АКАДЕМІЯ МЕДИЧНИХ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ ГЕРОНТОЛОГІЇ

БАКУРОВА ОЛЕНА МИХАЙЛІВНА

УДК 577.15 : [616-002.44 + 616.33-006.6]- 053.008

АКТИВНІСТЬ ФЕРМЕНТІВ ГЛІКОЛІЗУ ТА ОБМІНУ НУКЛЕОТИДІВ

У ПАЦІЄНТІВ РІЗНОГО ВІКУ

З ВИРАЗКОЮ ТА РАКОМ ШЛУНКА

03.00.04 - біохімія

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата медичних наук

Київ - 2006

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Донецькому державному медичному університеті ім. М. Горького

Міністерства охорони здоров’я України

Науковий керівник:

Доктор біологічних наук, професор

Борзенко Берта Георгіївна, Донецький державний медичний університет ім. М. Горького, завідувач кафедри біохімії.

Офіційні опоненти: - доктор медичних наук, професор, Гонський Ярослав Іванович,

Тернопільська державна медична академія ім. І.Я. Горбачевського,

завідувач кафедри медичної хімії

- доктор медичних наук, головний науковий співробітник лабораторії

регуляції метаболізму, Новікова Світлана Миколаївна,

Інститут геронтології АМН України

Провідна установа: Харківський національний університет ім. В.Н. Каразіна

Захист відбудеться 18.05.2006р. о 15 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.551.01 у Інституті геронтології АМН України за адресою: 04114 м. Київ, вул. Вишгородська, 67

З дисертацією можна ознайомитись в науковій бібліотеці Інституту геронтології АМН України ( 04114м. Київ, вул. Вишгородська, 67 )

Автореферат розісланий 16.04.2006р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради

кандидат медичних наук Потапенко Р.І.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Рівні захворюваності виразковою хворобою (ВХ) та раком шлунка (РШ), не тільки на Україні, а й в багатьох країнах світу, залишаються досить високими Колесник О.П., 2002; Аверкин Ю.И, 2003. Зберігається тенденція до зростання захворюваності на ВХ із розвитком ускладнень та інвалідізацією хворих Колесник О.П., 2002; Маев И., Подгорбунских Е., 2003. Відмічено збільшення росту захворюваності ВХ в старших вікових групах Коваленко Л.І., 2001. Для РШ залишається дуже низькою питома вага РШ I-II стадії – 5%, тоді як для РШ III стадії – 40%, IV стадії – 55% Щепотин И.Б., Галахин К.А., Курик Е.Г., 2002. Отже, існує необхідність в формуванні груп онкологічного ризику та проведення в них регулярних онкопрофоглядів. За модельними розрахунками такий підхід може дозволити знизити смертність населення України від РШ на 50-60% Щепотин И.Б., Галахин К.А., Курик Е.Г., 2002.

Актуальність теми. Наявність виразки шлунка підвищує ризик виникнення пухлини Далидович К.К., 1996; Богданов Б.А., 2002; Черноусов А.Ф., Богопольский П.М., 2000. Доведено, що попередня органічна патологія дванадцятипалої кишки має вплив, як на подальший розвиток виразки шлунку (ВШ), так і її малігнізації Койко М.А., 2002. Хронічний атрофічний гастрит, кишкова метаплазія, які нерідко супроводжують перебіг ВХ, підвищують ризик розвитку РШ Yoshimura T., Shimoyama T., Tanaka M. et al., 2000. Товстокишкова метаплазія та дисплазія епітелію вважаються пренеопластичними процесами Далидович К.К., 1996; Василенко И.В., Сургай Н.Н., Сидорова Ю.Д., 2001. Вірогідність пухлинної трансформації виникає не тільки в періульцерозній зоні, а й у віддалених від виразки ділянках слизової оболонки шлунку (СОШ), що значно ускладнює ранню діагностику. До того ж традиційні методи доопераційної діагностики, нажаль, мають певний відсоток як хибнонегативних, так і хибнопозитивних результатів Койко М.А., Богданов Б.А., 2000. Отже, „залишається актуальним вибір лабораторних показників для формування групи підвищеного онкологічного ризику серед хворих з хронічними захворюваннями шлунка” Бочкарева Н.В., 2000, пошуку додаткових маркерів, які можуть допомоги в ранній діагностиці рака.

Зміни проліферативного режиму, енергообміну, активація процесів апоптозу, порушення мікроциркуляції та гіпоксія СОШ – загальні ланки патогенезу, як виразкової хвороби, так і рака шлунка. З цими процесами тісно пов'язаний метаболізм нуклеїнових кислот та їх попередників, вуглеводний обмін. Тому для дослідження вікових особливостей обміну вуглеводів та попередників ДНК обрані ключові ферменти гліколізу (лактатдегідрогеназа, ЛДГ), пентозофосфатного циклу (глюкозо-6-фосфатдегідрогеназа, Г6ФДГ), метаболізму піримідинових та пуринових нуклеотидів (тимідинфосфорилаза, ТФ та аденозиндезаміназа, АДА). Ензими пов’язані з процесами тканинної проліферації та апоптозу, є чутливими до змін процесів оксигенації. ЛДГ, Г6ФДГ, АДА необхідні для життєдіяльності клітин крові Каминская Г.О., Абдуллаев Р.Ю., 2002, в тому числі для еритроцитів. Морфофункціональні особливості останніх впливають на реологічні властивості крові, а також є важливими чинниками для змін в СОШ при ВХ Фартушняк Л.В., 2000 .

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота виконувалась відповідно до основного плану НДР Донецького державного медичного університету ім. М.Горького і є фрагментом комплексної теми “Молекулярні механізми репаративних процесів при деяких патологічних станах організму людини” (№ держреєстрації 0100U000010, шифр УН 00.01.19). Науковий внесок дисертанта у виконанні НДР полягає в дослідженні вікових особливостей обміну вуглеводів та попередників ДНК в процесах контрольованої репаративної проліферації у хворих на виразкову хворобу в порівнянні з неконтрольованим пухлинним ростом у хворих на рак шлунка. Тему дисертації затверджено на засіданні Вченої ради Донецького державного медичного університету ім. М.Горького від 21.12.00 р., протокол № 10.

Мета і завдання дослідження. Метою роботи було виявити зміни активності ферментів метаболізму попередників ДНК і вуглеводного обміну при виразковій хворобі та у хворих на рак шлунка різного віку. Визначити метаболічні зрушення, що можуть бути одними з чинників неопластичної трансформації при виразковій хворобі шлунка. Розробити рекомендації для вибору індивідуальної тактики лікування при виразковій хворобі. Відповідно до цього були поставлені наступні задачі:

1. Вивчити активність ферментів обміну нуклеотидів в тканинах і сироватці крові хворих на рак шлунка, виразкову хворобу різного віку.

2. Дослідити вікову динаміку активності лактатдегідрогенази та глюкозо-6-фосфатдегідрогенази в сироватці крові і гомогенатах тканин при виразковій хворобі, раку шлунка.

3. Виявити особливості метаболізму попередників ДНК та обміну вуглеводів в організмі при зазначених патологічних станах.

4. На підставі виявлених особливостей активності ферментів визначити метаболічні зрушення, які можуть бути одними із чинників неопластичної трансформації при виразковій хворобі шлунка.

5. Розробити рекомендації для вибору індивідуальної тактики лікування при виразковій хворобі.

Об'єкт дослідження: проліферативні процеси при ВХ та РШ, залежно від перебігу захворювань та віку хворих.

Предмет дослідження: вікові особливості обміну вуглеводів та попередників ДНК в організмі при ВХ та РШ.

Методи дослідження: особливості метаболізму нуклеотидів вивчали за активністю анаболічної та катаболічної ТФ (метаболізм піримідинових нуклеотидів), за активністю АДА (обмін пуринових нуклеотидів). В якості показників вуглеводного обміну використовували ключові ферменти основних метаболічних шляхів глюкози – ЛДГ (гліколіз), Г6ФДГ (пентозофосфатний цикл). Визначення активності проводилось спектрофотометричним методом. Для оцінки достовірності виявлених змін ферментативної активності застосовували параметричні та непараметричні статистичні методи. Для індивідуального зіставлення одержаних результатів з морфологічними особливостями СОШ, проведено аналіз історій хвороб, результатів ендоскопічних, рентгенологічних і морфологічних досліджень.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше виявлено, що у хворих на ВХ з ускладненнями та наявністю хронічного атрофічного гастриту, передракових змін (дисплазії, метаплазії), порушення обміну вуглеводів та попередників ДНК найбільш наближені до змін метаболізму при РШ. Вперше запропоновано ферментативний показник проліферації, доведено його кореляцію з проліферативною активністю слизової шлунка. Доведено взаємовплив між змінами активності ферментів еритроцитів та характером перебігу ВХ. Встановлено, що зниження активності АДА еритроцитів та підвищення активності ЛДГ пов’язані з розвитком ускладнень при ВХ.

Набуло подальшого розвитку вивчення вікових особливостей активності ферментів в тканинах слизової шлунка та в крові, залежно від характеру патологічних процесів, та від віку. Одержані результати підтверджують встановлений раніш взаємозв’язок між активністю тканинних та сироваткових ферментів і свідчать про суттєвість впливу вікового фактору на зміни метаболізму вуглеводів, попередників ДНК при ВХ, при РШ.

Практичне значення одержаних результатів. На підставі виявлених особливостей активності ферментів в еритроцитах розроблено спосіб прогнозування розвитку ускладнень ВХ. Він може бути використаний при визначенні ефективності лікувальних заходів, під час проведення профілактики ускладнень виразкової хвороби.

Запропоновано малоінвазивний спосіб ранньої діагностики раку, оскільки для досліджуваних ензимів підтверджено, що активність сироваткових ферментів відображає особливості їх активності в тканинах. Його доступність та інформативність роблять можливим впровадження в практику поряд з іншими діагностичними заходами для скринінгу пухлинних процесів.

Розроблено спектрофотометричну методику визначення активності відомого маркера проліферації та ангіогенезу. Запропоновано ферментативний показник проліферації, який можна використовувати для динамічного спостереження за хворими з підвищеним ризиком розвитку рака та при індивідуальному визначенні чутливості пухлини до 5-фторурацила (5-FU) і його попередників.

Результати дисертаційної роботи впроваджено в практику хірургічного відділення Донецького обласного клінічного територіального медичного об'єднання, терапевтичної клініки Інституту невідкладної і відновної хірургії АМН України, хірургічного відділення Маріупольського міського онкологічного диспансеру, Донецького обласного протипухлинного центру, а також у навчальний процес Громадської організації „Нове мислення у медицині” при Харківському національному університеті ім. В.Н Каразіна, в педагогічний процес при викладанні курсу біохімії в Донецькому державному медичному університеті ім. М. Горького.

Особистий внесок здобувача. Внесок автора в отримані результати досліджень складається з підбору, біохімічного обстеження хворих на ВХ, РШ. При консультативній допомозі керівника автором розроблена методика визначення активності анаболічної ТФ. Самостійно відпрацьовані інші методики визначення активності ферментів і отримання гомогенатів тканин, еритроцитів, сироватки крові. В період 2000 – 2002 рр. автор здійснювала збір матеріалу і біохімічні дослідження. Самостійно проведено збір і аналіз даних анамнезу, інструментальних і морфологічних даних. Результати розширеного морфологічного аналізу одержані завдяки консультативній допомозі зав. каф. патологічної анатомії, д.мед.н., проф. Василенко І.В. Ідея нового біохімічного показника проліферації належить науковому керівнику. Автор здійснила його визначення в тканинах слизової шлунка та сироватці крові залежно від патологічних та морфологічних змін. Довела його кореляцію з інтенсивністю проліферації. Нею зібрано та проаналізовано літературні дані, узагальнено і статистично оброблено результати досліджень (описова статистика, одно- та багатофакторний аналіз), написано розділи дисертації. Під час аналізу результатів дослідження застосовано метод кластерного аналізу з побудовою математичної моделі, які були проведені з к.мат.н. Гур’яновим В.Г. За допомогою керівника сформульовані висновки і практичні рекомендації.

Апробація результатів дисертації. Основні положення дисертаційної роботи обговорювались та були представлені на VIII Українському біохімічному з’їзді (Чернівці, 2002), 4-му міжнародному з’їзді патофізіологів (Угорщина, Будапешт, 2002), 1-й польсько-литовській конференції з внутрішніх хвороб (Польща, Катовіце, 2003), на науковій конференції Донецького регіонального відділення УБТ, присвяченій 100-річчю від дня народження Войнара О.Й. (Донецьк, 2004), IV Національному конгресі геронтологів і геріатрів України (Київ, 2005). Дисертаційна робота апробована на спільному засіданні кафедр біохімії, гістології, цитології та ембріології, патологічної анатомії, патологічної фізіології, загальної хірургії, анестезіології та реаніматології, кафедри медичної інформатики та біофізики з курсом медичної апаратури Донецького державного медичного університету ім. М.Горького (грудень, 2005 р.).

Публікації. Основні результати наукових досліджень відображені у 12 працях, в тому числі, в 3-х наукових статтях у фахових журналах (одна з них написана без співавторів); в 3-х деклараційних патентах та 6 тезах на наукових форумах.

Структура та обсяг роботи. Дисертація складається зі вступу, огляду літератури, основної частини, висновків, списку використаних джерел, який містить 301 джерело (82 кирилицею, 219 латиницею). Робота викладена на 191 сторінці. Вона містить 17 рисунків, 54 таблиці (31 з них розміщена в додатках).

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріали та методи дослідження. В ході роботи досліджена кров (сироватка та еритроцити) 74 хворих ВХ, 40 хворих РШ у віці від 20 до 79 років; тканини СОШ в місцях виразок та у віддалених ділянках у 20 хворих ВХ, аналогічно обстежено 41 зразок при раку шлунка. Контрольну групу склали 108 умовно здорових осіб, що не мали патології гастродуоденальної зони. В осіб похилого віку з контрольної групи, як і в основних групах, мала місце супутня патологія: ІХС, атеросклеротичний кардіосклероз, гіпертонічна хвороба 1 – 2 ступеня.

Активність ТФк визначали за збільшенням екстинкції тиміну на СФ-46 при довжині хвилі 300 нм, активність ТФан досліджували спектрофотометрично за розробленою нами методикою. Активність ключового ферменту катаболізму аденозина – АДА досліджували в гомогенатах тканин, сироватці і еритроцитах крові за методом Tritch, 1983. Одночасно визначали активність ЛДГ за швидкістю окиснення НАДН (Ещенко Н.Д.,1982). Активність Г6ФДГ також досліджували в тканинах, сироватці і еритроцитах крові за зміною оптичної щільності середовища в результаті відновлення НАДФ (Путилина Ф.Е., Зоидзе С.Д., 1982).

Визначення особливостей ферментативної активності при ВХ і РШ ми проводили з урахуванням гістопатологічної картини СОШ в кожному індивідуальному випадку. При цьому використовували дані морфологічних досліджень біоптатів, узятих при ендоскопічному обстеженні і (або) дослідженні післяопераційного матеріалу.

При статистичній обробці результатів було проведено одно- та багатофакторний аналіз, вивчення кореляційних зв’язків з використанням програм пакету “MedStat”.

Основні результати дослідження.

В ході роботи вивчено вікові особливості активності ензимів гліколізу й пентозофосфатного циклу (ЛДГ, Г6ФДГ) та метаболізму нуклеотидів (ТФ, АДА), залежно від морфологічних змін СОШ. Оцінено вплив статі на їх активність. Так встановили, що в нормі для сироваткової ТФан характерним є підвищення активності до 30 років. У віковому проміжку 30-39 років, як у жінок, так і у чоловіків встановлено її максимальні значення. При попарному порівнянні активності залежно від статі виявили, що до 40 років ТФан проявляє більшу активність у жінок. Потім у них вона знижується (t = 2,80, p < 0,05), тоді як у чоловіків достовірних змін активності в старших вікових групах не виявлено. Тому після 40 років статеві відмінності в активності сироваткової ТФан відсутні. Також у жінок в 30-49 років максимальну активність проявляє АДА. У чоловіків вона відносно постійна. Як і ТФан, активність АДА в сироватці у жінок 30-39 річного віку вища, ніж у чоловіків. При старінні наростає активність катаболічної ТФ, тоді як активність анаболічної достовірно не змінюється. Паралельно зі змінами активності ензимів метаболізму попередників ДНК, в сироватці підвищується активність ЛДГ, знижується активність Г6ФДГ. Стать, як і вік, також має вплив на активність ЛДГ. У чоловіків у зрілому віці вона дещо вища, так в 40-49 років в 1,3 рази перевищує активність в жіночому організмі.

Отже, в контрольній групі активність сироваткових ензимів залежна від статі: для ТФан (р<0,05), АДА (р<0,001), ЛДГ(р=0,002). Крім того, для ТФк і ЛДГ встановлено прямий зв'язок із віком (показник рангової кореляції Спірмена с = 0,847 і 0,801, відповідно). Така вікова динаміка може призводити до зниження активності “запасного шляху” синтезу попередників ДНК і свідчити про зростання катаболічних процесів та посилення процесів анаеробного гліколізу в похилому віці.

В метаболізмі еритроцитів також спостерігаються вікові особливості. Зокрема, знижується активність АДА (сильний зворотний зв'язок із віком, показник кореляції Спірмена с = -0,832, p<0,05). У жінок зниження активності АДА виникає дещо пізніше (після 60 років) в порівнянні з чоловіками (після 50 років) (t = 2,38, p < 0,05). Також в еритроцитах осіб похилого віку встановлено зниження активності Г6ФДГ в порівнянні з активністю в молодому віці (с = - 0,799, p<0,05).

Згідно отриманим результатам, вік та стать впливають на активність досліджуваних ферментів. Це необхідне враховувати як при підборі контрольних груп, так і при вивченні ферментативної активності за патології. Оскільки серед обстежуваних переважали хворі чоловіки, то дослідження ферментативної активності при патології проводили саме у них. За активністю ферментів група хворих ВХ виявилася неоднорідною і розділилася на дві групи (1 і 2 групи). При аналізі результатів патоморфологічного дослідження виявлено, що в 2-й групі, в переважній більшості випадків перебіг хвороби був ускладнений кровотечами або стенозуванням, перфорацією або ж пенетрацією. Крім того, ускладнений перебіг поєднувався з наявністю передракового стану – хронічного атрофічного гастриту (ХАГ), і, як правило, з розвитком передракових змін СОШ, тобто дисплазій різного ступеня і (або) кишкової метаплазії.

Відомо про вплив морфофункціональних властивостей еритроцитів на розвиток дистрофічних змін СОШ (Фартушняк Л.В., 2000). Зміни метаболізму клітин впливають на їх функції, тому нами вперше проведено одночасне дослідження вікових особливостей активності АДА, ЛДГ, Г6ФДГ в еритроцитах хворих ВХ і РШ. При цих захворюваннях встановлено зниження активності АДА еритроцитів і підвищення активності ЛДГ (див. рис. 1). За допомогою дисперсійного аналізу встановлено достовірність цих змін порівняно з контролем (р < 0,01). Окрім цього, для АДА виявлені статистично значущі відмінності її активності у хворих ВХ 1-й гр (р < 0,01) та 2-ї гр ВХ і в групі РШ. Більш низькі значення активності ферменту встановлено в еритроцитах у хворих ВХ 2-ї гр, серед хворих на РШ, в порівнянні з контролем. Активність АДА не відрізнялась між цими групами (р = 0,99). Активність ЛДГ еритроцитів хворих ВХ і РШ підвищується в напрямку від контролю до групи хворих РШ, є достовірні відмінності між всіма групами.

Рис. 1. Активність АДА, ЛДГ в еритроцитах в нормі і при патології, нмоль/хв/мг;

1- контроль, 2- 1-а гр ВХ, 3 – 2-а гр ВХ, 4- РШ.

Вік посилює зміни активності АДА, ЛДГ при патології. Так у хворих ВХ, РШ похилого віку зниження активності АДА більш виражено в порівнянні із молодими (коефіцієнт кореляції активності АДА з віком с = - 0,514). Підвищення активності ЛДГ еритроцитів також більш виражено при старінні організму (коефіцієнт кореляції активності ЛДГ з віком с = 0,512, p<0,05). Виявлені зміни активності ферментів можуть приводити до більш грубих порушень обмінних процесів в еритроцитах і, як наслідок, погіршення мікроциркуляції в тканинах, що необхідно враховувати при лікуванні хворих літнього віку.

В еритроцитах хворих ВХ 1-й гр у віці 20-29 років достовірних змін активності Г6ФДГ не виявлено, проте з віком виявляється тенденція до зниження (зворотна кореляційна залежність з віком, с = - 0,487). Статистично значуще зниження Г6ФДГ спостерігається у хворих ВХ 2-й гр і РШ.

Отже, максимальні зміни активності ензимів в еритроцитах характерні для 2-ї гр ВХ і РШ. Це вказує на наявність зв'язку між метаболічними порушеннями та інтенсивністю патологічних процесів в СОШ.

Відомо, що показники функціонального стану еритроцитів можуть застосовуватись для прогнозування розвитку ускладнень ВХ і для оцінки ефективності лікування (Коломоєць М.Ю.,1997, Рак О.Л. 1997). В ході дослідження нами вивчена можливість складання прогнозу щодо розвитку ускладнень ВХ за змінами значень співвідношення активностей АДА/ЛДГ еритроцитів. Вважаємо, що активність цих ензимів у червонокрівцях безпосередньо впливає на функціональний стан останніх і пов'язана з розвитком циркуляторної гіпоксії та порушеннями оксигенації СОШ. Це узгоджується з даними про зв'язок характеру протікання ВХ і розвитку її ускладнень з реологічними властивостями еритроцитів.

За однофакторним аналізом, значення співвідношення АДА/ЛДГ в контролі і при ВХ та РШ достовірно відрізнялись (p<0,001). При порівнянні між групами патології (множинні порівняння, критерій Данна) доведено, що за значеннями цього показника група хворих на ВХ неоднорідна. Відмінності для АДА/ЛДГ при неускладненій ВХ в 1-й групі в порівнянні з АДА/ЛДГ в 2-й групі достовірні (Q = 4,27, р < 0,01). В 2-й групі хворих на ВХ при розвитку ускладнень відзначено його зниження в 4 рази, в той час як при неускладненому перебігу в середньому в 1,6 разів порівняно з нормою. Отже, якщо в еритроцитах пацієнтів з неускладненим перебігом спостерігається зниження АДА/ЛДГ більш, ніж в 2 рази, то ризик розвитку ускладнень підвищується. Відомо про вплив віку на розвиток гіпоксійних процесів. Як в нормі, так і при патологіях при старінні організму значення показника АДА/ЛДГ знижувалися в порівнянні з більш молодим віком (кореляційні зв'язки значень АДА/ЛДГ і віку в нормі с = - 0,770 і при патологіях с = - 0,599; p<0,05).

Крім змін мікроциркуляції, з якими пов'язані виявлені порушення метаболізму еритроцитів, могутнім чинником патогенезу патологій, що вивчаються, є порушення проліферації. Відомо, що як ТФан (PD-ECGF), так і ТФк регулюють синтез піримідинового попередника ДНК за реутилізаційним шляхом. Фермент визнається чинником патогенезу як ВХ, так і РШ. Для ВХ і РШ характерним є підвищення активності ТФан та зниження ТФк, як в СОШ, так і в сироватці крові (табл. 1).

Для більш повної характеристики інтенсивності проліферації проводили одночасне визначення активності ТФан та ТФк. Встановили, що з посиленням тяжкості патологічного процесу в СОШ та зростанням проліферативної активності (неускладнена виразкова хвороба; розвиток ускладнень та наявність атрофії, передракових змін; рак шлунку), зростає і показник співвідношення ТФан/ТФк. Між цими процесами встановлено пряму кореляцію (с = 0,98, p < 0,014).

Таблиця 1

Активність ферментів метаболізму попередників ДНК в тканинах СОШ у чоловіків зрілого віку хворих на ВХ та РШ, нмоль/хв/мг

Діагноз | ТФан | ТФк | АДА

СОШ | Locus

morbi | СОШ | Locus

morbi | СОШ | Locus

morbi

ВХ 1-а група

(n = 10) | 37,68 ±

4,18 | 62,00 ±

7,13** | 63,89 ±

5,96 | 33,84 ±

2,95** | 7,57 ±

2,05 | 10,83 ±

2,39

ВХ 2-а група

(n = 10) | 40,05 ±

5,96 | 83,75 ±

6,22*** | 62,04 ±

6,40 | 25,50 ±

2,50*** | 9,15 ±

1,28 | 18,73 ±

5,17*

РШ

(n = 21) | 40,46 ±

4,77 | 88,01 ±

5,32*** | 57,82 ±

7,99 | 21,92 ±

4,60** | 13,91 ±

2,68 | 24,15 ±

4,32*

Примітка. *- р < 0,05, ** - р < 0,01, *** - р < 0,001 в порівнянні із СОШ

За даними багатофакторного аналізу активність ТФан, ТФк достовірно відрізняються серед 1-ї та 2-ї груп хворих на ВХ. Очевидно, це свідчить про істотний зв’язок між морфологічними змінами в СОШ та активністю досліджуваних ензимів. Що підтверджується зростанням проліферативної активності при атрофічному гастриті та досягненні максимальних значень при неповній кишковій метаплазії в порівнянні з нормальною СОШ (Василенко И.В., Садчиков В.Д., Галахин К.А., 2001). На користь інформативності ТФан/ТФк свідчать встановлені відмінності його значень залежно від гістологічного типу раку шлунка. Так, показник достовірно вищий в аденокарциномах, для яких характерна найбільша проліферативна активність в порівнянні з іншими раками (W критерій Вілкоксона 36,0, р<0,001).

Ранговий аналіз довів статистичну значущість відмінності ТФан/ТФк між контролем і патологіями, як в тканинах, так і в сироватці крові. Про залежність цього співвідношення від змін проліферативної активності також свідчать виявлені кореляції з віком як в нормі, так і при патології.

Серед хворих на ВХ 1-ї гр в сироватці крові виявлено статистично значуще підвищення ТФан/ТФк у віці 40-60 років (W критерій Вілкоксона 193,5, p<0,001), а серед 2-ї гр раніше - після 30 років (W-критерий 21,0, p<0,001). Після 40 років у хворих ВХ 2-ї гр значення ТФан/ТФк перевищують контрольні в 4,3-4,9 рази, наближаючись до значень при РШ. Таким чином, зміни активності тимідинфосфорилази віддзеркалюють інтенсивність проліферації, яка зростає при атрофії й передракових змінах. Крім цього, на активність ТФ впливає вік (див. рис. 2). Ймовірно, що ризик розвитку раку у хворих на ВХ після 40 років підвищується. Встановлені вікові особливості відношення ТФан/ТФк в сироватці крові мають прикладне значення. Можливим є його застосування при формуванні груп підвищеного онкоризику, під час моніторингу за хворими з цих груп. Вважаємо, що співвідношення активностей ТФан/ТФк може стати біохімічним показником проліферації, оскільки корелює з її інтенсивністю.

Рис.2. ТФан/ТФк в сироватці крові у чоловіків, при ВХ та РШ, залежно від віку: по осі х - цифри відповідають періодам 20- 29, 30 - 39, 40 - 49, 50- 59, 60 - 69, 70- 79 років;

по осі z - Р1 -ВХ 1-а група, Р2 -ВХ 2-а група, Р3 –РШ

Досліджувані патологічні процеси впливають і на активність АДА, ЛДГ, Г6ФДГ, як в тканинах, так і в крові. Для тканинної АДА (табл.1) виявлено підвищення активності в місцях ураження (Locus morbi) в 2-й гр ВХ (W критерій Вілкоксона 55,0, р<0,001) і при РШ (W 233,0, р<0,001) Це веде до посилення активності “запасного шляху синтезу” попередників ДНК, що узгоджується з наростанням проліферативної активності тканин. Підвищення активності ензиму в зоні виразки у хворих на ВХ 2-ї гр, в пухлинах при РШ корелює із зростанням активності АДА сироватки крові. Для сироваткового ферменту характерним є підвищення активності з віком (показник кореляції Спірмена (с) = 0,517), що узгоджується зі встановленими нами віковими змінами співвідношення активностей ТФан/ТФк у хворих на ВХ.

Більш виражені зміни активності у хворих на ВХ 2-ї гр та РШ також характерні для ЛДГ, Г6ФДГ. При цьому в тканинах активність ЛДГ підвищувалася не тільки в Locus morbi, але і у віддалених від пухлини або виразки відділах (табл. 2). Ймовірно, це пов'язано з порушеннями процесів оксигенації СОШ та домінуванням анаеробного гліколізу при патологіях, що вивчаються. При раку шлунка також може бути пов'язаний з феноменом продукції лактату в аеробних умовах.

Таблиця 2

Активність ферментів вуглеводного обміну в тканинах СОШ у чоловіків зрілого віку хворих на ВХ, хворих на РШ, нмоль/хв/мг

Діагноз | ЛДГ | Г6ФДГ | СОШLocus

morbiСОШ | Locus morbi | ВХ 1-а група

(n = 10) | 11,33 3,05 | 20,99 ±

2,93* | 2,51 ± 0,46 | 1,55 ± 0,37* | ВХ 2-а група

(n = 10) | 20,08 2,96 | 46,08

8,84* | 1,10 0,27 | 0,95 ±

0,27 | РШ

(n = 21) | 26,90 4,27 | 84,14

19,22** | 0,90

0,20 | 3,05 ±

0,30*** |

Примітка. *- р < 0,05, ** - р < 0,01, *** - р < 0,001 в порівнянні із СОШ

Встановлено зниження активності Г6ФДГ в зоні виразки в 1-й гр ВХ (W критерій Вілкоксона 58,5, р<0,001). При підвищенні інтенсивності патологічних процесів зниження активності ферменту набуває поширеного характеру і реєструється не тільки в періульцерозній ділянці, але й і у віддалених відділах СОШ у хворих ВХ 2-й групи та у хворих на РШ. На фоні цих змін в СОШ для тканин самої пухлини характерним є збільшення активності Г6ФДГ (W критерій Вілкоксону 210,0, р<0,001), що може сприяти зростанню інтенсивності її проліферативних процесів.

Активність сироваткових ЛДГ, Г6ФДГ в 1-й гр. хворих на ВХ практично у всіх вікових підгрупах достовірно не змінювалася. В 2-й гр., де ускладнений перебіг ВХ поєднувалася з розвитком передракових змін СОШ, активність обох ензимів підвищувалася. З віком ці зміни дещо посилювались: (прямий зв'язок середньої сили для активності сироваткової ЛДГ і віку с = 0,465, а також для Г6ФДГ показник кореляції Спірмена с = 0,524). Достовірне підвищення активності ферментів сироватки крові встановлено і при РШ. Таким чином, виявлені зміни активності сироваткових ферментів обміну вуглеводів взаємопов'язані з тяжкістю патологічних процесів в СОШ.

Про доцільність визначення активності досліджуваних ферментів в сироватці крові, зокрема ТФан/ТФк, для ранньої діагностики раку, свідчить наступний приклад. В хірургічне відділення ДОКТМО ім. Калініна був госпіталізований хворий Б. 60-ти років з попереднім діагнозом: ВХ, активна фаза, виразка шлунка, ускладнена кровотечею. Разом із загальноклінічними дослідженнями при госпіталізації вивчена активність ферментів обміну вуглеводів та метаболізму попередників ДНК в сироватці крові (нмоль/хв/мг): ТФан 16,93; ТФк 18,01; ТФан/ТФк 0,94; АДА 4,00; ЛДГ 11,69; Г6ФДГ 1,41. Звернули увагу, що не тільки активність ензимів, які використовуються при розрахунку пропонованого показника проліферації, але й ферментів вуглеводного обміну була подібна до активності при раку у відповідній віковій групі. Так при РШ в групі 60-69 років: ТФан 17,09±2,81; ТФк 17,08±2,50; ТФан/ТФк 1,00±0,03; АДА 6,00±0,78; ЛДГ 13,35±1,60; Г6ФДГ 0,89±0,10. Отже, за значеннями ТФан/ТФк, активністю ТФан, ТФк, ЛДГ, Г6ФДГ сироватки крові, зміни метаболізму були подібні до таких у пухлинах, що дозволяло запідозрити рак.

З чинників, що підвищують вірогідність розвитку раку при ВХ шлунка, були, наявність в анамнезі з 1967 року виразки дванадцятипалої кишки. В травні і червні 2002 рр. спостерігалися кровотечі, проходив курс консервативної терапії. Госпіталізований у відділення в 2002 липні. Гастроскопія: виразка шлунку до 3,5 см в діаметрі, краї нерівні, щільні. Виразка вимагає морфологічної оцінки. Біопсія: фібриноїдний некроз, інфільтрація лейкоцитами, пептична виразка. В дрібному фрагменті – легка дисплазія. Виконано резекцію шлунку по Більрот I. Гістологічний висновок: в препараті аденокарцинома, раковий лімфангоїт. Заключний діагноз: Рак шлунку. Т3N2M0.

Під час роботи нами було вивчено вікові особливості активності окремих ферментів у здоровому організмі, при ВХ, при РШ. Для оцінки системного впливу хвороби на організм людини та визначення специфічних змін при ВХ та РШ для всієї сукупності досліджених ензимів, було застосовано методи кластерного аналізу з побудовою нейронних сітей Кохонена. Результати аналізу тканинних ферментів (як попередників ДНК, так і обміну вуглеводів) довели неоднорідність групи пацієнтів з ВХ, що значення ферментативної активності у 1-й гр ВХ, в 2-й гр ВХ та серед хворих на РШ чітко відрізняються між собою (статистично значущі відмінності по критерію хі-квадрат, p<0,001). У хворих 2-ї гр ВХ зміни активності наближаються до таких при РШ. Проте більше практичне значення має можливість використання в діагностичних цілях активності ензимів крові. Встановлено, що розподіл хворих за показниками активності ензимів по кластерах патологій є достовірним (по критерію хі-квадрат p<0,001). Аналіз центрів кластерів показав, що відмінності значень активності ферментів крові максимальні між групою контролю і РШ. Крім того, відрізняються за ферментативною активністю кластер 1-ї та 2-ї груп ВХ (для 2-ї гр. ВХ характерним є ускладнений перебіг та, як правило, протікання хвороби на фоні хронічного атрофічного гастриту, та супутній розвиток кишкової метаплазії, дисплазії).

Таким чином, доведено, що сироватка відображує особливості активності тканинних ензимів, що група хворих на ВХ неоднорідна. На особливості метаболізму попередників ДНК, обміну вуглеводів впливають як характер протікання ВХ, так і супутні морфологічні зміни СОШ (фон на якому протікає ВХ).

Отже, інформативне, недороге і просте у виконанні біохімічне обстеження може бути включено в традиційний комплекс діагностичних методів при пухлинній патології. Найбільшу практичну значущість може мати його використовування при динамічному спостереженні в групі підвищеного онкоризику, куди (за виявленими особливостями метаболізму) можуть бути віднесені хворі, у яких ВХ протікає на фоні ХАГ, передракових змін СОШ.

ВИСНОВКИ

В дисертації наведено теоретичне узагальнення і нове рішення наукової задачі, що виражається у встановленні вікових відмінностей обміну вуглеводів і попередників ДНК в процесах проліферації у пацієнтів з виразковою хворобою та з раком шлунка, виявленні метаболічних зрушень, які можуть сприяти неопластичній трансформації та бути використані при індивідуальному виборі тактики лікування. Наукове завдання вирішено шляхом експериментального вивчення вікової активності маркерних ферментів обміну вуглеводів і попередників ДНК, зіставлення їх з особливостями патоморфології тканин.

1. Вікове підвищення активності ТФк (с = 0,847) та ЛДГ (с = 0,801) в крові здорових людей, свідчить про посилення катаболічних процесів і анаеробного гліколізу при старінні. Після 60 років достовірне зниження активності Г6ФДГ та АДА в еритроцитах може бути метаболічним фоном для розвитку морфофункціональних змін червонокрівців в похилому віці.

2. Динаміка вікових змін активності ферментів метаболізму попередників ДНК у хворих ВХ і РШ відрізняється в порівнянні з нормою. На фоні виявлених змін вуглеводного обміну, це сприяє посиленню процесів проліферації, які використовують енергію анаеробного гліколізу.

3. Встановлено зворотний зв’язок між співвідношенням активності АДА, ЛДГ в еритроцитах та віком і важкістю патологічних процесів, обумовлених зокрема, порушенням оксигенації СОШ та ступенем розвитку гіпоксії.

4. Математичний аналіз засвідчив, що зміни активності ТФан/ТФк залежать не тільки від віку, але більшою мірою від морфологічних змін в СОШ. Встановлено, що після 40 років у хворих ВХ з супутніми передраковими змінами вони максимально наближені до метаболічних зсувів при РШ. Це вказує на підвищення онкоризику у таких хворих в старших вікових групах.

5. Виявлені відмінності в активності тимідинфосфорилази пацієнтів з ВХ різної важкості дозволяють використовувати її визначення при виборі індивідуальної тактики лікування.

6. Вікові зміни активності ферментів метаболізму вуглеводів та попередників ДНК, які відображають посилення проліферативних та гіпоксичних процесів, дозволяють вважати вік суттєвим чинником в патогенезі виразкової хвороби та раку шлунка.

ПРАКТИЧНІ РЕКОМЕНДАЦІЇ

1. Співвідношення ТФан/ТФк важливо застосовувати при індивідуальному визначенні онкоризику. Хворі на виразкову хворобу з наявністю передракових змін в слизовій оболонці шлунка і які в анамнезі мають ускладнення, при зростанні показника співвідношення потребують раннього оперативного лікування.

2. Дослідження активності ензимів в еритроцитах (аденозиндезамінази, глюкозо-6-фосфатдегідрогенази, лактатдегідрогенази) варто застосовувати при обстеженні хворих з виразковою хворобою та у хворих на рак шлунку. Ці показники можуть використовуватись для прогнозування характеру перебігу хвороб та оцінки ефективності лікування.

3. Показник співвідношення АДА/ЛДГ еритроцитів дозволяє прогнозувати перебіг виразкової хвороби. Ризик розвитку ускладнень підвищується при зниженні його в 2 рази і більше порівняно з віковою нормою.

СПИСОК ОПУБЛІКОВАНИХ ПРАЦЬ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Бакурова Е.М. О возможности использования ферментативного теста для ранней диагностики и при лечении рака желудка// Архив клин. и экспер. медицины. – 2003. –Т.12, №.2 -С. 204 – 209.

2. Борзенко Б.Г., Кульчицкий О.К., Бакурова Е.М. Возрастные аспекты метаболизма тимидинмонофосфата и возможные пути его контроля // Пробл. старения и долголетия. – 2002. – Т.11, №4. – С. 363 –369. (Особисто здобувачем проведено дослідження активності ТФан, ТФк, статистичну обробку результатів, написання статті).

3. Роль ферментативной особенности гипоксии при язвенной болезни / Б.Г. Борзенко, Е.М. Бакурова, Т.Н. Кухнина, А.М.Дудин // Лікарська справа. – 2003. – № 1 (січень лютий). – С.67– 71. (Здобувачем проводились дослідження активності АДА, ЛДГ. Аналіз результатів статистичної обробки, написання статті).

4. Патент 48550А України МКИ А 61В10/00. Спосіб діагностики раку: Патент 48550А України, МКИ А 61В10/00 Б.Г, Борзенко, О.М. Бакурова, І.В. Василенко, О.М. Білозерцев (Україна). – № 2001106848; Заявл. 09.10.01; Опубл. 15.08.2002, Бюл. промисл. власн. №8. (Здобувачем проведено патентний пошук, написання та оформлення матеріалів патенту).

5. Патент 60586 А України МКИ А 61В10/00. Спосіб прогнозування розвитку ускладнень виразкової хвороби: Патент 60586 А України, МКИ А 61В10/00 Б.Г. Борзенко, О.М. Бакурова, Т.М. Кухніна, О.М. Дудін (Україна). – № 2003010158; Заявл. 01.01.03; Опубл. 15.10.2003, Бюл. промисл. власн. – № 10. (Особисто здобувачем запропоновано та визначено ферментативний показник гіпоксії, виконано аналіз матеріалу).

6. Патент 3105 України МКИ А 61В10/00. Спосіб визначення індивідуальної хіміочутливості пухлин шлунка до 5-фторурацилу та його попередників: Патент 48550А України, МКИ А 61В10/00 Б.Г, Борзенко, О.М. Бакурова, Т.Н. Кухніна, Ю.В. Думанський (Україна). – № 2004010563; Заявл. 26,01,04; Опубл. 15.10.2004, Бюл. промисл. власн. – № 10. (Особисто здобувачем проведено патентний пошук, визначення активності ТФан, ТФк, зіставлення результатів біохімічних тестів з даними патоморфологічних досліджень, написання матеріалів патенту).

7. Борзенко Б.Г., Бакурова О.М. Експрес-тест діагностики ускладнень виразкової хвороби// Фізіологічний журнал. – 2002.- Т.48, № 4. – С.116-117. (Здобувачем проведені дослідження ферментативної активності, зіставлення результатів з характером перебігу хвороби, написання та підготовка тез до друку).

8. Особенности метаболизма углеводов в процессах регулируемой и нерегулируемой пролиферации в слизистой оболочке желудка / Бакурова Е.М., Соколовская Л.В., Никонова А.А., Горбачев А.А., Борзенко Б.Г.// Матеріали VIII Українського біохімічного з’їзду, 1-3 жовтня 2002р., м. Чернівці. - Укр. біохім. журн.- 2002. – Т.74, №4а (додаток 1).- С.22. (Здобувачем проведено дослідження ферментативної активності, аналіз результатів).

9. Borzenko B., Bacurova H., Akhtar N. Use of biochemical markers of an angiogenesis in clinical practice // 4th International Congress of Pathophysiology, Budapest, Hungary. June 29-July 5, 2002. - Acta Physiologica Hungarica. – 2002. - Vol. 89, № 1-3. - P.101.

(Здобувачем проведено біохімічні дослідження, статистичну обробку результатів, написання російськомовного варіанту тез).

10. Borzenko B.G., Akhtar M.N., Bacurova H.M. The role of disturbed metabolism of DNA precursors in pathogenesis of peptic ulcer and development of the complicated course of the disease // The first polish-lithuanian conference on internal medicine. Katowice, March 7-8. 2003. - Annales academie medicae silesiensis. – 2003. - Supl. 54. – P. 20. (Здобувачем проведено біохімічні дослідження, зіставлення результатів з клінічним перебігом хвороби, написання російськомовного варіанту тез).

11. Metabolic features of apoptosis at ulcer disease and cancer of a stomach / B.G. Borzenko, H.M. Bacurova, M.N. Akhtar, Y.V. Dumamelb // FEBS Special Meeting 2003 on Signal Transduction. Brussels, Belgium 3-8 July 2003. - EJB. – Vol. 270, Suppl. 1, July 2003. – P. 91-92. (Здобувачем проведено дослідження активності ізоферментів тимідинфосфорилази, розраховано показники проліферативної активності, написання російськомовного варіанту тез).

12. Бакурова О.М., Борзенко Б.Г. Вікові