АКАДЕМІЯ МЕДИЧНИХ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ НЕЙРОХІРУРГІЇ ІМЕНІ АКАДЕМІКА А. П. РОМОДАНОВА

КОЧІН Олег Валерійович

УДК: 616. 853 – 085. 36] - 092

ЗАСТОСУВАННЯ КРІОКОНСЕРВОВАНИХ ЕМБРІОНАЛЬНИХ ТА СТРОМАЛЬНИХ КЛІТИН КІСТКОВОГО МОЗКУ ПРИ ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНІЙ ЕПІЛЕПСІЇ

14.01.05. – нейрохірургія

Автореферат дисертації на здобуття наукового

ступеня кандидата медичних наук

Київ – 2006

Дисертацією є рукопис

Робота виконана в Інституті нейрохірургії імені академіка А. П. Ромоданова АМН України

Науковий керівник: член-кореспондент АМН України, доктор медичних наук, професор Цимбалюк Віталій Іванович, заступник директора Інституту нейрохірургії імені академіка А. П. Ромоданова АМН України, завідувач кафедри нейрохірургії Національного медичного університету ім. О.О. Богомольця МОЗ України

Офіційні опоненти: доктор медичних наук, професор Лапоногов Олег Олексанрович, завідувач відділення функціональної нейрохірургії Інституту нейрохірургії ім. акад. А. П. Ромоданова АМН України

доктор медичних наук, професор Смоланка Володимир Іванович, завідувач кафедри нервових хвороб та психіатрії з курсом нейрохірургії Ужгородського національного університету МОН України

Провідна установа: Дніпропетровська державна медична академія, МОЗ України, кафедра нервових хвороб та нейрохірургії, м. Дніпропетровськ

Захист відбудеться 24 жовтня 2006 р. о 12 годині на засіданні Спеціалізованої вченої ради Д 26.557.01 в Інституті нейрохірургії імені академіка А. П. Ромоданова АМН України (04050, м. Київ, вул. Мануїльського 32, конференц-зал)

З дисертацією можна ознайомитись в бібліотеці Інституту нейрохірургії імені академіка А. П. Ромоданова АМН України (04050, м. Київ, вул. Мануїльського 32)

Автореферат розісланий “23”вересня 2006 р.

Вчений секретар Спеціалізованої вченої ради,

доктор медичних наук, професор _________________________ Чеботарьова Л. Л.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Епілепсія є одним з найпоширеніших захворювань центральної нервової системи, важким за плином, але потенційно виліковним [Дзяк Л. А. із спіавт., 2001]. У світі на епілепсію страждає близько 40 млн. чоловік. В 20-30% пацієнтів з епілепсією не вдається домогтися фармакологічного контролю над судорогами [Polkey C. E. et al., 1993].

Хірургічному лікуванню підлягають хворі із частими важкими епілептичними припадками або важкими когнітивними й поведінковими порушеннями, які не піддаються консервативному лікуванню. Відповідно до рекомендацій ILAE [International League Against Epilepsy], рекомендований термін хірургічного втручання при резистентній до медикаментозної терапії епілепсії - не більше 2 років безуспішної фармакологічної терапії [Bittar R. G. et al., 2002; Greenberg M. S., 2001].

З огляду на складність патогенезу епілепсії, на сьогодні накопичений великий арсенал різноманітних протиепілептичних хірургічних втручань, спрямованих на припинення або різке зниження частоти епілептичних припадків. Однак, всі вони не позбавлені певних недоліків. Так, відкрита резекція скроневої частки, що широко застосовується в лікуванні скроневої епілепсії, сама по собі є високо травматичною операцією з видаленням великого об’єму мозкової тканини, та такою, що призводить до різноманітних ускладнень. Стереотаксична нейрохірургія розглядається як метод вибору в хірургічному лікуванні епілепсії. Спектр мозкових структур, які можуть стати мішенями для такого втручання, досить широкий. Відносно мала травматичність даних втручань значно розширює групи хворих, в яких може бути застосований стереотаксичний метод. Істотним недоліком подібних операцій можна вважати їхній деструктивний вплив на структури мозку зі збільшенням вже існуючих внаслідок прогресування епілептичного процесу, дегенеративних змін головного мозку. Так, тривала електростимуляція голівки хвостатого ядра та зубчастого ядра мозочку приводить до пригнічення епілептичної активності головного мозку, але, у той же час викликає дегенеративні зміни в зоні розташування електродів. У зв'язку із цим ряд авторів рекомендує обмежити застосування цього методу.

Виходячи з вищесказаного, залишається актуальним пошук недеструктивних методів хірургічного лікування епілепсії. Таким методом, цілком імовірно, може стати трансплантація стовбурних нервових клітин (НСК).

Дослідження можливостей застосування НСК у хірургічному лікуванні епілепсії проводяться досить широко. D. Barry at al. (1987, 1989) та Bengzon J. et al. (1992, 1993) для нейротрансплатації використовували ті частини ембріонального мозку, які у великій кількості виробляють норадреналін. Лапоногов О. О. зі співавт. (1998, 2002, 2003) відзначили високу ефективність ізольованої трансплантації фрагментів ембріональної нервової тканини, а також її комбінації із кріоамігдалотмією при важкій епілепсії в дітей. Показаннями до операції були різного виду часті епілептичні припадки, що не піддаються консервативному лікуванню, а також психічні й інтелектуально-мнестичні порушення. Після операцій у хворих було відзначено зниження кількості нападів та поліпшення інтелектуально-мнестичних функцій.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота виконана в межах державної теми №0102U002026 "Вивчення морфофункціональних особливостей регіональних стовбурних клітин ембріонів, їх кріочутливості та механізмів реалізації біологічної активності в умовах культивування і на моделях деяких патологічних станів” Інституту проблем кріобіології та кріомедицини НАН України (Харків).

Метою дослідження є оцінка ефективності застосування кріоконсервованих ембріональних нервових клітин (КЕНК) і нейробластів, диференційованих з клітин строми кісткового мозку (КСКМ), у хірургічному лікуванні епілепсії в експерименті.

Задачі дослідження:

1.

2.

3.

4.

5.

Об'єкт дослідження: самці щурів лінії Вістар у віці 6 місяців, яким була виконана операція відтворення епілепсії та зроблена трансплантація суспензії КЕНК та КСКМ в ділянку експериментального епілептичного вогнища.

Предмет дослідження: динаміка мікроморфологічних, біохімічних та електрофізіологічних зрушень у головному мозку епілептизованих щурів після трансплантацій КЕНК та КСКМ.

Методи дослідження: мікроморфологічні - для вивчення динаміки змін у зоні трансплантації КЕНК і КСКМ; біохімічні - для дослідження коливань вмісту ГАМК і біогенних амінів у стовбурі головного мозку епілептизованих щурів після трансплантації КЕНК і КСКМ; електрофізіологічні - для дослідження змін електричної активності гіпокампів епілептизованих щурів після трансплантації.

Наукова новизна отриманих результатів. Вперше були встановлені оптимальні строки трансплантації НСК в експериментальне пеніцилінове епілептичне вогнище після операції відтворення епілепсії. Показано, що гострі запальні зміни в зоні операції відтворення епілепсії стихають протягом 15 діб, а вплив медіаторів запалення, що спричиняє ушкодження клітин трансплантату, є мінімальним, якщо виконувати трансплантацію після зазначеного терміну.

Вперше показано, на підставі дослідження динаміки мікроморфологічних, біохімічних та електрофізіологічних змін в центральній нервовій системі епілептизованих щурів, що трансплантації КЕНК та КСКМ в епілептичне вогнище є однаково ефективними.

Доведено, що трансплантація КЕНК і КСКМ у ділянку епілептичного вогнища істотно та односпрямовано впливає на динаміку вмісту ГАМК, серотоніну, норадреналіну, дофаміну та адреналіну у стовбурі головного мозку щурів.

Вперше встановлено, що трансплантації КЕНК і КСКМ у ділянку епілептичного вогнища приводить до відновлення фізіологічного для ссавців типу електричної активності гіпокампу - и-ритму.

Практичне значення отриманих результатів. Показано, що пеніцилінова модель придатна для розробки методів хірургічного лікування епілепсії. Встановлені оптимальні строки проведення хірургічного лікування.

Отримані в роботі дані про динаміку мікроморфологічних, біохімічних та електрофізіологічних змін у центральній нервовій системі епілептизованих щурів після трансплантації КЕНК та КСКМ, диференційованих у нейробласти, можуть бути використані при розробці способів хірургічного лікування епілепсії.

Особистий внесок здобувача. Автором проведені аналіз а узагальнення літературних даних, сформульовані мета й завдання дослідження, підібрані адекватні методи організації та проведення досліджень, виконані оперативні втручання на тваринах, виконані обробка, аналіз та опис отриманих результатів. Автором не були використані наукові результати й ідеї, що належать співавторам опублікованих робіт.

Апробація отриманих результатів. Основні положення дисертації доповідалися та обговорювалися на III Російському конгресі патофізіологів з міжнародною участю “Дизрегуляторная патология органов и систем”, (Москва, 2004), Міжнародній науково-технічній конференції студентів, аспірантів та вчених “Молодь та сучасні проблеми радіотехніки та телекмунікацій” (Севастополь, 2006), Конференції нейрохірургів України “Нові технології в нейрохірургії” (Ужгород, 2006), Ювілейній Всеросійській науково-практичній конференціі “Поленовские чтения” (Санкт-Петербург, 2006).

Публікації. Результати дисертації опубліковані в 7 наукових працях, з них 3 статті в журналах, 4 тези доповідей у матеріалах конференцій.

Структура та обсяг дисертації. Дисертація складається зі вступу, літературного огляду, опису матеріалу та методів дослідження, результатів та аналізу досліджень, закінчення, висновків та списку літератури (46 вітчизняних та 260 закордонних джерел). Ілюстративний матеріал представлений 21 таблицею та 64 малюнками.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ ДИСЕРТАЦІЇ

Матеріали та методи дослідження. У дослідженні було використано 203 самця щурів лінії Вістар у віці 6 місяців масою 200-250 г з низькою початковою аудіогенною судорожною готовністю. Поріг судорожної готовності визначався за методикою, запропонованою Поповою О. Н. зі співавт. (1999), що складалася у звуковому подразненні, гучністю 100 дБ, тривалістю 2 хв., з 3-4 кратним повторюванням. В експерименті використовувалися тварини, у яких після триразового звукового впливу судорожний припадок не розвивався.

Дослідження проводилося в три етапи. На першому етапі було виконане вивчення мікроморфологічних, біохімічних та електрофізіологічних змін у головному мозку щурів після моделювання епілепсії.

На другому етапі вивчена динаміка морфологічних та електрофізіологічних змін у гіпокампах білатерально, а також біохімічних змін у стовбурі головного мозку щурів зі змодельованою епілепсією після трансплантації кріоконсервованих ембріональних нервових клітин у зону експериментального епілептичного вогнища.

На третьому етапі дослідження було проведене вивчення динаміки мікроморфологічних й електрофізіологічних зрушень у гіпокампі, та динаміки вмісту біогенних амінів та ГАМК у стовбурі головного мозку щурів після трансплантації клітин строми кісткового мозку, диференційованих у нейробласти, у ділянку експериментального епілептичного вогнища.

Окремо була виділена група з 24 тварин, яким у зону епілептичного вогнища була виконана трансплантація суспензії ембріональних клітин печінки. У даній групі тварин дослідження вмісту ГАМК та біогенних амінів проведене на 10-у, 30-у та 60-у добу після трансплантації, також вивчено рівень аудіогенної судорожної готовності з метою з'ясування впливу на динаміку епілептичного процесу трансплантації не нейрогенного клітинного матеріалу в епілептичне вогнище.

Епілепсія у тварин моделювалася шляхом стереотаксичної ін'єкції пеніциліну у гіпокамп. Скелетотопічними орієнтирами для операції на черепі тварини служили вінцевий та стрілоподібний шви, брегма (точка перетинання зазначених швів), а також ламбда (точка перетинання стрілоподібного та ламбдаподібного швів). Після внутрішньоочеревинного введення розчину тіопенталу (0,012 мг/100 г маси тварини) голову тварини фіксували в стереотаксичній установці за верхні різці та зовнішні слухові проходи так, щоб сагітальна площина проходила строго через верхні різці та стрілоподібний шов. Лінійний розріз м'яких тканин довжиною до 2 см у проекції стрілоподібного шва починали на 0,5 см ззаду від лінії, проведеної через верхні краї орбіт. Кістку скелетували для достатньої візуалізації брегми, ламбди та стрлоподібного шва. Після видалення м'яких тканин з черепа робили корекцію положення голови в стереотаксичній установці так, щоб брегма розташовувалася на 1 мм вище ламбди. Стереотаксичні координати гіпокампа визначали за атласом Fifkova та Marsala (1967) на 3 мм каудальніше (AP3), на 2 мм латеральніше брегми та на 3,4 мм вентральніше поверхні кістки. Фрезьовий отвір робили на 3 мм позаду від брегми та на 2 мм лівіше стрілоподібного шва. Розчин натрієвої солі пеніциліну у дозі 100 ОД об’ємом 1 мкл за допомогою мікроін’єктра, жорстко закріпленого на стереотаксичному апараті, вводили зі швидкістю 0,5 мкл/хв. Потім голка витягалася, рана ушивалася двома вузловими швами.

Критерієм успішності операції був розвиток у тварин клонічних судорог тривалістю 3-5 хв. після введення пеніциліну. Летальність тварин після операції відтворення епілепсії становила 5%. У післяопераційному періоді судороги в прооперованих тварин провокувалися за допомогою звукового впливу гучністю 100 дБ, тривалістю до 2 хв.

Джерелом суспензії алогенних кріоконсервованих фетальних нервових клітин служила нервова тканина плодів щурів 13-14 доби гестації. Плоди щурів одержували шляхом розкриття черевної порожнини анестезованої вагітної самки. Витягнуті ембріони промивали в розчині Хенкса, потім витягали головний мозок і розрізали його на невеликі фрагменти. Суспензію КЕНК одержували шляхом м'якої дезагрегації фрагментів нервової тканини в 10-кратному об’ємі розчину Хенкса за допомогою спеціального вібраційного пристрою. Отриману клітинну суспензію фільтрували, додавали кріопротектор диметилсульфоксид до кінцевої концентрації 10% і розливали в пробірки для кріоконсервування фірми Costar (Канада). Заморожування виконувалося за 3-х етапною програмою охолодження: 1 етап - зі швидкістю 1оС/хв до -40оС, 2 етап - 10оС/хв до -80оС, 3 етап - занурення в рідкий азот. Розморожування суспензії КЕНК здійснювалося на водяній лазні при температурі 40оС. Концентрація клітинної суспензії становила 16,7-20,5 Ч 106 клітин/мл, життєздатність – не менш 60%.

Клітини строми кісткового мозку щурів витягали шляхом пункції діафізу стегнової кістки щурів з промиванням їх розчином Хенкса (Sigma) в умовах внутрішньоочеревинного тіопенталового наркозу. Отриману тканину ресуспендували та двічі відмивали в розчині Хенкса по 5 хвилин центрифугуванням при 1000 об./ хв. Відмиті клітини ресуспендували у культуральному середовищі MEM/F12 (1/1) з 10 % фетальною бичачою сироваткою (Sigma) та розсіювали по 5 мільйонів клітин на культуральний посуд (25 см2, Nunc). Через 24 години культивування середовище з незакріпленими клітинами кісткового мозку видаляли, додавали свіже середовище та продовжували культивувати фібробластоподібні клітини ще тиждень для одержання первинної культури клітин строми кісткового мозку. Для диференціювання отриманих клітин у нейробласти (попередники нервових клітин) використовували середовище DMEM/F12 з 2% 10-6 ретиноєвою кислотою. Концентрація клітинної суспензії, що вводилася, становила 106 кліток/мл. Життєздатність досягала 100%.

Джерелом суспензії алогенних кріоконсервованих ембріональних клітин печінки служила печінка ембріонів щурів 13-14 доби гестації. Ембріони щурів одержували шляхом розкриття черевної порожнини анестезованої вагітної самки. Витягнуті ембріони промивали в розчині Хенкса, потім витягали печінку та розрізали її на невеликі фрагменти. Обробку та заморожування проводили за тією ж програмою. Клітинність суспензії становила 12 Ч 106/мл.

Трансплантацію здійснювали стереотаксичним методом за допомогою мікроін’єктора МШ-1М в зону експериментального епілептичного вогнища (ростральний гіпокамп зліва). Об’єм суспензії, що вводилася, становив 10 мкл, швидкість введення - 0,5 мкл/хв.

Морфологічні дослідження зони введення пеніциліну дозволили встановити, що гострі травматичні зміни та репаративні процеси з формуванням гліального рубця в зоні операції стихають не пізніше 15-и діб після втручання. Можна вважати, що мінімальний термін після операції відтворення пеніцилінового епілептичного вогнища, коли травматичні й запальні зміни в зоні операції не вплинуть на результат трансплантації в нього стовбурових нервових клітин, є 15 діб.

При дослідженні показників ГАМК та біогенних амінів, які виконують нейротрансмітерную функцію, у стовбурі головного мозку щурів виявлено, що їх вміст був значно більшим після операції моделювання епілепсії порівняно з аналогічними показниками в щурів з низькою судорожною готовністю. Виражене підвищення вмісту ГАМК у стовбурі головного мозку епілептизированих тварин відзначено вже в ранній термін після відтворення епілепсії. Розходження між показниками в досліджених групах були статистично вірогідні протягом усього спостереження (Р<0,05). Так, вже на 5 добу після моделювання епілепсії середній вміст ГАМК у стовбурі мозку епілептизованих щурів склав 1,22±0,14 нМ/г, у той час як середнє значення даного показника в групі щурів з низькою судорожною готовністю складало 0,63±0,1 нМ/г. У ході спостереження за динамікою зазначеного показника відзначене лише незначне його зниження. Так, на 75-у добу після моделювання епілепсії середній вміст ГАМК у групі досліджуваних тварин склав 1,16±0,14 нМ/г. Подібне підвищення вмісту ГАМК у стовбурі головного мозку свідчить про активацію ГАМК-ергічної системи, яку можна розглядати як фізіологічну відповідь на значне посилення процесів збудження в центральній нервовій системі, зокрема пароксизмальної активності, пов'язаної з моделюванням експериментального епілептичного вогнища в гіпокампі. При дослідженні рівня адреналіну в стовбурі головного мозку щурів після моделювання епілепсії відзначена поява слідів даного медіатора в ранній термін після операції. У тварин контрольної групи адреналін у стовбурі головного мозку не визначався. Адреналін був виявлений на 5-у (0, 26±0,06 нМ/г), 10-у (0, 21±0,05 нМ/г) та 15-у (0,03±0,01 нМ/г) добу спостереження, на 20-у добу слідів адреналіну в стовбурі мозку вже не було. При дослідженні показників норадреналіну в стовбурі головного мозку епілептизованих щурів відзначене прогресуюче статистично достовірне зниження (Р<0,05) його вмісту в порівнянні з таким у тварин з низькою судорожною готовністю протягом усього терміну спостереження. Так, вже на 5-у добу після операції моделювання епілепсії вміст зазначеного медіатора в стовбурі головного мозку щурів становив 7,85±0,26 нМ/г та до 75-ї доби спостереження досяг 6,68±0,32 нМ/г; у той час як середній показник вмісту цього медіатора в стовбурі головного мозку щурів з низькою судорожною готовністю склав 8,12±0,18 нМ/г. Вважають, що норадренергічна система впливає на ГАМК-ергічні нейрони, є вказівки на те, що активність норадренергічної системи реципрокно регулюється ГАМК-ергічними нейронами та підвищення їхньої активності не може не спричиняти гальмівного впливу на норадренергічну медіацію. Крім того, активність норадренергічної системи перебуває під гальмівним контролем серотонінергічних нейронів.

При дослідженні вмісту серотоніну в стовбурі головного мозку у щурів з експериментальною епілепсією відзначено значне та стійке підвищення даного показника протягом усього експерименту в порівнянні із тваринами з низькою судорожною готовністю. На 5-у добу після відтворення епілепсії середній показник вмісту серотоніну склав 10,36±0,39 нМ/г та до 75-ї доби спостереження досяг 14,22±0,18 нМ/г. Середній вміст серотоніну в стовбурі головного мозку щурів з низькою судомною готовністю дорівнював 9,25±0,21 нМ/г й був вірогідно нижче (P<0,05), ніж у групі епілептизованих тварин протягом усього періоду спостереження. Підвищений вміст серотоніну в стовбурі головного мозку щурів після операції відтворення епілепсії може розглядатися як реакція повноцінних нейротрансмітерних систем головного мозку на посилення судомної активності головного мозку в результаті створення епілептичного вогнища. Динаміка вмісту досліджених медіаторів у стовбурі головного мозку епілептизованих щурів представлена на діаграмі (рис. 1).

При дослідженні показників вмісту дофаміну в стовбурі головного мозку щурів з експериментальною епілепсією відзначена хвилеподібна їхня динаміка. Протягом перших 20 діб спостереження показники були статистично вірогідно (P<0,05) підвищені в епілетизованих щурів у порівнянні з щурами контрольної групи (Р<0,05). З 20-ї доби відзначено прогресуюче зниження середніх показників вмісту дофаміну в стовбурі мозку епілептизованих тварин, однак, статистично достовірні розходження з показниками контрольної групи відзначені тільки на 75-у добу спостереження (P<0,05). Підвищення активності дофамінергічної системи в ранній термін після моделювання епілепсії, можливо, пов'язане з участю дофаміну в регуляції збуджувальних процесів у нервовій системі, зокрема пригніченні холінергічної медіації у стріатумі. Наступне зниження вмісту дофаміну, ймовірно, пояснюється тим, що функціонування дофамінергічної системи стримується терміналями ГАМК-ергічних нейронів, які у великій кількості є у чорній субстанції.

Рис. 1. Динаміка вмісту медіаторів у стовбурі головного мозку епілептизованих щурів.

Дослідження біологічних ефектів трансплантації проводилося мікроморфологічними, електрофізіологічними та біохімічними методами на 10-у, 30-у й 60-у добу після трансплантації в групі щурів з експериментальним епілептичним вогнищем у гіпокампі.

Вивчення морфологічних змін в зоні епілептичного вогнища виконували методом світлової мікроскопії в мікропрепаратах фронтальних зрізів головного мозку щурів, забарвлених гематоксиліном та еозином. Було встановлено, що морфологічні зміни в зоні трансплантації КЕНК та КСКМ характеризуються формуванням гліального рубця. Більша частина трансплантованих клітинних елементів уже до 60-ї доби після операції, можливо, загинула. Однак не виключено, що астроглія та нейрони, виявлені в зоні трансплантації, є результатом диференціювання трансплантованих нейробластів. Істотних розходжень у динаміці морфологічних змін у зоні операції після трансплантації КЕНК та КСКМ відзначено не було. Таким чином, позитивний вплив нейротрансплантації на динаміку епілептичного процесу в головному мозку лабораторних тварин, вірогідно, обумовлений трофічним впливом біологічно активних речовин, що містяться у клітинах трансплантатів.

Дослідження динаміки вмісту ГАМК, норадреналіну, адреналіну, дофаміну та серотоніну в стовбурі головного мозку щурів після трансплантації КСКМ та КЕНК показало, що у тварин, яким були трансплантовані клітини стромального та фетального походження, спостерігаються аналогічні тенденції в зміні показників зазначених медіаторів. Так, в обох групах тварин після трансплантації відзначене прогресуюче зниження вмісту ГАМК у стовбурі мозку в порівнянні з епілептизованими тваринами, яким трансплантація не виконувалася. На 60-у добу після трансплантації вміст ГАМК у стовбурі головного мозку практично досяг рівня, характерного для тварин з низькою судорожною готовністю. Результати дослідження впливу трансплантацій КЕНК та КСКМ в зону епілептичного вогнища на динаміку вмісту ГАМК та біогенних амінів у стовбурі головного мозку епілептизованих щурів представлені у таблиці 1.

Таблиця 1.

Динаміки вмісту ГАМК та біогенних амінів у стовбурі головного мозку епілептизованих щурів після трансплантації КЕНК, КСКМ та КЕПК

Термін після операції, діб | Трансплантація

КЕНК, нМ/г | Трансплантація

КСКМ, нМ/г | Трансплантація КЕПК, нМ/г | Епілептизовані щури, нМ/г

ГАМК

10 | 1±0,12 1 | 0,97±0,13 1 | 1,18±0,13 | 1,22±0,13

30 | 0,93±0,1 1 | 0,87±0,07 1, 2 | 1,15±0,14 | 1,19±0,12

60 | 0,85±0,008 1 | 0,74±0,11 1 | 1,17±0,08 | 1,16±0,14

Норадреналін

10 | 7,87 ±0,2 1 | 7,12±0,17 1, 2 | 6,47±0,45 | 6,7±0,46

30 | 7,1 ±0,26 1 | 6,92±0,13 1 | 6,58±0,36 | 6,67±0,33

60 | 7,17 ±0,29 1 | 6,87±0,18 1 | 6,6±0,33 | 6,64±0,36

Дофамін

10 | 1,5 ±0,17 1 | 1,49±0,15 1 | 3,1±0,16 | 3,12±0,21

30 | 1,75 ±0,19 1 | 2,15±0,27 1, 2 | 2,37±0,2 | 2,45±0,2

60 | 1,89 ±0,18 1 | 2,85±0,32 1, 2 | 2,29±0,21 | 2,4±0,26

Серотонін

10 | 2,98 ±0,38 1 | 3,21±0,16 1 | 13,24±0,3 | 13,49±0,18

30 | 3,35 ±0,29 1 | 3,67±0,21 1, 2 | 13,8±0,4 | 14,14 ±0,4

60 | 3,47 ±0,31 1 | 4,11±0,14 1, 2 | 14,16±0,11 | 14,22±0,17

1 – показник статистично вірогідно відрізняється від значення, характерного для

епілептизованих щурів (P<0,05).

2 - показник статистично вірогідно відрізняється від значення, характерного для групи

епілептизованих щурів, яким була виконана трансплантація КЕНК в зону епілептичного вогнища.

Вивчення показників серотоніну в різні терміни після трансплантації КЕНК та КСКМ, показало, що динаміка вмісту цього медіатора після трансплантації зазначених клітин практично аналогічна й характеризується значним зниженням показників у порівнянні з епілептизованими щурами. На 30-у та 60-у добу після трансплантації спостерігалося зростання вмісту серотоніну, яке було трохи більш інтенсивним у групі щурів, яким виконувалася трансплантація КСКМ.

Трансплантації КЕНК та КСКМ впливають на вміст дофаміну в стовбурі головного мозку. При цьому в групі щурів, яким була виконана трансплантація КСКМ, показник дофаміну зростає до більш високих значень, ніж у групі тварин, яким була проведена трансплантація КЕНК. Це, можливо, пов'язане з тим, що після трансплантації КСКМ вміст ГАМК знижується до більш низьких значень, ніж при трансплантації КЕНК. Більш виражене зниження активності ГАМК-ергічної системи, терміналі якої пригнічують активність дофамінової системи мозку, приводить до підвищення активності дофамінергічних нейронів та, як наслідок, підвищення вмісту дофаміну у стовбурі головного мозку.

Дослідження показників норадреналіну в зазначений термін після трансплантації КЕНК та КСКМ виявило наявність односпрямованої динаміки вмісту даного медіатора в стовбурі головного мозку у щурів, яким були трансплантовані клітинні субстрати фетального та стромального походження. Відзначено достовірне (Р<0,05) зниження рівня норадреналіну після трансплантації у порівнянні з таким в епілептизованих щурів.

Підвищення вмісту адреналіну в ранній термін після операції було відзначено як після трансплантації КЕНК, так й після трансплантації КСКМ. Поява слідів адреналіну в стовбурі головного мозку спостерігалася також у ранній термін після операції відтворення епілепсії. Як видно, подібні коливання вмісту адреналіну в стовбурі мозку є стереотипною реакцією центральної нервової системи щурів на операційну травму.

При дослідженні гіпокампограм щурів в умовах змодельованої епілепсії та трансплантації КЭНК й КСКМ в зону експериментального епілептичного вогнища відзначено, що трансплантація істотно впливає на динаміку електричної активності. Встановлено, що після операції моделювання епілепсії в зоні епілептичного вогнища (у лівому ростральному гіпокампі) домінував г-ритм із переважною частотою 1-2 Гц, у контралатеральному гіпокампі також відзначалося підвищення потужності хвиль низькочастотного діапазону (рис. 2-3).

Після трансплантацій КЕНК та КСКМ вже у ранній термін після операції відзначено значне зниження потужності хвиль г-діапазону з одночасним зростанням виразності и-ритму в зоні епілептичного вогнища, що прогресувало протягом усього періоду спостереження. У контралатеральному гіпокампі також відзначене зниження потужності хвиль низькочастотного діапазону (рис. 4-5).

Рис. 2. Спектрограма електричної Рис. 3. Спектрограма електричної

активності лівого гіпокампа активності лівого гіпокампа

щура з низькою судомною (зона епілептичного вогнища).

готовністю 15 діб після моделювання

епілепсії

Дослідження частоти розвитку судорог у відповідь на стандартну звукову провокацію виявило значне підвищення порога аудіогенної судомної готовності в щурів після трансплантації КЭНК та КСКМ. Результати дослідження динаміки аудіогенної судомної готовності після трансплантації КЕНК та КСКМ представлені в таблиці 2.

Рис. 4. Спектрограма електричної Рис. 5. Спектрограма електричної

активності лівого гіпокампа активності лівого гіпокампа

(зона епілептичного вогнища). (зона епілептичного вогнища).

60 діб після трансплантації 60 діб після трансплантації

КЕНК КСКМ

Таблиця 2.

Результати дослідження динаміки рівня аудіогенної судомної готовності щурів після трансплантації КЕНК та КСКМ в зону експериментального епілептичного вогнища

Термін після трансплантації,

діб | Частота розвитку судорог у відповідь на звукове подразнення,

тварин у групі (%)

Трансплантація КЕНК | Трансплантація КСКМ | Епілептизовані тварини

10 | 4 (36,4%) | 3 (27,8%) | 10 (91%)

30 | 1 (9,1%) | 0 (0%) | 10 (91%)

60 | 0 (0%) | 0 (0%) | 9 (81,8%)

З метою встановлення, чи не є зміни в епілепизованому мозку, неспецифічною реакцією на введення в область епілептичного вогнища будь-яких стовбурових клітин, нами проведено дослідження, що полягало у трансплантації суспензії кріоконсервованих ембріональних клітин печінки (КЕПК) в зону епілептичного вогнища. На 10-у, 30-у й 60-у добу після трансплантації істотних зрушень у вмісті ГАМК, серотоніну, адреналіну, норадреналіну та дофаміну, у порівнянні із групою епілептизованих щурів, виявлено не було. Таким чином, специфічного впливу, пов'язаного зі стиханням епілептичного процесу в головному мозку тварин, трансплантація КЕПК в зону експериментального епілептичного вогнища не викликає (Таблиця 1).

ВИСНОВКИ

1.

2.

3.

4.

5.

6.

7.

8.

СПИСОК НАУКОВИХ ПРАЦЬ, НАДРУКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1.

2.

3.

4.

5.

6.

7.

АНОТАЦІЯ

Кочін О. В. “Застосування кріоконсервованих ембріональних та стромальних клітин кісткового мозку при експериментальній епілепсії”. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата медичних наук за спеціальністю 14.01.05. - нейрохірургія. Інститут нейрохірургії імені академіка А. П. Ромоданова АМН України. - Київ, 2006.

Дисертаційна робота присвячена дослідженню результатів трансплантації кріоконсервованих ембріональних нервових клітин та клітин строми кісткового мозку, диференційованих у нейробласти, в зону експериментального епілептичного вогнища в головному мозку лабораторних тварин. У дослідженні було використано 203 самця щурів лінії Вістар з вихідною низькою аудіогенною судомною готовністю. Епілепсію у тварин відтворювали шляхом стереотаксичної ін'єкції розчину натрієвої солі пеніциліну у лівий гіпокамп, в результаті відбувалося значне зниження порога аудіогенної судорожної готовності. Зрушення в балансі нейротрансмітерів стовбура головного мозку характеризувалися значним підвищенням вмісту ГАМК та серотоніну. У спектрі електричної активності гіпокампів відзначено зниження представленості хвиль и-діапазону з одночасним підвищенням потужності низькочастотного діапазону. Трансплантації КЕНК та КСКМ в зону епілептичного вогнища призводили до морфологічних змін у ділянці операції, змін у співвідношенні нейротрансмітерів у стовбурі головного мозку та динаміки електричної активності гіпокампів. Так, морфологічні зміни у зоні епілептичного вогнища після введення клітинних субстратів фетального та стромального походження характеризувалися формуванням гліомезодермального рубця. На 10-у та 30-у добу в зоні трансплантації виявлялося щільне клітинне скупчення, що складалося з дрібних округлих клітин з великим ядром - трансплантат. На 60-у добу після операції клітинні елементи у зоні трансплантації були представлені астроглією та невеликою кількістю дрібних нейронів. Трансплантація стовбурних нервових клітин фетального й стромального походження приводила до стійкого та значного зниження вмісту ГАМК та серотоніну в стовбурі головного мозку епілептизованих щурів протягом усього періоду спостереження. Зміни електричної активності гіпокампів після трансплантації характеризувалися зниженням потужності хвиль низькочастотного діапазону (1-2 Гц) з одночасним підвищенням представленості и-ритму. При дослідженні порога аудіогенної судорожної готовності після трансплантації КЕНК та КСКМ було відзначено його значне підвищення.

Ключові слова: експериментальна епілепсія, кріоконсервовані ембріональні нервові клітини, клітини строми кісткового мозку, гіпокамп, трансплантація.

АННОТАЦИЯ

Кочин О. В. “Применение криоконсервированных эмбриональных и стромальных клеток костного мозга при экспериментальной эпилепсии”. – Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук по специальности 14.01.05. – нейрохирургия. Институт нейрохирургии имени академика А. П. Ромоданова АМН Украины. – Киев, 2006.

Диссертационная работа посвящена исследованию результатов трансплантации криоконсервированных эмбриональных нервных клеток и клеток стромы костного мозга, дифференцированных в нейробласты, в область экспериментального эпилептического очага в головном мозге лабораторных животных. В исследовании было использовано 203 самца крыс линии Вистар с исходно низкой аудиогенной судорожной готовностью. Порог судорожной готовности определяли по методике, состоявшей в звуковом раздражении громкостью 100 дБ, длительностью 2 мин, с 3-4 кратным прозваниванием. В эксперименте использовались животные, у которых после звукового воздействия судорожный припадок не развивался. Эпилепсию у животных воспроизводили путем стереотаксической инъекции раствора натриевой соли пенициллина в левый гиппокамп. В результате введения пенициллина в гиппокамп отмечено значительное снижение порога аудиогенной судорожной готовности. В ответ на стандартную звуковую провокацию судороги развивались у 100% эпилептизированных животных. Сдвиги в баллансе нейротрансмиттеров ствола головного мозга характеризовались значительным повышением содержания ГАМК и серотонина. Среднее содержание ГАМК в стволе мозга эпилептизированных крыс уже на 5 сутки после операции составило 1,22±0,14 нМ/г, в то время как среднее значение данного показателя в группе крыс с низкой судорожной готовностью составило 0,63±0,1 нМ/г. В ходе наблюдения за динамикой указанного показателя отмечено лишь незначительное его снижение. Подобное повышение содержания ГАМК в стволе головного мозга свидетельствует об активации ГАМК-ергической системы, что можно рассматривать как физиологический ответ на значительное усиление процессов возбуждения в центральной нервной системе. При исследовании содержания серотонина в стволе головного мозга у животных с экспериментальной эпилепсией отмечено значительное и стойкое повышение данного показателя в течение всего эксперимента в сравнении с животными с низкой судорожной готовностью. На 5-е сутки после воспроизведения эпилепсии средний показатель содержания серотонина составил 10,36±0,39 нМ/г и к 75-м суткам наблюдения достиг 14,22±0,18 нМ/г. Среднее содержание серотонина в стволе головного крыс с низкой судрожной готовностью равнялось 9,25±0,21 нМ/г. Повышенное содержание серотонина в стволе головного мозга крыс после операции воспроизведения эпилепсии может рассматриваться как реакция исходно полноценных нейротрансмиттерных систем головного мозга на усиление судорожной активности головного мозга в результате создания эпилептического очага.

Исследование динамики содержания ГАМК, норадреналина, адреналина, дофамина и серотонина в стволе головного мозга крыс после трансплантации КСКМ и КЭНК показало, что у животных, которым были трансплантированы клетки стромального и фетального происхождения, имеются аналогичные тенденции в изменении этих показателей. Так, в обеих группах животных после трансплантации отмечено прогрессирующее снижение содержания ГАМК в стволе мозга в сравнении с эпилептизированными животными, которым трансплантация не выполнялась. На 60-е сутки после трансплантации содержание ГАМК в стволе головного мозга практически достигло уровня, характерного для животных с низкой судорожной готовностью.

Изучение показателей серотонина в различные сроки после трансплантации КЭНК и КСКМ, показало, что динамика содержания медиатора после трансплантации указанных клеток практически аналогична и характеризуется значительным снижением показателей в сравнении с эпилептизированными животными. На 30-е и 60-е сутки после трансплантации наблюдалось возрастание содержания серотонина, которое было несколько более интенсивным в группе животных, которым выполнялась трансплантация КСКМ.

В спектре электрической активности гиппокампов отмечено снижение представленности волн и-диапазона с одновременным повышением мощности низкочастотного диапазона. Трансплантации КЭНК