ХАРКІВСЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ

ім. В.Н. КАРАЗІНА

ПЕЛЕШЕНКО ГАННА БОРИСІВНА

УДК 577.112.85:616-008.841:612.017.1]-02:612.75:616-002

ФРАГМЕНТИ ФІБРОНЕКТИНУ ЛЮДИНИ І

ЇХ ІМУНОГЛОБУЛІН-ЗВ’ЯЗУЮЧА АКТИВНІСТЬ ЗА НОРМИ І

ПРИ ЗАПАЛЬНИХ ПРОЦЕСАХ В СПОЛУЧНІЙ ТКАНИНІ

03.00.04. – біохімія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Харків-2005

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Дніпропетровській державній медичній академії МОЗ України (м.Дніпропетровськ).

Науковий керівник: доктор біологічних наук, професор

Шевцова Алла Іванівна,

Дніпропетровська державна медична

академія МОЗ України,

професор кафедри біохімії та загальної хімії

Офіційні опоненти: – доктор біологічних наук, професор

Стародуб Микола Федорович,

Інститут біохімії ім. О.В. Палладіна

НАН України,

головний науковий співробітник відділу біохімії

сенсорних і регуляторних систем, (м. Київ)

– доктор біологічних наук, старший науковий співробітник

Клімова Олена Михайлівна,

Інститут загальної та невідкладної хірургії

АМН України,

зав. діагностичною лабораторією

з імуноферментним та радіоізотопним аналізом, (м. Харків)

Провідна установа: Київський національний університет ім. Тараса

Шевченка (кафедра біохімії), м. Київ

Захист відбудеться " " ____________2005 року о __ годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 64.051.17 Харківського національного університету ім. В.Н. Каразіна Міністерства освіти і науки України

(61077, м. Харків, площа Свободи, 4, біологічний факультет, ауд. 3-15).

З дисертацією можна ознайомитися в Центральній науковій бібліотеці Харківського національного університету ім. В.Н. Каразіна Міністерства освіти і науки України

(61077, м. Харків, пл. Свободи, 4).

Автореферат розісланий _____________2005 року

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради Падалко В.І.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Вивченню структури та функцій фібронектину (ФН) присвячено багато досліджень. Цей глікопротеїн плазми крові, екстрацелюлярного матриксу, цереброспинальної, амніотичної та синовіальної рідини, складається з гомологічних амінокислотних послідовностей типу F1, F2 і F3, що організовані у протеазорезистентні домени (Manabe R. et al., 1997). У молекулі ФН є сайти зв’язування фібрину, колагену, гепарину, імуноглобулінів, рецепторів клітинної поверхні та багатьох інших молекул, завдяки чому він проявляє широкий спектр біологічних ефектів (Sharma A. et al., 1999).

Кількість ФН та його функціональна активність змінюється при різних патологічних процесах, особливо у сполучній тканині. Збільшення рівня ФН у сироватці крові спостерігається за умов загрози розриву аорти (Бабаева О.И. и Князева М.В., 2002), а його підвищенний вміст у синовіальній рідині при ревматоїдному артриті відображає локальний запальний процес у суглобі (Homandberg G.A., 1999). ФН відіграє важливу роль у тромботичних, запальних, фібротичних та репаративних процесах у міокарді (Magnusson M. et Mosher D.F., 1998). Слід зауважити, що всі ці роботи стосуються загального ФН без урахування його стану та біологічної активності. Дані щодо ступеня деградації ФН при запальних процесах у сполучній тканині практично відсутні. Лише у роботах D.L. Xie et al. (1992), G.A. Homandberg (1999) обговорюється утворення та участь фрагментів ФН у патогенезі остеоартриту та ревматоїдного артриту, але ці дані стосуються лише ФН синовіальної рідини.

Відомо, що запальні процеси пов’язані з активацією протеолітичних ферментів та утворенням фрагментів ФН. У літературі існують дані стосовно високої чутливості ділянок молекули ФН до дії протеолітичних ферментів (Pankov R. et Yamada K.M., 2002) і її здатності до аутокаталітичного розщеплення (Unger J. et Tschesche H., 1999, Schnepel J. et al., 2001). Продукти деградації ФН здатні ще більше посилювати процеси катаболізму (Stanton H. et al., 2002, Yasuda T. et Poole A.R., 2002). Так, фрагмент ФН з молекулярною масою 27 кДа розщеплює нативний ФН та його фрагменти (Schnepel J. et al., 2001). Ступінь деградації ФН може мати більше діагностичне та прогностичне значення щодо розвитку патологічного процесу, ніж визначення загального вмісту ФН. Поява у міжтканинній рідині фрагментів ФН 93 і 125 кДа є характерною ознакою варикозної виразки (Grinell F. et Zhu M., 1996), а фрагменти 40, 68 і 120 кДа з’являються у гінгівальній рідині при періодонтиті (Huynh Q.N. et al., 2002).

Відзначають також здатність ФН взаємодіяти з імуноглобулінами, але дослідникі обмежуються лише констатацією цього факту (Rostagno A.A. et al., 1991, Васильев С.А. и др., 1996), молекулярні механізми утворення ФН-імуноглобулінових комплексів не розглядаються. Між тим, зміни стану ФН за умов запального процесу у сполучній тканині повинні впливати на його опсонічну активність. Фрагменти ФН можуть входити до складу імунних комплексів. Так, фрагменти ФН виявляються у складі ПЕГ-преципітатів синовіальної рідини при ревматоїдному артриті та остеоартриті (Barilla M.L. et Carsons S.E., 2000), вони беруть участь у формуванні комплексів з імуноглобуліном A та відкладанні їх на поверхні екстрацелюлярних структур при IgA нефропатії (Waga S. et al., 1999). Нещодавно встановлено, що при прееклампсії у складі ФН-імуноглобулін G (ФН-IgG) комплексів присутні певні фрагменти ФН, хоча загальна кількість циркулюючих імунних комплексів не змінюється (Маслак Г.С. та Бразалук О.З., 2003). Однак, роль фрагментів ФН у регуляції запальних процесів у сполучній тканині та опсонізації імунних комплексів залишається не з’ясованою.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертація виконана в рамках науково-дослідної роботи кафедри біохімії та загальної хімії Дніпропетровської державної медичної академії МОЗ України "Дослідження глікокон’югатів як біохімічних маркерів патологічних станів" (N держреєстрації 0100 U 00 05-91).

Мета і задачі дослідження. Метою роботи є оцінка ступеня фрагментованості фібронектину, його імуноглобулін-зв’язуючої активності в умовах норми та запального процесу у сполучній тканині людини та обґрунтування на цій основі ролі окремих фрагментів фібронектину в утворенні та елімінації імунних комплексів.

Для реалізації поставленої мети передбачалося розв’язання таких задач:

1.

2.

3.

4.

5.

6.

Об’єкт дослідження. Роль фібронектину в забезпеченні захисних реакцій.

Предмет дослідження. Фрагменти фібронектину людини та їх здатність взаємодіяти з імуноглобулінами G в умовах норми та гострого чи хронічного запального процесу в сполучній тканині.

Методи дослідження. Афінна хроматографія, диск-електрофорез у ПААГ, імуноферментний аналіз, імуноелектрофорез, імуноблот, імунодот, ПЕГ-преципітація, імунотурбодиметричний аналіз.

Наукова новизна одержаних результатів. Робота містить нові дані щодо стану ФН та біологічної активності окремих фрагментів ФН. Встановлено підвищення ступеню деградації плазмового ФН при гострому (ГЗП) та хронічному запальних процесах (ХЗП) у сполучній тканині порівняно з нормою. Знайдені загальні закономірності деградації ФН за умов запального процесу, зокрема появу фрагментів 120 кДа, та відмінності у спектрі фрагментів плазмового ФН, що є характерними для стадії запального процесу та його тривалості, тобто підвищення частоти виявлення фрагментів 140-100 і 19-15 кДа на стадії альтерації ГЗП, підвищення кількості фрагментів 95-90 кДа на стадії ексудації ГЗП та нормалізація стану ФН та зникнення його низькомолекулярних форм на стадії репарації ГЗП.

Доведено, що фрагменти ФН, які утворюються при запальних процесах у сполучній тканині, здатні неспецифічно зв’язуватися з імуноглобулінами і включатися до імунних комплексів. При ХЗП збільшується імуноглобулін-зв’язуюча активність окремих фрагментів ФН, особливо його низькомолекулярних форм (35-15 кДа).

У роботі вперше показано, що зі збільшенням віку людини спостерігається підвищення ступеня деградації вільного ФН на стадії альтерації ГЗП, підвищення частоти виявлення високо- (175-160 кДа) і середньомолекулярних фрагментів (140-130 кДа) вільного ФН і підвищення ступеня деградації зв’язаного з IgG ФН, особливо поява фрагментів 35-15 кДа, при ХЗП.

Одержано докази впливу нефракціонованого (НФГ) та низькомолекулярного гепарину на ступінь фрагментованості вільного та зв’язаного з імуноглобулінами ФН при ГЗП у сполучній тканині, що поширює уявлення про біохімічні механізми дії цих препаратів.

Теоретичне та практичне значення одержаних результатів. Отримані в роботі результати доповнюють сучасні дані про механізми розвитку реакцій неспецифічного захисту і вказують на важливе значення взаємодій ФН-IgG у формуванні та елімінації імунних комплексів при запальних процесах у сполучній тканині. Збільшення кількості та фрагментованості ФН у складі імунних комплексів на тлі незмінного вмісту плазмового ФН та циркулюючих імунних комплексів (ЦІК) є доказом підвищення імуноглобулін-зв’язуючої активності ФН та його фрагментів при запальних процесах у сполучній тканині. Аналіз ступеня фрагментованості ФН при системній склеродермії та гострому Q інфаркті міокарда (QІМ) свідчить про активацію різних протеолітичних ферментів при ГЗП та ХЗП у сполучній тканині. На підставі отриманих результатів розроблено схему, яка демонструє роль фрагментів ФН у механізмах розвитку запальних реакцій.

Результати роботи використовуються в курсі лекцій з біохімії для студентів ДДМА (розділ "Біохімія згортальної системи крові"). Вони мають практичне значення, оскільки є основою для створення методів діагностики, прогнозування перебігу захворювання та моніторингу ефективності терапевтичних засобів при захворюваннях, пов’язаних із запальними процесами у сполучній тканині.

Особистий внесок здобувача. Вибір теми дисертаційної роботи, встановлення мети та задач, обговорення результатів дослідження проведено спільно з науковим керівником. Дисертантка провела аналіз наукової літератури за цією проблемою. Усі експериментальні дослідження автором здійснені самостійно на базі кафедри біохімії та загальної хімії ДДМА.

Апробація результатів дисертації. Основні положення дисертаційної роботи доповідалися на Всеукраїнській науково-практичній конференції "Біохімія" (Дніпропетровськ, 2003); Міжнародній науково-практичній конференції "Україна наукова’ 2003" (Дніпропетровськ-Харків, 2003); Науково-практичній конференції, присвяченій 80-річчю від дня народження члена-кореспондента АМН СРСР, професора О. Й. Грицюка і 25-річчю Київського міського центру кардіології і ревматології (Київ, 2003); Установчому з’їзді Українського товариства клітинної біології (Львів, 2004); III Львівсько-Люблінській конференції з експериментальної та клінічної біохімії (Львів, 2004); 29th Meeting of the Federation of the European Biochemical Societies (Warsaw, 2004); VII Національному конгресі кардіологів України (Дніпропетровськ, 2004).

Публікації. Результати дисертації опубліковано у 7 статтях, серед яких 4 опубліковано у фахових виданнях, що затверджені ВАК України, та в 10 тезах доповідей.

Структура та обсяг дисертації. Дисертація викладена на 122 сторінках друкованого тексту і складається зі вступу, 5 розділів – огляду літератури, матеріалів і методів дослідження, результатів досліджень, обговорення результатів досліджень, заключної частини, висновків, списку використаної літератури, що містить 206 джерел. Дисертація ілюстрована 12 таблицями та 27 рисунками.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

ОГЛЯД ЛІТЕРАТУРИ

В огляді літератури представлено опис структури та функцій ФН людини та його фрагментів. Наведено біохімічні механізми запальних процесів у сполучній тканині. Представлено дані щодо участі ФН та його фрагментів у розвитку імунокомплексного та запального процесів.

МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ

Матеріалом дослідження була плазма крові 45 умовно здорових донорів (1 група), 21 хворого з ХЗП (системна склеродермія) (2 група) та 32 хворих з ГЗП (гострий QІМ) (3 група). Характеристика груп за віком і статтю наведена у табл. 1.

Гострий QІМ та системну склеродермію розглядали як модель для вивчення стану та біологічної активності ФН за умов відповідно ГЗП та ХЗП у сполучній тканині людини. Загальною ознакою захворювань є порушення мікроциркуляторного русла, що є мішенню і в той же час ареною патологічного процесу (Гусева Н.Г., 1993, Крижанівський В.О., 2000). Рандомізовані за міжнародними стандартами зразки крові пацієнтів 2 та 3 груп були люб’язно надані співробітниками кафедр госпітальної терапії №1 та №2 Дніпропетровської державної медичної академії.

Таблиця 1

Загальна характеристика досліджуваних груп

Група | Жінки | Вік, роки

(M±m) | Чоловіки | Вік, роки

(M±m)

Здорові донори

(1 група, n=45) | 27 | від 21 до 71 (46,00±2,87) | 18 | від 38 до 71

(50,67±2,21)

Хронічний запальний процес

(2 група, n=21) | 21 | від 17 до 51

(39,89±4,43) | - | -

Гострий

запальний процес

(3 група, n=32) | 9 | від 53 до 78

(67,17±3,84) | 23 | від 33 до 77

(56,08±2,45)

Наявність запального процесу була підтверджена у клінічній лабораторії за показниками ШОЕ, фібриногену, абсолютної кількості лейкоцитів, інтерлейкінів. У 2 групі показник ШОЕ складав 15,45±3,60 мм/ч. У 3 групі при надходженні до лікарні рівень IL-6 складав 35,27±4,76 пг/мл, показник абсолютної кількості лейкоцитів – 9,71±0,35 Г/л, рівень фібриногену – 3,86±0,12 г/л

У 3 групі забір крові та подальші дослідження проводили згідно з міжнародною програмою досліджень "Extract TIMI 25" тричі: при надходженні до лікарні, тобто до початку тромболітичної терапії альтеплазою і стрептокіназою згідно з стандартною схемою, після закінчення активної антитромбінової терапії з використанням НФГ та низькомолекулярного гепарину на 8 добу захворювання та наприкінці госпітального періоду на 21 добу від початку захворювання.

Отримання фібронектин-імуноглобулінових комплексів. Виділення комплексів ФН-IgG з кожного зразка плазми крові проводили за допомогою афінної хроматографії на протеін-G-сефарозі НР та желатин-агарозі. На рис. 1 представлено основні етапи цього процесу.

Рис. 1. Схема отримання вільного фібронектина та фібронектин-імуноглобулінових комплексів. Примітки: F1 – білки, що не містять IgG; F2 – імунні комплекси; F3 – F5 – білки, що не зв’язуються або слабо зв’язуються з желатином; F6 – ФН, зв’язаний з IgG; F7-F9 – білки, що не зв’язуються або слабо зв’язуються з желатином; F10 – вільний ФН.

Наявність ФН та IgG у білкових фракціях визначали методом імунодоту з використанням специфічних антитіл, кон’югованих з пероксидазою хрону. Контроль виділення білка проводили на спектрофотометрі СФ-26 при довжині хвилі 280 нм.

Імунохімічний аналіз. Визначення вмісту ФН у білкових фракціях проводили методом імуноферментного аналізу з використанням тест-системи (НВО Иммунотех, Росія) та ракетного імуноелектрофорезу.

Кількість імуноглобулінів у плазмі крові оцінювали методом ІФА з використанням тест-систем (Гранум, Україна), а також методом імунотурбодиметрії з використанням тест-набору (Human, Німеччина).

Фрагменти ФН визначалися методом вестерн-блотингу після електрофорезу за методом U.K. Laemmli (1970). Для негативного та позитивного контролю для ФН плазми крові людини використовували відповідні стандарти із тест-набору ІФА-ФН (HBO Иммунотех, Росія).

Визначення кількості ЦІК проводили за методом ПЕГ-преципітації за модифікацією П.В. Стручкова и др. (1985). Як калібратор використовували термоагреговані імуноглобуліни.

Усі біохімічні дослідження були проведені особисто автором з використанням хімічно чистих реагентів фірм Sigma (США), Serva (США), Chemicon (США), DAKO (Данія), Merk (Німеччина), Amersham Pharmacia Biotech Limited (Швеція), Chemapol (Чеська республіка), Гамалея (Росія), Лектинотест (Україна), СінБіас (Україна), BioRad (США).

Статистична обробка результатів дослідження проводилася з використанням параметричного критерію Стьюдента та непараметричного критерію Вілкоксона-Манна-Уїтні. Критерій Стьюдента застосовувався для відхилення гіпотези про однаковий закон розподілу виборок досліджуваних груп. У випадку малих виборок та за умов відсутності нормального розподілу експериментальних даних використовувався критерій Вілкоксона-Манна-Уїтні.

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

Фрагменти фібронектину людини та їх імуноглобулін-зв’язуюча активність за норми

Спектр фрагментів ФН плазми крові та фракцій F2 і F6 здорових людей представлено на рис. 2.

Як видно з рисунку, ФН плазми крові був представлений в основному субодиницями нативного ФН 220 кДа. Разом з тим, від 10 до 70% досліджуваних зразків містили фрагменти в межах 190-130 і 110-20 кДа, тобто частина молекул ФН була деградована. Ці дані узгоджуються з поданими у літературі відносно високої чутливості ФН до дії протеолітичних ферментів (Tressel T. et al., 1991, Pankov R. et Yamada K.M., 2002).

Частота виявлення окремих фрагментів у фракції F2, що містить імунні комплекси, коливалась від 20 до 100%. У 40% зразків виявлені фрагменти 120 кДа, які відсутні у плазмі крові. Характерною ознакою була відсутність фрагментів ФН 150 і 59-40 кДа у цій фракції.

Слід відзначити, що у складі комплексів ФН-IgG (фракція F6) частота виявлення субодиниці нативного ФН знижується на 40%, а всіх інших фрагментів, за винятком 175-160 і 49-40 кДа, – підвищується на 20-80% порівняно з плазмою крові.

Рис. 2. Фрагментованість вільного та зв’язаного з імуноглобулінами ФН за норми (1 група, n=45). Примітки: F2 – імунні комплекси; F6 – ФН, зв’язаний з IgG.

У 70% зразків виявляються нові фрагменти 120 кДа, а фрагменти 150 і 35-20 кДа навпаки відсутні. Одержані дані можуть вказувати на IgG-зв’язуючу здатність окремих фрагментів ФН. Згідно з даними A. Rostagno et al. (1991, 1996), у молекулі ФН існує кілька сайтів зв’язування IgG, один з яких є фізіологічно активним і міститься у структурі NH2-термінального домену. Наявність цього сайту у структурі окремих фрагментів ФН може впливати на спорідненість ФН до IgG.

Наявність фрагментів ФН 140-130 кДа у 100% здорових донорів як у складі фракції F2, так і у складі фракції F6 може свідчити про те, що ці фрагменти беруть участь у формуванні імунних комплексів. Фрагменти ФН 190-180 і 95-90 кДа виявляються у 100 % здорових людей у складі ФН-IgG комплексів, тобто ці фрагменти проявляють найбільшу спорідненість до IgG за норми. Згідно з даними J.L. Czop et al., фрагменти 190-180 кДа мають опсонічну активність (1985). На наш погляд, фрагменти ФН, виявлені у складі фракцій F2 і F6, можуть впливати на опсонізацію, фагоцитоз та елімінацію імунних комплексів в умовах норми.

Слід відзначити, що із збільшенням віку жінок спостерігається поширення спектру фрагментів ФН за рахунок низькомолекулярних форм. У чоловіків різного віку фрагменти 140-130 кДа не виявляються.

Стан фібронектину та його імуноглобулін-зв’язуюча активність за умов хронічного запального процесу

Кількість та фрагментованість вільного і зв’язаного з IgG ФН було досліджено на тлі системної склеродермії – системного захворювання сполучної тканини, що супроводжується ХЗП у цій тканині (Гусева Н.Г., 1993). Біологічний сенс фракцій F2 і F6 полягає в тому, що вони демонструють як відбувається формування імунних та ФН-IgG комплексів при ХЗП. Нас цікавило, які зміни кількості та фрагментованості ФН у складі цих комплексів супроводжують ХЗП.

Оцінка кількості ФН у плазмі крові здорових донорів (1 група) та при наявності ХЗП у сполучній тканині (2 група) свідчить про відсутність достовірних змін: концентрація ФН становить 234,05±49,11 мкг/мл у 1 групі, 265,01±22,73 мкг/мл – у 2 групі. Кількість IgG навпаки підвищена у 2 групі і становить 24,41±0,92 г/л проти 15,34±0,84 г/л у нормі (р<0,01). Інша картина має місце при аналізі складу ФН-IgG комплексів (табл. 2).

Таблиця 2

Кількісний аналіз ФН-IgG комплексів за норми (1 група) та при хронічному запальному процесі (2 група) у сполучній тканині

Показники | 1 група (n=45)

M±m | 2 група (n=21)

M±m | Співвідношення параметрів 2-ї та 1-ї груп

ФН, мкг/мл | 0,39±0,033 | 3,10±0,28* | 7,95

IgG, г/л | 4,74±0,32 | 10,01±0,95* | 2,11

ФН/IgG, мкг/мг | 0,09±0,005 | 0,36±0,04* | 4

Примітка. * – зміни достовірні стосовно 1 групи згідно з U-критерієм Вілкоксона-Манна-Уїтні (p<0,01).

За результатами наших досліджень при ХЗП у фракції F6 збільшується кількість ФН та IgG, причому співвідношення ФН/IgG є достовірно у 4 рази вищим, ніж за норми. Збільшення вмісту ФН у складі комплексів ФН-IgG може свідчити про підвищення IgG-зв’язуючої активності ФН за умов ХЗП.

Фрагментованість ФН було досліджено за допомогою вестерн-блот аналізу. Одержані результати свідчать про зміни у спектрі та частоті виявлення окремих фрагментів вільного ФН та про підвищення ступеня фрагментованості зв’язаного з IgG ФН при ХЗП (рис. 3 та 4).

Рис. 3. Фрагментованість вільного фібронектину людини за умов норми (1 група) та хронічного запального процесу (2 група)

Привертає увагу суттєве збільшення частоти виявлення фрагментів ФН 175-160 і 140-130 кДа та поява фрагментів 120 кДа (рис. 3). Частота виявлення фрагментів 150 і 95-75 кДа навпаки знижується в 2-й групі відносно такого показника в 1 групі.

Зміна частоти виявлення та поява окремих фрагментів вільного ФН у досліджуваних 2 групи свідчать про активацію протеолітичних ферментів плазми крові та екстрацелюлярного матриксу в умовах хронічного запалення. Згідно з даними у літературі, фрагменти ФН 175-160 кДа утворюються під дією триптази (Kaminska R. et al., 1999). Фрагменти 140, 75, 60, 35 кДа, кількість яких підвищується у складі комплексів ФН-IgG, є продуктами дії катепсину D, еластази, трипсину, хімотрипсину та термолізину (Tressel T. et al., 1991, Homandberg G. A., 1999).

У складі комплексів ФН-IgG (фракція F6) спостерігається підвищення частоти виявлення майже всіх фрагментів ФН, крім 190-160 та 49-40 кДа (рис. 4).

Рис. 4. Фрагментованість вільного та зв’язаного з IgG фібронектину за умов хронічного запального процесу у сполучній тканині людини (2 група, n=21)

Виявлені фрагменти вільного та зв’язаного з IgG ФН проявляють певну біологічну активність. Так, фрагменти ФН 175-160 кДа можуть містити клітину-зв’язуючий сайт (Ruoslahti E. et al., 1981), а фрагмент 140 кДа, частота виявлення якого у плазмі крові при ХЗП перевищує такий показник за норми, бере участь у регуляції звільнення еластази моноцитів (Xie D.L. et al., 1993). Інші фрагменти ФН, зокрема 120 та 72 кДа, проявляють хемотаксичну активність (Trial J. et al., 1999), тому можуть впливати на розвиток запального процесу. Фрагменти 140 і 50 кДа впливають на експресію матриксних протеїназ-1, -13 та стромелізину і через те індукують катаболізм колагену та агрегану сполучної тканини при артритах (Homandberg G.A., 1999, Stanton H. et al., 2002). Також існують дані у літературі про те, що фрагмент 60 кДа може мати спорідненість до желатину (McDonald J.A. et Kelley D.G., 1980), а фрагмент 35 кДа може мати мітогенну активність (Savill C.M. et Ayad S.R., 1986). Отже, дискретні біологічно активні фрагменти ФН можуть відображати зміну взаємодії й руху клітин та деградацію тканин у місцях запалення. Включення перелічених вище фрагментів ФН до складу ФН-IgG комплексів, на наш погляд, є адаптивною реакцією організму за умов хронічного запалення, спрямованого на зменшення катаболізму протеїнів ЕЦМ, зокрема й ФН.

Підвищення в 2-й групі частоти виявлення середньо- та низькомолекулярних фрагментів зв’язаного з IgG ФН може бути результатом залучення їх із плазми крові до складу комплексів ФН-IgG та свідчить про збільшення ступеня спорідненості їх до IgG. Цей факт є доказом участі цих фрагментів у формуванні імунних комплексів при ХЗП у сполучній тканині.

Порівняння стану ФН у складі ФН-IgG комплексів у 1-й та 2-й групі досліджуваних виявило, що при ХЗП у сполучній тканині має місце поширення спектру фрагментів ФН за рахунок низькомолекулярних фрагментів 35-15 кДа, а також збільшення частоти виявлення фрагментів 72-60 і 49-40 кДа (рис. 5). Зміна частоти виявлення фрагментів ФН, особливо наявність фрагментів 35-15 кДа у складі комплексів ФН-IgG у 2-й групі, свідчить про зміну спорідненості ФН до імуноглобулінів при ХЗП.

Рис. 5. Частота виявлення (%) фрагментів ФН у фракції F6 за норми (1 група) та при хронічному запальному процесі (2 група) у сполучній тканині.

Ми вважаємо, що підвищення IgG-зв’язуючої активності фрагментів 72-60, 49-15 кДа обумовлено експонуванням у них відповідних сайтів. Згідно з даними A.A. Rostagno et al. (1991), у молекулі ФН серед декількох сайтів зв’язування IgG фізіологічно активним є тільки один. Однак просторове складання утворених фрагментів ФН може призводити до активації у їх структурі також інших сайтів зв’язування IgG та впливати на спорідненість фрагментів до IgG.

Таким чином, отримані дані свідчать про зміну фрагментованості вільного та зв’язаного з IgG ФН. Виявлені зміни ФН у 2 групі є наслідком активації протеолізу за умов ХЗП і свідчать про участь фрагментів ФН у запальних процесах. Кількісні та якісні зміни у складі комплексів ФН-IgG при ХЗП у сполучній тканині можуть впливати на функції ФН, зокрема на опсонізуючу та імуноглобулін-зв’язуючу активність.

При аналізі фрагментованості ФН за умов ХЗП у сполучній тканині слід ураховувати вікові відмінності (табл. 3).

Таблиця 3

Вікові особливості спектру фрагментів фібронектину за умов хронічного запального процесу в сполучній тканині

Вік

(роки) | Фрагменти ФН (кДа)

Вільний ФН* | ФН, зв’язаний з IgG**

17-28 | (–) 150, 110-90

(+) 120, 72-20

175-160 | (–) 150, 35-20

(+) 110-75

72-60

40-51 | (–) 80-75, 35-20

(+) 120

175-160, 140-130

150, 59-50 | (–) 150

(+) 80-75, 35-15

120-100, 59-50

95-90

Примітки: – підвищення; – зниження; (–) – відсутність; (+) – присутність;

* – порівняно з нормою; ** – порівняно з вільним ФН при ХЗП у жінок

У таблиці 3 представлені результати досліджень фрагментованості вільного ФН у жінок різних вікових груп при ХЗП порівняно із нормою. Встановлено, що при ХЗП у жінок віком від 17 до 28 років зменшується кількість фрагментів 175-160 кДа та поширюється спектр фрагментів вільного ФН за рахунок 120 кДа і низькомолекулярних фрагментів, у той час як у віці від 40 до 51 року спостерігається протилежна картина.

Виявлені зміни свідчать, що активність протеолітичних систем при ХЗП залежить від віку. З віком змінюється й IgG-зв’язуюча активність окремих фрагментів ФН. Якщо у молодих жінок ця функція найбільшою мірою притаманна фрагментам 72-60 кДа, то у жінок віком від 40 до 51 року у складі ФН-IgG комплексів превалюють фрагменти ФН 120-100 та 59-50 кДа. Слід відзначити також, що у старшій групі фрагменти 80-75 та 35-20 кДа присутні тільки у складі ФН-IgG комплексів. Вікові розбіжності IgG-зв’язуючої активності перелічених вище фрагментів ФН можуть бути обумовлені різницею у просторовій конформації сайтів зв’язування IgG на цих фрагментах. На жаль, застосований нами метод імуноблоту не дає однозначної відповіді на це питання.

Фібронектин та його імуноглобулін-зв’язуюча активність за умов гострого запального процесу у сполучній тканині

Стан ФН та його імуноглобулін-зв’язуюча активність досліджувались у 32 хворих (3 група) на гострий QІМ, тобто інфаркт міокарда, що супроводжується розвитком патологічного зубця Q на електрокардіограмі (Крижанівський В.О., 2000). Згідно з сучасними поглядами, розвиток інфаркту міокарда призводить до виникнення системної та локальної запальної реакції на місці ушкодження (Чукаева И.И. и др., 2000). Дослідження проводилися тричі: у 1 добу захворювання, що відповідає стадії альтерації, через тиждень (стадія ексудації) та наприкінці госпитального періоду, тобто на стадії репарації. Результати цих досліджень представлені на рис. 6.

Рис. 6. Фрагменти вільного фібронектину за умов норми та за умов гострого запального процесу в сполучній тканині людини.

Одержані нами результати свідчать про значне підвищення ступеня деградації вільного ФН на стадії альтерації за рахунок зниження нативного ФН (з молекулярною масою 220 кДа), появи фрагментів з молекулярною масою 120 і 19-15 кДа і збільшення кількості фрагментів 140-130 і 110-100 кДа.

На 8 добу, тобто на стадії ексудації, зменшується кількість фрагментів ФН 140-130 і 110-100 кДа внаслідок включення їх до ФН-IgG комплексів та збільшується кількість фрагментів 95-90 кДа, але практично не змінюється частота виявлення низькомолекулярних форм. Виявлені зміни відбуваються тільки після застосування НФГ, але не низькомолекулярного гепарину. Окреме функціональне навантаження має фрагмент 90 кДа. За даними M. Gonzalez-Gronow et al. (1993), цей фрагмент утворюється внаслідок дії плазміну та має стрептокіназну активність. Підвищення частоти виявлення цього фрагменту ймовірно є наслідком застосування тромболітичних препаратів, що беруть участь в активації плазміну. У свою чергу, стрептокіназна активність цього фрагменту призводить до включення системи фібринолізу шляхом активації плазміну за механізмом зворотного зв’язку.

Фаза репарації характеризується нормалізацією стану ФН та зникненням низькомолекулярних фрагментів. Як уже було відзначено, фрагмент 120 кДа може брати участь в активації запальних процесів. Зниження частоти виявлення цього фрагменту вказує на завершальну стадію ГЗП. Не виявляється також 90 кДа-фрагмент, що може відображати стан рівноваги систем зсідання та фібринолізу. Ці зміни можуть свідчити про завершення процесів розчинення тромбу та про позитивний вплив антитромботичних препаратів.

Дослідження стану вільного ФН у 1 добу дозволяє прогнозувати перебіг патологічного процесу. Як видно з рис. 7, для всіх типів ускладнень характерне збільшення ступеня деградації вільного ФН, причому спектр фрагментів має свої особливості при кожному з розглянутих ускладнень.

Рис. 7. Фрагменти вільного фібронектину у 1 добу гострого запального процесу залежно від подальшого перебігу процесу.

Для тромботичних ускладнень характерним є відсутність фрагментів 190-180, 80-75 і 59-40 кДа порівняно зі спектром фрагментів вільного ФН за відсутності ускладнень. За умов загальних ускладнень у фракції вільного ФН підвищується частота виявлення фрагментів 190-150, 110-100, 80-75 і 49-40 кДа, а у 50% випадків спостерігається поява 19-15 кДа. Відомо, що фрагменти 190-180 кДа мають опсонічну активність (Czop J.L. et al., 1985). Слід також відзначити фрагменти 19-15 кДа. За даними A.A. Rostagno et al. (1999), вони відповідають ФН-фібриновим взаємодіям, що мають вирішальне значення у зміцненні тромбів та репарації тканин. Таким чином, перелічені фрагменти мають різне функціональне навантаження за умов ГЗП у сполучній тканині.

Ступінь деградації ФН залежить не тільки від фази ГЗП у сполучній тканині, але й має певні вікові розбіжності (табл. 4). Якщо порівняти спектр фрагментів вільного ФН на різних стадіях ГЗП з нормою у різних вікових групах, то слід відзначити, що у 1 добу (стадія альтерації) у чоловіків похилого віку значно зменшується кількість нативної субодиниці ФН 220 кДа та деяких середньо- та низькомолекулярних фрагментів.

Парадоксальна реакція спостерігається на 8 добу, тобто у фазі ексудації. У чоловіків віком від 62 до 71 року відбувається зменшення ступеня деградації ФН, відновлення нативної субодиниці 220 кДа та збільшення кількості фрагментів 175-150 кДа, тоді як у плазмі крові чоловіків віком від 37 до 55 років збільшується кількість низькомолекулярних фрагментів порівняно з цими показниками у 1 добу захворювання.

Таблиця 4

Вікові та статеві особливості спектру фрагментів вільного фібронектину за умов гострого запального процесу в сполучній тканині (3 група)

Вік

(роки) | Фрагменти ФН (кДа)

Чоловіки (n=22) | Жінки (n=6)

Стадія альтерації | Стадія ексудації | Стадія альтерації

37-55 | (–) 95-90, 72-60, 49-40

(+) 140-100, 19-15

150

80-75, 59-50 |

(+) 95-90, 72-60, 49-40

низькомолекулярні | -

62-71 |

(+) 190-180, 140-100

220, 95-90, 72-50,

35-20 | (–) 72-50, 35-20

(+) 19-15

220, 175-150

140-130, 110-100 | (–) 72-50

(+) 190-180, 140-100,

35-15

150

95-90, 49-40

Примітки: – підвищення; – зниження; (–) – відсутність; (+) – присутність.

Вищий ступінь деградації ФН у чоловіків похилого віку, на наш погляд, є наслідком превалювання процесів катаболізму, а відмінності в спектрі та частоті виявлення фрагментів ФН на 8 добу захворювання свідчать про вікові розбіжності у стані протеолітичних систем та взаємодії фрагментів ФН з гепарином.

Порівняльний аналіз стану фібронектину за умов гострого та хронічного запальних процесів у сполучній тканині

Аналіз літературних джерел свідчить, що при дослідженні захисної та опсонуючої функції ФН розглядається лише нативний ФН і не враховується біологічна активність окремих фрагментів ФН. За одержаними в роботі результатами, загальна кількість ФН, імуноглобулінів та ЦІК практично не змінюється при запальних процесах у сполучній тканині (табл. 5) порівняно із нормою.

Таблиця 5

Вміст фібронектину, імуноглобулінів G і циркулюючих імунних комплексів у плазмі крові за норми (1 група), при хронічному (2 група) та гострому (3 група) запальних процесах у сполучній тканині

№ групи | n | ФН, мкг/мл

M±m | IgG, г/л

M±m | ЦІК, мг/мл

M±m

1 | 45 | 234,05±14,04 | 15,34±0,84 | 1,31±0,09

2 | 21 | 265,01±22,73 | 24,41±0,92* | 1,27±0,11

3 | 32 | 221,70±13,05 | 14,76±0,51 | 1,23±0,10

Примітка. * – зміни достовірні стосовно 1 групи згідно з U-критерієм Вілкоксона-Манна-Уїтні (p<0,01).

Виняток становить тільки підвищення концентрації IgG майже на 60 % за умов ХЗП, але збільшення IgG має місце при багатьох хронічних захворюваннях.

Значно більшу інформацію про механізми захисних реакцій ФН дає порівняння стану ФН при ГЗП та ХЗП у сполучній тканині. Як видно з рис. 3 та рис. 6, ступінь деградації вільного ФН є більш високим при ГЗП, ніж при ХЗП у сполучній тканині, оскільки збільшується кількість окремих фрагментів ФН та поширюється спектр за рахунок появи фрагментів 19-15 кДа. Крім того, зменшується кількість фрагментів 220 кДа, що відповідають нативній субодиниці ФН. Неоднакова частота виявлення фрагментів ФН при розглянутих захворюваннях може бути наслідком активації різних ферментів і свідчити про відмінності у біологічній активності цих фрагментів при ХЗП та ГЗП у сполучній тканині. Як зазначалось вище, поява фрагментів 19-15 кДа у плазмі крові свідчить про активацію процесів тромбоутворення та опсонізації продуктів фібринолізу (див. стор. 13).

Великий інтерес становить наявність фрагменту ФН 120 кДа як при ХЗП, так і при ГЗП. У літературі (Clark R.A. et al., 1988) існує припущення, що протеїнази звільняють фрагмент 120 кДа для підвищення хемотаксичної активності у місцях запалення. Наявність їх у плазмі крові пацієнтів обох груп може бути діагностичним показником запального процесу.

ВИСНОВКИ

У дисертації відповідно до поставленої мети розв’язано актуальне наукове питання, що стосується утворення фрагментів ФН, їх функціональних особливостей за норми і при запальних процесах у сполучній тканині та зроблено наступні висновки:

1.

2.

3.

4.

5.

6.

7.

СПИСОК ОПУБЛІКОВАНИХ ПРАЦЬ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1.

2.

3.

4.

5.

6.

7.