АКАДЕМІЯ МЕДИЧНИХ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ ЕПІДЕМІОЛОГІЇ ТА ІНФЕКЦІЙНИХ ХВОРОБ

ім. Л.В. ГРОМАШЕВСЬКОГО

КОЛІУШ ОЛЬГА ІГОРЕВНА

УДК 616.36 – 002 + 616-092: 612.017.1 + 616.153.96

ФУНКЦІОНАЛЬНИЙ ВЗАЄМОЗВ'ЯЗОК ЛІПОПОЛІСАХАРИД-ЗВ'ЯЗУЮЧОГО БІЛКА ТА ІМУННИХ ЗРУШЕНЬ У ПАТОГЕНЕЗІ ХРОНІЧНОГО ВІРУСНОГО ГЕПАТИТУ С

14.01.13 - інфекційні хвороби

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата медичних наук

Київ - 2005

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Кримському державному медичному університеті ім. С.І. Георгієвського МОЗ України.

Науковий керівник: | кандидат медичних наук, доцент Аршинов Павло Спиридонович , Кримський державний медичний університет ім. С.І. Георгієвського, завідувач кафедри інфекційних хвороб та епідеміології

Офіційні опоненти:

доктор медичних наук, професор Вовк Алла Дмитрівна, Інститут епідеміології та інфекційних хвороб ім. Л.В. Громашевського АМН України, завідувач відділу вірусних гепатитів і СНІДу;

доктор медичних наук, професор Мірошниченко Валентин Павлович, Запорізька медична академія післядипломної освіти, завідувач кафедри інфекційних хвороб

Провідна установа:

Одеський державний медичний університет МОЗ України

Захист відбудеться “21” квітня 2005 р. о 11 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.614.01 по захисту кандидатських дисертацій при Інституті епідеміології та інфекційних хвороб ім Л.В. Громашевського АМН України за адресою 01015, м. Київ, вул. Січневого повстання, 23

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту епідеміології та інфекційних хвороб ім Л.В. Громашевського АМН України (03038, м. Київ, вул. М. Амосова, 5).

Автореферат розісланий “ 21” березня 2005 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради

кандидат мед. наук _____________ Кононенко В.В.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність проблеми. Вірусний гепатит С є актуальною проблемою сучасної гепатології через переважне розповсюдження хронічних прогресуючих форм хвороби, з ризиком розвитку через 20-30 років цирозу або гепатоцелюлярної карциноми і недостатньою ефективністю лікування. На Україні ця проблема набуває особливе значення в зв'язку з тим, що країна відноситься до екологічно неблагополучних регіонів з високим рівнем ураження населення вірусом гепатиту С. (Возианова Ж.И. 2000, Гураль А.Л. с соавт. 2004, Шахгильдян І.В. с соавт., 1998, Вовк А.Д. с соавт., 2001).

У повсякденній клінічній практиці діагноз гепатиту С в 60-80% випадків встановлюється вже в хронічну фазу через маломаніфестний перебіг гострих форм хвороби (Возіанова Ж.І., Корчинський, 2001, Соринсон С.Н. 1998, Alter M.J. 1995, Hoofnagle J. H., Di Bisceglie A.M.,1997). Своєчасна діагностика хронічного гепатиту С (ХГС), патогенетичні аспекти прогнозування його перебігу і вибір раціональної терапії залишаються складними питаннями і вимагають подальшого вивчення.

Числені дані літератури вказують на тісний взаємозв'язок особливостей імунної відповіді організму, зокрема клітинно-опосередкованого імунітету, з тривалою персистенцією HCV в організмі хворого. (Возiанова та співавт., 1998; С.Н. Соринсон, 1998; Исаков В.А., Аспель Ю.В., 1999; Рябоконь О.В., Колесник Ю.М., 2002, Никитин И.Г. с соавт., 1999, Ивашкин В.Т. с соавт, 1997, Семененко Т.А., 2000, Ярилин А.А.,1996, Bertoletti А., 1997, Diepolder Н.М., 1996., Emi K. 1997, Mondelli M.U. 1996, Reherman B. 1997). Прогресування ж патологічного процесу в печінці при ХГС пов'язане з хронічним запальним процесом, виникаючим в тканині печінки, що призводить до формування фіброзу з подальшим розвитком цирозу (Маянський А.Н. с соавт, 1998, Соринсон С.Н., 1998). Відомо, що активність трансаміназ мало корелює з морфологічними змінами в тканині печінки (Комарова Д.А., Цинзерлинг В.А. 1999, Серов В.В. с соавт, 1999). Разом з цим, взаємозв'язок між імунним дисбалансом в організмі і інтенсивністю запального процесу в печінці в патогенезі ХГС вивчений недостатньо. Це вимагає пошуку нових маркерів, які дозволили б надійно оцінити активність запального процесу в печінці на будь-якому етапі хвороби.

Як такі лабораторні маркери загалом підходять майже всі субстанції, які або метаболізуються, або синтезуються в печінці. Такими речовинами, широко відомими своєю ранньою участю в системному запальному процесі, являються гострофазні білки сироватки. Одним з представників цих білків є ліпополісахарид-зв'язуючий (lipopolysaccharide-binding protein, LBP), відомий як гострофазний білок 1-го типу, що синтезується гепатоцитами у відповідь на збільшення надходження по воротній вені ліпополісахариду (LPS) кишечної палички при дисбактеріозі кишечнику і грає першорядну роль в швидкій індукції запальної відповіді в організмі (Яковлев М.Ю., Лиходед В.Г., 1996, Schumann, 1990). Патофізіологічна роль LBP зумовлена, передусім, утворенням комплексу ліпополісахарид+LBP, який через рецептори фагоцитів CD14+ викликає їх активацію, що сприяє випуску прозапальних цитокінів, індукуючих та підтримуючих запалення (Scafer З., 2002, Lukkari Т.А., 1999, Jirillo Е., 1998, Caradonna L., 2002). Відомо, що ХГС часто супроводжується синдромом надмірного зростання кишкової мікрофлори за рахунок грамнегативних бактерій, передусім, гемолізуючих ешеріхій та умовнопатогенної флори, що призводить до збільшення кількості ліпополісахариду кишечної палички, що поступає по системі портальної вени (Созинов А.С. с соавт., 2002). Деструктивні зміни сінусоїдних клітин печінки та гепатоцитів внаслідок пошкодження їх вірусом гепатиту С порушують їх здатність елімінувати ліпополісахарид, а це сприяє збільшенню його кількості в загальній системі кровообігу та потенцює подальше пошкодження печінки (Яковлев М.Ю. с соавт., 1996, Шенкман Б.З., Грачева Н.В., 1989, Лиходед В.Г. с соавт., 1996).

Ліпополісахарид грамнегативної кишкової мікрофлори бере участь в розвитку патологічних процесів при ХГС, зокрема надає виражений вплив на Т- і В-лімфоцити, активує макрофаги та збільшує продукцію інтерферону, що доведено численими експериментальними даними (Шенкман Б.З., Грачева Н.В., 1989, Яковлев М.Ю., 1996, Jirillo Е., 1998). Однак в доступній нам літературі дослідження рівня LBP при ХГС одиничні, а взаємозв'язок його змін з імунними зсувами в патогенезі цієї хвороби ми не зустріли.

Незважаючи на досягнення у вивченні гепатиту С, кардинальні питання лікування залишаються ще не повністю розкритими. Загальноприйняте лікування ХГС з тривалим застосуванням препаратів -інтерферону та рібавірину, що мають противірусну і імунокоригуючу дію, надає ефект лише в 42-46% при інфікуванні генотипом 1в (Fried MW. 2002, Manns MP., 2001), що недостатньо ефективно. На наш погляд, це диктує необхідність розробки удосконалених терапевтичних підходів, впливаючих саме на патогенетичні аспекти індукції запального процесу і імунну систему, тобто основні механізми прогресування ХГС.

У зв'язку з цим виявлення характеру імунологічних зсувів, дослідження вмісту LBP, з'ясування механізмів взаємодії LBP з показниками клітинного і гуморального імунітету в динаміці у хворих на ХГС і обгрунтування застосування з патогенетичною метою препаратів, що знижують надходження ліпополісахариду грамнегативної кишкової флори по воротній вені (сорбент полісорб) і сприяють нормалізації кишкової мікрофлори (пребіотик хілак) в комплексній терапії ХГС є найбільш важливим напрямом досліджень.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота є фрагментом наукової теми кафедри інфекційних хвороб і епідеміології Кримського державного медичного університету ім. С.І. Георгієвського: “Регіональні клініко-патогенетичні та епідеміологічні аспекти актуальних бактерійних та вірусних захворювань, оптимізація діагностики, лікування і профілактики” наукової проблеми: “Інфекційні хвороби. Вірусологія. Епідеміологія”, шифр 02/21, № держ. реєстрації 0103 U 007102.

На основі приведених вище даних була визначена мета нашого дослідження.

Мета роботи: вивчити роль ліпополісахарид-зв'язуючого білка та імунних зрушень у патогенезі хронічного вірусного гепатиту С.

Відповідно до мети були поставлені наступні завдання:

1. Вивчити клініко-біохімічні особливості перебігу хронічного гепатиту С в динаміці та характер порушень мікрофлори кишечнику з урахуванням активності патологічного процесу.

2. Вивчити стан клітинного і гуморального імунітету та активності фагоцитозу у хворих на хронічний гепатит С в динаміці в залежності від активності процесу та зміни імунних показників під впливом лікування.

3. Вивчити вміст ліпополісахарид-зв'язуючого білка у хворих на ХГС в залежності від ступеня активності клінічного перебігу та гістологічної картини гепатиту.

4. Виявити взаємозв'язок між вмістом ліпополісахарид-зв'язуючого білка та імунними показниками в патогенезі хронічного гепатиту С.

5. На підставі отриманих даних визначити доцільність застосування хілаку і полисорбу в комплексній терапії хронічного гепатиту С.

Об'єкт дослідження. Хворі на хронічний вірусний гепатит С.

Предмет дослідження. Вміст ліпополісахарид-зв'язуючого білка, показники клітинної, гуморальної ланок імунної системи і неспецифічного захисту, морфофункціональний стан печінки.

Методи дослідження. У роботі використані: загальноприйняте клініко-лабораторне обстеження хворих на ХГС; визначення вмісту ліпополісахарид-зв'язуючого білка та маркерів вірусних гепатитів В та С методом імуноферментного аналізу (ELISA); визначення РНК HCV методом полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР), субпопуляційного складу лімфоцитів - в непрямій реакції поверхневої імунофлюоресценції з використанням моноклональних антитіл до антигенів лімфоцитів: СD3+, СD4+, СD8+, СD25+, СD22+, СD16+; оцінка фагоцитарної активності нейтрофілів, рівня ЦІК методом преципітації 3,5% розчином поліетіленгликоля; оцінка гістологічної активності процесу в печінці за результатами аспіраційної пункційної біопсії з використанням індексу гістологічної активності (ІГА), мікробіологічне дослідження вмісту товстої кишки; статистичні методи.

Наукова новизна отриманих результатів. Вперше показана роль ліпополісахарид-зв'язуючого білка в патогенезі ХГС. На основі аналізу імунологічних показників і морфологічних даних виявлені найбільш інформативні імунологічні тести, що дозволяють оцінити тяжкість перебігу гепатиту С. Вперше показаний новий аспект патогенезу ХГС на підставі вивчення взаємодії між характером імунологічних змін, рівнем ліпополісахарид-зв’язуючого білка, титром специфічних антитіл і клінічними проявами захворювання. Вперше показано, що ХГС супроводжується синдромом надмірного зростання умовнопатогенної кишкової мікрофлори, вираженість якого залежить від активності гепатиту.

Вперше визначена можливість використання в динаміці нарівні з активністю трансаміназ, специфічних антитіл, HCV РНК, вмісту ліпополісахарид-зв'язуючого білка і показників імунітету для оцінки ефективності проведеної терапії.

Новим в роботі є патогенетичне обгрунтування доцільності застосування пребіотику “Хілак” і сорбенту “Полісорб” в комплексній терапії хронічного гепатиту С.

Практичне значення отриманих результатів. Встановлені основні особливості клініко-біохімічного перебігу ХГС різного ступеня тяжкості. Показаний взаємозв'язок рівня ліпополісахарид-зв'язуючого білка і імунних зрушень у патогенезі ХГС і запропоновано використати основні імунні показники в оцінці активності перебігу ХГС. Патогенетично обгрунтоване застосування в комплексній терапії ХГС хілаку та полісорбу. Отримані 2 деклараційних патенти України на винаходи: "Спосіб лікування хронічного гепатиту С” Патент № 42537 А Україна, МКИ 7 А61К38/21, А61Р1/16; "Спосіб діагностики імунологічних порушень при хронічному гепатиті С” Патент № 47481 А Україна, МКИ 7 А 61В5/00, 5/145, А 61К38/21.

Результати дослідження та лікування застосовуються в інфекційному відділенні 7-ї міської лікарні м. Сімферополя, кабінетах інфекційних захворювань поліклінік м. Сімферополя, в міських інфекційних лікарнях м. Ялта, м. Севастополь, а також використовуються в навчальному процесі зі студентами та лікарями на кафедрі інфекційних хвороб та епідеміології КДМУ ім. С.І. Георгієвського.

Особистий внесок автора. Автором самостійно вивчена і проаналізована сучасна наукова література і патентна інформація з даної проблеми, проведене клініко-епідеміологічне обстеження хворих, їх відбір і забір матеріалу на імунологічні дослідження, які проводилися в Науково-дослідній лабораторії КДМУ ім. С.І. Георгієвського. Особисто дисертантом проведене визначення рівня ліпополісахарид-зв'язуючого білка в Науково-дослідній лабораторії КДМУ ім. С.І. Георгієвського. Автором персонально проведений статистичний аналіз даних дослідження, інтерпретація отриманих результатів, написані всі розділи дисертації, сформульовані висновки і практичні рекомендації і оформлена робота. В наукових публікаціях результатів дослідження за участю співавторів дисертанту належить основна частина внеску.

Апробація результатів дисертації. Матеріали роботи було представлено та обговорено на засіданні асоціації інфекціоністів Криму в 2001 р. і 2002 р., науково-практичній конференції з міжнародною участю “Инфекционные болезни в практике терапевта” в 2001 р. (м. Харків), на VI з'їзді інфекціоністів України “Клінічні проблеми боротьби з інфекційними хворобами” (м. Одеса) в 2002 р., науково-практичній конференції з міжнародною участю “Современная терапия больных с инфекционной и паразитарной патологией на догоспитальном и госпитальном этапах, методы профилактики” в 2002 р. (м. Харків), на науково-практичній конференції “Вирусные гепатиты с парентеральным механизмом передачи возбудителей и их исходы” (м. Київ) в 2001 р., на науково-практичній конференції з міжнародною участю “Гепатиты в практике терапевта, семейного врача и инфекциониста. Современные методы диагностики и терапии” в 2003 р. (м. Харків), засіданні кафедри інфекційних хвороб і епідеміології КДМУ ім. С.І. Георгієвського.

Дисертаційна робота апробована на спільному засіданні кафедр інфекційних хвороб і епідеміології; шкірних та венерологічних хвороб; кафедри мікробіології КДМУ ім. С.І. Георгієвського.

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 11 наукових праць, з яких 4 опубліковано у виданнях, рекомендованих ВАК України, отримано 2 деклараційних патенти на винахід.

Структура і обсяг дисертації. Дисертація викладена на 155 друкованих сторінках, складається зі вступу, розділів “Огляд літератури”, “Матеріали і методи дослідження”, “Результати власних досліджень”, “Обговорення результатів дослідження”, висновків, практичних рекомендацій, і списку літератури, що містить 199 джерел. Робота ілюстрована 34 таблицями, 22 малюнками і 6 виписками з медичних карток стаціонарних хворих.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріали і методи дослідження. Під нашим спостереженням в період з 1999 по 2004 р. перебував 191 хворий на хронічний вірусний гепатит С у віці від 18 до 65 років (151 хворий на хронічний гепатит С і 40 хворих з мікст-інфекцією хронічний гепатит В+С). З них 144 хворих знаходилися на стаціонарному лікуванні в інфекційному відділенні 7-ї міської лікарні м. Сімферополя, або лікувалися амбулаторно, а 47 хворих (військовослужбовців-призовників) спостерігалися нами в Військово-морському шпиталі ім. Н.І. Пірогова ЧФ РФ (м. Севастополь). Після стаціонарного лікування 144 хворих знаходились під нашим спостереженням протягом 12 місяців.

Серед хворих, що спостерігалися нами, було 145 чоловіків (75,9%) і 46 жінок (24,1%). Найбільш чисельні групи становили хворі на ХГС у віці 18-29 років (114 пацієнтів, 75,5%), переважно - чоловіки. З 40 хворих на ВГВ+С – 31 пацієнт (77,5%) також був вищезгаданого віку.

Діагноз хронічного гепатиту С у 151 хворого встановлювали на підставі клініко-епідеміологічних даних (скарг, епідеміологічного анамнезу, перебігу гепатиту з повторними біохімічними загостреннями та тривало підвищеним рівнем АлАТ, даних об'єктивного обстеження), лабораторно ХГС підтверджувався виявленням анти-НСV IgG і анти-НСVcorеIgM, анти-NS3, -NS4, -NS5 методом ELISA II покоління, виявленням РНК НСV в сироватці крові методом ПЛР. Маркери вірусних гепатитів А (анти-НАV IgM), B (HВsAg, анти-HВcIgM, HВeAg) и D (анти-HDV IgM) в крові обстежених були відсутні. Активність процесу в печінці оцінювалась за результатами аспіраційної пункційної біопсії печінки, яка проводилася 47 хворим сліпим чрезшкірним методом за Менгіні в модифікації (Воробец В.Г. с соавт., 2004) після вивчення функції зсідаючої системи крові і УЗД органів черевної порожнини. Кожний з отриманих біоптатов печінки довжиною від 0,5 до 3,0 см досліджувався з використанням світлооптичного мікроскопу Laboval-4. Крім якісної оцінки стану печінки проводилися гістоморфометричні дослідження за допомогою напівкількісних оцінок, зокрема активності і стадії патологічного процесу в печінці з використанням індексу гістологічної активності (ІГА), запропонованого R. G. Knodell в 1981 р.

Крім того, для діагностики хронічного гепатиту С проводилося тривале спостереження за хворими з повторними клінічними, біохімічними та імунологічними обстеженнями. У 40 хворих крім маркерів хронічного гепатиту С були виявлені маркери вірусного гепатиту В (HВsAg, анти-HВsIgG, анти-HВcIgM, HВeAg). У цьому випадку ставився діагноз мікст-інфекція: хронічний вірусний гепатит В+С.

Визначення ліпополісахарид-зв'язуючого білка (LBP) проводилося методом імуноферментого аналізу (ELISA) за принципом “сендвіч”-варіанта на твердофазному імуноферментному наборі фірми “HyCult Biotechnology” (Нідерланди). Оптична щільність отриманих зразків вимірювалася при 450 нм на спектрофотометрі “ИФА-ОЭП” (Росія).

Для оцінки стану клітинної і гуморальної ланок імунітету проводили визначення субпопуляційного складу лімфоцитів в непрямій реакції поверхневої імунофлюоресценції (НРІФ) з використанням мишачих моноклональних антитіл до антигенів лімфоцитів: СD3+, СD4+, СD8+, СD25+, СD22+, СD16+. Для проведення цих реакцій використовували тест-системи НВО “Препарат” (Н. Новгород, Росія). Визначення загальної кількості циркулюючих імунних комплексів (ЦІК) проводили методом преципітації 3,5% розчином поліетіленгликоля. Фагоцитарна активність нейтрофілів оцінювалася шляхом визначення фагоцитарного числа, фагоцитарного індексу і показника завершеності фагоцитозу.

Виявлення РНК вірусу гепатиту С в сироватці проводилося методом полімеразної ланцюгової реакції за допомогою набору реагентів “Полигеп С” науково-виробничої фірми “Литех” (м. Москва).

Мікробіологічне дослідження на дисбактеріоз товстого кишечнику проводилося за загальноприйнятими методиками (Знаменський В.А. с соавт., 1986).

Інші лабораторні показники визначалися за загальноприйнятими методиками: концентрація загального білірубина та його фракцій - за методом Єндрашика, рівень активності АлАТ, АсАТ – за методом Райтмана-Френкеля.

Отримані дані клінічного обстеження і лабораторних досліджень заносилися в спеціально розроблені карти для хворих на ХГС. Для проведення статистичної обробки матеріалів проводились за допомогою комп'ютерних програм “Excel-2000” та “STATISTICA 5.5” (Statsoft, Inc.). Використовували параметричні критерії (після перевірки на нормальність розподілу у вибірках) та непараметричні критерії. Достовірність відмінності між показниками двох вибірок оцінювали за парними критеріями (Student i Wilcoxon). Різницю вважали достовірною при р<0,05. Кореляційний аналіз провели за методом Спірмена.

Результати досліджень та їх обговорення.

Більшість хворих на ХГС, що проходили стаціонарне лікування, поступали в стаціонар в перші 9 днів від появи симптомів хвороби, найчастіше хворі на ХГС зверталися зі скаргами на слабкість, стомлюваність, зниження апетиту, нудоту. Жовтяниця шкіри та слизових оболонок виявлена у 35,1% хворих, темний колір сечі – у 44,4%, ахолія – у 27,2%. У 32,6% хворих скарги були відсутні і маркери HCV виявляли у них випадково, як правило, при обов'язковому медичному обстеженні (військовослужбовці-призивники), добровільному донорстві або ж з приводу інших захворювань шлунково-кишкового тракту. Прояви мікст-інфекції В+С були виражені більш яскраво, а скарги були відсутні лише у 2,5 % хворих.

Матеріали епідеміологічного аналізу свідчили про те, що найбільше значення в інфікуванні вірусами гепатитів С і В мали внутрішньовенне вживання наркотиків (27,7%) і різні лікувально-діагностичні парентеральні маніпуляції: лікування у стоматолога (26,2%), оперативні втручання (24,1%), інші медичні маніпуляції (гемодіаліз, донорство, ФГДС, колоноскопія та інш.) – 13,1%. У 4,7% хворих конкретні шляхи інфікування не встановлені. Від моменту можливого інфікування за даними епідеміологічного анамнезу (так званої “точки відліку”) до розвитку клінічно значущого гепатиту у більшості хворих на ХГС пройшло в середньому 11,2 ± 4,2 років, при ВГВ+С цей період склав 4,2 ± 1,1 роки. У хворих же, інфікованих при внутрішньовенному вживанні наркотиків, цей період склав 2,5 ± 0,8 роки.

Діагноз хронічного вірусного гепатиту встановлювался відповідно до класифікації Всесвітнього конгресу гастроентерологів (Лос-Анджелес, 1994 р.). Серед хворих на ХГС мінімальна активність встановлена у 106 (70,2%) осіб, слабка – у 39 (25,8%) осіб, помірна - у 6 (4,0%) пацієнтів. Серед хворих на ВГВ+С мінімальна активність захворювання встановлена у 17 (42,5%), слабка – у 10 (25%) і помірна – у 13 (32,5%) пацієнтів.

В наших спостереженнях у хворих на ХГС і ВГВ+С в найбільшому числі випадків незалежно від активності захворювання виявлялася слабкість (66,2% і 97,5% відповідно), зниження апетиту (62,3% і 87,5% відповідно), нудота (53,6% і 77,5% відповідно), досить часто – спленомегалія, непереносимість жирної їжі, зуд шкіри і субфебрильна температура. Симптоми, які вказували на давність і тяжкість ураження печінки: телеангіектазії, пальмарна еритема, виражена венозна сіть передньої черевної стінки, геморагічний синдром - відповідали відсотку виявлення клінічних форм ХГС і ВГВ+С помірної активності. З супутніх захворювань шлунково-кишкового тракту при ХГС і ВГВ+С виявлялись дискінезія жовчовивідних шляхів (7,9% і 7,5 % відповідно), хронічний холецистіт (7,3% і 5% відповідно), хронічний гастродуоденіт (6,0% і 5,0% відповідно), хронічний панкреатит (5,3% і 15% відповідно).

Серед осіб з мінімальною активністю захворювання нормальні біохімічні показники мали 28,5% хворих на ХГС та 2,5% хворих на ВГВ+С. При мінімальній активності показники пігментного обміну страждали мало, однак активність амінотрансфераз була достовірно вище норми (p<0,001) і не корелювала з вираженістю клінічних симптомів. При слабкій і помірній активності як ХГС, так і ВГВ+С всі біохімічні показники (білірубін і його фракції, активність АлАТ) були змінені у багато разів в порівнянні з нормою і вираженість цих змін відповідала активності та клінічним проявам гепатиту.

При обстеженні хворих на ХГС на маркери вірусного гепатиту С на початку спостереження анти-HCV IgG виявлені у всіх хворих, анти-HCVcorеIgM виявлені у 90,7% хворих. Анти-NS3 виявлені у 84,8% хворих, анти-NS4 - у 80,8% хворих, анти-NS5 - у 74,8% пацієнтів. При обстеженні хворих на ВГВ+С на специфічні маркери вірусних гепатитів В та С при надходженні до стаціонару анти-НСV IgG виявлені у всіх пацієнтів, анти-HCVcorеIgM та анти-NS3 – у 77,5% хворих, анти-NS4 виявлені у 75% хворих, анти-NS5 - у 67,5% пацієнтів. HВsAg виявлений у 92,5% пацієнтів, анти-НВсIgM – у 95% хворих, у всіх – анти-НВsIgG.

Аналіз тривалості збереження клінічних проявів захворювання показав, що тривалість основних клінічних симптомів при ХГС не завжди відповідала ступеню активності. Так, при перебігу ХГС мінімальної активності, вираженість всіх клінічних проявів була не така яскрава, але достовірно триваліше зберігались стомлюваність, артралгії, обложеність язика і темний колір сечі, а також, незважаючи на швидку нормалізацію рівня білірубіну, підвищена активність АлАТ зберігалась достовірно довше, ніж при інших ступенях активності. При ВГВ+С вираженість клінічних симптомів і тривалість їх збереження, як правило, відповідали ступеню активності. У той же час, при перебігу ВГВ+С з мінімальною і помірною активністю рівень АлАТ також достовірно більш тривало зберігався підвищеним.

Протягом 12 місяців спостереження за всіма нашими пацієнтами після виписки зі стаціонара, необхідно відмітити, що як серед хворих на ХГС, так і серед хворих на ВГВ+С зі слабкою і помірною активністю хвороби не було ознак клініко-біохімічного загострення. Серед хворих на ХГС з перебігом захворювання мінімальної активності у 7,9% реєструвались періодичні (“хвилеподібні”) підйоми активності АлАТ без порушення пігментного обміну печінки, що не супроводжувались клінічними проявами. Серед хворих на ВГВ+С такий перебіг відмічено у 20,0% пацієнтів. Через 12 місяців спостереження всі біохімічні показники у всіх хворих наблизилися до показників здорових осіб.

Скарги на дискомфорт в області живота після їжі, чергування запорів і послаблення стільця (3-4 рази на день), здуття і буркотиння в животі відмічалися лише в стадії загострення у 9 хворих з мінімальною активністю ХГС, 8 хворих зі слабкою активністю і 5 пацієнтів з помірною активністю ХГС. При обстеженні хворих на ВГВ+С вищезгадані симптоми відмічалися у 6 хворих з перебігом мінімальної активності, 6 хворих з перебігом хвороби слабкої активності і 9 пацієнтів з помірною активністю ВГВ+С. Вказані симптоми є клінічним маркером локалізованої (субкомпенсованої) форми дисбактеріозу кишечнику (класифікація Бабак О.Я., Кушнір І.Е.,1999). У інших хворих на ХГС і ВГВ+С клінічних симптомів дисбактеріозу виявлено не було. Проведене бактеріологічне обстеження показало, що дисбактеріоз I або II ступеня виявлений у 55,5% 65,2% і 100% обстежених хворих на ХГС мінімальної, слабкої і помірної активності відповідно, і у 90%, 99,9% і 100% хворих на ВГВ+С мінімальної, слабкої і помірної активності відповідно. При аналізі мікробного пейзажу товстого кишечнику хворих на ХГС і ВГВ+С відмічено зниження вмісту біфідобактерій, поява гемолітичних ешеріхій і збільшення питомої ваги умовнопатогенних бактерій, іноді - золотистих стафілококів у всіх хворих з виявленим сидромом надмірного зростання кишкової мікрофлори. При слабкій і помірній активності гепатиту крім вищезгаданих змін відмічене також зниження вмісту лактобактерій.

У всіх хворих анти-НСV IgG при первинному обстеженні циркулювали у високих титрах що перевищували нормальний показник оптичної щільності в 4,6 разів при мінімальній, в 3,5 разів при слабкій і в 3,7 разів при помірній активності хвороби. Також виявлявся анти-НСVcorе IgM в 97% випадків в титрах, в 2,8 разів при перебігу мінімальної активності, в 2,5 разів при слабкій активності і в 2 рази при перебігу помірної активності більше нормального показника оптичної щільності. При ВГВ+С крім анти-НСV IgG і анти-НСVcorеIgM, титри яких були підвищені аналогічно ХГС, виявлялися маркери вірусного гепатиту В: HВsAg, концентрація якого при надходженні перевищувала в 11, 7,6 і 9,3 разів негативний показник оптичної щільності при перебігу мінімальної, слабкої та помірної активності відповідно, а також анти-HBcIgM, який виявлявся у 92,5% хворих і титр якого в середньому 3,4 рази перевищував допустимий рівень оптичної щільності. На РНК HCV методом ПЛР було обстежено 102 хворих, (79 хворих на ХГС і 23 хворих на ВГВ+С), з них вірусна HCV РНК була виявлена у 92,4% хворих на ХГС та у 82,6% хворих на ВГВ+С.

Вивчення характеру і глибини порушень імунної системи виявило неоднорідність цих змін, міра вираженості яких багато в чому залежала від активності ХГС і ВГВ+С.

Гостра фаза ХГС характеризувалася імунними зсувами, що стосувались всіх ланок імунітету (мал. 1). Так, Т-клітинний імунітет характеризувався достовірним зниженням CD3+, CD4+, CD8+ лімфоцитів (р<0,05) і особливо чітко вищезгадані зміни були виражені при мінімальній і помірній активності захворювання. Зниження CD3+ лімфоцитів дуже характерно саме для хронічного інфекційного процесу (Караулов А.В., 1999). Цікавий той факт, що співвідношення клітин CD4+/СD8+ (ІРІ) достовірно не відрізнялося від показника здорових осіб, хоча при мінімальній активності виявлене збільшення ІРІ в більшій мірі за рахунок зменшення вмісту саме CD8+ лімфоцитів, які, як відомо, виконують супресорну або кілерну функцію. Враховуючи, що CD4+ і CD8+ лімфоцити є основними імунорегулюючими клітинами нашого організму, їх співвідношення (ІРІ) є дуже важливим показником, що відображає сбалансованість імунної відповіді (Дранник Г.Н., 1999).

Що стосується В-клітинної ланки, то як процентний, так і абсолютний вміст СD22+ лімфоцитів був достовірно знижений при всіх ступенях активності (р<0,001). Як відомо, основною функцією В-лімфоцитов є перетворення в плазматичні клітини при зв’язуванні з антигенами і подальшою секрецією специфічних антитіл, але для цього необхідна участь CD4+ клітин. Вище було показано, що рівень CD4+ клітин достовірно знижений. Очевидно, що і вплив на СD22+ лімфоцити значно менший. Відповідно, це може пояснювати той факт, чому при хронічній HCV-інфекції специфічні антитіла циркулюють в такій малій концентрації, “не встигаючи” зв'язувати циркулюючий вірус, який ще, до того ж, постійно змінює свою антигенну структуру (Соринсон С.Н., 1998). Однак відомо, що CD22+ можуть синтезувати антитіла (тільки класу IgM) без участі CD4+ лімфоцитів, короткочасно циркулюючі в крові без формування імунологічної пам'яті, а стимулом до такого синтезу антитіл може служити збільшення рівня ліпополісахариду грамнегативних бактерій кишечнику в сироватці крові і цей процес контролюється цитокінами (IL-1, IL-6, TNF-), що продукуються макрофагами (Дранник Г.Н., 1999).

Про глибину імунних зрушень свідчить достовірне підвищення рівня ЦІК (р<0,001) і зниження загального числа лімфоцитів, що було найбільш виражено при мінімальній активності ХГС, і свідчить про те, що навіть при малосимптомному клінічніму перебігу хвороби імунні зрушення можуть бути значно виражені. Підвищені рівні ЦІК утворюються при тривалій персистенції антигену (вірусу HCV) в організмі, надалі це створює умови для ураження тканин-мішеней імунними комплексами з приєднанням не тільки аутоімунного компоненту пошкодження гепатоцитів, але й формуванням позапечінкових проявів (Соринсон С.Н. с соавт, 1999, Майер К.-П., 2004).

ХГС мінімальної активності ХГС слабкої активності ХГС помірної активності

ВГВ+С мінімальної активності ВГВ+С слабкої активності ВГВ+С помірної активності

Мал. 1. Порівняння імунних показників хворих на ХГС і ВГВ+С в залежності від ступеня активності і здорових осіб

Показники здорових осіб прийняті за 100%. – показник до лікування, - показник після лікування, - здорові

Першою при попаданні чужерідного антигену в організм реагує неспецифічна ланка імунітету і тому її відповідь є основоположним фактором в подальших взаємовідносинах антиген – антитіло – організм загалом. У наших дослідженнях практично всі компоненти неспецифічного захисту виявилися зниженими: як рівень CD16+ (природних кілерів), відповідальних за лізис вирусінфікованих клітин при відсутності обмеження за головним комплексом гістосумісності (р<0,001), так і фагоцитарне число (р<0,001), показник завершеності фагоцитозу (р<0,05) та при помірній активності – фагоцитарний індекс (р<0,001). Відомо, що подавляти активність природних кілерів і пригнічувати проліферацію В-лімфоцитів можуть великі концентрації ЦІК, що співпадає з даними інших авторів (Никитин И.Г. з соавт, 1999, Абдукадырова М.А., 2002). Про міру активності імунної відповіді організму загалом свідчить достовірне підвищення вмісту активованих Т-, В-лімфоцитів і моноцитів (CD25+) при слабкій і помірній активності ХГС (р<0,001), в той же час знижений вміст CD25+ клітин при мінімальній активності підкреслює меншу вираженість специфічного клітинно-опосередкованого імунітету. Так, за даними Серова В.В. с соавт. (1999), в гепатобіоптатах при ХГС виявлені виражені скупчення в синусоїдах активованих лімфоцитів та моноцитів, що контактують з синусоїдними клітинами печінки. Отже, CD25+ клітини тісно взаємодіють і з макрофагальною системою пошкодженої печінки.

У гострій фазі ВГВ+С спрямованість зміни імунних показників була аналогічною змінам при ХГС (мал. 1).

Однак відмічене більш виражені лімфопенія та пригнічення Т-клітинної ланки, що проявлялося зниженням CD3+, CD4+, CD8+ лімфоцитів при будь-якому ступені активності і підвищенням співвідношення клітин CD4+/CD8+ (ІРІ) при мінімальній та слабкій активності захворювання (р<0,05). Виявлення достовірно більш високих рівнів ЦІК (р<0,05) особливо при помірній активності ВГВ+С можна пояснити більш вираженою аутоімунною реакцією на вірус гепатиту В. Вміст CD25+клітин при помірній активності перебігу ВГВ+С достовірно вищий показника при ХГС (р<0,001). При помірній активності пригнічення фагоцитарної активності нейтрофілів було більш виражено.

Таким чином, імунні зрушення в організмі можна розцінити як вторинний імунодефіцит, що зачіпає як клітинну, так і гуморальну ланки. Це все говорить на користь запального процесу, що продовжується в печінці.

Запальний процес в організмі при хронічному гепатиті проявляється не тільки біохімічними і імунологічний змінами. Передусім, через функціональні зміни гепатоцитів змінюється вміст майже всіх з'єднань, які або метаболізуються, або синтезуються в печінці і також можуть використовуватись як лабораторні маркери, що рано, надійно та ефективно відображають активність запального процесу і ступінь ураження печінки. Для оцінки активності запального процесу в печінці ми вивчали вміст ліпополісахарид-зв'язуючого білка (LBP), який є гострофазним показником, та синтезується гепатоцитами у відповідь на збільшення надходження по воротній вені ліпополісахариду грамнегативної флори кишечнику і грає першорядну роль для швидкої індукції запальної відповіді в організмі, в поєднанні з морфологічним дослідженням гепатобіоптатів у хворих з мінімальними клініко-біохімічними проявами.

Спочатку хворі на ХГС та ВГВ+С також були розподілені за ступенем активності відповідно до класифікації, запропонованої Всесвітнім конгресом гастроентерологів в Лос-Анджелесі (1994 р.) і було досліджено вміст цього білка при різній активності згідно клініко-біохімічним проявам (мал 2).

Мал. 2 Динаміка вмісту LBP при ХГС та ВГВ+С в залежності від ступеня активності

Контрольну групу склали 25 практично здорових донора у віці 28,1 ± 1,5 років (7 жінок і 18 чоловіків), анти-НСV-негативних і анти-HBs-негативних. Рівні LBP були достовірно збільшені як в групі хворих на ХГС, так і в групі хворих на ВГВ+С. Примітно, що вміст LBP чітко відповідав ступеню активності хвороби, яка визначалась за клініко-біохімічними показниками.

Вміст ліпополісахарид-зв'язуючого білка у хворих на хронічний гепатит С в залежності від активності процесу в печінці за результатами морфологічних даних. Як показало дослідження, у хворих на ХГС навіть при трохи зміненому рівні трансаміназ (2-3 норми) гістологічне вивчення гепатобіоптатів виявило зміни, відповідні хронічному запальному процесу помірної, слабкої або мінімальної активності. У підтвердження численим даним інших авторів (Серов В.В. 1997, Подымова С.Д., Постникова Т.Н. 1998, Комарова Д.А., Цинзерлинг В.А. 1999, Никитин И.Г., Ковалев С.Л., Сторожаков Г.И. 1999), активність амінотрансфераз в наших спостереженнях мало корелювала з інтенсивністю патологічного процесу в печінці, хоч про активний інфекційний процес в організмі свідчили специфічні маркери вірусного гепатиту С, що відображають гуморальну відповідь на ушкоджуючу дію вірусу, а виявлення РНК HCV говорило про вірусну реплікацію. Вираженість фіброзу знаходилась в залежності від активності запальної реакції в області портальних трактів і не була пов'язана з інтенсивністю патоморфологічних змін в часточках печінки. Характерними морфологічними ознаками, що зустрічались при НСV-інфекції, були лімфоїдні фолікули в перипортальній сполучній тканині (89,3%). Поява лімфоїдних фолікулів достовірно корелювала з деякими показниками активності запального процесу в області портальних трактів: портальною інфільтрацією (r=0,51; р<0,001), періпортальними некрозами (r = 0,29; р<0,05).

Хворі були розділені на декілька груп за показниками гістологічних змін в гепатобіоптатах. У 1 групу увійшли 10 пацієнтів з помірною активністю, 2 групу склали 13 хворих зі слабкою активністю процесу в печінці, 3 групу - 16 хворих з мінімальною активністю процесу. Отримані результати порівнювали з показниками хворих, що перенесли гострий ВГС, які були віднесені до 4 групи (8 пацієнтів). Однак при біохімічному дослідженні у 1, 2 та 3 групах хворих був виявлений латентний перебіг інфекційного процесу, про що свідчили дані активності трансаміназ і специфічних маркерів НСV. У всіх пацієнтів визначали рівень ліпополісахарид-зв'язуючого білка (LBP) сироватки крові.

Потрібно відмітити, що рівні LBP корелювали з активністю патологічного процесу в печінці за даними пункційної біопсії (табл. 1). Найбільш високий рівень LBP, в 6,1 разів перевищуючий показник контрольної групи, виявлений у хворих з помірною активністю патологічного процесу в печінці (1 група, р<0,001); в 4,5 рази рівень LBP перевищував показник контрольної групи у хворих зі слабкою активністю (2 група, р<0,001); при мінімальній активності процесу (3 група) вміст LBP був вище в 3,3 рази (р<0,001). Примітно, що навіть після перенесеного гострого вірусного гепатиту С (4 група) рівень LBP перевищував показник контрольної групи майже в 2 рази (р<0,05).

Таблиця 1

Рівень LBP (пг/мл) у хворих на ХГС

1 група

(n=10) | 2 група

(n=13) | 3 група

(n=16) | 4 група

(n=8) | Здорові

(n=25)

М | LQ

UQ | М | LQ

UQ | М | LQ

UQ | М | LQ

UQ | М | LQ

UQ

116,58* | 104,35

126,74 | 85,94* | 67,20

92,09 | 62,11* | 48,06

69,97 | 33,45** | 22,75

36,59 | 18,97 | 8,74

23,77

Примітки: M – медіана, LQ – нижній квартіль, UQ – верхній квартіль,

* - рівень значимості при порівняння зі здоровими за критерієм Wilcoxon р<0,001

** - рівень значимості при порівняння зі здоровими за критерієм Wilcoxon р<0,05

Таким чином, при хронічній НСV-інфекції при клініко-біохімічному загостренні у хворих на ХГС і ВГВ+С рівні LBP були достовірно підвищені і корелювали зі ступенем активності хвороби (мал. 2). У той же час при відсутності клінічних ознак загострення і мінімальних біохімічних проявах при хронічній HCV-інфекції гепатоцити синтезують достовірно підвищений рівень LBP (p<0,001), причому цей рівень корелює з активністю морфологічних змін в печінці, відображаючи запальний процес при хронічній HCV-інфекції.

Після проведеного лікування в досліджуваних групах хворих на ХГС та ВГВ+С сталися зміни у вмісті LBP. Як видно з мал. 2, в динаміці рівень LBP достовірно знизився після лікування як в групі хворих на ХГС, так і в групі хворих на ВГВ+С (p<0,001). Однак ні в одній з обстежених груп пацієнтів вміст LBP не досяг показника здорових осіб.

Враховуючи те, що LBP – гострофазний білок, рівень якого підвищується при запальному процесі в організмі, стає очевидним, що в печінці запалення продовжується, хоч інтенсивність його після лікування стала значно менше.

Підвищений синтез LBP у відповідь на поступаючий з кишечнику ліпополісахарид при взаємодії з CD14+ утворює комплекс ліпополісахарид+LBP+CD14, здібний до безпосередньої активації самих природних кілерів (CD16+) через цитокінову систему (IL-1, IL-6, TNF-), чим може бути пояснена наявність прямого кореляційного зв'язку між LBP та СD16+ (r = +0,71). Враховуючи виявлене зниження вмісту CD16+клітин, організму для боротьби з вірусом необхідна стимуляція функціональної активності природних кілерів.

Виявлення прямого зв'язку середньої інтенсивності (r = +0,75) між ЦІК з одного боку та LBP з іншого, швидше усього, пояснюється тим, що обидва показники відображають міру запального процесу. При тривалій персистенції вірусу створюються умови для подальшого формування ЦІК, які виводяться з організму моноцитарно-макрофагальною системою печінки і селезінки. Ці клітини знаходяться в активованому стані, виділяючи значно більшу кількість прозапальних цитокінів (IL-1, IL-6, TNF-) що було доведене Ивашкиным В.Т. і Маммаевым с соавт. (2001) і запропоновано використати їх для оцінки вираженості запального процесу в печінці. Як відомо, IL-1 та IL-6 – це цитокіни, що продукуються головним чином активованими макрофагами і основним їх “внеском” в патогенез запалення є індукція синтезу гепатоцитами білків гострої фази, зокрема LBP. Цим і пояснюється наявність прямого зв'язку (r = +0,67) між CD25+ клітинами та LBP. До того ж комплекс ліпополісахарид+LBP+CD14, що утворюється при зв’язуванні ліпополісахариду, який поступає по воротній вені печінки з кишечнику, сам по собі здібний до активації системи мононуклеарних фагоцитів печінки з подальшим виділенням медіаторів запалення Таким чином, клітини системи мононуклеарних фагоцитів та LBP в складі комплексу ліпополісахарид+LBP+CD14 здібні до взаємної стимуляції, що є однією з причин підтримання запального процесу. Узагальнення даних літератури і власні