Академія Медичних Наук УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ ГЕМАТОЛОГІЇ ТА трансфузіології

КЛИМЕНКО Сергій Вікторович

УДК: 616.155.392-07-08:616-001.28

Молекулярно-біологічні особливості субстратних клітин та механізми медикаментозної резистентності у хворих на гостру лейкемію, які постраждали внаслідок аварії на Чорнобильській АЕС

14.01.31 – гематологія та трансфузіологія

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

доктора медичних наук

Київ - 2006

Дисертацією є рукопис

Робота виконана в Науковому центрі радіаційної медицини АМН України

Наукові консультанти:

доктор медичних наук, професор, член-кореспондент АМН України

БЕБЕШКО Володимир Григорович, Науковий центр радіаційної медицини АМН України, завідувач відділу гематології та трансплантології

доктор медичних наук, професор

Базика Дмитро Анатолійович, Науковий центр радіаційної медицини АМН України, завідувач відділу клінічної імунології

Офіційні опоненти:

доктор медичних наук, професор

Романова Алла Федорівна, Інститут гематології та трансфузіології АМН України, головний науковий співробітник відділення захворювань системи крові

доктор медичних наук, професор

Гайдукова Світлана Миколаївна, Київська медична академія післядипломної освіти ім. П.Л. Шупика МОЗ України, завідувач кафедри гематології та трансфузіології

доктор медичних наук

МАСЛЯК Звенислава Володимирівна, Інститут патології крові та трансфузійної медицини АМН України, завідувач відділення гематології

Провідна установа:

Інститут онкології, науково-дослідне відділення системних пухлинних захворювань, АМН України, м. Київ

Захист дисертації відбудеться “ 21 ”03_______ р. о 13_ годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д .612.01 в Інституті гематології та трансфузіології АМН України за адресою: 04060, м. Київ, вул. М. Берлинського, 12.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту гематології та трансфузіології АМН України (04060, м. Київ, вул. М. Берлинського, 12).

Автореферат розісланий “ 20_ ”02________ р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради Г.П. Гащук

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Чисельні епідеміологічні дослідження підтвердили існування причинного зв’язку розвитку лейкемій з дією іонізуючої радіації (ІР) (Preston ; Doll ; Ron, ). Доказами слугували результати спостереження за особами, опроміненими під час вибухів ядерної зброї, професійної діяльності на об’єктах атомного виробництва, внаслідок техногенних катастроф і з метою лікування. Після аварії на Чорнобильській АЕС (ЧАЕС) населення значної частини європейських держав зазнало дії ІР. Відповідно до безпорогової концепції реалізації стохастичних ефектів опромінення, розвиток додаткових випадків гострої лейкемії (ГЛ) у цій ситуації став неминучим (UNSCEAR, ). Результати епідеміологічних досліджень, проведених в Росії, демонструють збільшення захворюваності на лейкемію серед учасників ліквідації наслідків аварії (ЛНА) на ЧАЕС (Ivanov ). Очікується, що спільне дослідження українських і американських учених ГЛ і споріднених захворювань надасть переконливі докази існування у ліквідаторів надлишку лейкемічних процесів, пов’язаного з радіаційним фактором Чорнобильської катастрофи (Romanenko ).

Деякими дослідниками наведено дані про особливості клітинного субстрату за радіаційно-асоційованої ГЛ (В.И. Клименко и соавт., 1991; В.Г. Бебешко и соавт., 1991; Gluzman et al., 2005). Розвитку захворювання у опромінених осіб часто передує фаза мієлодиспластичних змін (В.Г. Бебешко, ). Багато авторів відзначили резистентність лейкемічного процесу в учасників ЛНА на ЧАЕС і жителів радіоактивно забруднених територій до стандартної цитостатичної терапії (А.Ф. Романова и соавт., 1996; Л.А. Сивак та співавт., 2000). Однак дотепер недостатньо даних, щоб чітко визначити патогенетичні, молекулярно-біологічні та клініко-гематологічні особливості ГЛ, зумовлених дією ІР. Систематизоване і поглиблене дослідження хворих на гостру мієлоїдну лейкемію (ГМЛ), гостру лімфобластну лейкемію (ГЛЛ) та мієлодиспластичний синдром (МДС), які були опромінені внаслідок Чорнобильської катастрофи, може надати ґрунтовну інформацію про патогенетичні шляхи розвитку лейкемічного процесу і стати підставою для уточнення існуючої класифікації лейкемій, виділення радіаційно-індукованих і радіаційно-асоційованих випадків захворювання в окрему класифікаційну категорію. У практичному аспекті систематизація цитоморфологічних, імунофенотипових, цитогенетичних та молекулярно-біологічних характеристик лейкемічних клітин у осіб, опромінених унаслідок аварії на ЧАЕС, дозволяє розробити критерії прогнозування перебігу захворювання, диференціювати терапевтичні підходи та здійснювати контроль за ефективністю лікування.

Не вирішеною залишається проблема резистентності до цитостатичної терапії ГЛ у осіб, які зазнали дії ІР унаслідок аварії на ЧАЕС. Удосконалення потребує моніторинг результатів лікування, поглибленого вивчення – фактори, що призводять до розвитку медикаментозної резистентності у хворих на радіаційно-асоційовані ГМЛ і ГЛЛ. Розроблення стратегії терапії ГЛ, основаної на розумінні молекулярно-біологічних особливостей радіаційно-асоційованого лейкемічного процесу і спрямованої на подолання феномену множинної медикаментозної резистентності (ММР), має стати вирішальною в підвищенні результативності лікування постраждалих унаслідок аварії на ЧАЕС.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Роботу виконано в рамках науково-дослідних розробок Наукового центру радіаційної медицини (НЦРМ) АМН України, виконавцем яких був автор, а саме: 1) “Вивчення закономірностей виникнення, механізмів розвитку та особливостей перебігу найбільш розповсюджених захворювань у постраждалих, що віднесені до критичних груп. Розробка системи лікувально-реабілітаційних заходів, первинної та вторинної профілактики патологічних станів”. Підтема “Вивчити особливості перебігу та лікування різних форм мієлодиспластичного синдрому та лейкемії серед осіб, які постраждали внаслідок аварії на Чорнобильській АЕС, у віддалений період”. Шифр теми: 17/11 Н-99.03, номер держреєстрації 0199U003595 (1999–2001 рр.). 2) “Провести верифікацію випадків лейкемій в учасників ліквідації наслідків аварії на ЧАЕС в Державному та спеціалізованих реєстрах”. Шифр теми: 348, номер держреєстрації 0102U005687 (2002–2004 рр.). 3) “Розробка нових програм терапії гострих лейкемій та мієлодиспластичного синдрому у хворих, які постраждали внаслідок аварії на Чорнобильській АЕС, з урахуванням їх молекулярно-генетичних даних та множинної медикаментозної резистентності”. Шифр теми: 378, номер держреєстрації 0104U003631 (2004–2006 рр.).

Мета роботи. Визначити молекулярно-біологічні особливості субстратних клітин у хворих на ГЛ, які постраждали внаслідок аварії на ЧАЕС, і розробити стратегію диференційованого лікування, спрямовану на подолання медикаментозної резистентності.

Завдання дослідження:

1.

2.

3.

4.

5.

6.

7.

8.

Об’єкт дослідження: гостра мієлоїдна лейкемія, гостра лімфобластна лейкемія, мієлодиспластичний синдром в учасників ЛНА на ЧАЕС та жителів радіоактивно забруднених територій.

Предмет дослідження: цитоморфологічні, імунофенотипові, молекулярно-біологічні та цитогенетичні характеристики лейкемічних клітин, клініко-лабораторні показники, програми терапії радіаційно-асоційованих ГЛ.

Методи дослідження: клініко-гематологічні, біохімічні, імунофенотипові, молекулярно-біологічні, цитогенетичні, статистичні.

Наукова новизна одержаних результатів. Уперше встановлено особливості радіаційно-асоційованого лейкемічного процесу в осіб, опромінених унаслідок аварії на ЧАЕС. Визначено, що радіаційно-асоційована ГЛ має ознаки, які відмежовують її від спонтанної лейкемії. За результатами комплексного дослідження продемонстровано, що ГЛ, які розвинулись в учасників ЛНА та жителів радіоактивно забруднених територій, характеризуються своєрідністю клініко-гематологічної картини, а результати їх лікування значно гірші, ніж такі за спонтанних ГМЛ і ГЛЛ. Доведено, що попередній вплив ІР – значущий прогностичний фактор перебігу і відповіді на лікування ГЛ. Уперше виявлено особливості експресії факторів медикаментозної резистентності за радіаційно-асоційованих лейкемій.

Уперше визначено, що стан організму в цілому і здатність хворого перенести специфічну терапію більше впливають на перебіг захворювання та відповідь на лікування спонтанних лейкемій ніж радіаційно-асоційованих, за яких особливого значення набувають біологічні особливості власне пухлинного процесу.

Одержано пріоритетні дані про патогенез радіаційно-асоційованого лейкемічного процесу у разі ГМЛ. Визначено, що хромосомні транслокації, які вважаються ознакою захворювань de novo і терапієзумовлених ГМЛ після лікування інгібіторами ДНК топоізомерази II, не поширені серед пацієнтів на ГМЛ, які зазнали дії ІР унаслідок аварії на ЧАЕС. Наведено докази, що спектр молекулярно-генетичних перебудов у разі радіаційних ГМЛ зміщений у бік незбалансованих хромосомних аномалій, таких як втрати та набуття генетичного матеріалу, з невипадково високою частотою делецій 5q і/або 7q та 7р. Отримано нові дані на користь існування асоціації між специфічною аномалією хромосомного матеріалу – точковою мутацією гена AML1 та радіаційною асоційованістю лейкемічного процесу. Установлено, що, крім відмінних від спонтанних лейкемічних процесів патогенетичних механізмів, фенотипових характеристик субстратних клітин, радіаційно-асоційовані лейкемії характеризуються більш виразною генетичною нестабільністю.

Обґрунтовано необхідність досліджень з удосконалення існуючої класифікації ГЛ щодо виділення радіаційно-індукованих і радіаційно-асоційованих випадків захворювання в окрему класифікаційну категорію.

Визначено, що лейкемічний процес в учасників ЛНА і жителів радіоактивно забруднених територій характеризується багатофакторністю медикаментозної резистентності, яка включає своєрідність патогенезу, утягування в її формування транспортних протеїнів, порушення реалізації процесів апоптозу, генетичну нестабільність лейкемічного клону та нестачу внутрішньоклітинних мішеней для спрямованого протипухлинного лікування. У хворих на радіаційно-асоційовану ГЛ виявляються ознаки множинних процесів та чинників, які зумовлюють нечутливість субстратних клітин до цитостатичної терапії.

Аргументовано, що першочергові заходи щодо поліпшення результатів лікування ГМЛ і ГЛЛ в осіб, опромінених унаслідок аварії на ЧАЕС, мають бути спрямовані на забезпечення адекватної цитостатичної терапії індукції ремісії захворювання і терапії супроводу в достатньому обсязі. Доведено необхідність внесення змін до стратегії лікування ГМЛ і ГЛЛ, які розвинулись в учасників ЛНА на ЧАЕС і жителів радіоактивно забруднених територій, і теоретично обґрунтовані напрямки її удосконалення.

Практичне значення одержаних результатів. Відповідно до потреб практичної охорони здоров’я запропоновано комплекс тестів, які мають оптимізувати діагностику та прогнозування ГМЛ і ГЛЛ, на які хворіють учасники ЛНА на ЧАЕС і жителі радіоактивно забруднених територій. Визначено комплекс маркерів медикаментозної резистентності, які доцільно досліджувати на етапах діагностики ГЛ у постраждалих.

Розроблено патогенетично-обгрунтовану стратегію лікування ГМЛ і ГЛЛ, які розвинулись в учасників ЛНА на ЧАЕС і жителів радіоактивно забруднених територій. Обґрунтовано доцільність використання алогенної трансплантації стовбурових гемопоетичних клітин (СГК) як необхідного компонента терапії ГЛ в осіб, опромінених унаслідок Чорнобильської катастрофи.

На підставі проведеного оцінювання особливостей МДС в опромінених осіб показана можливість ранньої діагностики радіаційно-асоційованого лейкемічного процесу (Пат.  А Україна. Спосіб діагностики некласифікованого варіанта мієлодиспластичного синдрому як передстадії лейкемії у осіб, що зазнали дії іонізуючого опромінення / В.Г. Бебешко, В.І. Клименко, І.С. Дягіль, Т.Ф. Любарець, Т.В. Каднікова, С.В. Клименко; НЦРМ АМН України. – № ; Заявл. 22.01.99; Опубл. 15.12.2000, Бюл. № ІІ. – 3 c.).

Отримані дані використовуються в повсякденній клінічній діяльності відділення гематології Клініки НЦРМ АМН України, відділення гематології Головного військового клінічного госпіталю Міністерства оборони України, відділення гематології ІІ Обласної клінічної лікарні м. Києва, відділення гематології Житомирської обласної клінічної лікарні ім. О.Ф. Гербачевського, а також у педагогічному процесі кафедри радіології та кафедри гематології і трансфузіології Київської медичної академії післядипломної освіти ім. П.Л. Шупика Міністерства охорони здоров’я України.

Особистий внесок здобувача. Дисертацію виконано у відділі гематології та трансплантології (керівник – чл.-кор. АМН України, д.мед.н., проф. В.Г. Бебешко), відділі клінічної імунології (керівник – д.мед.н., проф. Д.А. Базика) Інституту клінічної радіології (ІКР) НЦРМ АМН України, Інституті патології, Нойхерберг, Германія (керівник – доктор М. Аткінсон). Здобувачеві належить ідея дисертаційної роботи. Автором здійснено аналіз попередніх наукових літературних даних, обґрунтовано актуальність і необхідність дослідження, його мету і завдання, сформовано групи спостереження, опрацьовано методики дослідження, виконано молекулярно-біологічні обстеження хворих, включаючи флуоресцентну in situ гібридизацію (FISH), полімеразну ланцюгову реакцію (ПЛР), сіквенування ДНК, аналіз збалансованості геному за допомогою генних чипів. Самостійно здійснено аналіз і зіставлення даних клінічних, цитологічних, біохімічних, цитохімічних, гістологічних, імунологічних, цитогенетичних, молекулярно-біологічних досліджень, оцінено результати лікування, сформовано комп'ютерну базу даних, написано всі розділи дисертації і сформульовано висновки. Імунофенотипові дослідження проводили на базі відділу клінічної імунології ІКР НЦРМ АМН України спільно з д.мед.н., проф. Д.А. Базикою, науковими співробітниками О.Л. Мазниченко, Н.А. Голярник, зворотно транскриптазну ПЛР (ЗТ-ПЛР) – спільно з провідним науковим співробітником відділу клінічної імунології д.мед.н. І.В. Абраменко та молодшим науковим співробітником лабораторії імуногенетики І.В. Дмитренко (керівник – д.б.н. Ж.М. Мінченко). Допомога у проведенні диференційного G-фарбування препаратів хромосом та їх аналізу надана науковим співробітником відділу гематології та трансплантології Ж.А. Мішаріною, у визначенні поліморфізму конформації однониткового ланцюжка ДНК гена р53 – доктором Н. Імамура із Інституту радіаційної біології і медицини Університету Хіросіми (Японія), у виготовленні та фотографуванні гістологічних препаратів – аспірантом І.Н. Кабаченко.

Наукове співробітництво здійснювалось з доктором М. Роземанном, доктором Я. Шміда та доктором К. Бінк із Інституту патології (Нойхерберг, Германія), доктором Х. Цитцельсбергом із Інституту молекулярної біології (Нойхерберг, Германія), проф. К.Р. Троттом із Інституту раку Грея (Лондон, Велика Британія). Автор щиро вдячний керівникам та співробітникам вищевказаних закладів за увагу до його досліджень і допомогу.

Апробація результатів дисертації. Результати наукового пошуку неодноразово обговорювались на практичних конференціях відділу гематології та трансплантології ІКР НЦРМ АМН України (2004–2005 рр.), а також викладені та обговорені на наукових форумах: 4-му Конгресі Європейської асоціації гематологів (Барселона, Іспанія, 1999 р.); XVIII з’їзді Польського товариства гематологів і трансфузіологів (Варшава, Польща, 1999 р.); ІV з’їзді гематологів та трансфузіологів України (Київ, 2001 р.); 6-му Міжнародному симпозіумі з мієлодиспластичного синдрому (Стокгольм, Швеція, 2001 р.); науково-практичній конференції з нагоди 15-річчя створення відділу клінічної імунології НЦРМ АМН України (Київ, 2002 р.); Міжнародній науково-практичній конференції фахівців з променевої терапії та радіаційної онкології (Чернігів, 2002 р.); семінарі НАТО “Оцінка ризику наслідків аварії на Чорнобильській АЕС” (Київ, 2002 р.); 8-му щорічному конгресі Європейської асоціації гематологів (Ліон, Франція, 2003 р.); 7-му Міжнародному симпозіумі з мієлодиспластичного синдрому (Париж, Франція, 2003 р.); 9-му щорічному конгресі Європейської асоціації гематологів (Женева, Швейцарія, 2004 р.); конференції “Исследование рисков Чернобыльской катастрофы” (Киев, 2004 р.); науково-практичній конференції “Сучасний стан гематологічної служби в Україні” (Яремча, 2004 р.); конференції молодих учених “Актуальні проблеми радіаційної медицини та радіобіології” (Київ, 2005 р.); Міжнародній науковій конференції з біохімії та молекулярної біології, присвяченій пам’яті Я. Парнаса (Київ, 2005 р.); 10-му щорічному конгресі Європейської асоціації гематологів (Стокгольм, Швеція 2005 р.); ІІІ Міжнародному симпозіумі “Хроническое радиационное воздействие: медико-биологические эффекты” (Челябінськ, Росія, 2005 р.); Науково-практичній конференції “Гематология и трансфузиология: фундаментальные и прикладные вопросы” (Київ, 2005 р.); науково-практичній конференції “Актуальні проблеми гематології та трансфузійної медицини” (Львів, 2005 р.).

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 45 наукових праць: статей у журналах – 23, статей у збірниках наукових праць – 2, розділів у колективних монографіях – 2, тез доповідей на з’їздах та наукових конференціях – 17. Одержано патент України на винахід. Із цієї кількості у виданнях, що відповідають вимогам ВАК України, опубліковано 28 наукових праць.

Структура та обсяг дисертації. Дисертацію викладено на 357 сторінках друкованого тексту (282 сторінки основного тексту), ілюстровано 44 таблицями і 63 рисунками. Дисертація складається зі вступу, 9 розділів, висновків, практичних рекомендацій, списку використаних джерел, який містить 489 назв, і додатку.

ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріали і методи дослідження. Проведено аналіз клінічних проявів, результатів лікування, клініко-гематологічних, імунофенотипових, цитогенетичних, молекулярно-біологічних особливостей у 268 хворих на ГМЛ, ГЛЛ та МДС, які маніфестували в період 1987–2005 рр. Захворювання класифікували відповідно до Міжнародної статистичної класифікації захворювань 10-го перегляду. У 187 хворих діагностовано ГМЛ (в тому числі у 24 – ГМЛ із МДС), у 79 – ГЛЛ, у 2 – МДС. Дані про належність хворих до категорій учасників ЛНА на ЧАЕС та жителів радіоактивно забруднених територій отримано з посвідчень потерпілих. Двоє хворих перенесли у 1986 р. гостру променеву хворобу (ГПХ) І і ІІ ступеня (поглинена доза 1,7 і 2,5 Зв відповідно). Пухлинний процес класифікували як радіаційно-асоційований на підставі опублікованих даних про ретроспективну дозиметрію учасників ЛНА та жителів радіоактивно забруднених територій (В.В. Чумак, С.В. Шолом, 1999; Likhtarev1994; 2002). “Радіаційна асоційованість” як характеристика вказує на те, що лейкемія розвинулась у особи, яка зазнала дії ІР в дозах вищих за фонові. Згідно безпорогової концепції реалізації стохастичних ефектів дії радіації на організм людини (UNSCEAR, 2000), серед пацієнтів з радіаційно-асоційованими лейкеміями існує частка хворих, у яких розвиток захворювання ініційований опроміненням внаслідок Чорнобильської катастрофи. У разі екстраполяції розрахунків Mettler та співавт. (1990) ризику надлишкових випадків лейкемії після дії ІР на людину, можна припустити, що 40% лейкемій в учасників ЛНА 1986-1987 рр. індуковані дією радіаційного випромінювання, спричиненого Чорнобильською катастрофою. Саме патогенетичні та фенотипові особливості, притаманні радіаційно-індукованій ГЛ, могли визначити відмінності всієї групи хворих з радіаційно-асоційованими захворюваннями від групи пацієнтів зі спонтанними лейкемічними процесами. Спонтанними, або de novo, вважали лейкемії, щодо яких не існувало відомостей про асоціацію розвитку патологічного процесу з попередньою дією будь-якого канцерогенного фактору.

Основну групу склали 133 хворі на радіаційно-асоційовані лейкемічні процеси, а саме: 70 учасників ЛНА та 63 мешканці радіоактивно забруднених територій. До контрольної групи ввійшли 132 пацієнти зі спонтанною ГЛ. Окремо розглядали двох хворих на терапієзумовлену, після лікування інгібіторами ДНК топоізомерази ІІ, ГМЛ, і одного хворого на ГЛЛ, яка розвинулась після лікування астроцитоми із застосуванням рентгенівських променів. Вік на момент верифікації діагнозу в пацієнтів основної і контрольної груп коливався від 16 до 80 років у кожній. Середній вік хворих на радіаційно-асоційовані лейкемічні процеси становив 46,1 року (95% довірчий інтервал, ДІ ,1–49,0), пацієнтів із спонтанними захворюваннями – 40,8 року (95% ДІ 37,6–44,1). Хворі основної групи були старішими (р<0,005), але кількість осіб віком понад 60 років у групах не відрізнялась (р=0,58). Серед хворих контрольної групи порівняно з основною було більше осіб жіночої статі (р<0,005). Не виявлено різниці у розподілі за статтю між контрольною групою та підгрупою мешканців забруднених радіонуклідами територій, яку формували 32 особи жіночої статі та 31 – чоловічої (р=0,73), але вона була очевидною в порівнянні з підгрупою учасників ЛНА, яка містила 8 осіб жіночої статі та 63 – чоловічої (р<0,0001). Хоча стать не вважається істотним прогностичним фактором перебігу лейкемічного процесу, визначена особливість розподілу є важливою ознакою, яка відображає демографічну своєрідність всієї когорти учасників ЛНА.

Для вирішення завдань роботи виконували ряд досліджень, зокрема:– 

аналіз клінічних даних: анамнезу, об’єктивного обстеження з констатацією клінічних проявів хвороби, показників результатів лікування;– 

аналіз клініко-гематологічних даних, зокрема цитоморфологічного дослідження крові і кісткового мозку з підрахунком лейкограми і мієлограми у паноптично забарвлених за Романовським–Гімзе препаратах, гістологічного дослідження трепанобіоптатів кісткового мозку, біохімічного дослідження крові (лактатдегідрогеназа, ЛДГ);– 

імунологічне фенотипування клітин кісткового мозку або периферичної крові з визначенням експресії Р-глікопротеїну, MRP, LRP, CD95, BCL-2, BAX, BCL-XL, p53 та топоізомерази ІІ? за допомогою проточної цитофлуориметрії;– 

цитогенетичні дослідження: каріотипування клітин кісткового мозку за методикою диференційного G-фарбування; дослідження інтерфазних ядер і метафазних пластинок методом FISH з пробами AML1/ETO, MLL, BCR/ABL, Cyclin D1/CEP11 та CEP8;– 

молекулярно-біологічні дослідження: ПЛР ампліфікацію ДНК генів AML1, Flt3; визначення поліморфізму конформації однониткового ланцюжка ДНК гена р53; визначення транскриптів AML1/ETO, MLL/AF4 і MLL/AF9 методом ЗТ-ПЛР; дослідження поліморфізму рестрикції продукту ПЛР кодону D835 гена Flt3; клонування продукту ПЛР екзону 8 гена AML1; флуоресцентне сіквенування екзонів 3–8 гена AML1, JD домену і кодону D835 гена Flt3; аналіз збалансованості геному за допомогою генних чипів;– 

статистичний аналіз: t-тест, 2-тест, тест Фішера, кореляційний і регресійний аналізи, методи Каплана-Мейера, Сімона і Лі, процедуру Мантеля. В табл. 1 наведено основні методи дослідження і кількісні характеристики об’єму виконаних робіт.

Таблиця 1

Використані в роботі методи дослідження і виконаний об’єм робіт

Метод дослідження | Об’єм дослідження

Аналіз клінічних та клініко-гематологічних даних | 268 хворих

Імунологічне фенотипування з визначенням детермінант ММР | 662 дослідження

Цитогенетичні дослідження

каріотипування | 2 дослідження

експерименти з FISH | 124 дослідження

Молекулярно-біологічні дослідження

ампліфікація ДНК і візуалізація продуктів ПЛР | 439 реакцій

визначення поліморфізму конформації ДНК | 18 досліджень

ЗТ-ПЛР | 75 досліджень

дослідження поліморфізму рестрикції продукту ПЛР | 158 досліджень

клонування продукту ПЛР | 3 експерименти

сіквенування ДНК | 48 досліджень

аналіз геному за допомогою генних чипів | 19 досліджень

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ, їх Аналіз і узагальнення

Клініко-гематологічні особливості та результати лікування радіаційно-асоційованої ГМЛ. Для визначення клінічних і клініко-гематологічних особливостей радіаційно-асоційованих лейкемічних процесів аналізували медичну документацію 82 хворих на ГМЛ основної та 70 – контрольної групи.

ГМЛ в учасників ЛНА та жителів радіоактивно забруднених територій частіше, ніж ГМЛ у контрольній групі, була представлена промієлоцитарним морфологічним варіантом (у 11 із 82 проти 3 із 70 пацієнтів відповідно, р<0,05) і рідше мала морфологію М4ео (у жодного із 82 проти 8 із 70 пацієнтів відповідно, р<0,005). Кількість осіб із ГМЛ, віднесених до інших категорій Франко-американо-британської (ФАБ) класифікації, у групах хворих із спонтанними та радіаційно-асоційованими лейкеміями не розрізнялась. Розвитку ГМЛ серед осіб, опромінених унаслідок аварії на ЧАЕС, частіше передував МДС – у 18 із 82 випадків проти 6 із 70 випадків за спонтанної ГМЛ (р<0,05). Високою частотою мієлодиспластичної передфази радіаційно-асоційована ГМЛ нагадує вторинні лейкемії, які індуковані алкілуючими агентами.

Лімфаденопатія, спленомегалія, гепатомегалія, екстрамедулярні ураження та важкий геморагічний синдром як ініціальні ознаки лейкемічного процесу зареєстровано в групах осіб із спонтанною та радіаційно-асоційованою ГМЛ однаковою мірою. Однак клінічна картина захворювання у пацієнтів, які зазнали дії ІР, частіше характеризувалась наявністю інфекційного процесу під час маніфестації (у 13 із 82 проти 1 із 70 випадків в групі контролю, p<0,05). Загальний стан хворих основної групи в цілому був більш тяжким. В істотно більшої частини осіб із радіаційно-асоційованою ГМЛ, порівняно з пацієнтами контрольної групи, загальний статус за шкалою ВООЗ оцінено більше, ніж у 2 бали (у 11 із 82 проти 3 із 70 пацієнтів відповідно, р<0,05). Кожний п’ятий хворий на ГМЛ серед осіб, опромінених унаслідок Чорнобильської катастрофи, мав протипоказання до проведення інтенсивної хіміотерапії індукції ремісії (16 із 82 випадків проти 2 із 70 в групі контролю, p<0,05). Істотні розбіжності між групами хворих на радіаційно-асоційовану та спонтанну ГМЛ в кількості осіб, яким може бути призначена адекватна специфічна хіміотерапія, заздалегідь зменшує шанси постраждалих на довготривале загальне і безрецидивне виживання.

Серед хворих на ГМЛ, опромінених унаслідок аварії на ЧАЕС, рівень ЛДГ частіше перевищував значення у 500 од/л, яке вважається верхньою межею нормативних показників (у 19 із 24 випадків проти 15 із 29 в групі контролю, p<0,05). В осіб із радіаційно-асоційованою ГМЛ нижчими, ніж в контрольній групі, були ініціальні показники периферичної крові щодо кількості еритроцитів (2,49 ? 1012/л проти 2,71 ? 1012/л відповідно, р<0,05) і вмісту гемоглобіну (75,6 г/л проти 83,9 г/л відповідно, р<0,05), істотно більша частина хворих потребувала трансфузій еритроцитарної маси у зв’язку зі зниженням рівня гемоглобіну менше 80 г/л (51 із 82 проти 29 із 70 осіб відповідно, р<0,05). Інші показники периферичної крові в групах не розрізнялись.

Кількість хворих, у яких визначили хоча б один із найбільш значущих факторів несприятливого прогнозу, зокрема вік понад 60 років, розвиток ГМЛ із МДС і кількість лейкоцитів у периферичній крові більше 30 ? 109/л під час маніфестації захворювання, становила 49 (60%) і 27 (39%) осіб з радіаційно-асоційованою та спонтанною ГМЛ відповідно (р<0,05). Варте уваги те, що не визначено очікуваного для спонтанних лейкемій позитивного кореляційного зв’язку між віком понад 60 років та розвитком ГМЛ із МДС і/або ініціальним лейкоцитозом у хворих, які зазнали дії ІР (r=0,08; р=0,48).

Результати лікування і відповідь на цитостатичну терапію проаналізовано у 150 пацієнтів – 81 та 69 хворих на радіаційно-асоційовану та спонтанну ГМЛ відповідно. Результати лікування оцінювали згідно із загальноприйнятими критеріями (Cheson ). Медіана виживання для хворих на радіаційно-асоційовану ГМЛ склала 99 днів, пацієнтів зі спонтанною ГМЛ – 407 днів. Розбіжність у загальному виживанні між групами у логранковому тесті була статистично значущою (р<0,0001). Імовірність дворічного виживання в групі хворих на радіаційно-асоційовану ГМЛ становила 13% (95% ДІ 8–18%), у хворих контрольної групи – 30% (95% ДІ 23–37%). Група пацієнтів із радіаційно-асоційованою ГМЛ була неоднорідною щодо радіаційного анамнезу. Розрахований за процедурою Мантеля тренд у загальному виживанні для хворих контрольної групи та, окремо, учасників ЛНА на ЧАЕС і жителів забруднених радіонуклідами територій (зокрема й евакуйованих із зони відчуження) був статистично значущим (р<0,0005, критерій 2, рис. ). Визначено статистичну значущість розбіжності в загальному виживанні між учасниками ЛНА та жителями забруднених радіонуклідами територій (р<0,05).

Рис. 1. Загальне виживання хворих на радіаційно-асоційовану та спонтанну ГМЛ:

1 – група хворих на спонтанну ГМЛ;

2 – група хворих на радіаційно-асоційовану ГМЛ;

3 – жителі забруднених радіонуклідами територій з ГМЛ;

4 – учасники ЛНА на ЧАЕС з ГМЛ.

Оцінюючи виживання без урахування радіаційного фактора осіб різної статі, віку і пролікованих з різною інтенсивністю з’ясовано, що жоден інший фактор не набував такої значущості, як радіаційний. Виявлено достовірне збільшення загального виживання хворих, які отримували адекватне лікування, порівняно з пацієнтами, яких лікували недостатньо інтенсивно (р<0,05).

За відсутності різниці в інтенсивності індукції ремісії, результати лікування пацієнтів, у яких не було протипоказань до проведення стандартної терапії (128 осіб) в основній і контрольній групах істотно відрізнялись. Повної ремісії досягли лише 4 із 64 хворих на радіаційно-асоційовану ГМЛ (проти 31 із 64 осіб контролю, p<0,0001). Крім того, в осіб, які зазнали дії ІР, ГМЛ частіше, порівняно з пацієнтами на спонтанну лейкемію, представлена резистентними до стандартного цитостатичного лікування формами (43 із 64 проти 23 із 64 випадків відповідно, p<0,001). Проведений у 128 пацієнтів кореляційний аналіз дозволив визначити, що факт резистентності асоціювався з неадекватністю індукційної терапії (r=0,29, р<0,005). Частота ранніх смертей в обох групах була однаково високою (17 із 64 проти 10 із 64 випадків відповідно, р=0,19). У 128 хворих на ГМЛ вона була істотно вищою від очікуваної за даними літературних джерел (Giles et al., 2002) (21% проти 10% відповідно, р<0,05). Забезпечення пацієнтів з радіаційно-асоційованою ГМЛ адекватною дезінтоксикаційною, антибактеріальною, антимікотичною, замісною терапією слід вважати необхідним заходом для проведення хіміотерапії в повному обсязі та зменшення пов’язаної з нею летальності.

Окремо проведено аналіз загального виживання та результатів лікування хворих на гостру промієлоцитарну лейкемію (ГПЛ). Підтверджуючи визначені раніше тенденції, загальне виживання в логранковому тесті у пацієнтів з радіаційно-асоційованою ГПЛ виявилось істотно коротшим, ніж у хворих з ГПЛ в контрольній групі (р<0,05). Порівнюючи результати лікування в групі пацієнтів з радіаційно-асоційованою ГПЛ, установлено, що загальне виживання пролікованих повністю трансретіноєвою кислотою (АТRA) було більш тривалим, ніж пацієнтів, які отримували тільки цитостатики (р<0,05).

Можна стверджувати, що попередній вплив ІР є значним прогностичним фактором перебігу лейкемічного процесу і припустити, що відзначені клініко-гематологічні особливості та незадовільні результати лікування відображають патогенетичну своєрідність радіаційно-асоційованих випадків ГМЛ.

Молекулярно-біологічні особливості субстратних клітин хворих на ГМЛ, які постраждали внаслідок аварії на Чорнобильській АЕС.

До початку дослідження не було однозначних доказів існування асоціації між специфічними аномаліями хромосомного матеріалу при ГМЛ, МДС і попередньою дією ІР. Найбільш перспективними для детального вивчення визначено перебудови хромосоми 21q22 з утягуванням гена AML1 і хромосоми 11q23 з утягуванням гена MLL (Hromas et al., ; 2001; Bloomfield et2002; Harada et al., 2003; 2004).

Зразки субстратних клітин 53 хворих на ГМЛ аналізували щодо наявності аномалій гена AML1 за допомогою FISH та/або ЗТ-ПЛР. На відміну від Hromas та співавт. (2000; 2001), у хворих на ГМЛ, які постраждали внаслідок аварії на ЧАЕС, не визначено незвичайних перебудов локусу AML1 з утягуванням інших, крім гена ETO, транслокаційних партнерів. Цитогенетичні перебудови з утягуванням AML1 методом FISH зареєстровано статистично частіше серед пацієнтів контролю (у 5 із 16 осіб), ніж серед хворих на радіаційно-асоційовану ГМЛ (у жодної з 21 особи, р<0,05). Прогностично сприятливу транслокацію AML1/ETO за допомогою FISH та/або ЗТ-ПЛР виявлено в одного із 24 хворих на ГМЛ, які зазнали дії ІР унаслідок аварії на ЧАЕС, але цю аномалію за спонтанної ГМЛ ідентифіковано значно частіше (p<0,05) – в 9 із 29 випадків. В 17% зразків транслокацію AML1/ETO визначали паралельно двома методами – FISH і ЗТ-ПЛР. Розбіжностей між результатами, отриманими різними методиками, не було в жодному з випадків.

Зазначимо, що частота транслокації AML1/ETO, зареєстрована в контрольній групі, збігається з відзначеною при ГМЛ серед мешканців західних регіонів Росії (Frenkelal., 1997; А.Г. Сергеев и соавт., 2000) і є дещо вищою, ніж серед захворілих на ГМЛ у країнах Західної Європи та Північної Америки (Haferlach et al., 2004). Високий рівень транслокації AML1/ETO за спонтанної ГМЛ в українській і російській когортах може відображати особливості східноєвропейської популяції в цілому.

Пацієнти, які зазнали дії ІР унаслідок аварії на ЧАЕС, рідко належать до сприятливої категорії ГМЛ, що характеризується транслокацією AML1/ETO. Найкращий результат лікування ГМЛ у разі наявності транслокації AML1/ETO досягається за використання високих доз цитозару на етапі консолідації ремісії захворювання (Astrom et al., 2000). Зменшення частки пацієнтів, очікувано чутливих до цитозару у високих дозах, значно знижує шанси опромінених хворих на виліковування методом стандартної хіміотерапії і спонукає до застосування інтенсивних схем терапії, які ґрунтуються на процедурах трансплантації СГК, протоколів клінічних випробувань перспективних лікувальних заходів.

Результати пошуку мутацій гена AML1 при МДС та ГМЛ, які розвинулись із МДС, в осіб, опромінених унаслідок аварії на ЧАЕС, у цьому дослідженні виявились дещо відмінними від отриманих Harada та співавт. (2003; 2004). Однак вони підтверджують гіпотезу про те, що найбільш імовірною окремою молекулярно-біологічною подією, яка призводить до розвитку радіаційно-індукованих лейкемічних процесів, є точкова мутація гена AML1. В жодному із 6зразків субстратних клітин , проаналізованих шляхом сіквенування послідовності ДНК, не виявлено змін AML1 із заміною окремого нуклеотиду, але виявлено всередині гена раніше не описану в літературних джерелах точкову мутацію – дуплікацію гексануклеотидної послідовності у пацієнта з МДС, який переніс ГПХ унаслідок аварії на ЧАЕС. Всі мутації у тих, хто пережив атомне бомбардування, знайдено в runt домені. Японські автори вважали, що наявність мутації гена AML1 в регіоні карбоксильного (C)-кінця тісно корелює зі спорадичною природою МДС (Haradaal., 2004). В цьому дослідженні точкову мутацію AML1 виявлено в домені активації транскрипції карбоксильного (C)-кінця безпосередньо за амінокислотним залишком 368 у реконвалесцента ГПХ з іще більшою, порівняно з хворими японської когорти, імовірністю радіаційної індукованості захворювання. Поглинута доза пацієнта становила 1,7 Гр і, згідно з епідеміологічними даними щодо розвитку лейкемій у ліквідаторів наслідків аварії на ЧАЕС (Ivanov ), імовірність радіаційної природи МДС у нього перебільшувала 90%.

За допомогою FISH та/або ЗТ-ПЛР нами проведено дослідження субстратних клітин 61 хворого щодо перебудов гену MLL. Його результати свідчать, що транслокації MLL, які характерні для спонтанних і зумовлених терапією інгібіторами ДНК топоізомерази ІІ ГМЛ (Mrozek et al., 2004), не є поширеними за радіаційно-асоційованих лейкемій. Статистичним аналізом не виявлено жодних відмінностей між хворими на радіаційно-асоційовану ГМЛ і хворими на спонтанну лейкемію щодо транслокацій (жодного із 23 проти 1 із 18 випадків відповідно, р=0,44) і будь-яких перебудов (1 із 23 проти 1 із 18 випадків відповідно, р=1,0) гена MLL, виявлених за допомогою FISH експериментів. Подальший аналіз було обмежено вивченням частоти найбільш поширених за ГМЛ транслокацій MLL. Додатково проведено скринінг наявності химерних генів MLL/AF4 і MLL/AF9 за допомогою ЗТ-ПЛР. Сумуючи результати FISH та ЗТ-ПЛР, частоту транслокацій MLL/AF4 і MLL/AF9 оцінено у 61 особи, зокрема 27 хворих на радіаційно-асоційовану ГМЛ, 32 – на спонтанну та 2 – на терапієзумовлену, після лікування інгібіторами ДНК топоізомерази ІІ. Частота транслокацій в усіх хворих на ГМЛ становила 3,3% (у 2 із 61 хворого) і відповідала літературним даним про поширеність подібних аномалій в неселекціонованих групах пацієнтів (Schoch et al., 2003). Не знайдено жодної транслокації MLL/AF4 і MLL/AF9 MLL у хворих на радіаційно-асоційовану ГМЛ, по одній виявлено у пацієнтів на спонтанну та терапієзумовлену лейкемію відповідно.

Таким чином, не отримано доказів, що транслокації MLL мають істотне значення в лейкемогенезі в осіб, опромінених унаслідок аварії на ЧЕАС. Більше того, слід вважати, що радіаційно-асоційована лейкемія цитогенетично відрізняється від такої, що розвинулась внаслідок терапевтичного застосування інгібіторів ДНК топоізомерази ІІ і характеризується невипадковими транслокаційними перебудовами локусу MLL. Проте отримані дані підтримують гіпотезу (Appelbaum  et al., 1996; Smith et al., 2003), які вважають, що ІР діє на клітини подібно багатьом пошкоджуючим ДНК речовинам, і за наслідками генотоксичного впливу схожа на алкілуючі агенти. Імовірно тому єдиною перебудовою гена MLL за радіаційно-асоційованої ГМЛ у цьому дослідженні була дуплікація MLL у хворої, евакуйованої після Чорнобильської катастрофи із м. Прип’ять. Дуплікація гена MLL, визначена за допомогою FISH, супроводжувалась й одночасною ампліфікацією гена cyclin. Ампліфікацію гена cyclin часто спостерігають за негоджкінських лімфом, але щодо ГМЛ таку аномалію раніше не описували. Аберантна активація двох патологічних шляхів – одного, який утягує регулятор активації генів гемопоезу MLL, і другого, який через cyclin D1 опосередковує прогресію клітинного циклу, – може характеризувати процес радіаційного лейкемогенезу в описаної хворої.

У радіаційному лейкемогенезі в осіб, постраждалих унаслідок аварії на ЧАЕС, важливу роль можуть відігравати втрати і набуття хромосомного матеріалу. Цілком слушно, що в цьому випадку радіаційний слід у розвитку радіаційно-індукованої лейкемії неможливо описати однією аномалією, а лише класом схожих подій, як то дуплікація нуклеотидної послідовності гена AML1, дуплікація гена MLL, ампліфікація гена cyclin D1 тощо. Це твердження підтримують дані про зменшення серед опромінених хворих частини осіб з аномаліями каріотипу інших цитогенетичних категорій, наприклад транслокаціями. Засобом, який використано для перевірки цієї гіпотези, став аналіз збалансованості геному за допомогою генних чипів.

Аналіз кількості копій хромосом за допомогою генних чипів проведено у 19 пацієнтів з ГМЛ. Обстежено 13 учасників ЛНА на ЧАЕС і 6 жителів забруднених радіонуклідами територій. Результати, отримані під час аналізу гібридизації зразків ДНК субстратних клітин на генні чипи, містили в кожному випадку ідентифікатори 10 нуклеотидів поліморфізму. Аналізували втрати та набуття хромосомного матеріалу, які за розмірами могли бути ідентифікованими методом каріотипування диференційно G-фарбованих хромосом. Такий підхід застосовано з огляду на те, що досліджували лише хворих основної групи – з радіаційно-асоційованою ГМЛ. Порівняння проводили з даними літератури про частоту хромосомних аномалій за спонтанної ГМЛ, визначених методом каріотипування диференційно G-фарбованих хромосом. Втрати та набуття хромосомного матеріалу ідентифіковано в 11 із 19 випадків. У 6 випадках спостерігалась наявність 3 і більше хромосомних аномалій – ознака комплексного аберантного каріотипу. Надзвичайно високою виявилась частота делецій довгого плеча хромосоми 5 та довгого і короткого плечей хромосоми 7. Принаймні одну з таких аномалій зафіксовано у 8 із 19 проаналізованих випадків. Частота делецій 5q та/або 7p і 7q у хворих на радіаційно-асоційовану ГМЛ виявилась суттєво вищою (р<0,05) порівняно з очікуваною за даними літературних джерел щодо спонтанної ГМЛ (Slovak et al., 2002; Schoch et al., 2004). Можна стверджувати, що за наслідком генотоксичного впливу іонізуюче випромінювання подібне до алкілуючих агентів. Ці препарати ініціюють ГМЛ з невипадково високою частотою делецій хромосом 5 і 7 (Thirman, Larson, 1996). Крім того, делеції довгого плеча хромосоми 5 і одного з плеч хромосоми 7 у разі ГМЛ за даними групи Schoch (2004) є ознакою надзвичайно несприятливого, рефрактерного до цитостатичних засобів лейкемічного процесу. Вважається, що єдиний шлях курації таких хворих – щонайшвидше проведення неспорідненої алогенної трансплантації СГК без сподівань на досягнення ремісії за стандартного цитостатичного лікування (Deet al., 2002; Pulsoni, Pagano, 2005). Ініціальну хіміотерапію в такому разі варто розглядати як циторедуктивну.

Фактори медикаментозної резистентності за радіаційно-асоційованої ГМЛ. Медикаментозна резистентність може формуватися внаслідок змін різних етапів дії цитостатичного препарату і стосуватися проникнення лікарського засобу в клітину, його метаболізму, внутріклітинних мішеней препарату, механізмів клітинної репарації та здібності клітини розпізнавати цитотоксичний вплив і входити в апоптоз. За допомогою проточного цитофлуориметра проведено аналіз експресії транспортних протеїнів, зокрема Р-глікопротеїну (Р-gp), MRP (білок множинної медикаментозної резистентності) та LRP (білок легеневої резистентності) на субстратних клітинах у 52 хворих на ГМЛ; молекул апоптозу, зокрема CD95, BAX, BCL-XL, BCL-2 та р53 – у 56 хворих (табл. 2).

Субстратні клітини пацієнтів із радіаційно-асоційованою ГМЛ частіше були позитивними на Р-глікопротеїн, ніж хворих зі спонтанним захворюванням. Визначено асоціацію гіперекспресії Р-глікопротеїну з резистентністю лейкемічного клону до цитостатичної терапії (r=0,47, р<0,05) у пацієнтів, які зазнали дії ІР внаслідок