхідністю катаболізму та видалення з організму компонентів підсиленого розпаду протеїнцукрових комплексів, що мають стосунок до функціонування хрящової тканини.

Внаслідок проведеної терапії після фармакологічної корекції вміст глюкозаміноглікансульфатів знижувався незначно, поєднання фармакологічної корекції з трансплантацією кріоконсервованої суспензії ембріональних мезенхімальних клітин та кріоконсервованої суспензії ембріональних гемопоетичних клітин приводило до більш виразного зменшення рівня цих сполук, а подекуди до нормальних значень.

Підсумовуючи результати проведених досліджень, слід відзначити, що вища терапевтична ефективність спостерігалась після застосування поряд з консервативним лікуванням внутрішньосуглобової трансплантації кріоконсервованої суспензії ембріональних мезенхімальних клітин та кріоконсервованої суспензії ембріональних гемопоетичних клітин . Цей оптимізуючий вплив виявлявся як в покращенні клінічної картини захворювання так і в нормалізації рівня глікопротеїнів, протеогліканів, глюкозаміногліканів та хондроїтинсульфатів в сироватці крові хворих на остеоартроз, що загалом може бути свідченням зменшення запального процесу та стимуляції репаративного хондрогенезу в ураженому суглобі.

В цілому, біохімічні зміни, визначені у хворих на остеоартроз та їхня динаміка після проведеного лікування підтверджують високу ефективність та обгрунтовують доцільність запропонованих схем комплексної терапії цього захворювання.

Схема застосування фетальної терапії у хворих на остеоартроз. Враховуючи дані експериментального дослідження про вплив ембріональних клітин на репаративні процеси у хондроцитах суглобового хряща при остеоартрозі, дані про клінічну ефективність застосування фетальної терапії у хворих на остеоартроз, дані математичного моделювання, лікувальна тактика ґрунтувалась на внутрішньосуглобовому введенні кріоконсервованої суспензії ембріональних гемопоетичних та мезенхімальних клітин у комплексному лікуванні. Нами запропонована наступна схема.

При вираженому больовому синдромі, набряканні параартикулярних тканин, доцільним є застосування трансплантації кріоконсервованої суспензії ембріональних гемопоетичних клітин шляхом внутрішньосуглобового введення в уражений суглоб одноразово.

При III стадії захворювання кріоконсервована суспензія ембріональних гемопоетичних клітин застосовується в об’ємі 0,51,0 мл з клітинністю 820106/мл, зі строком гестації 812 тижнів.

При IIIII стадії захворювання кріоконсервована суспензія ембріональних гемопоетичних клітин застосовується в об’ємі 0,51,0 мл з клітинністю 2050106/мл зі строком гестації 710 тижнів.

При зменшеній амплітуді рухів у суглобі, значній ранковій скутості, значному індексу Лекена та вираженому зниженні фізичної активності застосовується трансплантація кріоконсервованої суспензії ембріональних мезенхімальних клітин шляхом внутрішньосуглобового введення в уражений суглоб одноразово.

При III стадії захворювання доцільно застосовувати кріоконсервовану суспензію ембріональних мезенхімальних клітин в об’ємі 0,51,0 мл з клітинністю препарату від 5–18 106/мл, строк гестації 78 тижнів.

При IIIII стадії остеоартрозу доцільно застосовувати кріоконсервовану суспензію ембріональних мезенхімальних клітин в об’ємі 0,51,0 мл з клітинністю 1860Ч106/мл, строк гестації 58 тижнів.

Найбільш ефективним є застосовування кріоконсервованої суспензії ембріональних мезенхімальних клітин та кріоконсервованої суспензії ембріональних гемопоетичних клітин при I та II стадії остеоартрозу та малодоцільним використання трансплантації фетальних тканин при III стадії захворювання.

Протипоказання до застосування ембріональних клітин, на нашу думку, становлять наявність синовіїту у суглобі та гнійно-інфекційних процесів у шкірі та навколосуглобових тканинах при остеоартрозі.

Після проведеного лікування рекомендовано обмеження фізичної активності та зниження навантажень в залежності від стадії захворювання терміном 2-6 тижнів, з подальшим ЛФК та санаторнокурортним лікуванням.

ВИСНОВКИ

1. Проведені експериментальні, лабораторні та клінічні дослідження дозволили вирішити науково-практичну задачу використання фетальних тканин в комплексному лікуванні хворих на остеоартроз.

2. На експериментальній моделі остеоартрозу показано, що деструктивні та дистрофічні зміни суглобового хряща на субклітинному рівні у хондроцитах проявляються деструкцією мембран і кріст мітохондрій, ядерної мембрани, вакуолізацією і фрагментацією мембран гранулярної ендоплазматичної мережі, що відповідає патогенетичним механізмам розвитку остеоартрозу на субклітинному рівні.

3. Внутрішньосуглобове введення фетальних клітин в експерименті викликає стимуляцію репаративних процесів у хондроцитах, що структурно підтверджується збільшенням кількості рибосом і полісом у цитоплазмі, гіперплазією гранулярного ендоплазматичного ретикулюма, збільшенням числа кріст мітохондрій, зменшенням кількості осередків деструкції внутрішньоклітинних мембран.

4. У стадії загострення остеоартрозу в сироватці крові хворих зростає концентрація гексоз за рахунок глікопротеїнів та глюкозаміногліканів, достовірно підвищується коефіцієнт співвідношення глюкозаміноглікани/глікопротеїни, збільшується загальний рівень глюкозаміноглікансульфатів та їх фракцій хондроїтин-6-сульфат та хондроїтин-4-сульфат.

5. Найбільша позитивна динаміка біохімічних показників: глюкозаміногліканів та їх співвідношення з глікопротеїнами, хондроїтин – 6-сульфатів та хондроїтин-4-сульфатів спостерігалася після трансплантації фетальних тканин у хворих на остеоартроз.

6. На основі проведених клінічних та експериментальних досліджень розроблені схеми лікування хворих на остеоартроз. При набряково-больовому симптомокомплексі застосування кріоконсервованої суспензії ембріональних гемопоетичних клітин внутрішньосуглобово одноразово: при I-II ступені захворювання доцільно застосовувати препарат в об?ємі 0,5-1,0 мл з клітинністю 8-20 ? 106/мл зі строком гестації 8-12 тижнів, при II-III ступені – в об’ємі 0,5-1,0 мл з клітинністю 20-50 Ч 106/мл, зі строком гестації 7-10 тижнів та при порушенні функціонального стану суглобів – кріоконсервованої суспензії ембріональних мезенхімальних клітин внутрішньосуглобово одноразово: при I-II ступені захворювання препарату 5-18 ? 106/мл, зі строком гестації 7-8 тижнів, при II-III ступені – в об’ємі 0,5-1,0 мл з клітиністю 18-60 ? 106/мл зі строком гестації 5-8 тижнів.

СПИСОК ПРАЦЬ, ОПУБЛІКОВАНИХ ПО ТЕМІ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Литовченко В.О., Пенделя А.А., Невзоров В.П., Власенко В.Г., Петренко О.Ю., Сукач О.М. Зміни ультраструктурної організації хондроцитів у суглобовому хрящі під дією гемопоетичних ембріональних клітин печінки і мезенхімальних клітин шляхом внутрішньосуглобового введення в експерименті // Вісник морфології. – №2. –2002. – С.228230.

Автором проведений експеримент на щурах, підготовлений матеріал для електронної мікроскопії, проведений аналіз електронномікроскопічних показників при остеоартрозі.

2. Литовченко В.О., Пенделя А.А., Петренко О.Ю., Сукач О.М., Власенко В.Г., Березка М.І. Трансплантація кріоконсервованих гемопоетичних клітин ембріональної печінки людини в комплексному лікуванні деформуючого артрозу великих суглобів // Врачебная практика. – 2002. – №6. – С.4951.

Автором проведено аналіз особливостей перебігу остеоартрозного процесу при фармакологічній корекції та застосуванні ембріональних гемопоетичних клітин.

3. Мірошниченко О.В., Литовченко В.О., Пенделя А.А., Самосудова Л.В. Динаміка біохімічних змін у хворих на остеоартроз в процесі лікування // Труды Крымского государственного медицинского университета им. С.И.Георгиевского: "Проблемы, достижения и перспективы развития медикобиологических наук практического здравоохранения. – Т.138. – ч.3. – 2002. – C.6466.

Автором проведено аналіз динаміки біохімічних змін у хворих на остеоартроз в процесі лікування.

4. Литовченко В.О., Пенделя А.А., Власенко В.Г., Спесивий І.І. Роль та місце клітинної терапії в лікуванні деформуючого артрозу // Тези доповідей I конференції Харківської обласної клінічної лікарні: "Актуальні проблеми медицини". – 2002, Харків. – С.23.

Автором проведено аналіз механізму дії клітинної терапії в лікуванні деформуючого артозу.

5. Коструб О.О., Литовченко В.О., Пенделя А.А., Березка М.І., Спесивий І.І., Григорук В.В. Лікувальна тактика остеоартрозів великих суглобів // Збір. наук. праць співробітників КМАПО ім. П.Л.Шупика, вип. 12 кн.2 – К. – 2003. – С.7478.

Автором проведено аналіз та вироблена лікувальна тактика остеоартрозів великих суглобів.

6. Пенделя А.А., Литовченко В.О., Григорук В.В., Гуліда М.О., Палкін Б.В., Федорченко А.І. Динаміка ультраструктурних змін хондроцитів після трансплантації ембріональних клітин при остеоартрозі // Збір. наук. статей наук.прак. конф. морфологів: "Роль імунної, ендокринної та нервової систем в процесах морфогенезу та регенерації". – 2003. Вип. XI – С.117121.

Автором проведено аналіз ультраструктурних змін хондроцитів після трансплантації ембріональних клітин при остеоартрозі.

7. Литовченко В.О., Пенделя А.А., Власенко В.Г. Застосування тканинних препаратів при лікуванні остеоартрозу. // Тези наук.прак. конференції з міжнародною участю та актуальні питання тканинної терапії та перспективи застосування природних біологічно активних речовин у сучасній медицині. – 2003, Одеса. – С.103104.

Особистий внесок автора полягає у проведенні аналізу застосування тканинних препаратів при лікуванні дегенеративнодистрофічного процесу.

8. Литовченко В.О., Пенделя А.А., Власенко В.Г., Гарячий Е.В., Гуліда М.О. Клітинна трансплантація в лікуванні остеоартроза великих суглобів. // Трансплантологія. Т.4. №1. – 2003. – С.163–164.

Автором проведено аналіз клінічної ефективності застосування трансплантації ембріональних препаратів в лікуванні остеоартрозу, розроблена адекватна схема лікування.

9. Пенделя А.А., Литовченко В.О., Березка М.І., Власенко В.Г., Шармазанов А.В. Використання тканинних препаратів в лікуванні остеоартроза // Тези