КИЇВСЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ імені ТАРАСА ШЕВЧЕНКА

РОМАНОВА ОЛЕНА АНАТОЛІЇВНА

УДК: 616-089.848:612.112.94+612.419]:612.017.1

ВІДНОВЛЕННЯ КІСТКОВОГО МОЗКУ ЯК ОРГАНУ ІМУНІТЕТУ У РЕЦИПІЄНТІВ ЛІМФОМІЄЛОТРАНСПЛАНТАТУ

03.00.09 – імунологія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук

Київ – 2004

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Інституті мікробіології та імунології ім. І.І.Мечникова АМН України.

Науковий керівник: доктор медичних наук, професор, член-кореспондент НАН України Гольцев Анатолій Миколайович, Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України, заступник директора з наукової роботи

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, старший науковий співробітник Мінченко Жанна Миколаївна, Науковий центр радіаційної медицини АМН України, завідувач лабораторії імуногенетики;

доктор медичних наук, професор Лісяний Микола Іванович, Інститут нейрохірургії ім.А.П.Ромоданова АМН України, завідувач відділу нейроімунології

Провідна установа: Інститут експериментальної патології, онкології та радіобіології ім.Р.Є.Кавецького НАН України, м.Київ

Захист відбудеться "08" лютого 2005 року о 14.00 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.001.14 Київського національного університету імені Тараса Шевченка за адресою: 03127, м. Київ, проспект Глушкова, 2, корпус 12. Поштова адреса: 01033, Київ, вул. Володимирська, 64.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Київського національного університету імені Тараса Шевченка за адресою: 01033, Київ, вул. Володимирська, 58.

Автореферат розісланий "29" грудня 2004 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради

кандидат біологічних наук,

доцент Молчанець О.В.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Лікування ряду розладів гемопоезу, лімфопоезу та імуногенезу, внаслідок складності їх походження (Дранник Г.Н., 1999, Йегер Л., 1990), потребує використання засобів, які б одночасно мали і компенсаторні, і регуляторні властивості. Методи та засоби корекції цих порушень, що існують за теперішнього часу, не відповідають у повній мірі сучасним вимогам, оскільки не здатні здійснювати всеохоплюючий контроль процесів кровотворення та імуногенезу. При використанні вибірково- і штучнорегулюючих препаратів спостерігається їх швидкоплинна дія, а у багатьох випадках - виникнення побічних ефектів (Migauchi J et al., 1987, De Dhar S., 1988).

Єдиним корегуючим засобом з природною здатністю як до компенсаторного, так і до полірегуляторного впливу на процеси гемопоезу і вироблення клітин імунітету є клітини кісткового мозку (ККМ), що містять у своєму складі родоначальні поліпотентні гемопоетичні одиниці, комітовані лімфоїдні клітини і клітини-регулятори гемопоезу та імуногенезу.

Відомо, що при трансплантації ККМ не завжди відбувається приживання трансплантованих клітин, часто спостерігаються довготривалі гемо- та імунодепоресії, а також неповна реалізація пересадженими клітинами їх гемопоетичних потенцій (Gale R.P, 1998, Булычева Т.И. и др., 2000). У зв'язку з цим особливого значення набуває конструювання клітинного трансплантату, призначеного для форсованого і якісного відновлення гематологічного та імунного статусу реципієнтів з дефіцитом кровотворення.

Експериментальні і клінічні дані свідчать про те, що найбільш значущою у ранньому періоді після трансплантації ККМ є проблема затримки реконституції лімфоїдної тканини та імуногенезу, наслідком якої стають інфекційні та неінфекційні ускладнення, здатні призводити до фатального кінця (Лисуков И.А. и др., 1998, Carreras E. et al., 1998). Враховуючи це та беручи до уваги участь лімфоцитів у процесах гемопоезу, проліферації і диференціювання кровотворних попередників (Ярилин А.А. и др., 1985, Дыгай А.М., Шахов В.П., 1989) і процесах репаративної регенерації різних тканин (Бабаева А.Г., 1985, Белан Е.И., 1992), особливо важливою вбачається компенсація у ранньому післятрансплантаційному та подальшому періодах дефіциту організму у лімфоїдних клітинах, які відіграють важливу роль у підтриманні гомеостазу організму та його життєздатності.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота виконана у відповідності до науково-дослідної теми Інституту мікробіології та імунології ім. І.І.Мечникова АМН України “Розробка наукових основ і практичних підходів застосування з лікувальною метою клітин кровотворних та імунокомпетентних тканин при гемо- та імунопатіях” (№ держреєстрації UA 01000522Р). Здобувач – відповідальний виконавець вказаної теми.

Мета і задачі дослідження. Мета дослідження – на моделі променевої депресії гемопоезу та імуногенезу визначити основні закономірності відновлення кістковомозкового мієлопоезу, лімфопоезу та імуногенезу після лімфомієлотрансплан-тації і роль факторів, що впливають на нього у післятрансплантаційному періоді.

Для досягнення зазначеної мети були поставлені такі задачі:

1. Дослідити динаміку відновлення клітинності, клітинного складу кісткового мозку і основних параметрів крові (кількості еритроцитів, лейкоцитів, гемоглобіну, лейкоцитарної формули) після лімфомієлотранс-плантації.

2. Визначити закономірності реконституції кровотворного (кількісного вмісту КУО та їх функціональної активності) і лімфоїдного компартментів кісткового мозку у реципієнтів після лімфомієлотрансплантації.

3. Вивчити характер перебігу метаболічних процесів у мієлокаріоцитах на етапах відновлення кісткового мозку.

4. Визначити роль клітинних і гуморальних факторів у відновленні кісткового мозку після лімфомієлотрансплантації.

5. Порівняти ефективність відновлення гемопоезу та імуногенезу у реципієнтів, захищених лімфомієлотрансплантатом та мієлокаріоцитами per se.

Об'єкт дослідження - кістковий мозок тварин-реципієнтів лімфомієлотранс-плантату.

Предмет дослідження: процеси відновлення мієлопоезу, лімфопоезу та імуногенезу у реципієнтів лімфомієлотрансплантату, механізми і фактори регуляції відновлювальних процесів.

Методи дослідження. Гематологічні методи для оцінки вмісту еритроцитів, лейкоцитів, гемоглобіну у периферичній крові, вмісту колонієутворюючих одиниць (КУОс) у відновлюваному кістковому мозку; цитологічні та гістологічні методи – для оцінки відновлення клітинного складу кісткового мозку і периферичної крові та напряму диференціювання КУОс; радіоізотопні методи – для визначення проліферативної активності мієлокаріоцитів, рівня продукції лімфоцитів кістковим мозком, регуляторної дії мієлокаріоцитів і лімфоцитів та гуморальних факторів сироватки; імунологічні – для визначення вмісту лімфоцитів у кістковому мозку, їх фенотипічного складу і функціональної активності, функціональної здатності лейкоцитів периферичної крові, а також вивчення регуляторної дії мієлокаріоцитів, лімфоцитів, гуморальних факторів, що ними продукуються і гуморальних факторів сироватки; спектрофотометричні та колориметричні – для визначення активності ключових ферментів основних обмінних циклів, стану процесів перекисного окислення ліпідів та загальної антиокислювальної активності ККМ.

Наукова новизна отриманих результатів. Вперше встановлено основні кількісні, функціональні і метаболічні закономірності відновлення кісткового мозку, процесів лімфопоезу та імуногенезу у реципієнтів, що отримали комбінований лімфомієлотрансплантат. Показано, що відновлення клітинності кісткового мозку та його лімфоїдного пулу випереджає реконституцію їх функціональних можливостей та процеси імуногенезу. Вперше описано роль місцевих клітинних і гуморальних факторів, а також гуморальних факторів сироватки у регуляції відновлювальних процесів у кістковому мозку реципієнтів комбінованого трансплантату на рівні стовбурових кровотворних клітин та їх мієлоїдних і лімфоїдних нащадків. Встановлено, що у період інтенсивного відновлення кількісних показників серед лімфоїдних клітин з регуляторними властивостями в органі превалюють Т-клітини, які справляють активуючий вплив на гемопоетичні клітини, а під час другого післятрансплантаційного місяця у кістковому мозку з’являються лімфоцити з супресуючими властивостями, які мають фенотип нуль- і В-лімфоцитів і чинять інгібуючий вплив на клітини, що активно проліферують. У цей термін у сироватці реципієнтів лімфомієлотрансплантату виявлено інгібіторні фактори імунної та неімунної природи.

Проведені дослідження виявили перевагу комбінованого лімфомієлотранс-плантату над трансплантатом, що містить лише мієлокаріоцити, у відновленні кісткового мозку у тварин з променевою депресією лімфомієлоїдної тканини. Встановлено, що збагачення кістковомозкового інокулу лімфоцитами дозволяє створити умови для швидкої і повноцінної реалізації гемопоетичними клітинами їх функціонального потенціалу та у ранні післятрансплантаційні строки компенсувати дефіцит організму у лімфоїдних клітинах. Вперше подані дані про переборення за допомогою додавання лімфоцитів до кістковомозкового трансплантату “хвилеподібності” процесу відновлення мієлоїдного та лімфоїдного паростків гемопоезу, надання йому стабільності, що дозволяє уникнути депресії у системі кровотворення та імуногенезу у віддалені терміни після трансплантації.

Практичне значення одержаних результатів. Проведені дослідження довели доцільність збагачення трансплантату кісткового мозку лімфоїдними клітинами з метою підвищення його захисного потенціалу, компенсації у ранні строки після трансплантації дефіциту організму у лімфоцитах, прискорення процесу відновлення лімфомієлоїдної тканини, а також надання йому більш повноцінного і стабільного характеру. Отримані дані розширюють уявлення про процеси, що протікають в організмі, який потерпає від дефіциту кровотворної та імунної ланок, його здатність репарувати цю недостатність при уведенні гемопоетичної тканини сумісно з лімфоцитами, а також механізми, що контролюють і регулюють ці процеси після мієлотрансплантації.

Результати дослідження можуть слугувати обґрунтуванням для клінічного випробування ефективності використання лімфомієлотрансфузій при розладах гемопоезу та імуногенезу.

Наукові положення дисертації впроваджені у навчальний процес курсу загальної і клінічної імунології Харківського національного університету ім. В.Н. Каразіна, курсу трансплантології кафедри хірургічних хвороб Харківського державного медичного університету, Харківської медичної академії післядипломної освіти.

Особистий внесок здобувача. Автором особисто проведено інформаційний пошук, проаналізовано літературу, аргументовано робочу гіпотезу дослідження, визначено мету, задачі, методичне вирішення, здійснено розробку моделі дослідження. Самостійно проведено експерименти, статистично оброблено одержані дані, проведено їх аналіз та узагальнення, сформульовано висновки, написано і оформлено усі розділи дисертації.

Апробація результатів дисертації. Основні положення дисертації повідомлено і обговорено на: I обласній конференції “Вторинні імунодефіцити інфекційної і неінфекційної етиології” (Харків, 1989); науково-практичній конференції “Оптимальні засоби і методи імунокорегуючої, протизапальної та протимікробної терапії” (Харків, 1993); III Українському з'їзді гематологів і трансфузіологів (Суми, 1995); міжнародній науково-практичній конференції “Сучасні проблеми клінічної та експериментальної трансплантології (Київ, 1995); міжнародній науковій конференції, присвяченій 150-річчю з дня народження І.І. Мечникова “Ідеї Мечникова і розвиток сучасного природознавства” (Харків, 1995); шостій міжнародній науково-практичній конференції з актуальних питань клінічної імунології та алергології (Київ, 2002); ІІІ міжнародній науково-практичній конференції “Наука і соціальні проблеми суспільства: медицина, фармація, біотехнологія” (Харків, 2003); І Всеукраїнській науково-практичній конференції “Аутоиммунные заболевания: иммуногенез, иммунодиагностика, иммунотерапия” (Київ, 2003); ІІІ з’їзді з радіаційних досліджень (радіобіологія і радіоекологія) (Київ, 2003); науково-практичній конференції “Эколого-физиологические проблемы адаптации” (Партеніт, 2003); міжнародній конференції “Актуальні питання боротьби з інфекційними захворюваннями” (Харків, 2003); засіданнях Харківського товариства імунологів (2000-2003), міжнародній науково-практичній конференції „Сучасні проблеми трансфузіології” (Харків, 2004).

Публікації. За темою дисертаційного дослідження опубліковано 14 робіт, з них 7 - у наукових виданнях, в тому числі 3 – у фахових журналах, рекомендованих ВАК України, 7 – надруковані у матеріалах і тезах конференцій.

Обсяг і структура дисертації. Дисертаційна робота викладена на 174 сторінках друкованого тексту (з них основного тексту 147 сторінок), складається із вступу, огляду літератури, опису матеріалів і методів досліджень, результатів власних досліджень, аналізу та узагальнення результатів досліджень, висновків, списку використаних джерел літератури (27 сторінок), що включає 267 першоджерел. Робота містить 32 таблиці і 5 рисунків.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріали і методи дослідження. Ефективність застосування кісткового мозку у комбінації з лімфоцитами з реконструктивною та імунорегуляторною ціллю вивчали на моделі променевої депресії гемопоезу та імуногенезу. Дослідження проведені на мишах лінії (CBAхC57BL)F1 6-8-тижневого віку, вагою 20-22 г, опромінених на установці РУМ-17 у дозі 9 Гр. Донорами були миші тієї ж лінії ((CBAхC57BL)F1).

Групи тварин були такі: 1) опромінення+трансплантація ККМ (група порівняння); 2) опромінення+трансплантація ККМ сумісно з тимоцитами (дослідна група). Контролем слугували інтактні тварини тієї ж лінії.

Тваринам 1-ої групи ККМ вводили в/в у кількості 5х106. Тваринам 2-ої групи вводили 5х106 ККМ і 20х106 тимоцитів в одному шприці.

Відновлення показників кісткового мозку та периферичної крові тварин після трансфузії ККМ і лімфоцитів вивчалось у динаміці, на 5-, 10-, 15-, 20-, 30-, 45-, 60-, 90-ту добу.

Відновлення клітинності і клітинного складу кісткового мозку і периферичної крові у реципієнтів лімфомієло- та мієлотрансплантату оцінювали за кількістю клітин у стегновій кістці, вмістом лейкоцитів, еритроцитів та гемоглобіну у крові та вивченням мієлограм та лейкограм.

Функціональну активність лейкоцитів периферичної крові визначали за їх фагоцитарною активністю (ФЧ та ФІ) (Пастер Е.У и др., 1989) і НСТ-тестом (Щербаков В.И., 1989). Кількісний вміст та функціональну активність стовбурових кровотворних клітин оцінювали, визначаючи абсолютну та відносну кількість КУОс у кістковому мозку методом Till J.E., McCulloch E.A. (1961), колонієутворюючу здатність ККМ (в агаровій культурі in vitro (Кондратенко И.Ф., Шерешков С.И., 1974; Кузнецов С.А., 1976), напрям диференціювання КУОс – вивчаючи гістологічні препарати колоній у селезінці.

Проліферативну активність мієлокаріоцитів оцінювали методом “тимідинового самовбивства” (Сидорович И.Г. и др., 1987). Продукцію лімфоцитів у відновлюваному кістковому мозку визначали методом авторадіографії (Fuloр G.M., Osmond D.G., 1983; Pietrangeli C.E., Osmond D.G., 1987).

Вплив лімфомієлотрансплантації на лімфоїдний компартмент кісткового мозку оцінювали за абсолютним вмістом лімфоїдних клітин у стегновій кістці, їх фенотипічним складом, зрілістю та функціональною здатністю. Відносний вміст В- і Т-популяцій лімфоцитів виявляли методом мембранної імунофлюоресценції з використанням мічених ФІТЦ анти-Ig- та анти- Thy1,2 – сироваток (Miyama M. et al., 1978; Goldshneider J., 1976).

Відсоток дозрілих В-клітин (s+) та пре-В-клітин (с+s-) серед лімфоцитів кісткового мозку визначали, використовуючи анти--ФІТЦ-мічену сироватку, методом імунофлюоресценції (Pietrangeli C.E., Osmond D.G., 1987; Шторц Х., 1987). Визначення Fc- та С3-рецепторів на кістковомозкових лімфоцитах проводили за допомогою методів ЕА- та ЕАС-розеткоутворення за Miyama M. et al. (1978), Limdsten T., Andersson B. (1981).

Функціональну здатність В-лімфоцитів відновлюваного кісткового мозку виявляли за вмістом прекурсорів антитілоутворюючих клітин (АУК) у кістковому мозку та АУК у селезінці тварин-реципієнтів за методом Jerne N.K., Nordin A.A. (1963).

Здатність лімфоцитів відновлюваного кісткового мозку до аутоімунних реакцій та цитопатогенної дії визначали за їх здатністю до індукції спленомегалії у вторинних сублетально опромінених реципієнтів (Muraoka S. et al., 1977).

Оцінку метаболічних процесів у ККМ реципієнтів проводили, визначаючи активність основних ферментів енергетичного обміну: гексокінази, 6-фосфофруктокінази, піруваткінази, лактатдегідрогенази, глюкозо-6-фосфатдегідрогенази, ізоцитратдегідрогенази (Астауров Б.Л., 1974); вміст первинних, вторинних продуктів ПОЛ та загальну антиоксидантну активність - за методами Powell W.S. (1987), Паранич Л.И. и др. (1993), Спиричев В.Б. и др. (1979), вміст жиророзчинних вітамінів та метаболітів токоферолу – за методом Паранич А.В. и др. (1992).

Супресорні властивості лімфоцитів кісткового мозку після мієлотрансплантації оцінювали за їх здатністю до пригнічення проліферації сингенних клітин селезінки, стимульованих in vitro ЛПС або ФГА (Атауллаханов и др., 1980); регуляторний вплив сироватки крові на відновлення кісткового мозку визначали в культурі in vitro за рівнем включення радіоактивної мітки (3H тимідину) в антигенстимульовані сингенні та алогенні спленоцити та інтактні ККМ (Young M.R. et al., 1987; Сидорович И.Г. и др., 1987).

Статистичну обробку результатів проводили методом варіаційної статистики з використанням пакету програм “Excell-97”, вірогідність розходжень визначали за t-критерієм Ст’юдента.

Результати досліджень та їх обговорення. Вивчення кісткового мозку реципієнтів показало, що загальна кількість ядромістких клітин в органі у тварин, які одержали лімфомієлокаріоцити, відновлюється на 20-ту добу, тоді як у реципієнтів мієлотрансплантату відновлення клітинності завершується тільки на 30-ту добу (Рис.1). При цьому відновлений кількісний склад кісткового мозку реципієнтів лімфомієлотрансплантату залишається стабільним до 90-ої досліджуваної доби, а у реципієнтів мієлокаріоцитів per se зазнає подальших хвилеподібних коливань.

Рис.1 Число ядровміщуючих клітин у стегновій кістці реципієнтів мієлокаріоцитів per se (1) та мієлокаріоцитів у сукупності з лімфоцитами (2). По осі абсцис – доба після трансплантації, по осі ординат – кількість ядровміщуючих клітин (х106).

Відновлення клітинного складу кісткового мозку опромінених реципієнтів обох видів трансплантату відбувається за рахунок усіх паростків кровотворення за деякою перевагою мієлоїдного ряду клітин над еритроїдним і лімфоїдним. У реципієнтів лімфомієлотрансплантату реконституція абсолютного числа клітин мієлоїдного паростку спостерігається на 20-ту післятрансплантаційну добу, еритроїдного – на 15-ту, лімфо-моноцитарного – на 20-ту добу, а у реципієнтів мієлокаріоцитів – відповідно на 30-ту, 20-ту та 30-ту добу. Нормалізація клітинного складу окремих паростків гемопоезу у реципієнтів лімфомієлотрансплантату також настає швидше, ніж у тварин, що отримали мієлокаріоцити per se: еритроїдного ряду – на 20-ту, мієлоїдного та лімфо-моноцитарного ряду – на 45-ту добу, у той час як у реципієнтів мієлокаріоцитів per se реконституції змісту клітин мієлоїдного паростку не відбувається до кінця періоду дослідження (90-ої доби), а нормальний склад еритроїдного і лімфо-моноцитарного рядів спостерігається лише на 30-ту і 90-ту добу відповідно.

Відновлення до фізіологічного рівня числа лейкоцитів у периферичній крові тварин обох груп відбувалось переважно за рахунок чисельності гранулоцитарних клітин при відставанні темпів відновлення лімфоцитів. У реципієнтів дослідної групи воно настає на 20-ту добу, групи порівняння – на 30-ту добу. Повна нормалізація лейкограми у реципієнтів лімфомієлотрансплантату спостерігається на 45-ту добу дослідження, у реципієнтів мієлокаріоцитів per se – на 60-ту. Фагоцитарна і кисеньпродукуюча активність лейкоцитів крові, визначена за НСТ-тестом, що була значно знижена у обох груп тварин під час першого післятрансплантаційного місяця, у реципієнтів мієлокаріоцитів і лімфоцитів повністю нормалізується на 60-ту добу, а у тварин, захищених мієлокаріоцитами per se – наприкінці дослідження (90-та доба).

Дослідження показали, що у тварин, які одержали мієлокаріоцити у сукупності з лімфоцитами, процес накопичення КУОс у кістковому мозку протікає прискореними темпами у порівнянні з реципієнтами, які отримали тільки мієлокаріоцити. На 10-ту післятрансплантаційну добу у цій групі тварин кількість КУОс перевищувала їх число у тварин 1-ої групи у 2,7 разів, на 15-ту добу – у 2,0 рази, на 20-ту – у 1,5 рази. На 30-ту добу у тварин обох груп спостерігалось відновлення кількості КУОс до фізіологічних значень.

Введення лімфоцитів разом з мієлотрансплантатом спричинює зростання вмісту КУО, які перебувають у S-фазі клітинного циклу, у кістковому мозку реципієнтів на всіх етапах активного відновлення клітинності органу (10-20 післятрансплантаційна доба) порівняно з їх числом у тварин, які отримали лише мієлокаріоцити. При цьому на протязі усього цього часу мітотична активність КУО в обох групах реципієнтів у 2-4 рази перевищує активність стовбурових кровотворних клітин (СКК) інтактних тварин. Багаторазове збільшення активності СКК свідчить про намагання кровотворної системи задовольнити підвищений нефізіологічний запит на відновлення гемопоезу. Проте, коли клітинність кісткового мозку відновлюється до фізіологічного рівня, і цей запит зникає, кількість нащадків СКК, які поділяються, також знижується до значень фізіологічної норми.

Вивчення гістологічних препаратів селезінок з колоніями показало, що додавання лімфоцитів до мієлотрансплантату істотно не впливає на спрямованість диференціювання гемопоетичних одиниць, але значно підвищує чисельність диференційованих колоній. У реципієнтів змішаного трансплантату до 30-ої доби визначалось у 1,3-2,0 рази менше недиференційованих колоній, ніж у реципієнтів мієлокаріоцитів per se. Також встановлено, що клітини кісткового мозку реципієнтів лімфомієлотрансплантату достовірно (р<0,05) активніше формують колонії та клітинні агрегати в агарі, причому їх тип і співвідношення, характерні для нормального кісткового мозку, також відновлюються динамічніше, ніж у реципієнтів мієлокаріоцитів per se.

На моделі колонієутворення in vitro доведено, що виснаження на Т-лімфоцити кісткового мозку у всі дослідні терміни (10-та, 20-та, 45-та доба) суттєво знижує у тварин обох дослідних груп його колонієутворюючу спроможність.

За допомогою уведення реципієнтам радіоактивної мітки (37 кБк 3Н-тимідину/г ваги) і подальшої авторадіографії зразків кісткового мозку встановлено, що лімфоцити, уведені сумісно з мієлокаріоцитами, справляють потенцюючу дію на лімфоїдну продукцію відновлюваного кісткового мозку. У реципієнтів лімфомієлотрансплантату вироблення лімфоцитів на всіх етапах першого місяця після трансфузії достовірно (р<0,05) перевищує їх продукцію у реципієнтів мієлотрансплантату, у 3,2-4,5 рази перевершуючи їх фізіологічну генерацію в органі. Встановлено, що стимулюючий вплив лімфоїдних клітин на репаративні процеси у кістковому мозку (відновлення клітинності органу, активності КУО, лімфопоезу) найбільш виражений у перший місяць дослідження, коли спостерігається особливий дефіцит лімфомієлоїдних клітин, відбувається активне відтворення органу. У подальшому дія лімфоцитів із стимулюючої процеси гемо- та лімфопоезу перетворюється на стабілізуючу.

Аналіз фенотипічного складу лімфоїдного компартменту кісткового мозку (Табл.1) показав, що у перший післятрансплантаційний місяць у реципієнтів обох видів трансплантату виявляється підвищення, у порівнянні з фізіологічним рівнем, відносного вмісту Т-клітин (Thy1,2+), нуль-, пре-В-клітин (с?+, sм-) і індексу с?+sм-/sм+. Нормалізація вмісту і співвідношення s?+, с?+sм-, нульових і Thy1,2+-клітин у реципієнтів лімфомієлотрансплантату відбувається на 30-ту добу, а у реципієнтів мієлокаріоцитів per se – на 45-ту добу після трансплантації.

Таблиця 1

Вміст Thy 1,2+-, c+s--, s+- та нульових клітин (%) у лімфоїдному пулі кісткового мозку опромінених тварин після трансплантації мієлокаріоцитів per se (1) та мієлокаріоцитів у сполученні з лімфоцитами (2)

Доба після трансп-лантації Групи тварин Фенотипи клітин

s+-клітини c+s-- клітини Індекс s+/c+s- Нуль-клітини Thy 1,2+- клітини

10 1 9,9 0,5* 36,01,5* 0,270,01* 47,82,1* 6,30,2*

2 13,40,5*-** 43,62,1*-** 0,310,01*-** 33,31,4*-** 9,70,4*-**

15 1 16,10,8* 37,71,6* 0,550,02* 40,1 1,6* 6,1 0,2*

2 22,51,1*-** 38,91,8* 0,650,02*-** 31,21,7*-** 7,40,3*-**

20 1 21,41,3* 37,41,8* 0,690,03* 36,1 1,9* 5,1 0,2*

2 32,81,4*-** 36,81,8* 1,040,08*-** 24,21,2** 6,20,3*-**

30 1 34,11,9 35,71,4* 1,170,06* 27,51,2 2,6 0,1*

2 39,33,0 33,41,7 1,400,07** 24,51,3 2,9 0,1

45 1 38,92,1 28,3 1,7 1,370,08 29,7 1,5 3,1 0,2

2 41,22,8 28,9 1,2 1,420,08 26,71,3 3,2 0,1

60 1 38,22,3 29,1 1,9 1,360,06 29,11,3 3,2 0,1

2 40,92,7 29,9 1,2 1,370,06 25,91,3 3,3 0,1

90 1 38,62,5 28,4 1,9 1,360,07 29,91,5 3,1 0,1

2 40,82,9 29,7 1,4 1,370,06 26,21,3 3,1 0,1

Контроль 40,12,0 29,2 1,2 1,370,09 27,41,2 3,3 0,1

Примітки: *- достовірність відмінностей у порівнянні з контролем (p<0,05); ** - достовірність відмінностей показників тварин групи 2 у порівнянні з показниками тварин групи 1 (p<0,05).

Порівнювальний аналіз цієї динаміки у реципієнтів комбінованого трансплантату і мієлокаріоцитів per se свідчить про те, що додавання лімфоцитів до мієлотрансплантату сприяє дозріванню лімфоцитів, прискореному накопиченню в органі sIg+-клітин і зниженню вмісту нульових клітин.

Збільшення вмісту Т-лімфоцитів у кістковому мозку, що спостерігається у період відновлення клітинності, вірогідно, пов’язане з підвищеним затребуванням у цей час даного типу клітин – акцесорів і продуцентів численних цитокінів, здатних активувати і регулювати процеси проліферації, дозрівання і диференціювання різноманітних кістковомозкових клітин. Імовірно, що саме перевага відносного вмісту Thy1,2+-клітин у лімфоїдному пулі реципієнтів лімфомієлотрансплантату до 20-ої доби над аналогічним показником тварин, які одержали мієлокаріоцити per se, є обставиною, яка спричинює прискорення нормалізації клітинного складу лімфоцитарного паростку цих тварин.

Аналіз експресії Fc- і С3-рецепторів на лімфоїдних клітинах показав, що у кістковому мозку реципієнтів з 10-ої по 20-ту добу після мієлотрансплантації трансплантації і з 10-ої по 30-ту добу після лімфомієлотрансплантації відбувається збільшення, у порівнянні з інтактними тваринами, відносного вмісту sIg+-клітин, що експресують ці рецептори, і поява sIg- В-лімфоцитів, з цими рецепторами, причому у реципієнтів лімфомієлотрансплантату кількість sIg+- та sIg--клітин з Fc- та С3-рецепторами достовірно (р<0,05) перевищує їх вміст у тварин, що отримали мієлокаріоцити per se.

Протягом другого післятрансплантаційного місяця у реципієнтів обох груп настає нормалізація вмісту sIg+-клітин з Fc- і С3-рецепторами, а також зниження кількості sIg- В-лімфоцитів з цими рецепторами, що може бути пов’язано з придбанням ними поверхневих Ig-молекул. Рання експресія на клітинах рецепторів Fc і С3, яка, імовірно, відображає загальну тенденцію експресії рецепторів, є позитивною, оскільки дозволяє їм бути більш чутливими до регуляторних факторів, знаходитись під постійним контролем аутокринної та паракринної регуляції, брати участь в імунних взаємодіях, які є обов’язковими для розвитку імунних реакцій.

При оцінці функціональної активності лімфоцитів кісткового мозку було виявлено, що з 30-ої доби у реципієнтів обох видів трансплантату з’являються лімфоцити, що активно супресують включення 3Н-тимідину у стимульовані ФГА або ЛПС нормальні сингенні клітини селезінки.

По відношенню до непроліферуючих клітин ці лімфоцити не справляли інгібіторної дії. Доведено, що супресорні лімфоцити мають фенотип нуль- і sIg+-клітин. Встановлено, що нуль-клітини мають більш високу супресорну активність, ніж sIg+-лімфоцити як у реципієнтів лімфомієлотрансплантату, так і мієлокаріоцитів per se.

Вивчення процесу накопичення прекурсорів АУК у кістковому мозку і АУК у селезінці реципієнтів показало, що він протікає значно динамічніше у тварин, які одержали мієлокаріоцити у комбінації з лімфоцитами (Рис.2, 3). Цей процес є більш динамічним у кістковому мозку, ніж у селезінці. Крім того, у реципієнтів лімфомієлотрансплантату він відрізняється синхронністю відновлення концентрації прекурсорів АУК і їх абсолютної кількості в органі, тоді як у реципієнтів ККМ per se реконституція відносного вмісту цих клітин випереджає накопичення їх абсолютного числа на протязі 1-го місяця відновлення і синхронізується тільки починаючи з 2-го місяця. У результаті такої динаміки відновлення абсолютне і відносне число прекурсорів АУК у реципієнтів лімфомієлокаріоцитів нормалізується вже на 60-ту післятрансплантаційну добу, а у тварин, які одержали лімфомієлокаріоцити per se – тільки на 90-ту. Отримані дані свідчать про стимулюючу дію введених лімфоцитів на відновлення імунореактивності організму.

При дослідженні аутоімунних процесів, що мають місце після сублетального та летального опромінення, було встановлено, що у кістковому мозку реципієнтів лімфомієлотрансплантату, як і мієлокаріоцитів per se, з 10-ої по 90-ту добу спостерігається підвищення вмісту ауторозеткоутворюючих клітин у порівнянні з контролем, причому в обох групах на протязі 1-го місяця – за рахунок нуль-клітин, а під час 2-го і 3-го місяців - нуль- та sIg+-клітин. Проте, на моделі здатності клітин in vivo індуціювати спленомегалію у сублетально опромінених сингенних тварин було доведено, що лімфоцити лімфатичних вузлів і селезінки реципієнтів як лімфо-мієлотрансплантату, так і мієлокаріоцитів per se аутоцитопатогенної дії не справляють.

Аналіз метаболічної активності клітин кісткового мозку реципієнтів лімфомієло- та мієлотрансплантату, яка у суттєвій мірі визначає характер і повноцінність реконституції мієло- та лімфопоезу, виявив хвилеподібність її динаміки, подібну до тої, що спостерігається при відновленні кількісних показників гемопоезу та лімфопоезу.

Рис.2. Накопичення прекурсорів АУК у кістковому мозку тварин після трансплантації мієлокаріоцитів реr se (1) та мієлокаріоцитів у сукупності з лімфоцитами (2)

Рис. 3. Накопичення АУК у селезінці тварин після трансплантації мієлокаріоцитів per se (1) та у сукупності з лімфоцитами (2). Абсолютний вміст АУК у селезінці контрольних інтактних тварин становить (4,6±0,4)?104.

Активність основних ферментів нуклеїнового, білкового та вуглеводного обмінів
мієлокаріоцитів у тварин обох груп до 20-ої доби характеризується низьким рівнем, притаманним недозрілим клітинам, а в період інтенсивного поповнення клітинності органу (20-45-та доба у реципієнтів мієлокаріоцитів per se і 20-30-та доба у реципієнтів лімфомієлотрансплантату) вона значно зростає, перевершуючи показники норми. Додавання лімфоцитів до мієлотрансплантату справляє стимулюючий вплив на інтенсивність ферментних процесів у мієлокаріоцитах в період відновлення чисельності клітин і стабілізуючий вплив – після його завершення.

У період інтенсивного відновлення клітинного складу кісткового мозку у мієлокаріоцитах виявлено посилення процесів ПОЛ, яке тривало до 30-ої доби у реципієнтів лімфомієлотрансплантату і до 45-ої доби – у реципієнтів мієлотрансплантату. Паралельно цьому процесові у кістковому мозку тварин обох груп збільшувався рівень активних метаболітів токоферолу – димерів токоферолу і токоферілхінону. В цілому можна зазначити, що активація процесів ПОЛ у реципієнтів лімфомієлотрансплантату, як і у групі порівняння, супроводжується посиленням функціонування редокс-системи вітаміну Е, що забезпечує збільшення загальної АОА, ресурсів якої у цих умовах виявляється достатньо для ефективного контролю ПОЛ.

При дослідженні регуляторних впливів на відновлення кісткового мозку було встановлено, що супернатанти, отримані з in vitro культур кістковомозкових клітин реципієнтів мієло- і лімфомієлотрансплантату на 10-30 добу справляють стимулюючу дію на включення 3Н-тимідину у нормальні мієлокаріоцити. На цей час (10 – 20-та доба) у сироватці реципієнтів обох груп спостерігалось превалювання факторів із стимулюючими властивостями відносно проліферації антиген-стимульованих сингенних клітин селезінки, а у наступні строки (40 - 60-та доба) – субстанцій з супресорною активністю. Було встановлено, що інгібуючі проліферативну активність спленоцитів фактори сироватки мають переважно неімуноглобулінову природу і справляють вплив як на сингенні, так і на алогенні стимульовані клітини. У дослідженнях на культурі in vitro інтактних сингенних кістковомозкових клітин було доведено, що сироватка опромінених тварин обох груп, отримана на 40-90 добу, не чинить інгібіторної дії на нестимульовані клітини. Слід зазначити, що супресуюча дія сироватки на проліферативну активність клітин кісткового мозку з’являється у період появи у кістковому мозку реципієнтів клітин-супресорів. Вірогідно, у даному випадку дія супресорних факторів має за мету обмеження надпродукції клітин по мірі завершення відновлення їх чисельності в органі.

Таким чином, представлені дані свідчать про те, що додавання лімфоцитів до сингенних мієлокаріоцитів суттєво підвищує у ранні післятрансплантаційні строки активність реконституції кістковомозкової тканини після гемодепресії, відновлення мієлопоезу, лімфопоезу та імуногенезу; а у подальшому справляє стабілізуючий вплив на ці процеси. Крім того, уведені лімфоїдні клітини чинять регуляторну дію на процеси клітинної проліферації та диференціювання, а також суттєво компенсують дефіцит лімфоцитів в організмі під час ранньої післятрансплантаційної доби, коли він особливо гостро відчувається. Виявлені кількісні, функціональні і метаболічні закономірності, яким підлягає відновлення кісткового мозку реципієнтів комбінованого лімфомієлотрансплантату, доповнюють існуюче уявлення про процеси, які відбуваються в організмі, що функціонує в умовах недостатності кровотворної та імунної систем, його здатності репарувати цю недостатність при уведенні гемопоетичних клітин та лімфоцитів, а також про механізми, відповідальні за контроль і регуляцію цих процесів, даючи обгрунтування для подальшого клінічного застосування лімфомієлотрансфузій при комбінованих порушеннях гемопоезу та імуногенезу.

ВИСНОВКИ

Вперше виявлено кількісні, функціональні та метаболічні закономірності відновлення кісткового мозку реципієнтів мієлотрансплантату, збагаченого лімфоїдними клітинами, а також описано роль клітинних та гуморальних факторів у регуляції реконституційних процесів у кістковому мозку, які відбуваються під впливом трансплантації гемопоетичних і лімфоїдних клітин.

1. Період відновлення кісткового мозку після лімфомієлотрансплантації, як і при уведенні мієлокаріоцитів per se, у реципієнтів з променевою гемо- і імунодепресією характеризується переважанням недозрілих клітинних форм над дозрілими у всіх кровотворних паростках, високою мітотичною активністю КУО; підвищеним вмістом клітин, що перебувають у S-фазі клітинного циклу; недостатньою функціональною активністю дозрілих кістковомозкових клітин та їх зниженим метаболізмом у порівнянні з мієлокаріоцитами статеводозрілих особин.

2. Реконституція кількісних показників кісткового мозку (абсолютного числа клітин в органі, кількості клітин окремих кровотворних паростків), вмісту лейкоцитів у периферичній крові після лімфомієлотрансплантації випереджає відновлення клітинного складу кісткового мозку, функціональної та метаболічної активності його елементів. Відновлення абсолютної кількості ядровміщуючих клітин кісткового мозку, лейкоцитів периферичної крові відбувається на 20-ту післятрансплантаційну добу. Нормалізація клітинного складу кісткового мозку, метаболічної (ферментів основних обмінних циклів) і мітотичної активності мієлокаріоцитів спостерігається на 45-ту добу, антитілоутворюючої здатності кістковомозкових лімфоцитів – на 60-ту добу. Реставрація клітинного складу лейкоцитів периферичної крові настає на 45-ту, їх фагоцитарної та бактерицидої активності – на 60-ту добу після трансплантації.

3. Відновлення кількісних і функціональних показників кісткового мозку після лімфомієлотрансплантації супроводжується інтенсифікацією процесів ПОЛ у мієлокаріоцитах. При цьому їх антиоксидантна активність є достатньою для ефективного контролю ПОЛ. Нормалізація процесів ПОЛ у реципієнтів комбінованого трансплантату настає на 60-ту післятрансплантаційну добу.

4. У віддалені строки (30-90-та доба) після лімфомієлотрансплантації гемопоез реципієнтів характеризується високою стабільністю (відсутністю коливань як кількісних, так і функціональних показників), яка дозволяє уникнути гемо- та імунодепресій у цей період. Це відрізняє його від гемопоезу реципієнтів мієлокаріоцитів per se, який у ці терміни має хвилеподібний характер.

5. Відновлення кісткового мозку під час першого післятрансплантаційного місяця у реципієнтів лімфомієлотрансплантату характеризується активною реконституцією лімфоїдного компартменту органу, у той час як у реципієнтів мієлокаріоцитів per se відновлення цієї складової кісткового мозку носить уповільнений характер. Абсолютне число лімфоїдних клітин у кістковому мозку реципієнтів лімфомієлотрансплантату та їх фенотипічний склад відновлюються до фізіологічних значень наприкінці першого післятрансплантаційного місяця (30-та доба), а функціональна активність (здатність трансформуватись в АУК) – на 60-ту добу після трансплантації, тоді як у реципієнтів кісткового мозку per se ці параметри нормалізуються відповідно на 30-ту, 45-ту і 90-ту добу після трансплантації.

6. Збагачення мієлотрансплантату лімфоїдними клітинами сприяє більш високій динамічності відновлення основних кількісних, функціональних та метаболічних параметрів кісткового мозку опромінених реципієнтів. Уведені лімфоїдні клітини обумовлюють підвищення мітотичного індексу КУО та мієлокаріоцитів різного ступеню дозрілості, прискорення дозрівання мієлокаріоцитів, нормалізацію метаболічної активності у цих клітинах (процесів ПОЛ та основних ферментів нуклеїнового, білкового та вуглеводного обмінів), стимуляцію антиоксидантної системи, а також інтенсифікацію експресії рецепторних молекул. Трансплантація лімфоїдних клітин сумісно з мієлокаріоцитами створює умови для більш повної реалізації гемопоетичних властивостей трансплантату. Відновлення гемопоезу та імуногенезу у реципієнтів лімфомієлотрансплантату є більш ефективним і повноцінним, ніж у реципієнтів мієлотрансплантату.

7. Під час інтенсивного відновлення кількісних показників кісткового мозку (перший місяць після трансплантації) переважний регуляторний вплив на нього справляють кістковомозкові Т-лімфоцити, які активуюче діють на гемопоетичні клітини. На протязі другого післятрансплантаційного місяця у кістковому мозку з’являються лімфоцити з супресорними властивостями, які мають фенотип нуль- та В-лімфоцитів і справляють інгібіторну дію на клітини, що активно проліферують. У той самий термін у сироватці з’являються фактори імунної та неімунної природи з супресорними властивостями.

8. Відновлення лімфоїдного компартменту кісткового мозку не супроводжується формуванням лімфоцитів з аутореактивними цитотоксичними властивостями, здатних до ініціації аутоімунних розладів.

ПЕРЕЛІК ОПУБЛІКОВАНИХ РОБІТ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

Popov N.N., Romanova E.A., Belyaevskaya S.Yu. Morphofunctional alterations in bone marrow of irradiated recipients after injection of syngenic lymphomyelotransplant. I. Characterization of events in a nonlymphoid population of bone marrow cells // School of Fundamental Medicine Journal. – 1995. – Vol.1, №1.- P.49-59. (Особисто дисертантом проведені експериментальні дослідження, їх статистична обробка, аналіз отриманих результатів).

Popov N.N., Romanova E.A. Morphofunctional alterations in bone marrow of irradiated recipients after injection of syngenic lymphomyelotransplant. II. Characterization of events in lymphoid pool of bone marrow // School of Fundamental Medicine Journal. – 1996. – Vol.2, №1.- P.28-35. (Особисто дисертантом проведені експериментальні дослідження, їх статистична обробка, аналіз та узагальнення отриманих результатів).

Романова Е.А. Метаболическая активность костномозговых клеток на этапах восстановления гемопоэза у животных после облучения и миелотрансплантации //Вісник Харківського національного університету ім. В.Н.Каразіна. - 2001.- №523, вип.2.- С.108-112.

Попов Н.Н., Романова Е.А. Восстановление клеточного состава костного мозга облученных реципиентов лимфомиелотрансплантата //Анали Мечниківського інституту. – 2003. - №4-5. – С.85-88. (Особисто дисертантом сформульована загальна ідея, проведені експериментальні дослідження, їх статистична обробка, аналіз та узагальнення отриманих результатів).

Романова О.А. Стимулюючий вплив лімфомієлотрансплантату на функціональне дозрівання лімфоцитів кісткового мозку летально опромінених тварин //Проблеми медичної науки та освіти. – 2003. - №4. – С.82-86.

Романова Е.А. Роль факторов сыворотки в регенерации костного мозга животных после облучения и миелотрансплантации //Вісник Харківського національного університету ім. В.Н.Каразіна. – 2003. - №597, вип.6. –С.32-36.

Романова О.А. Роль лімфоїдного пулу клітин у реконституції кровотворення опромінених реципієнтів лімфомієлотрансплантату //Український радіологічний журнал. – 2004. – Том ХІІ, вип.1. – С.53-57.

Попов Н.Н., Романова Е.А. Характер аутоиммунных реакций у сингенных радиационных химер // Сборник тезисов І обл. конф. “Вторичные иммунодефициты инфекционной и неинфекционной этиологии”. – Харьков. – 1989.- С.74. (Особисто дисертантом проведені експериментальні дослідження, їх статистична обробка, аналіз та узагальнення).

Романова Е.А., Попов Н.Н. Роль костного мозга и селезенки в количественном и функциональном восстановлении В-лимфоцитов у облученных животных, защищенных криоконсервированным миелотрансплантатом // Сборник тезисов І обл. конф. “Вторичные иммунодефициты инфекционной и неинфекционной этиологии”. – Харьков. – 1989.- С.102. (Особисто дисертантом сформульована основна ідея, проведені експерименти, статистична обробка та аналіз отриманих даних).

Попов Н.Н., Романова Е.А. Некоторые механизмы влияния трансфузии миелокароцитов на системы гемопоэза и иммуногенеза у животных с гипоплазией костного мозга // Сборник тезисов научно-практ.конф. “Оптимальные средства и методы иммунокоррегирующей, противовоспалительной и противомикробной терапии”. – Харьков. – 1993. – С.216. (Особисто дисертантом сформульована основна ідея, проведені експериментальні дослідження, їх статистична обробка, аналіз та узагальнення, сформульовані висновки роботи).

Романова О.А., Попов М.М. Вплив трансфузії сингенних мієлокаріоцитів на регенерацію кісткового мозку після цитостатичної обробки //Збірник тез III Українського з’їзду гематологів і трансфузіологів. – Київ.- 1995.- С.171-172. (Особисто дисертантом сформульована основна ідея, проведені експериментальні дослідження, статистична обробка даних, їх аналіз та узагальнення, сформульовані висновки роботи).

Попов Н.Н., Романова Е.А., Беляевская С.Ю. Некоторые эффекты взаимодействия сингенных и аллогенных миелокариоцитов с организмом реципиента //Сборник тезисов междунар. науч. конф. “Идеи Мечникова и развитие современного естествознания”. – Харьков.- 1995.- С.244-245. (Особисто дисертантом сформульована основна ідея, проведені експериментальні дослідження, аналіз та узагальнення даних).

Романова Е.А., Попов Н.Н. Восстановление лимфоидного пула костного мозга у радиационных химер после лимфомиелотрансплантации //Збірник тез ІІІ з’їзду з радіаційних досліджень (радіобіологія і радіоекологія). – Київ. – 2003. – С.421. (Особисто дисертантом сформульована основна ідея, проведені експериментальні дослідження, аналіз та узагальнення даних, сформульовані висновки).

Романова О.А., Попов М.М. Ефект використання лімфоцитів у мієлотрансплантації //Розшир. тези міжнар. конф. “Актуальні питання боротьби з інфекційними захворюваннями” – Харків. – Анали Мечниківського інституту. – 2003. - №4-5. – С.145. (Особисто дисертантом сформульована основна ідея, проведені експериментальні дослідження, аналіз та узагальнення даних, сформульовані висновки).

АНОТАЦІЯ

Романова О.А. Відновлення кісткового мозку як органу імунітету у реципієнтів лімфомієлотрансплантату. – Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.09 – імунологія. Київський національний університет ім.Тараса Шевченка, Київ, 2004.

Основні наукові положення дисертації містять результати комплексного дослідження закономірностей відновлення кістковомозкового мієлопоезу, лімфопоезу та імуногенезу після лімфомієлотрансплантації, а також визначенню ролі клітинних та гуморальних