АКАДЕМІЯ МЕДИЧНИХ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ ФАРМАКОЛОГІЇ ТА ТОКСІКОЛОГІЇ

КАНУРНИЙ ІВАН ІВАНОВИЧ

УДК 615.225.2:547.583.5]001.8

СТРЕСПРОТЕКТИВНА АКТИВНІСТЬ ГЛЮКОЗИЛАМОНІЄВОЇ СОЛІ ЗАМІЩЕНОЇ ФЕНІЛАНТРАНІЛОВОЇ КИСЛОТИ

14.03.05 – фармакологія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Київ – 2005

Дисертацією є рукопис

Робота виконана в Інституті неврології, психіатрії та наркології АМН України та на кафедрі клінічної фармакології з фармацевтичною опікою Національного фармацевтичного університету

Науковий керівник: доктор медичних наук, професор,
Заслужений діяч науки і техніки України
Зупанець Ігор Альбертович,
Національний фармацевтичний університет,
завідувач кафедри клінічної фармакології з
фармацевтичною опікою (м.Харків)

Офіційні опоненти: доктор медичних наук, професор,

Заслужений діяч науки і техніки України

Громов Леонід Олександрович,

завідувач відділом нейрофармакології

Інституту фармакології та токсикології
АМН України (м. Київ)

доктор медичних наук, професор

Дев’яткіна Тетяна Олексіївна,

Українська медична стоматологічна академія

МОЗ України, професор кафедри експериментальної

та клінічної фармакології (м. Полтава)

Провідна установа: Харківський державний медичний університет

МОЗ України, кафедра фармакології та

медичної рецептури (м. Харків)

Захист відбудеться 21.09.2005 року о 14 годині на
засіданні спеціалізованої вченої ради Д .550.01 при Інституті фармакології та токсикології АМН України за адресою: 03057, м. Київ, вул. Е. Пот’є, 14.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту фармакології та
токсикології АМН України за адресою: 03057, м. Київ, вул. Е. Пот’є, 14.

Автореферат розісланий 20.08. 2005 року.

Вчений секретар
спеціалі-зованої вченої ради Д .550.01,
кандидат біологічних наук

| ______________ І.В.Данова

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Хронічні стресорні впливи є причиною розвитку ряду патологічних станів: артеріальна гіпертензія, кардіоваскулярні порушення, виразкова хвороба, нервово-психічні розлади (К.В. Судаков, Є.А. Юматов, 1991; Л.В. Сошусенко з співавт., 1992; Ж.Д. Кобалава, К.М. Гудков, 2002; Є.І. Соколов з співавт., 2005; K. Pacak et all., 1995).

Тому особливу актуальність набуває проблема пошуку, розробки і вивчення фармакологічних засобів, які відносяться до фармакологічної групи стреспротекторів. До цієї групи належать різноманітні за хімічною структурою і механізмами дії лікарські препарати – седативні, транквілізатори, тонізуючи, адаптогени, антиоксидантні, мембраностабілізувальні та інші засоби.

Однак, полівалентність патологічних ланок стрес-синдрому, велика кількість різноманітних побічних ефектів існуючих препаратів, резистентність до них та тривалий час наступу терапевтичної дії вимагає пошуку нових ефективних стреспротективних засобів. З цього погляду особливий інтерес викликають глюкозиламонієві солі фенілантранілової кислоти. Зацікавленість до таких сполук обумовлена двома основними моментами. По-перше, головні компоненти клітинних оболонок представлені вуглеводними компонентами гліколіпідів (цереброзіди, гангліозіди), глікопротеїдами, мукополісахаридами, більшість з яких містять залишки N_ацетіл-D-глюкозаміну. Відомо, що поверхня клітини відіграє важливу роль у міжклітинних взаємодіях, у тому числі синаптичних контактах, і глюкозамін, включаючись в обмін клітинних оболонок, виконує протекторну, транспортну та стабілізувальну роль щодо плазматичної мембрани. До того ж, аміноцукор має антиоксидантну активність, що особливо важливо у випадку стресорних впливів у зв'язку з активізацією вільнорадикального окиснювання, яке призводить до ушкодження клітинних мембран (А. Ленинджер, 1974). По-друге, антранілова кислота має потенційну стреспротективну активність, оскільки серед декількох шляхів її метаболізму є шлях біотрансформації у триптофан – попередник гальмового медіатора синаптичної передачі між нейронами головного мозку серотоніну. Вона також є субстратом синтезу бензодіазепінів, які мають протисудомну та заспокійливу дію на центральну нервову систему (А.Ф. Ізнак, 2004).

Вищевикладене з'явилося обґрунтуванням синтезу глюкозиламонієвих со-лей фенілантранілової кислоти з метою одержання сполуки з очікуваною стреспротективною активністю. При цьому передбачалося синтезувати сполуку, яка б мала мембраностабілізувальну та депримуючу активність.

В оцінці стреспротективної дії досліджуваних речовин особлива увага приділяється їх впливу на показники загального адаптогенного синдрому (ЗАС), описаного Г. Сел’є (1972, 1979), а також таким важким наслідкам емоційного стресу, як порушення міжцентральних взаємовідносин структур головного мозку, артеріальна гіпертензія, серцево-судинна недостатність (П.К. Анохін, 1965, Ф.П. Ведяєв, Т.М. Воробйова, 1983, К.В. Судаков, 1997). Необхідно підкреслити, що зараз в медичній практиці вже застосовується ряд лікарських засобів, створених на основі антранілової кислоти (мефенамінова кислота) і глюкозаміну : Артрон (США), Глюкамін (Росія), Терафлекс (США). Однак препарати, які б поєднували фенілантранілову кислоту та глюкозамін та мали б стреспротекторну дію, в світової практиці відсутні.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертація виконана у відповідності до плану науково-дослідних робіт Національного фармацевтичного університету з проблеми МОЗ України “Хімічний синтез, виділення та аналіз нових фармакологічно активних речовин, встановлення зв’язку “структура – дія”, створення нових лікарських препаратів” (номер державної реєстрації 0198U007011).

Мета і завдання дослідження. Мета роботи – експериментально обґрунтувати доцільність використання глюкозиламонієвої солі фенілантранілової кислоти для усунення порушень, викликаних емоційним стресом.

Для реалізації мети дослідження були сформульовані наступні завдання:

1. На підставі експериментальних даних вибрати найбільш активну речовину серед чотирьох вперше синтезованих солей фенілантранілової кислоти.

2. Визначити гостру токсичність (ЛД50) відібраної сполуки.

3. Встановити ефективну дозу та вивчити вплив цієї сполуки на показники стрес-синдрому при гострому емоційному стресі.

4. Дослідити дію відібраної сполуки на показники функціонування серцево-судинної системи (артеріальний тиск і електрокардіографія) при хронічному емоційному стресі.

5. Вивчити вплив відібраної сполуки на біоелектричну активність мозку (за даними електроенцефалограми ) при хронічному емоційному стресі.

6. Проаналізувати динаміку кореляційних зв'язків структур головного мозку: кора, гіпокамп, гіпоталамус, ретикулярна формація - при хронічному емоційному стресі та вплив на цей процес відібраної сполуки.

Об'єкт дослідження – білі миші, щури з моделями гострого та хронічного емоційного стресу.

Предмет дослідження – стреспротективна активність сполуки Ді_глюкозиламонієва сіль 4_хлор’_карбоксифеніл) антранілової кислоти при гострому і хронічному емоційному стресі.

Методи дослідження – фармакологічні, біохімічні, токсикологічні, нейрофізіологічні та статистичні.

Наукова новизна отриманих результатів. Показана стреспротективна активність вперше синтезованої сполуки Ді_глюкозиламонієва сіль 4_хлор’_карбоксифеніл) антранілової кислоти, яка попереджує розвиток тріади Сел’є та зміни інших показників стрес-реакції при гострому емоційному стресі.

Вперше встановлено, що сполука Ді_глюкозиламонієва сіль 4_хлор’_карбоксифеніл) антранілової кислоти усуває патологічні зміни з боку серцево-судинної системи (артеріальну гіпертензію, електрокардіографічні порушення), відновлює добову екскрецію адреналіну і норадреналіну в сечі до вихідного рівня, нормалізує біоелектричну активність мозку при хронічному емоційному стресі.

Вперше проаналізовані зміни кореляційних зв'язків частотного спектру ЕЕГ між неокортексом, гіпокампом, гіпоталамусом, ретикулярною формацією мозку, які настають при хронічному емоційному стресі, і вплив Ді_глюкозиламонієвої солі 4_хлор’_карбоксифеніл) антранілової кислоти на цей процес.

Практичне значення отриманих результатів. Отримані в експерименті результати свідчать про доцільність використання сполуки Ді_глю-ко-зиламонієвої солі 4_хлор’_карбоксифеніл) антранілової кислоти для профілактики розвитку стрес-синдрому, а також для лікування наслідків хронічного стресорного впливу з боку центральної нервової і серцево-судинної систем.

Результати дисертаційної роботи використовуються в курсі лекцій і практичних занять, наукових дослідженнях на кафедрах фармацевтичної хімії, клінічної фармакології з фармацевтичною опікою Національного фармацевтичного університету, на курсах стажування та інформатики Інституту неврології психіатрії та наркології АМН України.

Особистий внесок здобувача. Дисертантом самостійно проведено патентно-інформаційний пошук, аналіз наукової літератури за даною темою, визначені мета і завдання дослідження, освоєні і відтворені моделі гострого та хронічного емоційного стресу на тваринах.

Самостійно проведено пошук речовин зі стреспротективною активністю серед 4 сполук похідних глюкозиламонієвих солей фенілантранілової кислоти.

Виконано статистичну обробку отриманих результатів, проведено аналіз результатів, сформульовані висновки роботи, опубліковані основні положення дисертації. Оформлення дисертаційної роботи та автореферату виконано дисертантом самостійно.

Апробація роботи. Основні фрагменти результатів дисертаційної роботи доповідалися та обговорювалися на Всеукраїнській науково-практичній конференції “Вчені України – вітчизняній фармації” (Харків, 2000) та ХІ Всесвітньому міжнародному конгресі психіатрів (Гамбург, Німеччина, 1999), на науково-практичній конференції “Платонівські читання” (Харків, 2004), на пленумах правління Товариства неврологів, психіатрів та наркологів (Миргород, 2003, Донецьк, 2004), на засіданнях Товариства неврологів (2003, 2004), на V Всеукраїнської науково-практичній конференції “Клінічна фармація в Україні” (Харків, 2004).

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 6 робіт, з них 4 статті у наукових фахових виданнях, 2 тези у матеріалах конгресу та науково-практичної конференції.

Обсяг та структура дисертації. Дисертаційна робота викладена на 149 сторінках машинописного тексту, складається із вступу, огляду літератури, опису матеріалів та методів дослідження, трьох розділів власних досліджень, аналізу та узагальнення результатів дослідження, висновків, практичних рекомендацій та списку літератури, який містить 227 літературних джерела, з них кирилицею – 147, латиницею – 80. Робота проілюстрована 31 таблицею, 53 рисунками.

Основний зміст дисертації

Матеріали та методи досліджень. Досліди проведені на нелінійних статевозрілих білих щурах масою 200 –  г в кількості 242, білих щурах лінії Вістар масою 200 – 230 г в кількості 304 і білих мишах масою 19 –  г в кількості 35. Тварини знаходилися в стандартних клітках із природним освітленням, відносною вологістю повітря 45 - 60% і температурою 18 – 21° С.

Гострий емоційний стрес моделювали в дослідах на білих щурах на основі конфлікту аферентних порушень. При цьому тварини розміщувалися в спеціальній камері, підлога якої мала металеву решітку. Дія умовних подразників відбувалась разом з больовим подразненням шляхом подачі електричного струму на ґратчасту підлогу. Звук і світло включалися аперіодично. Це викликало розвиток емоційного стресового стану (Ф.П. Ведяев, 1975).

Хронічний емоційний стрес моделювали за методикою Ф.П. Ведяєва та Т.М. Воробйової (1983). В експериментальній камері на ґратчасту металеву підлогу подавався електричний струм. Тривалість одного електрошкіряного подразнення складала 10 с, з інтервалом 15 с. Вплив здійснювали протягом 1 години, 5 разів на тиждень, протягом 30 діб. Це приводило до розвитку емоційного стресу й об'єктивно характеризувалося формуванням стійкої артеріальної гіпертензії. Стійка артеріальна гіпертензія зберігалася в щурів протягом 1,5-2 місяців після припинення електрошкірного подразнення.

У першу чергу реєстрували показники стрес-реакції відповідно до тріади Сел’є: коефіцієнти маси тимусу, наднирникових залоз і стан слизової оболонки шлунка (наявність і кількість петехій, ерозій, виразок). Також реєстрували зміни коефіцієнту маси селезінки. У наднирниках визначали вміст аскорбінової кислоти і 11-оксикортикостероїдів (11-ОКС), у плазмі крові – рівень 11-ОКС, у периферичній крові – число еозинофілів.

Вимір систолічного артеріального тиску (АТ) проводили електроплетизмографічним методом у хвостовій артерії з використанням графітного датчика, ртутного манометра і реєстрацією пульсової хвилі на екрані індикатора імпульсів “ИМ-789” (В.П. Пинеліс з співавт., 1982). Моніторинг АТ проводили до електробольового подразнення, через 0,5, 12 і 24 години після стресорного впливу, а далі – щодня протягом усього дослідження.

Запис ЕКГ виконували за допомогою приладу ЭК2Т-02 у трьох стандартних відведеннях із застосуванням сталевих електродів, що прикріплювалися до кінцівок тварин безпосередньо перед дослідженням. Швидкість руху стрічки встановлювалася на 50 і 100 мм/с.

Поряд з візуальним аналізом показників ЕКГ проводили математичний аналіз. На підставі даних показників обчислювали частоту серцевих скорочень (ЧСС), інтегральний показник (ІП), напруженість серцевого ритму (НСР) (Є.І. Соколов, В.П. Подачин та ін., 1980; Р.М. Баєвський з співавт., 1984), а також коефіцієнт аритмії (КА) (В.А. Цибенко з співавт., 1996).

Тваринам в стані етамінал-натрієвого наркозу вживляли довгострокові нехромовані електроди в дорзальний гіпокамп (Hipp), латеральний гіпоталамус (Hpt), мезенцефальну ретикулярну формацію середнього мозку (Rf). Коркові нехромовані електроди (Cort) вводили епідурально в лобово-тім'яну ділянку кори головного мозку. Стереотаксичні координати досліджуваних структур мозку щурів зрілого віку визначали за координатами Є. Фіфковой і Д. Маршала (цитоване по Я.С. Бурешу з співавт., 1962). Індиферентний електрод вживляли в кістку носової пазухи. Експеримент проводили на 3 – добу після стереотаксичної операції.

Біполярний запис електричної активності мозку здійснювали на 8_канальному електроенцефалографі EEG-8S фірми “Медікор” (Угорщина).

Анксіолітичну активність вивчали за методом, запропонованим Ю.І. Вихляєвим і Т.А. Клигуль (1986). За добу до початку тестування тварини знаходилися на водяній депривації. Потім вони розміщалися в експериментальній камері з автоматичною поїлкою. До поїлки підводився струм для нанесення електробольового подразнення під час підходу й взяття води з поїлки. Больовий рефлекс викликав почуття страху, яке зменшувало кількість питних рефлексів. Анксіолітики, пригнічуючи почуття страху, збільшують кількість підходів до поїлки та кількість прийомів води.

Вплив на агресивне поводження тварин визначали за методом, описаним Л.П. Польовим (1967).

Нейротропні речовини з депримуючим типом дії знижують спонтанну рухову активність. В нашій роботі рухова активність реєструвалася на 20_канальному актографі. Кожний канал містить 5 електроізольованих металевих пластинок, які замикаються при пересуванні тварини по каналу, що реєструється автоматичними лічильниками.

Наркозопотенцюючу дію визначали за здатністю речовини збільшувати кількість мишей, які заснули (прийняття бічного положення) при введенні допорогової снотворної дози гексеналу (39 мг/кг, внутрішньоочеревинно) (В.В. Гацура, 1973).

Вміст 11-ОКС вивчали в наднирниках і плазмі крові за умов стресу і під впливом досліджуваної речовини. Кількість 11-ОКС у тканинах наднирникових залоз визначалося за С.А. Єрьомі-ною і співавт. (1968), а в крові – за З.І. Цюхно і співавт. (1981). Принцип методу ґрунтується на здатності до флуоресценції проб, які містять 11-ОКС, після обробки сумішшю концентрованої сірчаної кислоти й етилового спирту.

Кількість аскорбінової кислоти досліджували за А.Є. Шпаків (1967). Принцип методу ґрунтується на здатності відновленої аскорбінової кислоти до окислення 2,6 – діхлорфенолідофенолятом натрію до дигідроаскорбінової кислоти, яка при реакції з 2,4 – динітрофенілгідразином утворює зафарбований продукт. Екстинція проб виміряється при довжині хвилі 520 нм.

Кількість еозинофілів у 1 мм3 периферичної крові підраховували за методикою І.С. Паришвілі (1968).

Дослідження катехоламінів у сечі проводили за методикою підвищення специфічності триоксиіндолової процедури (А.М. Бару, Т.П. Бойко, 1979).

Гостру токсичність Ді_глю-ко-зиламонієвої солі 4_хлор’_карб-оксифеніл) антранілової кислоти визначали за методом В.Б. Прозо-ров-сь-кого і співавт. (1978).

Результати, отримані в роботі, оброблені за допомогою традиційних методів статистики (М.Л. Біленький, 1963; С.Н. Лапач, А.В. Чубенко, П.Н. Бабич, 2000) з використанням програми Statistica та EXCEL'00 для персонального комп’ютера. Вірогідність отриманих даних визначали за t критерієм Ст'юдента при імовірності похибки р0,05.

Результати досліджень та їх обговорення. Синтез глюкозиламонієвих солей антранілової кислоти був здійснений С.Г. Ісаєвим і співавт. (НФаУ).

Скринінгу на гіпотензивну активність при емоційному стресі піддавалися наступні сполуки:

1) Ді–D–(+)–глюкозиламонієва сіль 4–хлор–N–(3’–карбоксіфеніл)– антранілової кислоти (214 – ІП);

2) D–(+)–глюкозиламонієва сіль 4–хлор–N–(3’–карбоксіфеніл)– антранілової кислоти (114 – ІП);

3) D–(+)–глюкозиламонієва сіль 4–нітро–N–(4’–карбоксіфеніл)– антранілової кислоти (106 – ІП);

4) Ді–D–(+)– глюкозиламонієва сіль 4–нітро–N–(4’–карбоксіфеніл)– антранілової кислоти (206 – ІП).

Рис. 1. Ді–D–(+)–глюкозиламонієва сіль 4–хлор–N–(3’–карбоксіфеніл)– антранілової кислоти (214 – ІП).

Рис. 2. D–(+)–глюкозиламонієва сіль 4–хлор–N–(3’–карбоксіфеніл)–антранілової кислоти (114 – ІП).

Рис. 3. D–(+)–глюкозиламонієва сіль 4–нітро–N–(4’–карбоксіфеніл)–антранілової кислоти (106 – ІП).

Рис. 4. Ді–D–(+)–глюкозиламонієва сіль 4–нітро–N–(4’– карбоксіфеніл)–антранілової кислоти (206 – ІП).

Для виявлення найбільш фармакологічно активної сполуки із зазначених речовин були проведені дослідження їх впливу на рівень АТ, який різко зростав (на 56,2 – 88,6%) у щурів при хронічному емоційному стресі. Досліди проведені на білих щурах масою 170 – 210 г. Досліджувані речовини (214–ІП, 114–ІП, 106–ІП, 206–ІП) вводили внутрішньошлунково через зонд в еквімолярних дозах 20 мг/кг. При виборі емпіричної ефективної дози приймалася до уваги низька токсичність вихідних продуктів, тобто антранілової кислоти і глюкозаміну, широкий діапазон їхньої фармакологічної дії та використання мефенамової кислоти (похідне антранілової кислоти) в експериментальних дослідженнях у дозах 7 _  мг/кг.

Спочатку реєстрували вихідний рівень АТ у групі піддослідних тварин. Потім вони піддавалися 30_денному електрошкірному больовому стресорному впливу. Наступної доби після припинення стресорного впливу реєстрували рівень АТ і після цього вводили досліджувані речовини. Гіпотензивну активність досліджуваних сполук визначали через 2 години після їхнього введення. Результати дослідів представлені в табл.1.

З табл. 1 видно, що достовірне зниження АТ у стресованих щурів відзначалося під впливом хлорвмісних глюкозиламонієвих солей антранілової
кислоти (ІП–214; ІП–114). Достовірної гіпотензивної дії нітровмісних глюкозиламонієвих солей антранілової кислоти (сполуки ІП–106; ІП–206) не спостерігалося.

Отримані дані дозволили виділити найбільш активну з досліджуваних речовин – сполуку ІП–214. Для зручності викладу експериментального матеріалу сполукаІ–214 одержала умовну, робочу назву “англюсін”.

Таблиця 1

Вплив сполук ІП-206; ІП-214; ІП-1124; ІП-106 на артеріальну

гіпертензію (мм рт. ст.), викликану хронічним стресорним впливом

Досліджу-вані сполуки | n | Вихідний рівень артеріального тиску | Артеріальний тиск після 30-денного стресорного впливу | Артеріальний тиск після 30_ден-но-го стресорного впливу і введення досліджуємих сполук

абс. | абс. | % | абс. | %

ІП-206 | 6 | 88,7 5,1 | 138,7 10,8 | 56,2* | 111,2 14,6 | - 19,3

ІП-214 | 6 | 91,0 8,8 | 166,1 15,3 | +82,5* | 122,1 8,4 | - 26,9**

ІП-114 | 6 | 88,5 6,3 | 154,1 11,6 | +75,0* | 122,5 9,8 | - 20,9**

ІП-106 | 6 | 94,3 9,7 | 178,1 21,3 | + 88,6* | 152,5 14,8 | - 14,0

Примітки:

1. * – р<0,05 у порівнянні з вихідним рівнем;

2. ** – р<0,05 у порівнянні з показниками тварин після 30-денного

стресорного впливу.

Вплив англюсіну на показники стрес-реакції
при гострому емоційному стресі

Після моделювання гострого емоційного стресу визначалася дія англюсіну на коефіцієнти маси тимусу, наднирникових залоз, селезінки і патологічні зміни слизової оболонки шлунка. Крім того, вивчався вміст аскорбінової кислоти і 11_ОКС у тканині наднирникових залоз, 11_ОКС у плазмі крові, кількість еозинофілів у периферичній крові, а також динаміка АТ.

Досліди проведені на білих щурах лінії Вістар масою 200 – 230г. З метою визначення залежності “доза – ефект” англюсін вводили внутрішньошлунково в дозах 5, 20, 50 і 100 мг/кг. Досліджувану речовину вводили двічі – за 1 добу і за 1 год до початку відтворення гострого емоційного стресу. Показники стрес-реакції в контролі та досліді реєструвалися через 1 годину після закінчення стресорного впливу.

Проведені досліди показали, що гострий емоційний стрес призводить до зниження коефіцієнта маси тимусу на 41 %, селезінки на 64,6 %, підвищення коефіцієнту маси наднирникових залоз на 42,9 %. У 100 % випадків у тварин спостерігалися патологічні зміни в шлунку: набряк слизової оболонки, її гіперемія і крапкові крововиливи. Гострий емоційний стрес супроводжувався зниженням вмісту 11_ОКС у наднирниках на 38 % і підвищенням рівня цього кортикостероїда в плазмі крові на 49 %. При цьому знижувався вміст аскорбінової кислоти в наднирниках на 35,9 % і кількість еозинофілів у крові на 52,4 %. АТ при цьому зростав з 94,7 ± ,6 до 117,9 ± ,4 мм рт. ст., тобто в середньому на 24,9 мм рт. ст. Попереднє введення англюсіну за 1 добу і за 1 год до початку стресорного впливу дозозалежно попереджувало розвиток змін зазначених вище показників і проявів стрес-реакції. Коефіцієнти маси селезінки і тимусу залишалася в межах норми, починаючи з дози 20 мг/кг; коефіцієнт маси наднирникових залоз – з дози 50 мг/кг; розвиток патологічних змін в слизовій оболонці шлунка попереджувався при введенні англюсіну, починаючи з дози 50 мг/кг. Рівень 11-ОКС у тканині наднирників і плазмі крові відрізнявся від даних у тварин зі стресом при введенні англюсіну, починаючи з дози 50 мг/кг. Профілактика змін вмісту аскорбінової кислоти і кількості еозинофілів в крові при введенні англюсіну починалась з дози 20 мг/кг. У цій дозі англюсін попереджав розвиток гіпертензії при гострому емоційному стресі. Необхідно відзначити, що у інтактних тварин англюсін у дозах 20, 50, 100 мг/кг не впливав на рівень АТ протягом 3-х годин спостереження. Отримані результати свідчать про виразну стреспротективну дію англюсіну.

Дослідження гіпно-седативної і транквілізуючої дії англюсіну

Відомо, що стреспротективні засоби, крім попередження проявів стрес-реакції, можуть мати транквілізуючу, седативну і гіпногенну дію. Дослідження в цьому напрямку показали, що англюсін, введений внутрішньошлунково в дозі 20 мг/кг за 2 год. до тестування, знижував рухову активність на 64,6 % через 2 год. і на 67,2 % і 72 % через 3 і 4 год. відповідно після введення речовини. Горизонтальна рухова активність у тесті “відкрите поле” знижувалася після введення англюсіну в 3 рази. При цьому англюсін у дозі 20 мг/кг не мав власне снотворного ефекту і не потенціював снотворної дії гексеналу.

Досліди, проведені за методикою “конфліктної ситуації”, показали, що англюсін у дозі 20 мг/кг не має транквілізуючої дії, але у цій же дозі він попереджував агресивне поводження тварин за методикою “спровокована бійка”. Під впливом англюсіну у тварин не спостерігалося “бійцівських сутичок” і “спровокованих бійок”.

Отримані результати свідчать про те, що англюсін не має транквілізуючої і снотворної дії, але має седативний ефект.

В окремій серії дослідів визначалася гостра токсичність (ЛД50) англюсіну. Досліди проведені на білих мишах і білих щурах при внутришньошлунковому введенні англюсіну та 14_денному спостереженні за тваринами.

Результати досліджень показали, що ЛД50 англюсіну для мишей складає 5200 (4700 ? 6020) мг/кг, для щурів 4800 (4200 ? 5700) мг/кг, що відповідає класу малотоксичних речовин (В.Б. Прозо-ров-сь-кий і співавт.,1978). Як показали проведені досліди, ефективною стреспротективною дозою англюсіну є 20 мг/кг, що складає 1/250 від ЛД50 і свідчить про велику широту його фармакологічної дії.

Вплив англюсіну на патологічні зміни серцево-судинної системи
при хронічному емоційному стресі

Відомо, що емоційний стрес і, особливо, тривалий, хронічний вплив стресорних факторів призводить до патології серцево-судинної системи – артеріальної гіпертензії і порушення роботи серця (К.В. Судаков, Є.А. Юматов, 1991; М.В. Потанін, 1998; Ж.Д. Кобалава, К.М. Гудков, 2002; Є.І. Соколов з співавт., 2005; K. Pacak et all., 1995). Тому стреспротектори повинні бути ефективними засобами профілактики і лікування серцево-судинної патології, яка розвивається при тривалому емоційному стресі.

У попередніх дослідженнях було показано стреспротективну дію англюсіну і його здатність знижувати АТ (на 26,9 %) при одноразовому введенні після закінчення хронічного впливу. Однак АТ не відновлювалося до вихідного рівня, перевищуючи його на 13,4 %. Тому були проведені дослідження при тривалому введенні англюсіну (15 діб). При цьому вивчали вплив англюсіну не тільки на АТ, але і на діяльність серця при хронічному емоційному стресі.

Досліди проведені на білих щурах. Англюсін вводили внутришньошлунково в дозі 20 мг/кг щодня протягом 15 днів. АТ реєстрували після закінчення стресорного впливу, а також через 2 год після введення англюсіну в 1_у, 5_у, 10_у та 15_у добу. Контрольні дослідження показали, що хронічне 30-денне стресування призводить до розвитку стійкої гіпертензії (АТ підвищується на 79яка реєструвалася протягом 1,5 – 2 місяців після закінчення стресорного впливу.

Одноразове, так саме, як і 5-разове введення англюсіну вірогідно знижувало АТ у стресованих тварин, але не відновлювало його до вихідного рівня. Найбільший терапевтичний ефект реєструється після 10-ти й, особливо, 15-денного введення англюсіну (рис. ).

Рис. 5. Динаміка змін АТ при тривалому введенні англюсіну щурам із хронічним емоційним стресом.

Примітки:

1. 1– вихідні дані АТ, 2 – АТ у стресованих тварин, 3 – АТ при одноразовому введенні англюсіну, 4 – АТ при 5-денному введенні англюсіну, 5 – АТ при 10-денному введенні англюсіну, 6 – АТ при 15_денному введенні англюсіну;

2. * – р<0,05 стосовно вихідних даних;

3. ** – р<0,05 стосовно стресованих тварин.

Отримані дані свідчать, що англюсін відновлює рівень АТ у щурів з вираженою і стійкою гіпертензією, викликаною хронічним емоційним стресом.

Стресорні впливи можуть призводити до порушень екстра- і інтракардіальних механізмів діяльності серця. При цьому патологія серцевої діяльності може обтяжуватися під впливом артеріальної гіпертензії, яка є постійним синдромом наслідків стресу. Тому були проведені дослідження впливу англюсіну на показники функціонування серця у стресованих тварин.

Досліди проведені на білих щурах. Англюсін вводили внутрішньошлунково в дозі 20 мг/кг щодня протягом 20 днів відразу після закінчення стресорного впливу. Показники ЕКГ реєстрували до стресу, після завершення дії стресорного фактору і через 30 – 60 хв на 5, 10 і 20 добу введення англюсіну. Аналізували наступні показники ЕКГ: коефіцієнт аритмії (КА), інтегральний показник (ІП), напруженість серцевого ритму (НСР), частоту серцевих скорочень (ЧСС). Крім того, оцінювали інтервал PQ, а також амплітуду зубців P, R, S, T.

Хронічний стрес протягом 30-ти днів призводив до вірогідного зростання коефіцієнта аритмії на 46,4інтегральний показник підвищувався на 105напруженість серцевого ритму знижувалася на 18,7При цьому спостерігалися зміни тривалості інтервалу PQ і амплітуда зубців P, R, S, T. Зазначені порушення ЕКГ свідчать, що при хронічному емоційному стресі домінують симпатичні впливи на серце і це призводить до ослаблення механізмів адаптації і дестабілізує серцеву діяльність.

Введення англюсіну протягом 10 днів відновлює коефіцієнт аритмії до вихідного рівня, а інтегральний показник, величина напруженості серцевого ритму, амплітуда зубців P, R, S, T, інтервал PQ нормалізуються після 5-денного введення англюсіну.

ЧСС при 30-денному емоційному стресі не змінювалася, можливо, в зв'язку з тим, що тривале стресування приводить до адаптації регуляції ЧСС.

У інтактних тварин англюсін у дозі 20 мг/кг, який вводили протягом 20 діб, не впливав на показники серцевої діяльності.

Результати проведених досліджень свідчать про те, що англюсін знімає ефект гіперактивності симпатичної нервової системи й інших стрес-лімітуючих факторів, перешкоджає подальшому розвитку патологічного процесу і сприяє нормалізації екстракардіальних і ауторегуляторних механізмів міокарда.

Це підтверджувалося і наступною серією дослідів, у яких вивчався вплив англюсіну на добову екскрецію катехоламінів у щурів, що піддавалися хронічному стресорному впливу. Добова екскреція адреналіну і норадреналіну в щурів визначалася на 1-у і 9-у добу після закінчення хронічного емоційного стресу. У зазначені дні досліджень рівень адреналіну і норадреналіну в сечі тварин підвищувався в значній мірі: адреналіну – на 48і 25,6 % відповідно, а норадреналіну – на 61 % і 61,3 % (табл. 2).

Введення англюсіну приводило до зниження добової екскреції адреналіну. Цей ефект зростав відповідно до кратності введення досліджуваної сполуки. На 6-у добу введення відзначалися достовірні розходження стосовно стресованих тварин, а на 9-у добу введення англюсіну добова екскреція адреналіну вірогідно не відрізнялася від відповідного показника в інтактних тварин (табл. 2). Аналогічна динаміка спостерігалася й стосовно добової екскреції норадреналіну. На 6-у добу введення англюсіну цей показник вірогідно відрізнявся від стресованих тварин. На 9-у добу введення англюсіну добова екскреція норадреналіну вірогідно не відрізнялася від відповідного показника в інтактних тварин (табл. 3). Варто підкреслити, що відновлення добової екскреції адреналіну і норадреналіну на 9-у добу введення англюсіну за часом збігається з нормалізацією АТ і діяльністю серця в стресованих тварин.

Таблиця 2

Динаміка змін добової екскреції катехоламінів (нмоль/доба) у стресованих тварин під впливом англюсіну (у кожній серії дослідів n=6)

Катехол-аміни | Інтактні тварини | Тварини з хронічним стресом | Введення англюсіну тваринам з емоційним стресом, доба

1 | 2 | 3 | 6 | 7 | 8 | 9

Адре-налін | 0,55± 0,03 | 1,42± 0,17* | 1,15± 0,14* | 1,07± 0,13* | 0,99± 0,13* | 0,88± 0,09 ** | 0,72± 0,06 ** | 0,72± 0,06 ** | 0,63± 0,05 **

Норад-рена-лін | 3,70± 0,11 | 11,74± 1,38* | 9,67± 0,92* | 8,91± 0,76* | 8,59± 0,79* | 6,95± 0,82 ** | 6,28± 0,82 ** | 5,87± 0,86 ** | 4,92± 0,64 **

Примітки:

1. * – р<0,05 стосовно інтактних тварин;

2. ** – р<0,05 стосовно стресованих тварин.

Це свідчить про те, що активація адренергічної системи при хронічному емоційному стресі є однією з провідних ланок у механізмі формування серцево-судинної патології. Введення англюсіну за цих умов знижує добову екскрецію катехоламінів і відновлює до норми показники функціонування серцево-судинної системи.

Особливість дії англюсіну полягає в тому, що він ефективно впливає на показники стрес-реакції в тварин з емоційним стресом і не змінює ці ж показники в інтактних тварин. Це стосується і добової екскреції катехоламінів (табл. ). Англюсін інтактним тваринам вводили протягом 9 діб.

Було встановлено, що внутрішньошлункове введення англюсіну в дозі 20 мг/кг не призводило до зміни добової екскреції адреналіну і норадреналіну в інтактних тварин. Отримані результати ще раз підкреслюють стреспротективну активність сполуки.

Таблиця 3

Вплив англюсіну на добову екскрецію катехоламінів у інтактних тварин (нмоль/доба)

Інтактні тварини | Введення англюсіну інтактним тваринам

А д р е н а л і н

1,20 0,08

n = 10 | 0,99 0,10

n = 10

Н о р а д р е н а л і н

6,50 0,76

n = 10 | 6,23 0,71

n = 10

Дія англюсіну на біоелектричну активність мозку щурів при хронічному емоційному стресі

Сукупність стреспротективного і седативного ефектів англюсіну дає підставу зробити висновок про його вплив на центральну нервову систему. Об'єктивним і інформативним показником функціонування мозку є біоелектрична активність за даними електроенцефалографії (ЕЕГ). Тому були проведені дослідження з вивчення впливу англюсіну на показники ЕЕГ у щурів, які піддавалися хронічному емоційному впливу. Біопотенціали реєструвалися в неокортексі, гіпокампі, гіпоталамусі і ретикулярній формації мозку. Крім того, був проведений кореляційний аналіз зв'язків частотного спектру біоелектричної активності між зазначеними вище структурами мозку при хронічному емоційному стресі і тривалому введенні англюсіну.

Досліди проведені на 18 білих щурах масою 250 – 300 г. Першу групу склали 6 контрольних тварин, другу – 6 тварин з хронічним емоційним стресом без лікування, третю – 6 тварин з хронічним емоційним стресом, яким щодня в дозі 20 мг/кг внутрішньошлунково вводили англюсін. ЕЕГ реєстрували через 30 – 60 хв після введення речовини на 1, 5, 10, 15 і 20-у добу досліду.

Найбільш характерною зміною біоелектричної активності мозку при хронічному емоційному стресі є наявність пароксизмальних розрядів домінуючих частот – альфа, бета, тета, сигма. Причому із збільшенням часу стресуючого впливу до 15 – 20 доби на ЕЕГ з'являються поодинокі і множинні судомні розряди. При цьому в різні періоди розвитку стрес-синдрому (на 5, 10, 15, 20-у добу) в генерації судомної активності домінували різні структури головного мозку. На 5-у добу стресорного впливу це була сенсомоторна кора і гіпоталамус; на 10-у добу – неокортекс і гіпокамп; на 15_у добу – всі досліджувані структури (неокортекс, гіпокамп, гіпоталамус, ретикулярна формація). В цей період переважала епілептична активність, а сенсомоторна кора і гіпокамп працювали як єдиний генератор цієї активності.

Лікувальна дія англюсіну на електрогенез мозку починає виявлятися після 5-ї доби введення. З 5-го по 10-е введення англюсіну відновлення ЕЕГ відбувається хвилеподібно, а починаючи з 15-го введення – біоелектрична активність мозку цілком нормалізується. У тварин без лікування англюсіном у цей часовий період на ЕЕГ продовжує реєструватися епізодична епілептогенна активність.

Заслуговує на увагу той факт, що відновлення біоелектричної активності мозку під впливом англюсіну спостерігається приблизно на 15-у добу введення сполуки і за часом збігається з нормалізацією артеріального тиску і серцевої діяльності.

Відносна тривалість розвитку стреспротективного ефекту при хронічному стресорному впливі дає підставу для припущення, що Діглюкозил-амонієва сіль 4-хлор-N-(3’-карбоксифеніл) антранілової кислоти має нейрометаболічну дію.

При аналізі кореляційних зв'язків між неокортексом, гіпокампом, гіпоталамусом і ретикулярною формацією було встановлено, що хронічний емоційний стрес викликає мозаїчну перебудову взаємин зазначених структур мозку.

Найбільш потужні зв'язки в початковий період впливу стресу (5 діб) спостерігалися між неокортексом і гіпоталамусом. Гіпокамп працював у власному, але не фізіологічному режимі. Надалі (10 – 20 доба стресу) на перший план виступали потужні кореляційні зв'язки між неокортексом і гіпокампом, що визначало функціонування інших структур мозку.

Лікувальна дія англюсіну, який відновлює вихідний рівень кореляційних зв'язків, також має своєрідний нейродинамічний характер. У перші 5 діб введення англюсін підсилював кореляційні зв'язки частотного спектру ЕЕГ між неокортексом і гіпоталамусом. Надалі (10 – 20 доба введення сполуки) основною структурою (мішенню) дії англюсіну був гіпокамп, який тісно взаємодіє з ретикулярною формацією і гіпоталамусом. Сенсомоторна кора виконувала функції пускового механізму і контролю взаємодії, що відбувалися при дії англюсіну.

Своєрідність фармакологічної дії Діглюкозиламонієвої солі 4_хлор-N-(3’_карбоксифеніл) антранілової кислоти полягає в тому, що у контрольних (інтактних) тварин ця сполука не впливає на тріаду Сел’є й інші показники стрес-синдрому, на АТ і серцеву діяльність, добову екскрецію катехоламінів і біоелектричну активність мозку.

Разом з цим англюсін має профілактичний ефект щодо розвитку стрес-синдрому при гострому емоційному стресі та діє лікувально дію на патологічні зміни серцево-судинної і центральної нервової системи при хронічному стресорному впливі.

Вищевикладене разом із встановленим седативним впливом англюсіну дозволяє зробити висновок про те, що вивчена сполука має стреспротективну активність за рахунок дії на центральну нервову систему

ВИСНОВКИ

У дисертаційній роботі теоретично обґрунтовано та експериментально підтверджено, що сполука Діглюкозиламонієва сіль 4-хлор-N-(3’-карбоксифеніл) антранілової кислоти має стреспротективну активність.

1. Гострий емоційний стрес характеризується розвитком тріади Сел’є, а також вірогідним зниженням вмісту 11-ОКС у наднирниках (на 40%), підвищенням рівня цього кортикостероїда в плазмі крові (на 98%), зниженням вмісту аскорбінової кислоти у наднирниках (на 26%) і еозинофілів у крові (на 52,4%), підвищенням артеріального тиску (на 25%).

2. Наслідками тривалого емоційного стресу є стійка артеріальна гіпертензія (вірогідне підвищення АТ в середньому на 70; порушення скорочувальної здатності і електрогенеза (ЕКГ) міокарду; збільшення добової екскреції катехоламінів – адреналіну на 27 – 41 %, норадреналіну в 2,5 рази; дезорганізація біоелектричної активності неокортексу, гіпокампу, гіпоталамусу, ретикулярної формації і порушення кореляційних взаємин цих структур мозку.

3. Ефективна стреспротективна доза Діглюкозиламонієвої солі 4_хлор-N-(3’-карбоксифеніл) антранілової кислоти при внутрішньошлунковому введенні – 20 мг/кг, що складає 1/250 від ЛД50. Досліджувана сполука відноситься до малотоксичних речовин: ЛД50 при внутрішньошлунковому введенні у мишей дорівнює 5200 мг/кг, у щурів – 4800 мг/кг.

4. Двократне введення Діглюкозиламонієвої сілі 4-хлор-N-(3’-карбоксифеніл) антранілової кислоти білим щурам за добу і годину до гострого емоційного стресу попереджає розвиток тріади Сел’є, зсуви вмісту 11-ОКС у наднирниках і плазмі крові, кількісні зміни вмісту аскорбінової кислоти в наднирниках і еозинофілів у крові.

5. Діглюкозиламонієва сіль 4-хлор-N-(3’-карбоксифеніл) антранілової кислоти має седативну дію при відсутності транквілізуючого та снотворного ефекту.

6. Тривале введення Діглюкозиламонієвої солі 4-хлор-N-(3’-карб-оксифеніл) антранілової кислоти білим щурам (протягом 5-20 діб) при хронічному емоційному стресі знижує артеріальний тиск до вихідного рівня (10-15 доба), нормалізує показники електрокардіографії (15-20 доба), відновлює добову екскрецію катехоламінів до рівня контрольних тварин (10 доба).

7. Діглюкозиламонієва сіль 4-хлор-N-(3’-карбоксифеніл) антранілової кислоти при тривалому введенні білим щурам (5, 10, 15, 20 діб) нормалізує біоелектричну активність мозку за даними електроенцефалографії (20 доба), дезорганізовану під впливом хронічного емоційного стресу, а також кореляційні зв'язки частотного спектру електроенцефалограми між неокортексом, гіпокампом, гіпоталамусом, ретикулярною формацією.

8. У інтактних білих щурів та мишей Діглюкозиламонієва сіль 4-хлор-N-(3’-карбоксифеніл) антранілової кислоти не викликає змін: не впливає на біоелектричну активність мозку і міокарда, не змінює рівень артеріального тиску і частоту серцевих скорочень, не впливає на показники тріади Сєл’є і добову екскрецію катехоламінів з сечею.

9. Одночасний збіг фармакологічних ефектів досліджуваної сполуки на біоелектричну активність мозку при емоційному стресі, добову екскрецію катехоламінів і показники функціонування серцево-судинної системи дає підстави для висновку про те, що Діглюкозиламонієва сіль 4-хлор-N-(3’-карбоксифеніл) антранілової кислоти відноситься до речовин центральної дії зі стреспротективною активністю.

Перелік праць, опублікованих за темою дисертації

1. Канурный И.И. Результаты скрининг исследований производных Дглюкозамина при эмоциональной гипертензии в эксперименте // Український вісник психоневрології. – 1999. – Т.7, Вип. 2 (20). – С. 105 – 108.

2. D-(+)-глюкозиламонієві солі заміщених N-фенілантранілової кислоти, 9-(карбоксифенил) аміноакридину, синтез та біологічна активність / А.О. Ткач, О.О. Павлій, С.Г. Ісаєв, І.І. Канурний, І.А. Зупанець // Фармацевтичний журнал. – 2001. – №3. – С. 59 – 63. (Особистий внесок здобувача: вивчення гострої токсичності, гіпотензивної активності, аналіз та узагальнення результатів, участь у написанні статті).

3. Канурний І.І. Вплив Діглюкозиламонієвої солі 4-хлор-N-(3’-карбоксифеніл) антранілової кислоти на електричну активність мозку щурів з експериментальною емоційною артеріальною гіпертензією // Вісник фармації. – 2003. – №4 (36). – С. 111 – 115.

4. Канурний І.І. Динаміка показників електрокардіограми при експериментальній емоційній артеріальній гіпертензії під впливом Ді-D-(+)-глюкозиламонієвої солі 4-хлор-N-(3’-карбоксифеніл) антранілової кислоти // Клінічна фармація. – 2003. – Т.7, №2. – С. 46 – 50.

5. Ivan Kanurniy. Pharmacological Correction of Emotional Hypertension // Abstracts of the XI World Congress of Psychiatry. – Hamburg, 1999. – P. 248.

6. Гіпотензивна активність D-(+)- та Ди-D-(+)глюкозиламонієвих солей N-фенілантранілових кислот / О.О. Павлій, І.І. Канурний, С.Г. Ісаєв, О.І. Павлій // Вчені України – вітчизняній фармації: Мат. наук.-практ. конф. – Харків, 2000. – С. 33 – 34 (Особистий внесок здобувача: вивчення гострої токсичності, гіпотензивної активності, аналіз та узагальнення результатів, участь у написанні статті).

Анотація

Канурний І.І. Стреспротективна активність глюкозиламонієвої солі заміщеної фенілантранілової кислоти. – Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за фахом 14.03.05 – фармакологія. – Інститут фармакології і токсикології АМН України, Київ, 2005.

Дисертація присвячена проведенню скринінгу стреспротективної активності серед похідних глюкозиламонієвих солей фенілантранілової кислоти з наступним вивченням їх стреспротективної дії в умовах моделей гострого, хронічного емоційного стресу, артеріальної гіпертензії.

Виявлено найбільш активну сполуку – Ди-D-(+)-глюкозиламонієву сіль 4_хлор-N-(3'-карбоксифеніл) антранілової кислоти (англюсін), яка впливає на рівень АТ, що різко зростав при хронічному емоційному стресі. Введення англюсіну до початку стресу дозозалежно попереджало розвиток патологічних проявів стрес-реакції. Сполука має седативний ефект. Визначено ефективну стреспротективну дозу (20 мг/кг),