АКАДЕМІЯ МЕДИЧНИХ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ МІКРОБІОЛОГІЇ ТА ІМУНОЛОГІЇ ІМ. І.І.МЕЧНИКОВА

БОЙКО ВАЛЕНТИНА МИКОЛАЇВНА

УДК 616-003. 725: 615.28: 546.16: 547.594.5

ПРОТИМІКРОБНА ДІЯ ТА БІОЛОГІЧНА АКТИВНІСТЬ НОВИХ АНТИСЕПТИКІВ І ДЕЯКИХ ХІНОЛОНІВ

03.00.07 – мікробіологія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата медичних наук

Харків – 2005

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана на кафедрі мікробіології, вірусології та імунології Вінницького національного медичного університету ім. М.І.Пирогова МОЗ України.

Науковий керівник:

заслужений діяч науки і техніки України, доктор медичних наук, професор Палій Гордій Кіндратович, Вінницький національний медичний університет
ім. М.І.Пирогова МОЗ України, завідувач кафедри мікробіології, вірусології та імунології

Офіційні опоненти:

доктор медичних наук, професор Дикий Ігор Леонідович, Національний фармацевтичний університет МОЗ України, завідувач кафедри мікробіології, вірусології та імунології;

доктор медичних наук, професор Сидорчук Ігор Йосипович, Буковинський державний медичний університет МОЗ України, завідувач кафедри клінічної імунології, алергології та ендокринології

Провідна установа: Київська медична академія післядипломної освіти ім.П.Л.Шупика МОЗ України

Захист дисертації відбудеться “ 13 ” квітня 2006 р. о 11.00 год. на засіданні спеціалізованої вченої ради Д.64.618.01 при Інституті мікробіології та імунології ім. І.І.Мечникова АМН України (61057, м. Харків, вул. Пушкінська, 14/16).

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту мікробіології та імунології ім. І.І.Мечникова АМН України (61057, м. Харків, вул. Пушкінська, 14/16).

Автореферат розісланий “ 10 ” березня 2006 р.

Вчений секретар

Спеціалізованої вченої ради

к.мед.н., ст.н.с. Бруснік С.В.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Антисептики є однією з найбільш поширених і ефективних груп антимікробних лікарських препаратів, що використовують для профілактики та лікування гнійно-запальних захворювань. Проте, арсенал антимікробних засобів, що застосовують в медицині для лікування і профілактики захворювань інфекційного ґенезу не задовольняє лікарів. Відомо, що значна кількість антибіотиків, які використовують в медичній практиці володіють вузьким інтервалом між лікувальними і токсичними дозами. Здатність знижувати токсичний вплив антибіотиків виявлено у мікробних полісахаридів, багатоатомних спиртів, що доцільно дослідити у сучасних антисептичних препаратів, фторхінолонів (Мороз В.М., Палій Г.К., Волянський Ю.Л., 2000; Палій Г.К., 2002 та ін.).

Вчені України постійно проводять пошукові дослідження із створення нових лікарських препаратів. Лише за останні десять років впроваджено в медичну практику та налагоджено промислове виробництво субстанції та фіксованих лікарських форм декаметоксину (ДКМ), мірамістіну, етонію (Палій Г.К., 1997; Грабік І.М., Ковальчук В.П., 2004; І.Л.Дикий і співав., 2004 та ін.). Необхідно підкреслити, що до сих пір не вирішено таку важливу задачу як всебічне дослідження і розробка нових фіксованих лікарських форм на основі вітчизняних антисептичних препаратів. Потрібно наголосити, що в останні роки все більше уваги стали приділяти в Україні пошукам протимікробних засобів серед фторхінолонів, які поєднують з антисептиками і підтримують необхідні концентрації лікарських засобів у вогнищі запалення. Застосування нових вітчизняних антисептичних препаратів в медицині дозволило значно покращити ефективність профілактики та лікування багатьох захворювань інфекційної етіології (Палій Г.К., 2000; Красильников А.П. с соавт., 2000; Сидорчук І.Й із співавт. 2001).

Важливо зазначити, що у резистентних мікроорганізмів до антисептиків (декамін, ДКМ) та антибіотиків спостерігали уповільнення їх розмноження та росту, гальмування всіх фізіологічних процесів, що може бути доказом впливу антимікробних препаратів на важливі ланки обмінних процесів у клітинах. Вивчення впливу ДКМ і декаміну на активність ферментів циклу Кребса дозволило виявити, що мікробоцидні концентрації антисептиків значно пригнічували досліджувані ферменти (Волянский Ю.Л., 1981, Палій Г.К., 1997).

ДКМ в модельних системах проявляв високу здатність активізувати фагоцитарні клітини. Напевно, здатність ДКМ активізувати Т-лімфоцити є визначальним в індукції неспецифічної резистентності, про що свідчить його виражений захисний ефект при генералізованій синьо-гнійній інфекції (Желіба М.Д., Палій В.Г., 2001).

Досить перспективну групу антимікробних препаратів становлять похідні фторхінолону. Хінолони складають велику групу нових протимікробних засобів, які є ліками вибору для лікування багатьох складних інфекцій, викликаних полірезистетними до антибіотиків, антисептиків мікроорганізмами. Механізм дії хінолонів на мікробну клітину полягає в інгібіції ферменту бактеріальної клітини - ДНК-гірази (Падейская Е.Н., 2000; Яковлєв В.П., Яковлєв С.В., 2002).

Принципово нові сполуки одержано шляхом введення атому фтору в 6-те положення молекули хінолону. Наявність одного або кількох атомів фтору в молекулі та різних замісників у різних положеннях визначають особливості антибактеріальної активності і фармакологічні властивості окремих препаратів. В залежності від кількості атомів фтору виділено монофторовані, дифторовані, трифторовані сполуки. Один атом фтору (монофторовані) містять ципрофлоксацин, офcоксацин, перфлоксацин, норфлоксацин, руфлоксацин та ін. До дифторхінолонів відносять левофлоксацин, спарфлоксацин та ін. До трифторхінолонів відносять флероксацин та ін. (Сидоренко С.В., 2004).

Подальше вивчення властивостей антисептиків, що містять чотирьохвалентний азот та фторхінолонів дозволить розширити уяву про їх антимікробний спектр і показання для їх медичного застосування

Зв’язок роботи з науковими програмами, темами. Робота виконана на кафедрі мікробіології, вірусології, імунології Вінницького національного медичного університету ім. М.І. Пирогова МОЗ України і пов’язана з його плановою науковою темою: “Дослідження багатовекторності фармакодинамічних проявів властивостей нових лікарських засобів, що містять декаметоксин і фторхінолони” (номер державної реєстрації 01030003114).

Мета дослідження. Пошук ефективних антимікробних препаратів в ряду антисептиків, які містять чотирьохвалентний азот та фторхінолони.

Задачі дослідження:

1. Провести вивчення протимікробної активності і спектру дії антимікробних препаратів на музейних і свіжовиділених штамах мікроорганізмів.

2. Вивчити вплив несприятливих умов на протимікробну активність нових антисептичних препаратів, фторхінолонів.

3. Дослідити особливості формування резистентності бактерій до антисептичних препаратів і фторхінолонів.

4. Вивчити адгезивну здатність бактерій в присутності антисептиків та ципрофлоксацину, офлоксацину.

5. Визначити лікувальну ефективність антисептиків та фторхінолонів в організмі тварин з гострою експериментальною стафілококовою інфекцією.

Об'єкт дослідження: інфекційні та гнійно-запальні процеси.

Предмет дослідження: мікроорганізми, антисептики, фторхінолони. Методи дослідження: мікробіологічні (визначення протимікробних властивостей антисептичних препаратів окремо, та в комбінації з фторхінолонами), біохімічні (ідентифікація мікроорганізмів, вивчення впливу протимікробних препаратів на адгезивні властивості бактерій), біологічні (вплив антибактеріальних препаратів на організм тварин з гострою експериментальною стафілококовою інфекцією).

Наукова новизна одержаних результатів дослідження. Вперше на штамах мікроорганізмів з природною і набутою стійкістю до антимікробних препаратів визначено ступінь впливу декаметоксину, ципрофлоксацину, офлоксацину, левофлоксацину та досліджено їх антимікробні властивості в залежності від різних негативних умов. В процесі дослідження антимікробних препаратів встановлено їх залежність від мікробного навантаження; вмісту білків; різного рН поживного середовища.

Наведено дані про вплив антимікробних засобів на адгезивну здатність збудників бактеріальних інфекцій. В експерименті вивчено особливості формування резистентності мікроорганізмів при дії антисептиків та фторхінолонів. Вивчено вплив поєднаного застосування декаметоксину в комбінації з ципрофлоксацином в організмі тварин з гострою стафілококовою інфекцією; доведено синергідну дію суббактеріостатичних доз декаметоксину та ципрофлоксацину .

Практичне значення одержаних результатів. Результати виконаних мікробіологічних досліджень є доповнюючим етапом визначення антимікробної активності протимікробних препаратів. Результати всебічного експериментального дослідження декаметоксину включені до Аналітичної нормативної документації на субстанцію антисептика декаметоксину (Decamethoxinum), яка затверджена наказом МОЗ України (реєстраційне посвідчення № П.10.02/05401).

Одержані дані дозволяють рекомендувати сумісне застосування лікарських препаратів на основі декаметоксину з ципрофлоксацином. Антисептичні препарати, що містять декаметоксин в низьких дозах, зменшують інтенсивність утворення резистентних варіантів бактерій до фторхінолонів. Встановлено, що синергідна дія препаратів декаметоксину, офлоксацину, ципрофлоксацину, левофлоксацину не залежить від типу резистентності бактерій.

Одержані результати досліджень використовують в навчальних програмах у вищих медичних учбових закладах (Вінницький національний медичний університет ім. М.І.Пирогова, Буковинський державний медичний університет, Львівський національний медичний університет ім. Данила Галицького, Луганський державний медичний університет).

Особистий внесок здобувача. Автор самостійно здійснила пошук і аналіз вітчизняної та іноземної літератури, обґрунтувала мету і задачі дослідження. Особисто визначила протимікробний спектр антибіотиків, декаметоксину, ципрофлоксацину, офлоксацину, левофлоксацину на свіже виділених штамах мікроорганізмів. Вивчила формування резистентності у мікрорганізмів до антимікробних препаратів. Дисертантом вивчено адгезивну здатність бактерій в присутності антисептика декаметоксину, ципрофлоксацину, офлоксацину, левофлоксацину. Самостійно визначено лікувальну ефективність антисептиків та фторхінолонів в організмі тварин з гострою експериментальною стафілококовою інфекцією. Проведено математико – статистичний аналіз одержаних результатів, узагальнено основні наукові положення, висновки та практичні рекомендації. Написані всі розділи дисертації та підготовлені до друку наукової роботи.

Апробація результатів дисертації. Матеріали дисертаційної роботи доповідались і обговорені на університетських підсумкових конференціях молодих учених Вінницького національного медичного університету ім. М.І.Пирогова (2003, 2004, 2005), міжнародній конференції “Актуальні питання в боротьбі із інфекційними захворюваннями“ (Харків, 2003, 2005), науково-практичній конференції “Актуальні питання дезінфектології: токсикологія, гігієна, епідеміологія” (Київ, 2003), міжнародній науково-практичній конференції “Актуальні питання стратегії, тактики застосування та дослідження антисептиків, антибіотиків” (Вінниця, 2004), науково-практичній конференції з міжнародною участю “Резистентність мікроорганізмів та їх патогенез” (Львів, 2003), на X з’їзді товариства мікробіологів України (Одеса, 2004), на XIV з’їзді мікробіологів, епідеміологів та паразитологів України (Полтава, 2005).

Публікації. За темою дисертації опубліковано 10 наукових робіт, серед них 3 статті в наукових фахових журналах та 7 в збірниках конференцій, з’їздів.

Обсяг і структура дисертації. Робота викладена на 159 сторінках машинописного тексту, складається із вступу, огляду літератури, опису матеріалів і методів дослідження, 4 розділів власних досліджень, аналізу та узагальнення одержаних результатів дослідження, висновків. Робота ілюстрована 25 таблицями та 48 рисунками, що займають повний обсяг 15 сторінок. Список використаних наукових джерел містить 239 наукових посилань, серед яких українською та російськими мовами 192 та 47 робіт іноземних авторів.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ ДИСЕРТАЦІЇ

Матеріали і методи досліджень. У вступі викладено мету та наукові завдання, які розв’язувались при виконанні дисертаційної роботи. Обґрунтовано актуальність теми, розкрито наукову новизну і практичне значення здобутих результатів дисертації. Викладено обсяг і структуру дисертації. Проведено мікробіологічні дослідження промислових зразків препаратів декаметоксину, ципрофлоксацину (ЦФЛ), офлоксацину (ОФЛ), левофлоксацину (ЛФЛ). Дослідження антимікробного спектру і чутливість клінічних та музейних штамів до декаметоксину, ципрофлоксацину, офлоксацину та левофлоксацину проводили трьохкратно методом послідовних серійних розведень препаратів в рідкому поживному середовищі за загальноприйнятою методикою. Швидкість формування резистентності до антибактеріальних препаратів, вивчали шляхом тривалого пасажування тест культур в присутності суббактеріостатичних концентрацій протимікробних засобів.

Вивчення протимікробної активності ЦФЛ, ОФЛ, ЛФЛ, ДКМ в несприятливих фізико-хімічних умовах (рН, сироватка крові, та мікробне навантаження), проводили за методикою послідовних серійних розведень препаратів в рідкому поживному середовищі. Дослідження впливу протимікробних препаратів на адгезивні властивості бактерій виконували на музейних штамах (S.aureus 209 Р; S.aureus АТСС 25923; S.aureus виділених з патологічного матеріалу хворих із гнійно-запальними захворюваннями).

Для експериментального обґрунтування були взяті різні суббактеріостатичні концентрації декаметоксину, ципрофлоксацину, офлоксацину, левофлоксацину. В процесі дослідження адгезії у бактерій готували мазки, за загальноприйнятими методами. Під мікроскопом на 25 еритроцитах визначали індекс адгезивності бактерій – число адгезованих мікроорганізмів на одному еритроциті, який приймав участь в адгезії. Комбіновану дію декаметоксину та ципрофлоксацину стосовно до локалізованої гнійної інфекції проводили на 45 білих мишах вагою 15-17 г, які перебували на стандартному раціоні віварію згідно санітарно – гігієнічним вимогам та правилам. Дослідження антимікробних властивостей декаметоксину, ципрофлоксацину, офлоксацину, левофлоксацину проводили на 16 музейних та 235 клінічних штамах мікроорганізмів.

Результати досліджень та їх аналіз. Результати власних досліджень викладено у третьому – шостому розділах. Встановлено, що антимікробна активність ДКМ, ЦФЛ, ОФЛ, ЛФЛ, щодо музейних мінімальна бактеріостатична (МБсК) ДКМ до S.aureus становила – 0,24 мкг/мл, мінімально бактеріоцидна (МБцК) – 0,48 мкг/мл. По відношенню до умовно–патогенних ентеробактерій МБсК ДКМ була 7,8 – 62,5 мкг/мл. МБцК препаратів знаходилась в межах 15,6 – 125 мкг/мл. Для P.aeruginosa МБсК ДКМ–250 мкг/мл; МБцК - 500 мкг/мл, що засвідчило про меншу чутливість псевдомонад до цих препаратів, в порівнянні із грампозитивними бактеріями. МБсК ЦФЛ, ОФЛ, ЛФЛ була по відношенню до S.aureus 0,12- 0,48 мкг/мл, МБцК - 0,24 – 0,97 мкг/мл. Значно краще діяли ЦФЛ, ОФЛ, ЛФЛ на ентеробактерії. Зокрема, МБсК для ЦФЛ до E.coli склала 0,24 мкг/мл , ОФЛ – 0,12 мкг/мл, ЛФЛ – 0,03 мкг/мл; МБцК ЦФЛ до E.coli була 0,48 мкг/мл, ОФЛ – 0,12 мкг/мл, ЛФЛ – 0,06 мкг/мл відповідно.

Результати вивчення протимікробної дії ДКМ, ЦФЛ, ОФЛ, ЛФЛ на штами стафілококів (табл.1), кишкової палички, протеїв, синьогнійної палички, які циркулюють в лікувально - профілактичних клініках різного профілю були наступні. МБсК ДКМ, щодо свіжевиділених стафілококів склала 0,24 –
0,48 мкг/мл; МБцК – 0,48 – 0,97 мкг/мл відповідно. МБсК ЦФЛ дорівнювала 0,24 мкг/мл; ОФЛ та ЛФЛ була в межах 0,12 – 0,24 мкг/мл. МБцК ЦФЛ дорівнювала 0,48 мкг/мл; ОФЛ та ЛФЛ – 0,24 – 0,48 мкг/мл. МБсК ДКМ стосовно до ентеробактерій була в межах - 7,8 - 31,2 мкг/мл; МБцК – 15,8 – 62,5 мкг/мл. Таким чином, всі полірезистентні до антибіотиків клінічні штами мікроорганізмів зберігали високу чутливість до ДКМ, ЦФЛ, ОФЛ, ЛФЛ.

Таблиця 1

Порівняльна антимікробна активність ДКМ, ЦФЛ, ОФЛ, ЛФЛ до клінічних штамів стафілококів (n 185)

Концент-

рація протимік-робних препаратів (мкг/мл) | МБсК | МБцК | ДКМ | ЦФЛ | ОФЛ | ЛФЛ | ДКМ | ЦПФ | ОФЛ | ЛФЛ | абс | % | абс | % | абс | % | Абс | % | абс | % | Абс | % | абс | % | абс | % | 0,06 | 5 | 3 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0,12 | 34 | 18 | 70 | 38 | 76 | 41 | 82 | 46 | 5 | 3 | 0 | 0 | 40 | 22 | 0 | 0 | 0,24 | 45 | 25 | 22 | 12 | 7 | 4 | 15 | 8 | 34 | 18 | 70 | 38 | 40 | 22 | 82 | 46 | 0,48 | 31 | 10 | 28 | 16 | 30 | 16 | 36 | 19 | 40 | 22 | 25 | 13 | 3 | 2 | 15 | 8 | 0,97 | 12 | 17 | 12 | 6 | 40 | 22 | 24 | 12 | 18 | 10 | 31 | 17 | 30 | 17 | 36 | 19 | 1,95 | 20 | 6 | 29 | 16 | 32 | 17 | 25 | 13,5 | 36 | 19 | 12 | 6 | 40 | 22 | 24 | 12 | 3,9 | 6 | 11 | 1 | 0,5 | 0 | 0 | 3 | 1,5 | 12 | 6 | 29 | 15 | 32 | 17 | 25 | 13 | 7.8 | 6 | 3 | 7 | 4 | 0 | 0 | 0 | 0 | 20 | 11 | 2 | 1 | 0 | 0 | 3 | 2 | 15,6 | 6 | 3 | 11 | 6 | 0 | 0 | 0 | 0 | 6 | 3 | 6 | 3 | 0 | 0 | 0 | 0 | 31,2 | 8 | 4 | 3 | 1,5 | 0 | 0 | 0 | 0 | 6 | 3 | 11 | 6 | 0 | 0 | 0 | 0 | 62,5 | 0 | 0 | 2 | 1 | 0 | 0 | 0 | 0 | 8 | 4 | 5 | 3 | 0 | 0 | 0 | 0 |

Вивчення чутливості клінічних штамів протеїв до досліджуваних препаратів дали змогу отримати наступні результати. Затримку росту для більшості протеїв виявили в присутності ДКМ - 62,5 мкг/мл. МБцК ДКМ коливалася від 31,2 мкг/мл, до 125 мкг/мл.

МБсК протеїв була у ЦФЛ– 0,48 мкг/мл; МБцК ЦФЛ була в межах 1,95 мкг/мл. МБсК ОФЛ - 0,12 мкг/мл; МБцК ОФЛ - 0,24 мкг/мл. МБсК, МБцК для ЛФЛ були досить високими для всіх штамів протеїв – від 0,06 мкг/мл, до 0,48 мкг/мл. Штами протею виявилися менш чутливими до ДКМ, в порівнянні з ЦФЛ, ЛФЛ, ОФЛ.

Нами було вивчено чутливість стафілококів до антимікробних засобів (табл.2). Встановлено, що до амікацину виявились резистентними 114 штамів (із 185 штамів) стафілококів (62%); до азлоциліну 99 штамів (54%); до оксациліну - 71 штам (38 %) відповідно. Чутливість до олеандоміцину виявили 35% (64 штами) стафілококів.

Таблиця 2

Чутливість стафілококів до антибактеріальних препаратів (n 185)

Антибактеріальні

препарати | Ступінь чутливості | Ч | П | Рабс | % | абс | % | абс | % | Амікацин | 45 | 24 | 26 | 14 | 114 | 62 | Азлоцилін | 63 | 34 | 23 | 12 | 99 | 54 | Гентаміцин | 177 | 96 | - | - | 8 | 4 | Доксициклін | 37 | 20 | 9 | 5 | 139 | 75 | Кліндаміцин | 90 | 49 | 49 | 26 | 46 | 25 | Лінкоміцин | 82 | 45 | 63 | 34 | 40 | 21 | Ломефлоксацин | 172 | 93 | 9 | 5 | 4 | 2 | Оксациклін | 64 | 35 | 50 | 27 | 71 | 38 | Олеандоміцин | 64 | 35 | 94 | 51 | 27 | 14 | Офлоксацин | 172 | 93 | 9 | 5 | 4 | 2 | Рифампіцин | 113 | 61 | 17 | 9 | 55 | 30 | Пефлоксацин | 173 | 94 | 7 | 3,5 | 5 | 2,5 | Цефазолін | 91 | 33 | 37 | 20 | 87 | 47 | Цефаклором | 49 | 26 | 43 | 24 | 93 | 50 | Цефалотин | 43 | 24 | 74 | 40 | 68 | 36 | Цефуроксим | 111 | 60 | 37 | 20 | 37 | 20 | Примітка: Ч – чутливі;П – помірно чутливі; Р – резистентні (стійкі).

Результати дослідження протимікробної дії цефалоспоринів показали різний рівень активності до досліджуваних штамів бактерій. Стафілококи були чутливими до цефазоліну, цефаклору, цефалотину в межах від 24-33%. До цефуроксиму були чутливими 60% штамів стафілококів. До цефтріаксону були чутливими 120 штамів (65%) стафілококів.

Встановлено, що до кліндаміцину та лінкоміцину, найбільш чутливими були стафілококи (45-49%). До рифампіцину чутливими були 113 штамів (61%) стафілококів. Серед аміноглікозидів найактивнішим до стафілококів був гентаміцин 96% (177 штамів). Стійкими до олеандоміцину виявилися 139 штамів стафілококів (75%).

По відношенню до антибіотиків штами ентеробактерій були малочутливими. Активність доксицикліну до ентеробактерій відмічалась у 50% чутливих штамів. Ентеробактерії по відношенню до рифампіцину були резистентними в 95-100% штамів. До амікацину були стійкими від 38 до 50% ентеробактерій. До цефуроксиму ентеробактерії були резистентними в межах 56-85% штамів. Цефтріаксон по відношенню до кишкової палички та протеїв був малоактивним. Всі штами синьогнійної палички були резистентними до олеандоміцину.

За результатами наших досліджень, досить високоактивними засобами, до всіх мікроорганізмів були фторхінолони. До офлоксацину були чутливі стафілококи (93%); E.сoli (96%); бактерії роду Protеus (94%). Високу чутливість спостерігали до ломефлоксацину та пефлоксацину у стафілококів (93–94%); E.coli (94 –97%); бактерії роду Protеus (95 –96%).

Таким чином, на основі проведених досліджень можна стверджувати, що раціональне лікування гнійно – запальних процесів доцільно проводити після визначення чутливості збудників до антибактеріальних препаратів. Необхідно до призначення протимікробних препаратів проводити бактеріологічне дослідження матеріалу від хворих та визначення чутливості до антибактеріальних засобів.

Дію препаратів на мікробну клітину обумовлює ступінь кислотності та лужності середовища (рН). Дія протимікробних препаратів на мікроорганізми в присутності факторів, які можуть впливати на активність антимікробних сполук, може змінюватись. У зв’язку з цим було досліджено антимікробні властивості ДКМ, ЦФЛ, ОФЛ, ЛФЛ в середовищі із різним рН. Антистафілококова бактерицидна активність ДКМ, ЦФЛ, ОФЛ при рН 6,0 і 8,0 поживного середовища зменшувалася у 2-4 рази в порівняні з контролем. Зокрема, ДКМ при рН 6,0 діяв на стафілококи в конценрації 1,97±0,5 мкг/мл; рН 8,0 – 3,97±0,5 мкг/мл. ЦФЛ при рН 6,0 діяв на збудників в дозі 2,31±0,2 мкг/мл. МБсК ОФЛ для стафілококів дорівнювала 1,61±0,5 мкг/мл. Під час дослідження ЦФЛ концентрація для 44 штамів стафілококів при рН 8,0 була в межах 2,31±0,2 мкг/мл, для ОФЛ – 1,61±0,5мкг/мл.

Таким чином, досліджувані препарати (ДКМ, ЦФЛ, ОФЛ) можна віднести до засобів, які проявляють високу бактерицидну активність в кислому і лужному середовищі по відношенню до клінічних штамів стафілококів. Результати дослідів свідчать про те, що дані препарати доцільно, застосовувати при захворюваннях викликаних стафілококами.

Важливим експериментальним дослідженням було визначення антимікробної дії ДКМ, ЦФЛ,ОФЛ при наявності 10%, 20% сироватки в МПБ, так як білки крові здатні по різному зв’язувати лікарські препарати в поживному середовищі. Встановлено, що антимікробна концентрація ДКМ при навантаженні поживного середовища 10% сироватки крові дорівнювала 4,6±0,1 мкг/мл. Вміст 20% сироватки, збільшив діючу концентрацію антисептика до 5,8±0,5 мкг/мл. Без сироватки в поживному середовищі (контроль) МБсК ДКМ дорівнювала 1,95 мкг/мл. Для ЦФЛ в контролі концентрація препарату дорівнювала 1,08±0,8 мкг/мл. В досліді в присутності 10%, та 20% сироватки в поживному середовищі - 2,0±0,5 мкг/мл відповідно. Для ОФЛ в контролі МБсК дорівнювала 0,96 мкг/мл. Наявність 10%, 20% білків крові в поживному середовищі збільшило МБсК ОФЛ до 2,7±0,2 мкг/мл. Кратність зниження МБсК ОФЛ до контролю в антисептика ДКМ була в межах 2 – 16 разів; у ЦФЛ – 2 – 8 разів; у ОФЛ у 2 – 4 рази.

Наведені результати засвідчують, що білки сироватки крові зв’язують протимікробні препарати і знижують їх активність. Одержані дані вказують на необхідність враховувати дозу антибактеріальних засобів у процесі застосування протимікробних засобів для лікування гнійно-запальних захворювань. Зміна мікробного навантаження у мільйони разів, не впливала на зміну дії ЦФЛ, ОФЛ, ДКМ, що свідчить про високу протимікробну активність даних препаратів.

Дослідження формування резистентності у мікроорганізмів до анти- мікробних препаратів ДКМ, ЦФЛ,ОФЛ,СТМ вивчали на штамах S.aureus 22; S.aureus 23; E.coli 108; E.coli 110. Всього було проведено 30 пасажів в присутності суббактеріостатичних доз антимікробних препаратів. Швидкість формування резистентності до ДКМ у S.aureus, E.coli характеризувалась поступовістю. Після п’яти пасажів в присутності ДКМ МБсК для S.aureus 22, становила 1,95 мкг/мл і зберігалася на одному рівні після 15 пасажу. Подальше культивування S.aureus 22, S.aureus23, в присутності зростаючих концентрацій ДКМ показало, що після 20 пасажів МБсК збільшилась в 4 рази, після 30 пасажів – в 8 разів.

Значно повільніше резистентність формувалася у штамів E.coli. Так, зниження чутливості спостерігали після 15 пасажів. Починаючи з 20 пасажу культивування E.coli 108 в присутності ДКМ призвело до зростання МБсК в 2 рази (15,6 мкг/мл) порівняно з контролем, після 30 пасажів - в 4 рази (31,2мкг/мл).

Характеристика формування резистентності до ципрофлоксацину показана на рисунку 1. Резистентність S.aureus 22, S.aureus 23, E.coli 110 до ЦФЛ формувалася досить повільно.

Рис. 1. Характеристика формування резистентності до ципрофлоксацину у мікроорганізмів (мкг/мл).

Так, після 15 пасажів в присутності ЦФЛ МБсК для S.aureus 22 становила 15,6 мкг/мл; для E.coli 110 - 1,95 мкг/мл. Після 30 пасажів чутливість S.aureus, E.coli до ЦФЛ зменшилась відповідно - S.aureus у 4 рази, E.coli у 8 разів.

Швидкість формування резистентності до офлоксацину у мікроорганізмів зображена на рисунку 2. Швидкість формування резистентності до ОФЛ у клінічних штамів проходила повільно. В присутності ОФЛ початкова МБсК у S.aureus 22 – 7,8 мкг/мл; S.aureus 23 – 0,24 мкг/мл; E.coli 108 та E.coli 110 -0,97 мкг/мл. Тридцятикратне культивування тест-штамів мікроорганізмів в присутності зростаючих концентрацій препарату ОФЛ знизило чутливість до нього S.aureus у 4 рази, E.coli - 8 разів. При цьому МБсК зросла до 31, 2 мкг/мл у S.aureus 22; S.aureus 23 – 0,97 мкг/мл; E.coli 108, E.coli 110 – 7,8 мкг/мл.

Зовсім іншу картину спостерігали під час пасування бактерій в присутності стрептоміцину (СТМ). Стійкість до СТМ формувалась досить швидко. По відношенню до клінічного штаму E.coli вона була наступною. Так, після 5 пасажу вона зросла у 2 рази; по завершенні 25 пасажу стійкість збільшилась у 8 разів. У S.aureus, також формувалась стійкість, але порівняно із E.coli повільніше і після 25 пасажу чутливість зменшилась у 4 рази.

Аналізуючи результати дослідження формування резистентності штамів бактерій до протимікробних препаратів потрібно підкреслити, що стійкість S.aureus, E.coli не супроводжувалася розвитком перехресної резистентності до ДКМ, ЦФЛ, ОФЛ. Декаметоксинрезистентні і фторхінолонрезистентні культури стафілококів, ешерихій характеризувалися зміною біологічних властивостей, в тому числі пригніченням цукорлітичної активності. Зміни фізіології бактерій були в найбільшій мірі у мутантів, які виявлені при пасуванні в присутності ДКМ.

Рис. 2. Характеристика формування резистентності офлоксацину у мікроорганізмів (мкг/мл).

Виявлено, що перехресна резистентність стафілокока, ешерихій до декаметоксину, ципрофлоксацину, офлоксацину та антибіотиків не формувалась. Результати даного експерименту, дозволяють поповнити наші знання про формування стійкості до антисептиків та фторхінолонів.

Актуальні проблеми антибіотикотерапії вимагають пошуку нових методів дослідження дії антибіотиків з метою підвищення ефективності протимікробних засобів та попередження стійкості у мікроорганізмів. Перспективним напрямком сучасної мікробіології є вивчення адгезії у мікроорганізмів, яка служить пусковим механізмом їх патогенності. Початкові стадії інфекційного процесу пов’язані із адгезією мікробних клітин на чутливих клітинах, послідовною їх колонізацією та проявом вірулентних властивостей.

Протимікробні препарати діють на структурні елементи клітинної стінки мікроорганізму – адгезини, які зумовлюють взаємодію із клітинами макроорганізму. Блокування феномену адгезії впливає на розвиток інфекційного захворювання. Специфічна адгезія відбувається в результаті молекулярної взаємодії між адгезинами мікробної клітини та рецепторами клітин господаря (ліганд-рецепторна взаємодія).

Адгезини являють собою поверхневі структури мікробних клітин, до складу яких входять макромолекули лектинів, протеїнів, які здатні зв’язуватись з карбогідратами. Рецептори знаходяться на поверхні клітини, які являють собою білкові фрагменти, або карбогідрати, що комплементарні адгезинам. У грамнегативних мікроорганізмів адгезини входять до складу ворсинок (фімбрії, пілі), тому їх називають фімбріальними адгезинами. Грампозитивні бактерії здійснюють адгезію завдяки афімбріальним адгезинам. Структура більшості афімбріальних адгезинів представлена білковими молекулами, які тісно зв’язані з цитоплазматичною мембраною бактеріальної клітини. Рецепторами для адгезинів грампозитивних бактерій є фібронектин та білки міжклітинного матриксу. Отже, прилипання патогенних мікроорганізмів до клітин макроорганізму є важливим патогенетичним механізмом.

Фактори вірулентності стафілококів, пов’язані їх адгезією на рецепторах чутливих клітин, колонізацією та іншими властивостями. Адгезивна здатність стафілококів виражена у відношенні клітин та міжклітинних речовин різних тканин (епітелій, фібронектин, коллаген, фібриноген та ін.). Тейхоєві кислоти відповідають за адгезію на епітеліальних клітинах. Стафілококи не прикріплюються до тромбів, якщо вони покриті гнійним ексудатом, внаслідок блокування фібронектинових рецепторів. Капсульні полісахариди також приймають участь у здійсненні адгезії. Білок А, який розміщується в клітинній стінці S.aureus, володіє антифагоцитарними властивостями. Він зв’язується із фібронектином - адгезивним глікопротеїном, який покриває поверхню клітин і знаходиться в базальних мембранах сполучної тканини.

Отже, головна роль в здійсненні взаємодії мікробів із мішенями належить процесам міжмембранної адгезивної взаємодії. Увага науковців до явища адгезії важлива для створення нових методів діагностики, лікування, профілактики інфекційних захворювань.

Адгезія бактерій до клітин макроорганізму зв’язана з їх адгезинами. Її можна вивчати при використанні ізотонічного розчину натрію хлориду з додаванням суббактеріостатичних та бактеріостатичних концентрацій хіміотерапевтичних препаратів. Проте, залишаються мало вивченими питання про дію різних концентрацій протимікробних засобів, на адгезивні властивості мікроорганізмів. Нами було вивчено вплив різних концентрацій препаратів ципрофлоксацину, офлоксацину, левофлоксацину на адгезивні властивості бактерій.

Дія ципрофлоксацину на адгезію клінічних (n 18) та музейних (n 2) штамів S.aureus показана на рисунку 3. Дослідження показали, що всі препарати впливали на явище адгезії у стафілококів. Так, адгезивність стафілококів під дією ципрофлоксацину знизилася в порівнянні з контролем від 12,5 до 22, 5 % у музейних штамів S.aureus; від 37,5 – 40% у клінічних штамів S.aureus.

Рис. 3. Дія ципрофлоксацину на адгезію клінічних
(n 18) та музейних (n 2) штамів S.aureus.

В контролі ІАЕ музейних штамів дорівнював 3,20,3. Дія різних концентрацій ципрофлоксацину на адгезивність стафілокока знаходилась в межах 2,5 – 2,8. В контролі ІАЕ клінічних штамів дорівнював 4,00,19, а при дії препарату лише 1,5- 1,6 бактерій.

Показник інгібуючого адгезивність ефекту для музейних стафілококів знизився при МБсК ЦФЛ на 40%, при СБсК – 37,5%. Таким чином, зниження адгезії під дією ципрофлоксацину у музейних штамів S.aureus в порівняні з контролем було на 15,5%, у клінічних стафілококів – 38,5%.

При дії МБсК ОФЛ (7,81 мкг/мл) кількість музейних штамів, які прийняли участь у адгезії була – 1,520,28 (47,5%). В присутності СБсК ОФЛ (3,9 - 1,95 мкг/мл) була однаковою і дорівнювала 1,460,28 (45%) відповідно. ІАЕ музейних штамів був в межах 52,5 – 55%. ОФЛ впливав на адгезію у клінічних S.aureus при МБсК, СБсК однаково – 47,5% (1,90,2), ІАЕ для ОФЛ був в межах 42 – 52%, що свідчить про високу дію ОФЛ на адгезію у S.aureus. Аналіз протимікробної дії левофлоксацину на досліджувані штами S.aureus показав, що кількість музейних штамів, які прийняли участь в адгезії в присутності МБсК ЛФЛ (0,48 мкг/мл) дорівнював 1,520,19 (48%), в присутності СБсК ЛФЛ (0,061–0,24 мкг/мл) – 1,50,19 (46%). Зниження адгезивних властивостей в музейних штамів, відповідно до одержаних даних було в межах 52 – 54%.

За отриманими даними щодо впливу ЛФЛ на адгезивну здатність свіжевиділених стафілококів при МБсК (0,48 мкг/мл) була в межах 1,750,18 (44%), при СБсК ЛФЛ (0,061 – 0,24 мкг/мл) майже 1,7 (59%). ЛФЛ понижав адгезію на 56 – 59% (2,25 – 2,350,82) відповідно. Отже, в порівнянні з контролем ЛФЛ змінював адгезивні властивості клінічних та музейних штамів стафілококів від 52% до 57%.

Проведені дослідження впливу ЦФЛ, ОФЛ, ЛФЛ на адгезію показали чутливість адгезинів музейних та свіжевиділених штамів S.aureus до антимікробних препаратів, що дозволяє рекомендувати ці лікарські препарати для застосування їх в комбінованій терапії гнійно – запальних захворювань. На основі отриманих даних можна сказати, що ІАЕ при дії препаратів (ЦФЛ, ОФЛ, ЛФЛ) тісно пов'язаний із концентрацією препаратів.

Адгезивна здатність музейних мікроорганізмів при МБсК ДКМ
(1,95 мкг/мл) дорівнювала 0,90,16 (27%), при СБсК ДКМ (0,12 – 0,48 мкг /мл) – 0,820,16 (25%). Таким чином, зниження початкових патогенних властивостей стафілококів під впливом ДКМ становило 2,20,1 (73%). Аналіз антиадгезивної дії ДКМ на адгезію у стафілококів показав, що препарат проявляв активність на музейні штами і свіжевиділені штами стафілококів в порівняні з контролем.

Результати дослідження впливу антисептика ДКМ на адгезію у музейних і клінічних штамів стафілококів показали високу активність препарату. ДКМ понижав ІАЕ у стафілококів на 70 – 75%. Вивчення впливу антисептика ДКМ на адгезію стафілококів поглиблює відомості про властивості препарату, які є важливими в боротьбі із гнійно – запальними захворюваннями.

Гнійно-запальні захворювання продовжують посідати провідне місце в структурі хірургічних захворювань. Боротьба з інфекцією рани є дуже складною, в зв’язку з стійкістю збудників до антисептичних препаратів. Нами проведено дослідження лікувальної ефективності в експерименті локалізованої гнійної стафілококової інфекції ципрофлоксацином, декаметоксином. Досліди проводили на 45 білих мишах масою 15-17 г. Критеріями ефективності лікування були терміни одужання тварин; характер та ступінь запальної реакції.

Встановлено, що загоювання гнійно-некротичної рани при лікуванні ципрофлоксацином, було зафіксовано на 8 добу. Комбінована хіміотерапія ципрофлоксацином і декаметоксином, виявила швидке загоювання рани, яка була досягнута на 4 добу. Введення ципрофлоксацину і декаметоксину збільшувало кількість тварин, які одужали. Різниця виживання піддослідних тварин (II-III групи) і контрольної (I група) груп статистично достовірні (р<0,001). При аналізі комбінованого лікування ципрофлоксацином та його ефективності з декаметоксином, відмічали краще рубцювання вогнища запалення, що свідчить про лікувальну перевагу ципрофлоксацину з декаметоксином.

Аналіз ефективності лікування з показником виживання тварин з стафілококовою інфекцією показав найнижчу летальність у 3 групі при застосуванні комбінацій препаратів ципрофлоксацину та декаметоксину (10%) в порівнянні з монотерапією (45%). Сумарна тривалість життя тварин при стафілококовій інфекції, в процесі лікування показала, що лікування ципрофлоксацином стафілококової інфекції забезпечило виживання 55% тварин. В групі тварин лікованих ципрофлоксацином та декаметоксином вижило 80% піддослідних тварин. Встановлено, що лікування тварин з локалізованою стафілококовою інфекцією, виявилось найбільш ефективним при застосуванні комбінованого лікування ципрофлоксацином та декаметоксином.

Терапія ципрофлоксацином та декаметоксином гнійного вогнища, забезпечила загоювання гнійного вогнища на четверту добу. Препарати ЦФЛ, ДКМ в комбінації володіли більш високою лікувальною ефективністю при експериментальній стафілококовій інфекції. Отже, дослідження дії ципрофлоксацину та декаметоксину дозволяють значно розширити застосування даних препаратів при місцевих гнійно – запальних процесах, викликаних стафілококовою інфекцією.

ВИСНОВКИ

У дисертаційній роботі на підставі експериментального дослідження та теоретичного аналізу вперше обґрунтовано розв’язання наукових питань, пов’язаних з розробкою нових ефективних препаратів, способів із застосуванням лікарських засобів декаметоксину, ципрофлоксацину, офлоксацину, левофлоксацину для лікування експериментальної стафілококової інфекції. Встановлено особливості формування резистентності у стафілококів, ешерихій, ефективність антиадгезивної дії антимікробних препаратів на бактерії.

1. Декаметоксин, ципрофлоксацин, офлоксацин, левофлоксацин проявляють високу антимікробну активність по відношенню до виділених госпітальних штамів мікрорганізмів. МБсК ДКМ до S.aureus становить 0,24 мкг/мл, МБцК – 0,48 мкг/мл. По відношенню до умовно–патогенних ентеробактерій МБцК препарату знаходиться в межах 15,6 – 125 мкг/мл. ЦФЛ, ОФЛ, ЛФЛ проявляють бактеріостатичну дію на S.aureus в межах 0,12- 0,48 мкг/мл, МБцК - 0,24 – 0,97 мкг/мл. МБсК ЦФЛ для E.coli складає 0,24 мкг/мл, ОФЛ – 0,12 мкг/мл, ЛФЛ – 0,03 мкг/мл; МБцК ЦФЛ до E.coli дорівнює 0,48 мкг/мл, ОФЛ – 0,12 мкг/мл, ЛФЛ – 0,06 мкг/мл відповідно.

2. Клінічні штами стафілококів чутливі до гентаміцину (96%); ципрофлоксацину (95%); пефлоксацину (94%); офлоксацину (93%); ломефлоксацину (93%); цефтріаксону (65%); рифампіцину (61%); цефуроксиму (60%); кліндаміцину (49%); лінкоміцину (45%);

Помірну чутливість госпітальні штами стафілококів зберігають до олеандоміцину (51%). цефалотину (40%); лінкоміцину (34%); оксацикліну (27%); кліндаміцину (26%); цефуроксиму, цефазоліну, цефтріаксону (по 20%); стрептоміцину (14%); азлоцилін (12%); рифампіцину (9%); офлоксацину (5%); ломефлоксацину (5%); доксицикліну (5%) пефлоксацину (3%); ципрофлоксацину (3%). Клінічні штами ентеробактерій та P.aeruginosa зберігають високу чутливість до ципрофлоксацину, офлоксацину, ломефлоксацину, пефлоксацину, а саме: кишкові палички (95%); протеї (94%); синьогнійні палички (50%).

3. Антимікробні препарати ДКМ, ЦФЛ, ОФЛ, ЛФЛ у різних негативних умовах зберігають протимікробну активність:

- ДКМ, ЦФЛ, ОФЛ зберігають високі протимікробні властивості в лужному та кислому поживних середовищах;

- наявність 10%, 20% сироватки в поживному середовищі знижує бактерицидну концентрацію ДКМ в порівнянні з контролем (1,9±0,8 мкг/мл) у 2,5 рази (4,6±0,1 мкг/мл); у ЦФЛ при контролі 1,08±0,8 мкг/мл, концентрація понижається: 2,2 рази (2,0±0,5 мкг/мл); у ОЛФ при контролі 0,84±0,7 мкг/мл МБцК зменшується у 2,8 рази (2,71±0,2 мкг/мл );

- мікробне навантаження госпітальних штамів (103; 106; 109 КУО), суттєво не впливає на бактерицидну активність ДКМ, ЦФЛ, ОФЛ.

4. Формування резистентності у госпітальних штамів стафілококів, ешерихій до ДКМ, ЦФЛ, ОФЛ проходить повільно і не досягає високого рівня. Декаметоксинрезистентні варіанти стафілококів, ешерихій зберігають вихідну чутливість до ЦФЛ, ОФЛ. У резистентних до ДКМ штамів стафілококів, ешерихій спостерігають уповільнення росту на поживних середовищах та зниження життєздатності цих бактерій.

5. ДКМ, ЦФЛ, ОФЛ, ЛФЛ мають антиадгезивну дію на стафілококи. ІАЕ під дією ципрофлоксацину у госпітальних штамів S.aureus в порівнянні з контролем складає 38,5%; інгібуючий адгезивність ефект офлоксацину дорівнює 52%, для левофлоксацину має 59%; декаметоксин знижує адгезію стафілококів на 75%.

6. Лікування ципрофлоксацином гострої експериментальної стафілококової інфекції забезпечує виживання 55% тварин. Комбінація ципрофлоксацину з декаметоксином, має більшу лікувальну активність і забезпечує ефективність виживання 80% тварин.

СПИСОК ОПУБЛІКОВАНИХ ПРАЦЬ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Палій Г.К., Бойко В.М. Мікробіологічна характеристика фторхінолонів та антисептиків // Вісник Вінницького національного медичного університету. - 2004.- Т. 8,