ТАВРІЙСЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ

ІМ. В.І. ВЕРНАДСЬКОГО

ГАММА ТЕТЯНА ВІКТОРІВНА

УДК 612.014.46:612.821:615.214:547.78

ВПЛИВ БЕНЗИМІДАЗОЛУ І ЙОГО НОВИХ ПОХІДНИХ НА ЕЛЕКТРИЧНУ АКТИВНІСТЬ НЕЙРОНІВ Helix albescens Rossm. І ПОВЕДІНКУ ЩУРІВ

Спеціальність 03.00.13 — Фізіологія людини і тварин

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Сімферополь – 2006

Дисертацією є рукопис

Роботу виконано у Таврійському національному університеті

ім. В.І. Вернадського

Науковий керівник - доктор біологічних наук,

Коренюк Іван Іванович,

Таврійський національний університет

ім. В.І. Вернадського,

професор кафедри фізіології людини і тварин та

біофізики

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор,

Ляшенко Валентина Петрівна

Дніпропетровський національний університет

МОН України,

завідувач кафедри фізіології людини і тварин

доктор хімічних наук, професор,

Гришковець Володимир Іванович,

Таврійський національний університет

ім. В.І. Вернадскього, завідувач кафедри фізичної та аналітичної хімії

Провідна установа: Донецький національний університет МОН України, м. Донецьк

Захист відбудеться “21“ вересня 2006 р. о 14.00 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради К 52.051.04 при Таврійському національному університеті ім. В.І. Вернадського за адресою: пр. Вернадського, 4, Сімферополь, 95007

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Таврійського національного університету ім. В.І. Вернадського за адресою: пр. Вернадського, 4, Сімферополь, 95007

Автореферат розісланий 18 серпня 2006 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради

К 52.051.04,

кандидат біологічних наук Хусаінов Д.Р.

Підписано до друку _09.08.06 _Формат 60х80/16

Тираж 100

Надруковано у видавничому відділі

Таврійського національного університету ім. В.І. Вернадського

95007, м. Сімферополь,

пр. Вернадського, 4

Загальна характеристика роботи

Актуальність теми. Вперше властивості бензимідазолу і його похідних стали обговорюватися в літературі понад 100 років тому (Hobrecker F., 1872). Особливий інтерес до цього класу сполук виник після того, як було встановлено, що одним з компонентів вітаміну В12 є 5,6-диметилбензимідазол (Hodgkin D, Pickworth J., Robertson S., et al., 1955). У деяких похідних бензимідазолу виявлені різні по силі і напрямку дії психостимулючі (Розин, 1951; 1971), нейролептичні (Спасов А.А., Ієжица І.Н., Бугаєва Л.І., Анісімова В.А., 1999), антидепресантні (Шаймарданова Г.С., Камбург Р.А., Євстігнєєва Р.П., Сєргєєва Н.В., 1992), транквілізуючі (анксиолітичні) (Кірічек Л.Т., Бобков Ю.Г., 1991), протисудомні (Михайлов І.Б.,, Гузева В.І., Шарф М.Я., 1997) і снодійні (Бугаєва Л.І., Спасов А.А., Вєровський В.Є., Ієжица І.Н., 2000) властивості. Показано, що дибазол і 5,6-диметилбензимідазол (димедазол, димезол) усувають деякі неврологічні порушення при експериментальній травмі головного мозку і можуть бути використані для профілактики больового шоку (Розін М.А., 1951; 1971; Шаймарданов Г.С., Камбург Р.А., Євстігнєєва Р.П., Сєргєєва Н.В., 1992).

Слід зазначити, що до теперішнього часу передбачається декілька можливих механізмів дії похідних бензимідазолу. Так, за даними Maryanoff B.E., Ho W., McComsey D. et al. (1995) анксиолітична активність деяких похідних бензимідазолу обумовлена їхньою взаємодією з бензодіазепіновими рецепторами, а саме з ГАМКА-рецепторами. При стимуляції бензодіазепінових рецепторів спостерігається алостерична активація ГАМКА- рецепторів, тому взаємодія бензимідазолів з рецепторами проявляється у вигляді ГАМК-миметичного ефекту. Встановлено також, що деякі похідні бензимідазолу є антагоністами кальцію, тому що мають здатність блокувати повільні кальцієві канали гладеньком’язових клітин кровоносних судин (Анісімова В.А., Спасов А.А., Левченко М.В., Александрова О.А., 1995; Ковальов Г.В., Гофман С.М., Івановськая С.В. та ін., 1972; Сімонов А.М., Білоус А.А., Анісімова В.А, Івановськая С.В, 1990). Для бемітилу, який має м’який психостимулюючий і транквілізуючий ефекти, передбачається, що в основі механізму його дії є активація синтезу РНК в результаті взаємодії препарату з геномом завдяки структурній схожесті похідних бензимідазолу з пуриновими основинами нуклеїнових кислот - аденіном і гуаніном (Смірнов А.В., 1984).

Крім вивчення фармпрепаратів групи бензимідазолу до цього часу синтезуються багато й інших його похідних, які потребують детального дослідження їхньої фізіологічної активності. Деякі автори передбачають, що модифікація молекули бензимідазолу у другого атому вуглецю може привести до появи у нових сполук нейро- і психотропних властивостей. Саме цей ряд нових похідних бензимідазолу і привернув нашу увагу. Виходячи з того, що похідні бензимідазолу впливають на ЦНС, то, в очевидь, механізми нейротропної дії можуть бути розкриті при вивченні змін характеристик електричних потенціалів нейронів, а наявність і напрямок психотропної дії – при вивченні поведінки тварин.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дослідження проводилися в рамках науково-дослідницьких робіт кафедри фізіології людини і тварин і біофізики та кафедри органічної хімії Таврійського національного університету ім. В.І. Вернадського за програмами: “Дослідження функціональної організації нервової системи і механізмів впливу хімічних сполук на нейрони” (№ держ. реєстрації 0103U00209) і “Розробка методів синтезу замісних 2-(N-фенілпіромідон-2-іл) бензимідазолів – катализаторів і ініціаторів хімічних реакцій” (№. держ. реєстрації 0103U004783).

Мета дослідження

Метою роботи було визначити наявність, напрямок, концентраційну залежність і механізм дії бензимідазолу і деяких нових його похідних на електричні процеси в нейронах виноградного равлика, а також наявність і напрямок впливу тестованих речовин на поведінку щурів.

Задачі роботи:

1. Використовуючи метод внутрішньоклітинного відведення біопотенціалів виявити наявність, напрямок і особливості впливу бензимідазолу і деяких його похідних на електричну активність ідентифікованих і неідентифікованих нейронів виноградного равлика. Визначити порогові, оптимальні і токсичні концентрації тестованих речовин.

2. За допомогою методу електричного диференціювання потенціалів дії (ПД) визначити іонні механізми дії бензимідазолу і його нових похідних при безпосередній їхній аплікації на нейрони ізольованного підглоткового комплексу гангліїв виноградного равлика.

3. За допомогою поведінкового тесту “відкрите поле” виявити у щурів наявність і напрямок психотропної дії бензимідазолу і його нових похідних при системному їх введенні.

4. Визначити наявність залежності хімічна структура – напрямок дії бензимідазолу і його аналогів на нейронну і поведінкову активність.

Об’єкт дослідження – нервові клітини молюска Helix albescens Rossm., поведінка щурів, бензимідазол і його похідні.

Предмет дослідження – наявність, напрямок і особливості впливу бензимідазолу і деяких його похідних на електричну активність нейронів і поведінку щурів.

Методи дослідження – макро- і мікропрепарування нервової системи молюска, ідентифікація нейронів, внутрішньоклітинне відведення біопотенціалів, позаклітинна аплікація речовин, електричне диференціювання біопотенціалів, тест “відкрите поле”.

Наукова новизна отриманих результатів. Вперше досліджено вплив 2-бензилбензимідазолу (1), 2-етилтіобензимідазолу (2), бензимідазолу (3), 2-метилбензимідазолу (4), 2-етилбензимідазолу (5), 2-амінометилбензимідазолу (6), 2-(1-гидроксиетил)бензимідазолу (7), 2-(3-гидроксипропіл)бензимідазолу (8), 2-трифторметилбензимідазолу (9) і 2-циклопропілбензимідазолу (10) на електричну активність нейронів виноградного равлика. Встановлено, що ці сполуки мають нейротропні властивості, напрямок дії яких залежить від їхньої хімічної структури і типу нейронів. Визначені порогові, оптимальні і токсичні концентрації досліджених речовин. Виявлено, що 3 і 9 в концентрациях 10-3 і 10-2 М у деяких нейронів призводять до проявлення як збуджуючих (ЗПСП), так і гальмівних (ГПСП) постсинаптичних потенціалів на мембрані соми пейсмекерних і непейсмекерних нейронів, а також до глибокої гіперполяризації мембрани. Показано, що на мембрані пейсмекерних нейронів, а саме, нейрона ППа2, є як мінімум дві, просторово розділені, з різними механізмами запускання ПД трігерні ділянки. При одноразовому внутрішньочеревинному введенні (50 мг/кг) розчину речовин на підставі отриманих єфектів досліджені сполуки були поділені на 2 групи. До першої віднесено речовини 1-5, які пригнічують локомоцію і психоемоційний стан щурів, а до другої – сполуки 6-8, що активують ці показники. Встановлено, що в дозах 100 і 150 мг/кг всі дослідженні сполуки пригнічують поведінку тварин.

Теоретичне і практичне значення роботи. Отримані результати мають теоретичну цінність, тому що значно розширюють уявлення про механізми виникнення і регуляції електричної активності в нервових клітинах молюсків. Практичне значення результатів роботи полягає в тому, що досліджено особливості впливу бензимідазолу і деяких його нових похідних на нейронну і поведінкову активність тварин, а також визначено їхні порогові, оптимальні і токсичні концентрації при позаклітинній аплікації, що повинно бути враховано в експериментальній фармакології при розробці лікарських засобів на їхній основі. Результати досліджень використовуються при підготовці курсу лекцій з різних фізіологічних і суміжних дисциплін на кафедрі фізіології людини і тварин і біофізики Таврійського національного університету ім. В.І. Вернадського (акт впровадження від 7.07.2006) та кафедрі нормальної фізіології Кримського державного медичного університету ім. С.І. Георгієвського МОЗ України (акт впровадження від 30.06.2006)

Особистий внесок здобувача. Особистий внесок є достатнім і полягає в тому, що автор самостійно провела аналіз літературних даних, виконала всі експериментальні дослідження, провела математичну обробку даних. Постановка цілей і задач дослідження, а також інтерпретація експериментальних даних здійснені при участі наукового керівника.

В працях, написаних у співавторстві, автору належать узагальнення літературних даних, підготовка експериментальної частини та статистична обробка даних.

Апробація результатів дисертації. Основні положення роботи були представлені на Всеукраїнській конференції “Актуальні проблеми сучасного природознавства” (Сімферополь, 2001), і III конференціях Українського товариства нейронаук (Донецьк, 2001; 2005), XVI і XVII з’їздах Українського фізіологічного товариства (Вінниця, 2002; Чернівці, 2006), Тhe International Conference “New technologies of obtaining and application of biologically active substances’, (Alushta, 2002), International Summer Workshop “Pharmacology of Synaptic Transmission in the Nervous System” (Kiev, 2002), конференції, присвяченої пам’яті Шостаковської І.В. (Львів, 2002), International conference chemistry of nitrogen containing geterocycles CNS-2003 (Kharkov, 2003), Всеукраїнській конференції молодих вчених “Актуальні питання сучасного природознавства – 2003” (Сімферополь, 2003), Всеукраїнській науково-практичній конференції “Проблеми вікової фізіології” (Луцьк, 2005) і обговорювалися на наукових конференціях професорсько-викладацького складу Таврійського національного університету ім. В.І. Вернадського (Сімферополь, 2000-2006).

Публікації. Результати роботи опубліковані в 15 наукових працях, з яких 6 – у вигляді статей і 9 – у вигляді тез.

Структура і об'єм дисертації. Дисертація написана на 124 сторінках машинописного тексту і містить вступ, огляд літератури, матеріали и методи досліджень, результати і їх обговорення, закінчення, висновки та список літератури с приведеними 198 вітчизняними і зарубіжними джерелами. Дисертація має 25 рисунків.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

У Вступі обґрунтовано актуальність вибраної теми досліджень, сформульовано мету і задачі роботи, розкрито новизну, а також теоретичне і практичне значення отриманих результатів, особистий внесок здобувача, наведено інформацію про апробацію результатів дослідження.

У розділі „Огляд літератури” проаналізовано і узагальнено наукові дані про нервову систему молюска, особливості функціонування нейронів і параметри їх електричної активності, а також відомі дані про біологічний вплив речовин, що досліджені в дисертаційній роботі. Наголошується на фрагментарності і суперечливості відомостей, що є в літературі.

У розділі „Матеріали і методи дослідження” обґрунтовано і розкрито методи дослідження і статистичного аналізу.

Нейрофізіологічні експерименти були проведені за допомогою стандартної методики внутрішньоклітинного відведення біопотенціалів (Сахаров Д.А., 1974; Кононенко Н.І., 1981) на 335 ідентифікованих і 254 неідентифікованих нейронах дорзальної поверхні підглоткового комплексу гангліїв равлика Helix albescens Rosm.

Схема постановки експерименту була наступною: спочатку реєстрували фонові електричні параметри, які відображають початковий функціональний стан нейронів (контроль), потім через 0,5, одну, п’ять і 20 хв від моменту аплікації речовини і аналогічно від початку відмивання. Аналізували наступні компоненти електричних потенціалів: величину мембранного потенціалу (МП), частоту генерації імпульсів (ЧГІ), критичний рівень деполяризації (КРД) транссинаптичних ПД, амплітуду ПД, тривалість висхідної і низхідної його фаз, амплітуду і тривалість слідової гіперполяризації. Розрахунок значень іонних струмів аналізували по Магура, 1981. Реєстрація та обробка експериментальних даних забезпечувалась комп’ютерною програмою „Action potential” (Замотайлов А.А, Коренюк І.І., 2004).

Тестовані хімічні сполуки розводилися стандартним розчином Рінгеру для холоднокровних тварин (в мМ: NaCl-100, KCl-4, CaCl2-10, MgCl2-4, ТРИС-HCl-10; рН 7.5) до потрібних концентрацій. Аплікація виконувалася шляхом заміни розчину Рінгера на розчин тестованої речовини в експериментальну камеру. Нерозчинні в розчині Рінгеру похідні бензимідазолу переводили в хлориди. З кожною тестованою сполукою в концентраціях 10-6, 10-5, 10-4, 10-3 і 10-2 М було проведено не менш 15 експериментів на різних типах нейронів.

Дослідження психотропної дії речовин проведено на 90 білих безпородних щурах-самцях (маса 180-220 г) з середньою руховою активністю (Кулагін Д.А., Болондінський Б.К., 1986). Для тестування конкретної сполуки використовували дві групи щурів по 10 особин в кожній. Одній групі внутрішньочеревинно вводили 0,2 мл фізіологічного розчину (контроль), а другій – 0,2 мл тестованої сполуки в дозах 50, 100 і 150 мг/кг. Введення розчинів здійснювалося по (Буреш Я., Бурешова О., Х’юстон Д., 1991) наступним чином: спочатку одноразово вводили тестований розчин і через 1.5 год від моменту ін’єкції реєстрували параметри активності щурів. Потім після тиждневої перерви тваринам також одноразово вводили сполуки в дозі 100 мг/кг і аналогічно 150 мг/кг. Оцінка впливу тестованих речовин на активність тварин здійснена за допомогою тесту “відкрите поле”, який дозволяє оцінити цілостну фізіологічну реакцію тварини на ту чи іншу дію (Маркель А.Л., 1981; Калуєв О.В., 1998).

Обробку і аналіз експериментальних даних здійснювали за допомогою пакета програм Statistica 5.0. Експериментальні дані до і після дії речовин порівнювалися за непараметричними критеріями Вілкоксона і Мана-Уітні (вірогідність різниці середніх значень Р?0,05). Дані аналізу параметрів окремих нейронів чи щурів в тексті наведені як абсолютні, а в деяких випадках для більш наочного представлення результатів використовували відносні одиниці (%).

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ОБГОВОРЕННЯ

Вплив бензимідазолу і його похідних на електричну активність нейронів молюска

В даному розділі роботи встановлені порогові концентрації сполук, які для 1-6, 8 і 9 складають 10-5 і для 7 і 10 – 10-4 М. При цих концентраціях ефекти дії досліджених речовин були ледве помітними. При високих концентраціях виявлено, що нейрони різних типів специфічно реагують на одні і тіж, а тим більш на різні тестовані сполуки. Так, дибазол (1) у всіх застосованих концентраціях пригнічує електричну активність нейронів ППа1, а в концентрації 10-4 М – селективно активує электрогенез нейронів ППа2 і ППа7, тобто підвищує амплітуду ПД і ЧГІ, а при концентраціях 1 10-3 і 10-2 М спострерігається пригнічення електричної активності цих нейронів. У зв’язку з цим ми припустили, що дія дибазолу на ці нейрони реалізується за рахунок пригнічення дибазолом трансмембранних іонних струмів, які забезпечують біоелектричні процеси в нервових клітинах.

Аналіз першої похідної ПД (Магура І.С., 1981; Костюк П.Г., Магура І.С., 1984) дозволив з’ясувати іонні механізми дії тестованих сполук. Виявлено, що 1 в концентраціях 10-4 і 10-3 М значно сповільнює максимальну швидкість зростання ПД нейрона ППа1 (від 11,1 0,35 В/с в фоні до 9,1 1,1 і 7,14 0,25 В/с відповідно, р0,05) (рис. 1). Оскільки швидкість зростання ПД є показником зниження максимальної швидкості струму, який входить до клітини під час висхідної фази ПД (Магура І.С., 1981), то вочевидь 1 уповільнює вхідний Na+-струм. Однак, з літератури відомо, що у нейронів молюска, в тому числі у ППа1, роль переносників вхідного струму виконують не тільки іони Na+, але і Са2+ (Кононенко Н.І., Щербатко А.Д., 1985; 1986; Костюк П.Г., Кришталь О.А., 1981; Костюк П.Г., 1984). Виходячи з цього ми вважаємо, що крім натрієвого дибазол інгибує і кальцієвий струм. Разом зі зменшенням швидкості розвитку ПД 1 в вищезазначених концентраціях зменшує і максимальну швидкість його спаду (від 13,351,8 В/с у фоні до 10,5 1,6 і 7,2 1,4 В/с, р0,05 відповідно). З цього виходить, що 1 пригнічує і вихідний затриманний калієвий струм, який, як відомо (Магура І.С., 1981; Костюк П.Г., Магура І.С., 1984), забезпечує низхідну фазу ПД. Таким чином, 1 в концентраціях 10-4 і 10-3 М здійснює пригнічуючу дію, як на вхідні, так і на вихідні струми, які приймають участь у генерації ПД. В концентрації 10-2 М 1 у нейрона ППа1 швидше ніж при вищеописаних концентраціях інгибує і вхідні і вихідні сумарні іонні струми, які задіяні в розвитку ПД нейрону.

Кількісний аналіз кривих трансмембранних іонних струмів показав, що 1 здійснює більш чіткий вплив на вхідні струми, які зменшуються від 105*10-9-110*10-9 А в фоні до 5*10-9-10*10-9 А у відповідь на збільшення концентрації речовини до 10-2 М. Одночасно знижуються і вихідні струми від початкових 40*10-9-48*10-9 А до 15*10-9-20*10-9 А. Таким чином, 1 пригнічує вхідні і вихідні трансмембранні іонні струми.

Оскільки 10-20 хв відмивання призводить до відновлення генерації ПД, хоча їхні параметри суттєво і відрізняються від фонових, можна вважати, що дія 1 є частково зворотньою.

У відношенні нейронів ППа2 і ППа7 слід зазначи-ти, що 1 первинно підвищує, а зі збільшенням його концентрації знижує як швидкість зрос-тання вхідних су-марних трансмем-бранних іонних струмів, так і вихідних, інгибуючи їх з однаковою силою.

Таким чином, можна констатувати, що 1, який містить бензиловий радикал, надає диференційо-ванного нейротроп-ного ефекту, а саме дозозалежно пригнічує електричну активність нейронів ППа1 і активує в концентрації 10-4 М електрогенез нейронів ППа2 і ППа7.

Вплив бемітилу (2) в багатьох рисах був аналогічним дії 1 на нейрони ППа1 (рис. 2). З рисунка видно, що 2 в концентрації 10-4 М не призводить до істотніх змін амплітуди ПД, про що свідчить і максимум швидкості розвитку ПД (рис. 2, А, Б). При співставленні фонових ПД і зареєстрованих при експозиції 2 спостерігається зменшення тривалості ПД. При анализі швидкості спаду фонових ПД, у більшості нейронів ППа1 помітна затримка розвитку нисхідної фази ПД (рис. 2, Б), яка свідчить про те, що на вихідний калієвий іонний струм накладається протилежний за напрямком вхідний кальцієвий струм (Магура І.С., 1981; Магура І.С., Преварська Н.Б., Дуб В.А., 1983; Магура І.С., Віхрєва Л.А., 1989). Під час експозиції 2 затримка згладжується, що вказує на зменшення і/або пригнічення даною сполукою саме вхідного Са2+-струму. Можливо, цим і пояснюється зменшення тривалості ПД при дії речовини. При концентрації 10-3 М 2 призводить до появи повільних коливань МП і його зміщенню на 18,4 2,7 мВ (р0,01) в бік деполяризації. Через 3-5 хв експозиції МП залишається на тому ж рівні, а його повільні хвилі зникають. При цьому максимум швидкості зростання ПД знижується відносно фону на 5,36 0,43 В/с.

При концентрації 10-2 М бемітил через 2-3 с експозиції призводить до різкого деполяризаційного зсуву МП (на 23 5,36; р0,001) і зниженню амплітуди ПД, а через 5-20 с експозиції розвивається гіперполяризація мембрани, припиняється генерація ПД, а потім МП падає до нуля. Ми припускаємо, що ця гіперполяризація мембрани обумовлена відкриттям хлорних каналів і входом іонів Cl- в клітину. Цікаво, ефекти дії 2 проявляються в гіперполяризації мембрани і є незворотніми, а 1 – в її деполяризації і є частково зворотні. Отже, хоча 1 і 2 в високих концентраціях і призводять до припинення ритмічноі активності нейронів, однак механізми їхньої дії всеж-таки різні. У випадку застосування 1 припинення імпульсної активності відповіає класичному уявленню щодо процессу, який розвивається при деполяризації мембрани і пов’язаного з порушенням роботи Na+-каналів, а 2 блокує як Na+-канали, так і порушує функціональний стан К+- і/або Cl--каналів. Не виключено, що 1 і 2, крім того, впливають і на метаболічні процеси клітин, змінюючи їхній функціональний стан. Слід зазначити, що первинно бемітил призводить до зниження швидкості розвитку ПД (на 20,3 2,27 В/с, р0,05), а потім і швидкості спаду (на 12,6 2,04 В/с, р0,05) ПД. Оскільки при цій концентрації МП, в кінці кінців, падає до нуля і при відмиванні і стимуляції нейронів вхідним деполяризуючим струмом імпульсна активність не відновлюється, ми вважаємо, що концентрація 2 10-2 М є токсичною і це призводить до їхньої загибелі. Аналогічні ефекти дії 2 в дослідженому діапазоні концентрацій відзначені у нейронів ППа2 і ППа7. Це вказує на те, що 2, який містить сірку і вуглеводневий радикал –С2Н5, на відміну від 1 неселективно впливає на біоелектричні процеси нейронів різних типів.

Вплив самого бензимідазолу (3) та його похідних 2-метилбензимідазолу (4) і 2-етилбензимідазолу (5), які містять –СН3 і –С2Н5 вуглеводневі радикали, на електрогенез нейронів різних типів взагалі був аналогічним 2 і виражався у дозозалежному прямопропорційному зниженні швидкостей розвитку ПД.

В окремих препаратах у нейронів ППа1 і неідентифікованих нейронів ВГ вираженість ефектів 3 при різних концентраціях суттєво відрізнялась від вищеописаних (рис. 3). Так, при концентрації 10-4 М ефекти речовини аналогічні таким же, як і у всіх нейронів. При концентрації 10-3 М у трьох з п’ятнадцяти досліджених нейронів ППа1 ефект виражається в редукції імпульсної активності і прояві ГПСП. Потім поступово развивається гіперполяризація мембрани і коли рівень МП досягає значення рівноважного потенціалу для іонів Cl-, то спостерігається реверсія ГПСП в ЗПСП. Амплітуда таких ЗПСП досягає 10-25 мВ і їхня тривалість сягає 20-100 мс (рис. 3, А). Цікаво те, що через три-пять хв експозиції 3 МП цих нейронів відновлюється і вони починають генерувати повноцінні ПД, поміж яких продовжують розвиватися поодинокі або серії ГПСП (рис. 3, Б). Раптове відновлення генерації ПД, можливо, пояснюється гетерогеністю пластичних властивостей хеморецептивної соматичної мембрани нейрона (Кононенко Н.І., Щербатко А.Д., 1988). Після 20 хв відмивання імпульсна активність нейронів відновлюється. Необхідно зазначити, що на деякі неідентифіковані нейрони ВГ (п’ять з 20 досліджених) з низькою ЧГІ в фоні 3 в концентрації 10-4 і 10-3 М здійснює збуджувальний вплив: спостерігається деполяризація мембрани і підвищується ЧГІ (рис. 3, В). Не виключено, що пригнічуючий ефект тестованої речовини на нейрон ППа1 може бути опосередкований впливом саме на синаптично пов’язані з ним нейрони ВГ, які збуджуються під впливом бензимідазолу.

При концентрації 3 10-2 М у нейронів ППа1 первинно спостерігається зсув МП в сторону деполяризації, підвищення частоти імпульсації і різке зниження амплітуди ПД. Потім розвиваються ГПСП і гіперполяризація мембрани. При 20 хв відмивання імпульсна активність нейронів не відновлюється.

На наш погляд, поява ГПСП, розвиток гіперполяризації і наступна реверсія ГПСП на мембрані соми пейсмекерних і непейсмекерних нейронів при аплікації 3 свідчить про наявність на ній синаптичних гальмівних входів. З всього вище вказаного виходить, що дія 3 на досліджені нейрони може бути як безпосередньою, так і опосередкованою гальмівними нейронами, які збуджуються під його впливом.

Таким чином, 3 на різні нейрони здійснює неоднакову дію, селективно запускаючи різні механизми електрогенезу нейронів. Крім того, селективність цієї сполуки проявляється і в тому, що вона полегшує прояв гальмівних входів на мембрані соми, про що свідчать чітко виражені ГПСП.

Необхідно зазначити, що виявлені цікаві особливості ефектів 2-трифторметилбензимідазола (9) в концентрації 10-3 М у трьох з 15-ти нейронів ППа2. Це полягає в тому, що впродовж трьох-чотирьох хв експозиції сполуки, під час якої мембрана є деполяризованою, МП різко досягає фонового рівня і, впродовж 10-20 с припиняється генерація ПД (рис. 4). Потім МП знову поступово зменшується і замість нормальних ПД з’являються невеликої амплітуди с крутим переднім фронтом “швидкі” піки (рис. 4). Амплітуда таких потенціалів варіює між 4 і 20 мВ і є кратною найменшому значенню (4 мВ), а їхня тривалість складає 10-30 мс. По мірі деполяризації мембрани амплітуда таких піків градуально до певного значення зростає, однак вони не досягають КРД. З цього виходить, що 9 при зовнішній аплікації пригнічує лавинопо-дібний розвиток на мембрані соми ПД, які антидромно розповсюджуються з активного локусу аксо-дендритного дерева. Крім того, на фоні деполяризації мембрани у нейрона ППа2 серед цих швидких піків з’являються і повільні коливання МП; спостерігаються як ЗПСП, так і ГПСП. Амплітуда ЗПСП і ГПСП знаходиться в межах 5-15 мВ, а тривалість – 20-100 мс. З часом окремі ЗПСП досягають КРД і виникають поодинокі, а потім і групи повномірних ПД (рис. 4). Важливо відзначити, що в фоні такі постсинаптичні потенціали не проявляються. Вочевидь, різна вираженість дії 9 обумовлена його бензимідазольною частиною, оскільки прояв ГПСП спостерігається і при аплікації самого бензимідазолу. Однак, поки що у нас немає відповіді на те, чому не має таких ефектів дії при аплікації інших похідних. Виходячи з цих даних ми припускаємо, що у пейсмекерного нейрона ППа2 ПД можуть мати як ендо-, так і екзогенну природу. У випадку ендогенної природи, ПД виникає в тригерній зоні аксо-дендритного дерева, а екзогенні ПД обумовлені транссинаптичною активацією безпосередньо мембрани соми. Таким чином, отримані нами дані з великою долею вірогідності дозволяють вважати, що на мембрані пейсмекерних нейронів, а саме, нейрона ППа2, є як мінимум дві, просторово розділені, з різними механізмами запускання ПД трігерні ділянки.

При аплікації 9 в концентрації 10-2 М впродовж 40-55 с від моменту аплікації спостерігається повне пригнічення генерації ПД у всіх досліджених нейронів, яке також обумовлене інгибуванням як вхідних, так і вихідних трансмембраних іонних струмів.

Через 20 хв відмивання 9 в концентраціях 10-4 і 10-3 М значення МП і амплітуди ПД у всіх тестованих нейронів наближаються до фонового рівня, а після концентрації 10-2 М - ні. Таким чином, ефект тестованої речовини в концентраціях 10-4 і 10-3 М зворотній, а в 10-2 М – для більшості нейронів токсичний, частково зворотній.

Ефекти 6 при різних його концентраціях нейрон ППа1 представлено на рис. 5. Як видно з рис. Б при експозиції 6 в концентрації 10-4 М підвищуються як максимум швидкості зростання, так і швидкості спада ПД. Однак, зі збільшенням концентрації сполуки пригнічуються як вхідні, так і вихідні іонні струми. Подібний вплив 6 здійснює і на нейрони ППа2 і ППа7, що вказує на неселективність дії даної сполуки.

Слід зазначити, що ефекти аплікації 7, 8 і 9, які містять –ОН-групу і радикал циклопропіл, в дослідженому діапазоні концентрацій були подібні дії 6. Це може свідчити про те, що саме заміщення водню в молекулі бензимідазолу призводить до появи у нових сполук активуючого напрямку нейротропної дії.

В цілому, результати цієї частини роботи вказують на те, що навіть в мембрані окремих нейронів відносно “простої” нервової системи равлика є широке різноманіття гетерогенних механізмів їхнього функціонування.

Таким чином, на підставі отриманих нами даних, тестовані в роботі бензимідазол і його похідні розділені на дві групи. В першу ввійшли сполуки 5-8 і 10, які активують електогенез нейронів. В очевидь, саме заміщення водню у другого атому вуглецю на –NH2 і –OH групи і циклопропіл призводить до активуючого напрямку дії тестованих сполук. До другої групи були віднесені речовини 1-4 і 9, які пригнічують електричну активність нейронів, яке, можливо, обумовлене заміщенням водню на вуглеводневі радикали, бензол, сірку і фтор. Проте необхідно зазначити, що бензимідазол і дибазол здійснюють селективну дію на нейроні різних типів.

Отже, встановлено, що різного напрямку ефекти сполук залежать від їх хімічної структури, специфіки мембран нейронів і їхнього функціонального стану.

Оскільки фармпрепарат дибазол, який використовується як дуже ефективний гіпотензивний засіб, змінює параметри електричних потенціалів, а саме в залежності від концентрації пригнічує трансмембранні іонні струми, то в очевидь речовина має і нейро- і, можливо, психотропні властивості. В даному розділі роботи встановлено, що сполуки 1-4, 8-10 мають пригнічуючу нейротропну дію, у зв’язку з чим можна очікувати у них проявлення седативних і транквілізуючих властивостей. Сполуки 5-7, навпаки, в оптимальних концентраціях активують електрогенез нейронів, тому можна передбачити у них наявність психостимулючих і антидепресантних властивостей. Отже, тестовані в роботі речовини можуть мати і психотропні властивості, що спонукало нас до їхнього подальшого тестування на ссавцях, а саме щурах.

Вплив бензимідазолу і деяких його похідних на поведінку щурів при системному введенні

Бемітил при системному введенні у всіх використаних дозах призводить до різкого генералізованого пригнічення поведінки щурів (табл. 1). Так, в умовах контролю середні значення індексу горизонтальної рухової активності (ГРА), який характеризує локомоторну активність, складають від 20.4 ± 4.3 до 25.0 ± 5.5, а після ін’єкцій бемітилу цей показник знижується до 6.8 ± 2.6 – 4.3 ± 1.2, тобто до 27–21 % контрольних значень. Слід зазначити, що при цьому явної залежності інтенсивності гальмування ГРА від дози препарату не спостерігається. Приблизно аналогічні ефекти бемітил здійснює і на вертикальну рухову активність (ВРА). Контрольні значення індексу ВРА варіюють від 8.4 ± 2.1 до 3.4 ± 1.0, а при дії бемітилу цей індекс різко знижується до нуля. Дослідницька активність (ДА) і грумінг пригнічуються під впливом бемітилу в меншому ступені, але також без чіткої залежності від дози введеного засобу. Дозозалежність ефектів бемітилу проявляється лише відносно таких поведінкоких феноменів, як дефекація та уринація. При цьому необхідно враховувати, що середні індекси частоти цих поведенкових феноменів в умовах контролю складають всього від 2.0 до 1.0 і від 0.2 до 0.6 відповідно. Ін’єкції бемітилу в дозі 50 мг/кг приводять до зменшення індексів цих поведінкових проявлень до 44–50 % початкових значень. Коли ж бемітил вводиться в дозі 150 мг/кг, ці феномени через півтори години після ін’єкцій взагалі відсутні в межах періодів спостереження.

Таблиця 1

Показники поведінки щурів при дії бемітилу

Показники поведінки | ДОЗА БЕМІТИЛУ, мг/кг

50 | 100 | 150

Контроль | Дослід | Контроль | Дослід | Контроль | Дослід

ГРА | 20,4 4,3 | 4,3 1,2* | 25,0 5,5 | 6,8 2,6** | 21,5 3,8 | 5,0 2,2**

ВРА | 3,4 1,0 | 0* | 4,6 1,1 | 1,4 0,5* | 8,4 2,1 | 2,1 1,4

ДА | 9,4 2,0 | 3,8 0,5 | 15,4 2,7 | 8,2 1,5* | 2,0 0,8 | 0,6 0,4*

Гр | 1,6 0,3 | 0,8 0,3 | 2,4 0,7 | 0,6 0,4* | 0,2 0,1 | 0,2 0,1

Деф | 1,8 1,0 | 0,8 0,2 | 1,0 0,6 | 0,2 0,1 | 2,0 0,5 | 0*

Ур | 0,2 0,1 | 0,2 0,1 | 0,6 0,1 | 0,2 0,1 | 0,2 0,1 | 0

Примітка (тут і далі): достовірні зміни показників виділені жирним шрифтом: * – при р0,05; ** – р0,001

Ефекти бензимідазолу відносно досліджених поведінкових проявів в цілому аналогічні з вище зазначеними ефектами бемітилу. Індекс ГРА, який в контролі складає від 23.0 ± 4.7 до 19.4 ± 4.5, після ін’єкцій бензимідазолу зменшується до 23–6 % початкових значень (табл. 2). Приблизно аналогічну депресію бензимідазол здійснює і на ВРА. Пригнічення ДА і зменшення частоти грумінгу після ін’єкцій бензимідазолу в цілому є також менш вираженим, ніж зменшення інтенсивності ВРА і ГРА. Відсутність зниження інтенсивності грумінгу після введення бензимідазолу в мінімальній з використаних доз (50 мг/кг) і, навпаки, значне зменшення цього показаника і повне пригнічення ВРА при дозі 100 мг/кг, можливо, пояснюється вище означеною випадковою варіабельністю відповідних даних. Зниження частоти дефекацій і уринацій під впливом бензимідазолу є дуже значним, але на відміну від ефектів бемітилу вираженої дозозалежності в цих випадках не відбувається.

Таблиця 2

Показники поведінки щурів при дії бензимідазолу

Показники поведінки | ДОЗА БЕНЗИМІДАЗОЛУ, мг/кг

50 | 100 | 150

Контроль | Дослід | Контроль | Дослід | Контроль | Дослід

ГРА | 23 4,7 | 0,4 0,2* | 19,4 4,5 | 4,5 1,6** | 21,3 2,0 | 0,3 0,2*

ВРА | 3,4 0,8 | 1,2 0,6* | 6,0 1,0 | 0 | 2,8 0,6 | 0,3 0,1*

ДА | 5,0 0,7 | 1,8 0,3* | 16,0 2,7 | 7,0 1,5* | 5,6 0,4 | 1,2 0 ,3*

Гр | 0,2 0,1 | 0,8 0,3 | 2,5 0,8 | 0,2 0,1 | 0,7 0,3 | 0,3 0,1

Деф | 2,2 0,6 | 1,2 0,5 | 3,1 0,6 | 0 | 1,7 0,5 | 0,7 0,3

Ур | 0,8 0,5 | 0,2 0,1 | 1,0 0,1 | 0 | 1,0 0,5 | 0,1 0,1

Таким чином, ефекти введення бемітилу і бензимідазолу у щурів в умовах цього експерименту представляють собою суттєве зниження практично всіх реєструємих поведінкових показників. При цьому, найбільш суттєвою зміною є розвиток рухового дефіциту. Оскільки бемітил і бензимідазол призводять також до зниження індексів, які характеризують рівень емоційного збудження тварин, можна констатувати, що ці речовини в використаних дозах здійснюють потужну седативну дію. Це співпадає з даними одних авторів (Кірічек Л.Т., Бобков Ю.Г., 1991), але протиречить погляду інших (Спасов А.А., И. Н. Ієжица, Л.І. Бугаєва та ін., 1999), які вказують на те, що дія бемітилу при одноразовому введенні не супроводжується седативним ефектом. На підставі отриманих нами даних можна переконливо стверджувати, що тестовані речовини у вказаних дозах інтенсивно пригнічують локомоцію і орієнтовно-дослідницьку поведінку щурів. Такий висновок співпадає також з даними про те, що бемітил генералізовано пригнічує електричну активність нейронів молюска (Гамма Т.В., Коренюк І.І., Баєвський М.Ю., 2003) і забезпечує зниження інтенсивності епилептичних розрядів (Михайлов І.Б., Гузева В.І., Шарф М.Я., 1997).

В цілому, результати наших експериментів з одноразовим введенням використаних доз бемітилу і бензимідазолу дозволяють заключити, що ці сполуки здібні обумовлювати генералізоване пригнічення поведінки щурів і здійснювати потужну седативну, анксиолітичну і антистресорну дію.

Вплив 2-метилбензімидазола і 2-етилбензимідазола (4 і 5) аналогічний бемітилу і бензимідазолу, однак відрізняється силою і вираженістю ефектів. Дія даних похідних в тестованому діапазоні доз була більш “м’якою” і менш виразною порівняно з вище вказаними сполуками.

Введення 50 мг/кг похідних бензимідазолу, які містять –NH2 і –OH-групи (6, 7 і 8) призводить, на відміну від всіх вище зазначених речовин, до вірогідного зростання горизонтальної, вертикальної і дослідницької активності щурів. Виходячи з цього, а також враховуючи напрям їхньої нейротропної дії, можна припустити, що ці сполуки в дозі 50 мг/кг мають м’який психостимулюючий ефект. Однак, при дозах 100 і 150 мг/кг тестовані речовини знижують індекси локомоції, дослідницької активності і психоемоційний стан досліджених тварин. Можливо, 6, 7 і 8 в високих дозах здатні проявити антистресорні властивості.

В цілому, аналіз нейронної і поведінкової активності тварин показав, що бензимідазол і його похідні, які активують нейрону активність, активують і поведінку щурів, а ті, які пригнічують нейрону активність, інгибують поведінку тварин. Таким чином, вивчаючи вплив похідних бензимідазолу на електричну активність нейронів молюска, можна передбачити вплив речовин цього ряду на поведінку ссавців.

ВИСНОВКИ

1.

2.

3.

4.

5.

6.

СПИСОК НАДРУКОВАНИХ РОБІТ

1. Гамма Т.В., Раваева М.Ю., Хусаинов Д.Р., Кизилов А.Е. Влияние биологически активных соединений на параметры электрической активности идентифицированных нейронов моллюска Helix albescens // Ученые записки ТНУ, серия “Биология”, 2001, Т. 14. - №2. - С. 21-26.

Особистий внесок. Особистий внесок автора полягає