ІНСТИТУТ БОТАНІКИ ім. М.Г. ХОЛОДНОГО

НАЦІОНАЛЬНОЇ АКАДЕМІЇ НАУК УКРАЇНИ

ВОЛОЩУК

Наталія Михайлівна

УДК 528.28:630*17:504

МІКРОМІЦЕТИ ПОДРІБНЕНОЇ ДЕРЕВИНИ ГІЛОК ЛИСТЯНИХ ПОРІД

ТА ЇХ ЕКОЛОГО-БІОЛОГІЧНІ ВЛАСТИВОСТІ В УМОВАХ

ДЕРНОВО-СЛАБОПІДЗОЛИСТОГО ГРУНТУ ПІВНІЧНОГО ЛІСОСТЕПУ УКРАЇНИ

03.00.21 - мікологія

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

КИЇВ – 2005

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Національному аграрному університеті Кабінету Міністрів України

Науковий керівник - доктор біологічних наук, професор

ХАРЧЕНКО Світлана Миколаївна,

Національний аграрний університет,

професор кафедри мікробіології, вірусології та біотехнології

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук

БУХАЛО Ася Сергіївна,

Інститут ботаніки ім. М.Г. Холодного НАН України,

головний науковий співробітник відділу мікології

доктор біологічних наук, професор,

член-кореспондент УААН,

ЦИЛЮРИК Анатолій Васильович,

Національний аграрний університет,

завідувач кафедри захисту лісу,

директор ННЦ лісівництва навчально-наукового

Інституту лісового і садово-паркового господарства НАУ

Провідна установа - Інститут мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАНУ,

відділ фізіології та систематики мікроміцетів, м. Київ

Захист відбудеться " 14 " березня 2005 р. о 12 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.211.01 Інституту ботаніки ім. М.Г. Холодного НАН України за адресою: 00601, м. Київ, вул. Терещенківська, 2.

Факс: (380) 44-235-10-64

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту ботаніки ім. М.Г. Холодного НАН України (01025, м. Київ, вул. Велика Житомирська, 28).

Автореферат розісланий 11.02. 2005 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради Виноградова О.М.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Міцеліальні гриби займають провідне місце у блоці біодеструкторів органічної речовини рослинного походження, зокрема целюлози. За своєю біомасою, видовою різноманітністю та функціональною активністю вони є важливим компонентом біоти наземних екосистем. Проте, різноманітність видового складу мікроміцетів у певних екологічних нішах, розповсюдження окремих видів у ценозах, процеси засвоєння поживного субстрату і рівень біосинтетичної діяльності окремих видів грибів ще до теперішнього часу залишаються недостатньо вивченими. (Жданова, Василевская, 1982; Харченко, 2002; Zavgorodnyaya et al., 2000).

За існуючими в сучасному лісівництві технологіями в грунт як органічне добриво може вноситись подрібнена деревина гілок (ПДГ). При цьому виявлена більш ефективна дія ПДГ листяних порід, ніж хвойних (Lemieux, 1997). За даними багатьох дослідників, використання ПДГ активізує розвиток дереворуйнуючих лігнотрофних видів грибів, які сприяють не тільки відновленню трофічних зв’язків і кругообігу поживних речовин, а також приймають участь у біоочищенні антропогенно забруднених грунтів (Andersson et al., 2001; Bredberg et al., 2002; Koch, 1987; Kokalis-Burelle et al., 1994; Lazarovits et al., 2001; Sauer, 1999). У зв’язку з цим, дослідження можливості раціонального використання лісових ресурсів для захисту біосфери від забруднення хімічними агентами, підвищення родючості грунтів, становить значний інтерес і вимагає вивчення видового складу мікобіоти ПДГ та з’ясування її ролі у розкладанні деревини як активних компонентів довкілля.

Тому питання екології та біології мікроміцетів подрібненої деревини гілок листяних порід, зокрема поширених в Україні Acer platanoides L. (клена гостролистого), Acer tataricum L. (клена татарського) і Quercus robur L. (дуба звичайного), а також вивчення функціональних особливостей ПДГ при внесенні її у дерново-слабопідзолистий грунт, можуть сприяти підвищенню родючості грунтів і збагаченню грунтових біоценозів певними групами мікроміцетів.

Зв’язок з науковими програмами, планами, темами. Робота здійснювалась у межах науково-дослідної міжнародної програми оздоровлення басейну ріки Дніпро за угодою між Боярською лісовою дослідною станцією і Центром дослідження міжнародного розвитку м. Оттава (Канада) за темою № 20 “Подрібнена деревина гілок”, яка виконувалась протягом 1997-2001 рр., а також у межах держбюджетної теми № 110/63-Пр. (№ ДР 0101U003627) “Розробити наукові основи використання нетрадиційних органічних добрив для вирощування селекційно-покращеного посадкового матеріалу та лісовідновлення в умовах Полісся і Лісостепу” Боярської лісової дослідної станції, де робота виконувалась з 2001 року, а також на кафедрі мікробіології, вірусології та біотехнології і на кафедрі фітопатології Національного аграрного університету.

Мета і завдання дослідження. Мета роботи – дослідити видовий склад мікроміцетів подрібненої деревини гілок листяних порід Acer platanoides, A. tataricum і Quercus robur, та його вплив на мікобіоту дерново-слабопідзолистого грунту, вивчити еколого-біологічні властивості грибів, ізольованих з ПДГ та грунту, встановити закономірності формування мікоценозів при внесенні ПДГ у дерново-слабопідзолистий грунт.

Для досягнення мети вирішувались наступні завдання:

1. Встановити видовий та кількісний склад мікроміцетів, ізольованих з подрібненої деревини гілок Acer platanoides, A. tataricum і Quercus robur.

2. Дослідити видовий та кількісний склад грибів у дерново-слабопідзолистому грунті до і після внесення ПДГ у грунт.

3. Дослідити динаміку заселення ПДГ мікроміцетами у дерново-слабопідзолистому грунті.

4. Виявити комплекс ферментів грибів, вилучених з ПДГ та дерново-слабопідзолистого грунту.

5. Дослідити антибіотичні властивості мікроміцетів та ідентифікувати антимікробні речовини, що продукуються ними.

Об’єкт дослідження. Мікроміцети подрібненої деревини Acer platanoides, A. tataricum і Quercus robur та дерново-слабопідзолистого грунту.

Предмет вивчення – видовий склад мікроміцетів подрібненої деревини гілок листяних порід дерев (Acer platanoides, A. tataricum, Quercus robur), його таксономічна та екологічна структура, динаміка та зміна видового складу грибів під час розкладання ПДГ у грунті, біосинтетична активність мікроміцетів, ізольованих з ПДГ та грунту.

Методи дослідження. Завдання, що поставлені в роботі, вирішувались експериментально з використанням класичних мікологічних, мікробіологічних, біохімічних та статистичних методів досліджень.

Наукова новизна одержаних результатів. Уперше проведено цілеспрямоване вивчення видового складу та біологічних особливостей мікроміцетів, ізольованих з подрібненої деревини гілок листяних порід Acer platanoides, A. tataricum і Quercus robur. Уперше визначено видовий склад, біологічне та екологічне значення в грунтовому мікробоценозі мікроскопічних грибів, які приймають участь у розкладанні ПДГ Acer platanoides, A. tataricum і Quercus robur. Встановлено динаміку їх зміни під час розкладання ПДГ у дерново-слабопідзолистому грунті. Одержано дані про роль мікроміцетів в окисно-відновних процесах та синтезі лігнін-целюлозних екзоензимів, про трансформацію органічних сполук, які вони використовують як джерело живлення. Встановлено біосинтез антибіотичних речовин та спектр їх антимікробної дії у певних видів грибів. Виявлена роль ферментів та антибіотиків в екології мікроміцетів ПДГ та грунту. Створено колекцію живих культур мікроміцетів, вилучених з ПДГ і дерново-слабопідзолистого грунту, а також одержані штами продуценти антибіотиків та мікотоксинів.

Практичне значення отриманих результатів. Результати дослідження розширюють відомості про процеси формування мікоценозів на деревних породах та в грунті під час розкладання деревини. Дані з вивчення видового складу та біологічних особливостей мікроміцетів подрібненої деревини гілок листяних порід дерев Acer platanoides, A. tataricum і Quercus robur можуть бути використані в лісівництві при створенні сучасних технологій збагачення лісових грунтів новими видами добрив. Результати роботи використані в практичних розробках наукового відділу Боярської лісової дослідної станції для наукового обґрунтування перспективи використання нетрадиційних органічних добрив для лісовідновлення в умовах Полісся і Лісостепу.

Особистий внесок здобувача. Робота виконана під керівництвом доктора біологічних наук, професора С.М. Харченко і є самостійним дослідженням здобувача, яким виконані відбір зразків ПДГ листяних порід дерев та грунту, виділення культур грибів, визначена видова належність і досліджена ферментативна та антимікробна активність мікроміцетів, виконана математична обробка та аналіз отриманих результатів, підготовка матеріалів до друку у вигляді статей і тез, написання рукопису дисертації.

Апробація результатів дисертації. Результати роботи доповідалися та обговорювалися на щорічних конференціях професорсько-викладацького складу і аспірантів факультету захисту рослин та біотехнології Національного аграрного університету України (2001, 2002, 2003, 2004), на мікологічній секції ботанічного товариства України (2003); на конференціях І Всеукраїнській конференції молодих вчених-аграріїв (Київ, 2001); І з’їзді мікологів Росії (Москва, 2002); XIV Конгресі європейських мікологів (Ялта, 2003).

Публікації. Результати досліджень висвітлені у 12 публікаціях, серед яких 4 статті у фахових наукових журналах та 8 тез доповідей.

Структура та обсяг роботи. Дисертація включає вступ, огляд літератури та сім розділів експериментальних досліджень, заключення та висновки, список використаних джерел літератури, що містить 315 бібліографічних посилань. Робота викладена на 211 сторінках, ілюстрована 22 таблицями і 44 рисунками.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ

БІОЕКОЛОГІЧНІ ОСОБЛИВОСТІ МІКРОМІЦЕТІВ У ЛІСОВОМУ БІОГЕОЦЕНОЗІ

(Огляд літератури)

Дано критичний аналіз даних літератури з позицій теоретичних і прикладних аспектів еколого-біологічної характеристики грибів, як компонентів біогеоценозів, висвітлено питання участі мікроміцетів у руйнуванні целюлозовмісних субстратів та розглянуто особливості їх біосинтетичної активності.

КЛІМАТИЧНІ УМОВИ ТА ХАРАКТЕРИСТИКА ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЇ ДІЛЯНКИ

На основі метеорологічних даних та літератури подано характеристику клімату, грунтового та рослинного покриву.

МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ

Експериментальна ділянка, площею 270 м2 закладена на території Боярської лісової дослідної станції, в урочищі „Круглик” Хотівського лісництва, Київської області.

Матеріалом для роботи правили 108 зразків подрібненої деревини гілок та 192 проби дерново-слабопідзолистого грунту, які були відібрані протягом 2000-2002 років.

Методи вилучення, якісного та кількісного обліку мікроміцетів. Відбір зразків свіжої подрібненої деревини гілок для мікологічних досліджень проводили безпосередньо на місці її подрібнення (ГОСТ 27262-87). Відбір зразків грунту, який здійснювали навесні, влітку та восени, виконували за загальноприйнятою методикою (Зенова, Кураков, 1988). Кислотність грунту визначали потенціометричним методом (Гнатенко та ін., 2000). Дослідження мікобіоти подрібненої деревини гілок виконували методами посіву зразків ПДГ у „вологу камеру” та інокуляції на агаризовані поживні середовища (Чапека, пивне сусло, картопляно-глюкозний агар, Сабуро, Гаузе 1, Гетчинсона та агаризований водний грунтовий екстракт) (Кириленко, 1982; Семенов, 1990). Для виявлення мікобіоти, характерної для ПДГ, внесеної у грунт, використовували метод принади (Ivarson, 1973). Вилучення мікроміцетів у чисту культуру із свіжевідібраних зразків грунту проводили методом розведень (Кириленко, 1982). Ідентифікацію видів грибів здійснювали методом виготовлення мікроскопічних препаратів, які досліджували в світловому біологічному мікроскопі „Біолам Р-15”. Для визначення таксономічної належності мікроміцетів користувалися визначниками вітчизняних та іноземних авторів (Билай, 1977; Билай, Коваль, 1988; Билай, Курбацкая, 1990; Дудка, Бурдюкова, 1996; Кириленко, 1978; Лугаускас, Микульскене, 1987; Мельник, 2000; Пидопличко, 1953; 1972; Пидопличко, Милько, 1971; Carmichael, Kendrick et al., 1980; Ellis, 2001; Rifai, 1969). Систематична належність мікроміцетів приведена за системою, опублікованою у 9-му виданні „Ainsworth & Bisby’s Dictionary of the fungi” (Kirk et al., 2001), а в окремих випадках, згідно інших сучасних літературних джерел (Новое в систематике и номенклатуре грибов, 2003; Samson, Pitt, 2000). Чисельність грунтових мікроміцетів визначали у перерахунку на 1г сухого грунту, з визначенням коефіцієнта заселення (Кириленко, 1982; 1984). Для оцінки типовості виду та положення його в структурі домінування у біоценозі нами було застосовано критерій частоти трапляння мікроміцетів, в тому числі поняття сезонної частоти трапляння виду, що при сумісному використанні цих показників дозволило нам диференціювати комплекс грунтових мікроміцетів на типові домінуючі, типові чисельні, типові рідкісні і випадкові види (Методы почвенной микробиологии и биохимии, 1991; Мирчинк, 1984). Для оцінки комплексів грунтових грибів контрольних і дослідних ділянок використовували коефіцієнт спільності Жаккара (Кириленко, 1982). Для характеристики видового складу грибів у досліджуваних зразках грунту застосовували коефіцієнт подібності Соренсена-Чекановського, індекс Шеннона та показник Симпсона (Зенова, Кураков, 1988; Методы почвенной микробиологии и биохимии, 1991; Одум, 1986). Для порівняння видового складу грибів, вилучених з ПДГ A. platanoides, A. tataricum і Q. robur, нами було застосовано коефіцієнт дискримінації Стугрена-Радулеску (Шмидт, 1984).

Антибіотичну активність мікроміцетів визначали методом паперових дисків (Харченко, 1982), а ідентифікацію антибіотиків виконували методом збірної хроматографії на папері (Шевчик, 1959). Дослідження синтезу ферментів: амілази, целюлази, ендо-1,4-?-ксиланази, фенолоксидаз, а також лігнін-целюлозних екзоензимів проводили за допомогою ензиматичних реакцій (Борисова, 1982; Borokhov, 2000; Molitoris, 1978; Molitoris, Prillinger, 1986). Целюлазну активність мікроміцетів вивчали за методом Хагедорна – Ієнсена (Сиверс, 1973), при вирощуванні їх на рідкому середовищі Чапека з фільтрувальним папером в якості єдиного джерела вуглецю, про накопичення якої судили з кількості утвореної ними в культуральній рідині глюкози (мг/мл). Фунгістатичну активність ПДГ визначали методом додавання екстрактів, отриманих з ПДГ до живильних середовищ (Степанова, Мухин, 1979). Статистичну обробку експериментальних даних проводили за комп’ютерною програмою MS Excel.

ВИДОВИЙ ТА КІЛЬКІСНИЙ СКЛАД МІКРОМІЦЕТІВ, ІЗОЛЬОВАНИХ З ПОДРІБНЕНОЇ ДЕРЕВИНИ ГІЛОК ACER PLATANOIDES, A. TATARICUM І QUERCUS ROBUR

Із зразків ПДГ вилучено та ідентифіковано 55 видів мікроміцетів з 26 родів, серед яких найбільша кількість (41 вид, 74,5% від загальної кількості) належала до групи Anamorphic fungi (Deuteromycotina, Deuteromycetes, Fungi Imperfecti), яка є формальною групою, до якої відносять морфи, що є частиною життєвого циклу грибів із статевим процесом, і незалежні колоніальні популяції, що дивергували від грибів із статевим процесом [Дудка, Андріанова та ін., 2002; Kirk et al., 2001].

Anamorphic fungi розподілилися за класами таким чином: Agonomycetes – 2 види, Coelomycetes – 3 види, Hyphomycetes – 36 видів. При цьому найчисленнішим виявився рід Penicillium, до якого відносилось 8 видів. Так як для більшості грибів родів Aspergillus, Penicillium, Trichoderma та Fusarium ще не встановлені зв’язки з телеоморфами, тому в нашій роботі ми розглядаємо їх у складі групи Anamorphic fungi.

До відділу Ascomycota належало 8 видів (14,5%), серед яких домінували представники роду Chaetomium, і до відділу Zygomycota – 5 видів, що становило 9,1% від загального видового складу мікроміцетів, виявлених на ПДГ. Відділ Oomycota був представлений лише одним видом (1,9%).

Високими коефіцієнтом заселення (33,3-66,6) і частотою трапляння (29,6-48,1) характеризувались Rhizopus stolonifer, Fusarium oxysporum, Trichoderma viride, Mycelia sterilia (alba). Зокрема, на ПДГ A. platanoides найбільший коефіцієнт заселення відмічався у Fusarium moniliforme і Chaetomium globosum. На деревині гілок A. tataricum найчастіше реєструвався Aspergillus niger, Penicillium purpurogenum, P. variabile, Doratomyces stemonitis і Byssochlamys nivea. На зразках ПДГ Q. robur – Aspergillus niger і Fusarium moniliforme.

Найбільша кількість видів грибів була вилучена нами з деревини A. tataricum (39 видів), а найменша – з A. platanoides (22 види), що становить відповідно 71 і 40% від загальної кількості ізольованих видів мікроміцетів. Проте, мікоценози деревних порід не відрізнялись співвідношенням грибів за їх таксономічною приналежністю (Рис. 1). Серед мікроміцетів, ізольованих з ПДГ,тільки на деревині гілок клена гостролистого були наявні представники Oomycetes. У цілому, на деревині зазначених порід серед мікроміцетів значно переважають види анаморфних грибів. При цьому тільки на деревині A. platanoides зустрічались Rhizopus arrhizus, Penicillium solitum, Doratomyces purpureofuscus, Phaeostalagmus cyclosporus, Chaetomium cochlioides та Ch. globosum. На ПДГ A. tataricum – Aspergillus flavus, A. multicolor, Penicillium funiculosum, P. frequentans, P. wortmannii, Fusarium sporotrichiella var. poae, Trichoderma koningi, Alternaria chlamidospora, Cladosporium macrocarpum, Gliocladium catenulatum, Helminthosporium sp., Eidamella spinosa, Phoma eupirena і P. herbarum. Тільки на подрібнених гілках Q. robur було вилучено – Acrophialophora fusispora, Gilmaniella humicola, Humicola grisea, Chaetomium aureum і Ch. medusarum.

Досліджувані листяні деревні породи різняться складом видів грибів, що підтверджується показниками коефіцієнта дискримінації (?). При цьому найбільша відмінність видового складу мікроміцетів спостерігалась між ПДГ Q. robur і A. platanoides, а також між ПДГ A. platanoides і A. tataricum (? 0,5).

ДИНАМІКА ЗАСЕЛЕННЯ ПОДРІБНЕНОЇ ДЕРЕВИНИ ГІЛОК

ACER PLATANOIDES, A. TATARICUM І QUERCUS ROBUR МІКРОМІЦЕТАМИ У ДЕРНОВО-СЛАБОПІДЗОЛИСТОМУ ГРУНТІ

Протягом 16 місяців нами були проведені дослідження зміни видового складу мікроміцетів, що ізольовані з ПДГ A. platanoides, A. tataricum і Q. robur, яку було внесено в дерново-слабопідзолистий грунт. У результаті досліджень із зразків ПДГ, внесеної в грунт, було вилучено та ідентифіковано 81 вид мікроміцетів з 48 родів. Найбільша кількість видів грибів (55 видів, 67,9% від загальної кількості вилучених видів) належала до анаморфних грибів, які розподілилися за класами таким чином: Agonomycetes – 2 види, Coelomycetes – 7, Hyphomycetes – 46 видів. При цьому найбільш численним виявився рід Penicillium, до якого відносилось 9 видів. У досліджених зразках ПДГ також були представлені мікроміцети відділу Ascomycota (13 видів, 16,1%), серед яких переважали представники роду Chaetomium, а також Zygomycota (10 видів, 12,3%) та Oomycota (3 види, 3,7%). Для мікобіоти всіх досліджуваних деревних порід характерним було переважання Anamorphic fungi.

Найбільш високим коефіцієнтом заселення (25,0-57,5) і частотою трапляння (55,5-88,8) характеризувалися Rhizopus stolonifer, Fusarium gibbosum, Trichoderma harzianum, T. viride, Cladosporium herbarum, Microascus cinereus. Зокрема, на подрібненій деревині гілок A. platanoides високий коефіцієнт заселення відмічали у Chaetomium cochlioides. На деревині гілок A. tataricum найчастіше реєстрували Penicillim wortmannii, а на зразках ПДГ Q. robur – Rhizopus arrhizus.

З деревини кленів татарського і гостролистого було вилучено 54 і 52 види мікроміцетів відповідно, а із зразків ПДГ дуба звичайного тільки 49 видів. При цьому найбільш характерними і типовими представниками для ПДГ цих порід виявились Rhizopus stolonifer, Penicillium wortmannii, Mycelia sterilia (alba), Microascus cinereus та Fusarium gibbosum. До типових найбільш чисельних видів належали – Rhizopus arrhizus, Trichoderma koningi, Arthrinium sphaerospermum, Cladosporium herbarum, Gilmaniella humicola, Fusarium moniliforme, F. solani, Byssochlamys nivea, Chaetomium dolichotrichum, Thielavia terrestris.

Різниця досліджуваних деревних порід за набором видів грибів була підтверджена показниками коефіцієнта дискримінації (?). Найбільша відмінність видового складу мікроміцетів спостерігалась у варіантах Q. robur і A. platanoides, а також Q. robur і A. tataricum 0,51 та 0,50 відповідно.

Після перебування у грунті протягом двох місяців найбільшим коефіцієнтом загального заселення грибами характеризувалась ПДГ клена татарського (33,3%), а найменшим – дуба звичайного (12,5%). Із збільшенням часу інкубації деревини в грунті найбільша заселеність мікроміцетами у більшості випадків спостерігалась на деревині гілок дуба звичайного. По мірі розкладання деревини різних порід в дерново-слабопідзолистому грунті, спостерігались зміни у видовому складі мікроміцетів. Так, після інкубації ПДГ в грунті протягом двох місяців на подрібнених гілках усіх досліджених порід були присутні Rhizopus stolonifer і Trichoderma viride. На зразках ПДГ клена гостролистого також траплялись Byssochlamys nivea і Mycelia sterilia (alba), а на деревині дуба звичайного Penicillium wortmannii та Chaetomuim globosum. Так, у перші чотири місяці її руйнування піонерами-колонізаторами були Rhizopus arrhizus, R. stolonifer, Penicillium wortmannii, Trichoderma viride, Mycelia sterilia (alba), Gilmaniella humicola, Doratomyces stemonitis, Arthrinium sphaerospermum, Byssochlamys nivea, Chaetomium globosum і Fusarium moniliforme. По мірі розкладу домінуючими видами стають Cladosporium herbarum, Chaetomium cochliodes, Microascus cinereus, Trichoderma harzianum та Fusarium gibbosum.

ВПЛИВ ПОДРІБНЕНОЇ ДЕРЕВИНИ ГІЛОК

ACER PLATANOIDES, A. TATARICUM, QUERCUS ROBUR

НА ФОРМУВАННЯ МІКОЦЕНОЗУ ДЕРНОВО-СЛАБОПІДЗОЛИСТОГО ГРУНТУ

Видовий склад мікроміцетів дерново-слабопідзолистого грунту при внесенні ПДГ. Із зразків грунту, де пройшов процес інкубації ПДГ, було вилучено та ідентифіковано 119 видів мікроміцетів з 49 родів. Найбільша кількість видів грибів (94 види, 79,0% від загальної кількості вилучених видів) належала до анаморфних грибів. Вони розподілилися за класами таким чином: Agonomycetes – 2 види, Coelomycetes – 2, Hyphomycetes – 90 видів. При цьому найбільш численним виявився рід Penicillium, до якого відносився 31 вид. У досліджених зразках грунту з ПДГ також були представлені мікроміцети відділу Ascomycota (11 видів, 9,2%), серед яких переважали представники роду Chaetomium, а також Zygomycota (12 видів, 10,0%), Basidiomycota - (1 вид, 0,9%) та Oomycota - (1 вид, 0,9%). Для всіх досліджуваних зразків грунту було характерним переважання Anamorphic fungi.

Високими показниками коефіцієнтів заселення (27,7 – 60,5) і частоти трапляння (26,1 – 40,2) характеризувалися види: Trichoderma viride, Fusarium gibbosum, F. moniliforme, F. oxysporum, F. solani та Arthrinium sphaerospermum. Зокрема, у контрольних зразках високий коефіцієнт заселення відмічали у Zygorhynchus heterogamus, Penicillium expansum, P. verrucosum var. cyclopium, Alternaria alternata, Gilmaniella humicola, Humicola fuscoatra та Mycelia sterilia (alba), а у пробах грунту з ПДГ клена гостролистого – у Mycelia sterilia (alba). У зразках грунту з ПДГ клена татарського високий коефіцієнт заселення реєстрували у Penicillium terrestre, Alternaria alternata та Mycelia sterilia (alba). У грунті з ПДГ дуба звичайного – у Aspergillus fumigatus, Trichoderma koningi, Gilmaniella humicola та Humicola fuscoatra. Найбільша кількість видів мікроміцетів була вилучена з контрольних зразків грунту (82 види), менша з грунту із ПДГ клена татарського – 54 види, з проб грунту із ПДГ клена гостролистого та дуба звичайного, відповідно 44 і 47 видів.

Порівнявши критерії просторової і сезонної частоти трапляння, ми виділили серед мікроміцетів три групи видів: типові чисельні, типові рідкісні та випадкові. У контролі до типових чисельних видів належав Arthrinium sphaerospermum, а до типових рідкісних Zygorhinhus heterogamus, Penicillium expansum, P. verrucosum var. cyclopium, Trichoderma viride, Fusarium gibbosum, F. moniliforme, F. oxysporum, F. solani, Alternaria alternata, Gilmaniella humicola, Humicola fuscoatra та Mycelia sterilia (alba). Серед мікроміцетів, вилучених із зразків грунту з ПДГ клена гостролистого, до типових чисельних належав – Fusarium moniliforme, а до типових рідкісних – Trichoderma viride, Arthrinium sphaerospermum та Mycelia sterilia (alba). У пробах грунту з подрібненою деревиною гілок клена татарського типовими чисельними видами були – Trichoderma viride, Fusarium moniliforme, F. oxysporum і F. solani, типовими рідкісними – Penicillium terrestre, Fusarium gibbosum, Alternaria alternata, Arthrinium sphaerospermum. У зразках грунту з ПДГ дуба звичайного до типових чисельних належать Trichoderma viride, Fusarium oxysporum, Arthrinium

Таблиця 1

Середня чисельність мікроміцетів у дерново-слабопідзолистому грунті в роки досліджень*

Рік | Грунт з ПДГ

Контроль | A.

platanoides | A.

tataricum | Q.

robur

2000 | 14,2±3,1 | 11,8±1,9 | 7,6±1,8 | 15,2±3,1

2001 | 11,9±5,2 | 8,8±4,2 | 14,1±9,1 | 8,4±6,0

2002 | 12,2±3,7 | 16,4±4,6 | 14,8±2,4 | 13,0±4,9

Примітка: * - тис. грибних зародків в 1 г сухого грунту.

sphaerospermum і Gilmaniella humicola, а до типових рідкісних – Trichoderma koningi, Fusarium gibbosum, F. moniliforme, F. solani та Humicola fuscoatra. Всі інші мікроміцети є випадковими видами. Саме група випадкових видів своєю чисельністю збагачує видове різноманіття структури дерново-слабопідзолистого грунту та у загальній сукупності дає значну біомасу.

Найбільшим різноманіттям комплексу грунтових грибів за показником індексу Шеннона характеризувались контрольні зразки грунту (Н 7,3), меншим – з внесеною ПДГ A. tataricum і Q. robur, відповідно Н 4,7 і 4,4. Найменшу видову різноманітність грибів відмічали у грунті з ПДГ A. platanoides (Н 3,9).

Динаміка чисельності та видової різноманітності мікроміцетів у дерново-слабопідзолистому грунті під впливом внесеної ПДГ. Внесення у дерново-слабопідзолистий грунт ПДГ A. platanoides, A. tataricum і Q. robur впливало на чисельність мікроміцетів. Аналіз одержаних нами даних показав, що середня чисельність мікроміцетів дерново-слабопідзолистого грунту після внесення ПДГ листяних порід відрізнялась у різні роки спостережень (табл. 1). Так, у грунті з ПДГ A. platanoides і особливо з A. tataricum вже у перший рік кількість грибних зародків значно зменшилась, в порівнянні з контролем, з 14,2 до 11,8 і 7,6 тис./ г грунту відповідно, а з Q. robur, навпаки, зросла до 15,2 тис./ г грунту. На другий рік інкубації ПДГ у грунті чисельність мікроскопічних грибів у варіантах з A. platanoides і Q. robur знизилась до рівнів 8,8 і 8,4 тис./ г грунту відповідно. У цей період найбільша кількість мікроміцетів спостерігалась в грунті з ПДГ A. tataricum - 14,1 тис./ г грунту, порівняно з контролем – 11,9 тис./ г грунту. Тільки на третій рік спостережень чисельність мікроскопічних грибів у грунті з ПДГ всіх деревних порід була вищою за чисельність мікроміцетів у контролі. При цьому найбільша кількість грибів була відмічена в грунті з ПДГ A. platanoides – 16,4 тис./ г грунту.

Протягом 2000 – 2002 років неоднаковою була і різноманітність видового складу мікроміцетів у всіх дослідних варіантах. У 2000 році найбільша видова різноманітність грибів спостерігалась у літні місяці (VI-VIII) як в контрольних пробах грунту, так і з ПДГ Q. robur. У 2001 році різноманітнішим виявився склад грибів у контролі навесні (IV-V), а в грунті з ПДГ всіх досліджених порід, навпаки – восени (IX-X). На третьому році наших спостережень найбільша кількість видів відмічалась навесні у всіх пробах грунту.

Такі зміни у динаміці чисельності та різноманітності видового складу мікроміцетів дерново-слабопідзолистого грунту, на наш погляд, можна пояснити: низькою родючістю грунту; посушливими погодними умовами, що склались протягом вегетаційних періодів 2000 – 2002 років; змінами значень показників рН грунту в період розкладання ПДГ.

Специфіка внесеного целюлозно-лігнінового субстрату ПДГ також визначає чисельність та видову різноманітність комплексу грунтових мікроміцетів, які освоюють його. Нами було досліджено фунгістатичну дію спиртових екстрактів із ПДГ A. platanoides, A. tataricum і Q. robur на швидкість росту 16 представників різних груп грибів, виділених із зразків дерново-слабопідзолистого грунту. Чутливими до екстрагованих речовин із свіжої ПДГ всіх порід дерев виявились Aspergillus parasiticus, Paecilomyces variotii, Arachniothus aurantiacus, Alternaria alternata, Cladosporium cladosporioides і Humicola grisea. Найбільш активним був екстракт з ПДГ A. platanoides, який пригнічував ріст Penicillium wortmannii, Fusarium oxysporum, Arthrinium sphaerospermum та Stemphylium botryosum. У порівнянні з контролем, стимулююча дія всіх екстрактів спостерігалась у Trichoderma viride. Слід зазначити, що екстракти з ПДГ усіх порід не впливали на ріст Penicillium janthinellum та Chaetomium dolichotrichum.

Таким чином, на основі одержаних даних можна констатувати помітні зміни в структурі комплексу мікроміцетів дерново-слабопідзолистого грунту під впливом подрібненої деревини гілок твердолистяних порід A. platanoides, A. tataricum і Q. robur. Це свідчить про те, що ПДГ можна вважати фактором, який регулює чисельність та різноманітність грунтових мікроміцетів, а також відіграє роль у їх сукцесії.

ФЕРМЕНТАТИВНА АКТИВНІСТЬ МІКРОМІЦЕТІВ, ІЗОЛЬОВАНИХ З ПОДРІБНЕНОЇ ДЕРЕВИНИ ГІЛОК ACER PLATANOIDES, A. TATARICUM, QUERCUS ROBUR ТА ГРУНТУ

Трансформація дослідженими видами мікроміцетів вуглецевих сполук. Визначення ензиматичної активності грибів, вилучених з ПДГ та грунту. Серед 26 досліджених мікроміцетів, чітка та інтенсивна ензиматична реакція на амілазу зареєстрована у Aspergillus nidulans 80, Penicillium puberulum 57, P. variabile Qr, P. purpurogenum 54, Alternaria alternata, Cladosporium cladosporioides 84 та представників родів Trichoderma і Fusarium. Дуже сильна активність амілази була відмічена тільки у Penicillium notatum Qr, P. terrestre Qr і Dicyma ampullifera 302.

Позитивна реакція на ендо-1,4-?-ксиланазу була виявлена у більшості досліджених грибів, окрім Aspergillus phoenicis 74 і Penicillium terrestre Qr. Ензиматична реакція найбільшої інтенсивності спостерігалась у Arthrinium sphaerospermum 502, Dicyma ampullifera 302 та Stemphylium botryosum 101. Інтенсивну реакцію на продукування 1,4-?-ксиланази виявили Aspergillus nidulans 80, Penicillium notatum Qr, Trichoderma harzianum 402, Alternaria alternata і Arachniotus aurantiacus 402. Всі інші досліджені мікроміцети мали чітку реакцію на ксиланазу.

Ензиматична реакція на ?-целюлазу була позитивною для більшості досліджених мікроміцетів і мала чіткий прояв. Інтенсивну реакцію виявили Trichoderma koningi, T. viride, Arachniotus aurantiacus 402, Doratomyces stemonitis, Humicola grisea 1201 та Stemphylium botryosum 101. Слідова реакція на целюлазу була зареєстрована у Penicillium variabile Qr, P. wortmannii 18 та Alternaria alternata. Реакція на целюлазу була відсутня у Aspergillus phoenicis 74, Penicillium notatum Qr і P.terrestre Qr.

Целюлазна активність мікроміцетів, ізольованих з ПДГ та грунту. Нами була досліджена целюлазна активність мікроміцетів, ізольованих з ПДГ та грунту, при вирощуванні культур на рідкому середовищі Чапека з фільтрувальним папером в якості джерела вуглецю. Активність оцінювали за кількістю утвореної в культуральній рідині глюкози (мг/мл). Вже на десяту добу культивування досліджених штамів грибів найбільшу целюлазну активність виявили Penicillium wortmannii 18, Trichoderma harzianum 402 та Arachniotus aurantiacus 402 (0,177 – 0,195 глюкози мг/мл), а найменшу – Stemphylium botryosum 101 (0,088 глюкози мг/мл). На двадцяту добу інкубації найбільша активність ферменту спостерігалась у Fusarium oxysporum 501 і Trichoderma harzianum 402 (0,202 та 0,304 глюкози мг/мл відповідно). Найменш активним у цей період виявився Aureobasidium pullulans 19 (0,139 глюкози мг/мл). На тридцяту добу найвища целюлазна активність відмічалась у Aspergillus sydowi 79, Trichoderma viride та Paecilomyces variotii 78 ( відповідно 0,308, 0,264 і 0,253 глюкози мг/мл), а найменша - у Aspergillus ficuum (0,088 мг/мл глюкози). Аналіз одержаних даних свідчить про те, що досліджені штами мікроміцетів відрізняються целюлазною активністю у різні періоди їх розвитку. Однак, для більшості досліджених нами грибів можна відмітити загальне підвищення синтезу целюлази із збільшенням експозиції. Така стратегія може зумовлювати чергування видів грибів під час заселення ними целюлозовмісних субстратів.

Участь мікроміцетів, вилучених з ПДГ та грунту, в окислювально-відновних процесах. Серед 26 досліджених мікроміцетів дуже інтенсивна реакція на утворення лакази на середовищі з ?-нафтолом була у Penicillium puberulum 57, інтенсивну реакцію виявили у Fusarium gibbosum 501 та F. solani Qr, чітка реакція спостерігалась у Arachniotus aurantiacus 402 і Fusarium moniliforme Ap, слідова реакція була у грибів Penicillium corylophylum 1, P. notatum Qr та P. variabile Qr. У всіх інших досліджених видів грибів прояв продукування лакази був відсутній.

Більш активними продуцентами пероксидази виявились всі досліджувані представники роду Fusarium: F. gibbosum 501, F. moniliforme Ap та F. solani Qr. Чітку ензиматичну реакцію на пероксидазу реєстрували у Penicillium wortmannii 18 і Humicola grisea 1201, а слідова реакція на синтез пероксидази спостерігалась у Penicillium notatum Qr і Dicyma ampullifera 302.

Дослідження на середовищі з таніном (реакція Бавендамма) показало, що більшість тестованих видів мікроміцетів відноситься до целюлозоруйнівних грибів, а руйнування лігніну притаманне тільки окремим видам. Так, найбільша активність фенолоксидаз спостерігалась у Chaetomium dolichotrichum 701, Ch. globosum Ap і Alternaria alternata. Інтенсивну ензиматичну реакцію проявили Aureobasidium pullulans 19, Cladosporium cladosporioides 84 та Stemphylium botryosum 101. Сліди синтезу фенолоксидаз виявлено у Penicillium terrestre Qr і Fusarium gibbosum 501.

Синтез мікроміцетами лігнін-целюлозних екзоензимів. Нами була досліджена лігнін-целюлазна активність екзоферментів 26 видів мікроміцетів за допомогою барвника Remazol Brilliant Blue R (RBBR), який у присутності даних ензимів змінює свій синій колір на жовтий. Прояв чіткої за інтенсивністю активності екзоферментів був відзначений у Aspergillus nidulans 80, A. phoenicis 74, Fusarium gibbosum 501, F. moniliforme Ap, F. solani Qr, Trichoderma harzianum 402, Aureobasidium pullulans 19, Dicyma ampullifera 302 і Doratomyces stemonitis. Слідова реакція на ці ферменти спостерігалась у Alternaria alternata, а всі інші досліджувані види мікроміцетів не змінювали колір барвника RBBR.

Таким чином, дослідження видів мікроміцетів, виділених із ПДГ та дерново-слабопідзолистого грунту, показало, що мікроміцети адаптовані до конверсії органічної речовини рослинного походження, завдяки синтезу гідролітичних і окислювальних ферментів.

АНТИМІКРОБНА АКТИВНІСТЬ МІКРОМІЦЕТІВ, ІЗОЛЬОВАНИХ З ПОДРІБНЕНОЇ ДЕРЕВИНИ ГІЛОК ТА ГРУНТУ

Антибіотична активність грибів, вилучених з ПДГ та грунту. Було досліджено спектр антимікробної дії 38 видів (41 штам) мікроміцетів, вилучених з подрібненої деревини гілок A. platanoides, A. tataricum і Q. robur та грунту, по відношенню до 20 видів мікроорганізмів з різних таксономічних груп (бактерії, дріжджі та гриби).

Найбільш активними проти бактеріальних та дріжджових тест-культур (зона пригнічення росту 8 – 16 мм) були представники родів Aspergillus (A. candidus 81, A. ficuum, A. nidulans 80, A. parasiticus 77, A. sydowi 79) і Penicillium (P. expansum Ap, P. frequentans At, P. janthinellum, P. notatum Qr, P. puberulum 57, P. purpurogenum 54, P. verrucosum 2002). Фунгістатичну активність по відношенню до Alternaria alternata виявлено у досліджуваних видів роду Penicillium (P. verrucosum 2002), Trichoderma (Trichoderma harzianum 402, T. koningi) та Chaetomium (Chaetomium cochlioides 701, Ch. dolichotrichum 901 і Ch. globosum).

Ідентифікація антибіотичних речовин мікроміцетів, вилучених з ПДГ та грунту. Дослідивши спектр антибіотичної дії 38 видів (41 штам) мікроміцетів, ізольованих з ПДГ A. platanoides, A. tataricum і Q. robur та дерново-слабопідзолистого грунту, для подальших досліджень нами були відібрані вісім видів мікроміцетів (Aspergillus nidulans 80, A. sydowi 79, Penicillium frequentans At, P. janthinellum, P. notatum Qr, P. puberulum 57, Alternaria alternata 1801 і Stemphylium botryosum 101). Встановлено, що досліджені штами грибів накопичують в культуральній рідині антибіотичні речовини різної хімічної природи. Порівнявши отримані антибіотикограми антимікробних речовин досліджених нами грибів з антибіотикограмами стандартних препаратів відомих антибіотиків і токсинів, ми визначили у Aspergillus nidulans 80 стеригматоцистин, A. sydowi 79 – коєву кислоту, Penicillium frequentans At – фреквентин, P. janthinellum – пеніцилову кислоту, гентизиловий спирт, P. notatum Qr – пеніцилін, патуліну, P. puberulum 57 – патулін, пуберулову кислоту, Alternaria alternata 1801– альтернаріол, у Stemphylium botryosum 101 – трихотецени.

ЗАКЛЮЧЕННЯ

Проведені дослідження показали, що подрібнена деревина гілок (ПДГ) A. platanoides, A. tataricum і Q. robur заселена специфічною мікобіотою. Одержані нами дані про видовий і кількісний склад та екологічні особливості мікроміцетів, які заселяють ПДГ, є новими і мають значення для з’ясування процесів формування мікоценозів на деревині та під час розкладання ПДГ при внесенні її у грунт.

У результаті мікологічних досліджень зразків ПДГ листяних порід (108 зразків) та грунту (192 зразки), відібраних у 2000-2002 рр., нами було вилучено та ідентифіковано 172 види (315 штамів) мікроміцетів, що належать до 73 родів, 8 родин, 10 порядків відділів Oomycota, Zygomycota, Ascomycota, Basidiomycota та групи Anamorphic fungi. Найбільш численною групою грибів у досліджуваних еконішах виявились Anamorphic fungi, які були представлені 131 видом (165 штамів) з 53 родів.

Видовий склад грибів ПДГ кожної з досліджуваних порід є досить специфічним, що випливає з порівняльного аналізу, проведеного з використанням коефіцієнта дискримінації (?).

За нашими даними, при внесенні ПДГ у грунт виявлено формування біокомплексів грибів-потенційних руйнівників целюлози, які в процесі розкладання ПДГ зазнають якісних і кількісних змін. Виявлена закономірність у динаміці певних видів мікроміцетів під час розкладу ПДГ у дерново-слабопідзолистому грунті. При цьому найбільша відмінність видового складу мікроміцетів спостерігалась у варіантах Q. robur і A. platanoides, а також Q. robur і A. tataricum, а із збільшенням часу знаходження деревини у грунті, найбільшою заселеністю мікроміцетами характеризувалась переважно ПДГ Q. robur.

Застосувавши критерії, що використовуються в загальній екології (показники подібності, різноманіття та домінування), вдалося охарактеризувати зміни в структурі мікобіоти дерново-слабопідзолистого грунту, які відбулись під впливом розкладу подрібненої деревини гілок.

Дослідження видів мікроскопічних грибів, виділених із ПДГ та дерново-слабопідзолистого грунту, показало, що мікроміцети адаптовані до конверсії органічної речовини рослинного походження, завдяки синтезу гідролітичних і окислювальних ферментів.

Мікроміцети, ізольовані із подрібненої деревини гілок та дерново-слабопідзолистого грунту, характеризуються чіткою вибірковістю антимікробної дії і можуть розглядатись як один із екологічних факторів, які формують видову структуру мікоценозів, зокрема ПДГ A. platanoides, A. tataricum та Q. robur і грунту, а також виконують роль регуляторів диференціації мікробних популяцій в біоценозах, завдяки синтезу в процесі своєї життєдіяльності біологічно активних речовин, які допомагають їм витримувати конкуренцію при заселенні рослинних субстратів, регулюючи видове різноманіття і чисельність мікроскопічних грибів.

ВИСНОВКИ

1. Сукупне видове різноманіття подрібненої деревини гілок (ПДГ) клена гостролистого (Acer platanoides), клена татарського (A. tataricum) і дуба звичайного (Quercus robur), контрольних і дослідних зразків грунту та ПДГ, інкубованої в грунті, складає 172 види мікроміцетів з 73 родів, 8 родин, 10 порядків відділів Oomycota (3 види, 1,7%), Zygomycota (17 видів, 9,9%), Ascomycota (20 видів, 11,6%), Basidiomycota (1 вид, 0,6%) та групи Anamorphic fungi (131 вид, 76,2%).

2. З подрібненої деревини гілок листяних порід дерев вилучено 55 видів мікроміцетів з 26 родів, у таксономічній структурі яких домінують Anamorphic fungi (41 вид, 74,5%) з переважанням представників роду Penicillium. Найбільша кількість видів грибів виявлена на ПДГ клена татарського – 39 видів, дуба звичайного і клена гостролистого 30 і 22 види, відповідно. Найбільша відмінність видового складу мікроміцетів спостерігалась між дубом звичайним і кленом гостролистим та між кленом гостролистим і кленом татарським.

3. Встановлена приуроченість певних видів мікроміцетів до деревини досліджених листяних порід. Тільки на ПДГ клена гостролистого траплялись Rhizopus arrhizus, Penicillium solitum, Doratomyces purpureofuscus, Phaeostalagmus cyclosporus та Chaetomium globosum, на ПДГ клена татарського – Penicillium wortmannii, Trichoderma koningii, Alternaria chlamydospora, Cladosporium macrocarpum, Eidamella spinosa та інші. Види Acrophialophora fusispora, Gilmaniella humicola, Humicola grisea, Chaetomium aureum і Ch. medusarum було вилучено тільки з ПДГ дуба звичайного.

4. Із зразків ПДГ, внесеної в грунт, було вилучено та ідентифіковано 81 вид мікроміцетів з 48 родів, у таксономічній структурі яких домінують анаморфні гриби (55 видів, 67,9%). З деревини кленів татарського і гостролистого було вилучено 54 і 52 види мікроміцетів відповідно, а із зразків ПДГ дуба звичайного – 49 видів.

5. Високим коефіцієнтом загального заселення грибами у перші два місяці інкубації в грунті